CN110273010B - 一种mc1r基因单倍型的鉴定与应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于畜牧学或动物遗传育种技术领域，公开了一种MC1R基因单倍型的鉴定与应用方法，所述MC1R基因单倍型的鉴定方法包括：通过对MC1R基因进行PCR扩增后，采用单端Sanger测序获得变异序列；基于构建的单倍型，对育种群毛色的基因型与表型进行关联分析，鉴定出控制黑羽的单倍型及黑羽纯合基因型。本发明准确鉴定出控制黑羽的单倍型及黑羽纯合基因型。本发明在一个测序反应下将关键的SNPs位点同时鉴定出来；而已有技术是用2个测序引物才能将SNPs位点同时鉴定出来。相比已有技术的PCR‑RFLP鉴别方法，Sanger测序进一步提高了鉴定的准确性。

Description

一种MC1R基因单倍型的鉴定与应用方法
技术领域
本发明属于畜牧学或动物遗传育种技术领域，尤其涉及一种MC1R基因单倍型的鉴定与应用方法。
背景技术
目前，最接近的现有技术：在国内对有色羽活鸡的消费市场中，黑色羽毛的鸡深受消费者的喜欢，占有一定的市场份额。羽毛颜色是一个复杂性状，鸡毛色呈黑色(Extendedblack)、金翎(buttercup)和茶花色(wild type)由E，ebc，e+三种位点分别控制，三者显隐性关系为E>ebc>e+。由于黑羽显性位点的纯合基因型和杂合基因型的表型相同，在育种过程中，需要通过将待测个体与隐性纯合子个体进行测交试验，根据杂交后代毛色是否分离才能进行区分。而测交试验需要花费大量的人力和物力，且试验时间长。因此，对黑羽鸡育种群体进行快速、准确的基因型鉴定，是提高黑羽鸡育种进程的重要手段。
MC1R作为控制鸡毛色的主效基因。国内地方鸡种MC1R基因存在大量遗传变异。利用PCR产物直接测序法，在河北柴鸡鉴定出10个新SNPs。虽然对遗传变异与毛色进行的相关分析，然而未能区分黑羽中纯合和杂合个体。
现有技术一，CN201210336647.2公开一种鸡MDH基因5′侧翼区单核苷酸多态性的检测方法，包括以下步骤：鸡MDH基因5′侧翼区PCR引物的设计；以引物P进行PCR扩增待测鸡的MDH基因片段；PaeI酶切消化PCR扩增的MDH基因片段；PaeI消化PCR产物后琼脂糖凝胶电泳分析；MDH基因不同基因频率和基因型频率。针对上述MDH基因5′侧翼区的SNP多态性，本发明公开其筛查和检测方法，通过设计特定的引物PCR扩增，特定的限制性内切酶酶切鉴定，能够快速、简单、低成本、高精确地检测其单核苷酸的多态性；能够从分子遗传学上快速的对种质资源进行分型，以便用于鸡腹脂重和产蛋数的标记辅助选择(MAS)，建立鸡种群。
现有技术二，CN201811413923.4公开一种c-kit基因突变检测方法，包括如下步骤：S1、依据9、11、13和17号c-Kit外显子的DNA序列设计特异性扩增引物；S2、利用步骤S1中设计得到的特异性扩增引物进行PCR扩增9、11、13和17号c-Kit外显子的基因，并对PCR扩增产物进行酶解；S3、根据测序引物，对酶解产物进行循环扩增获取Sanger片段；S4、利用步骤S3中得到的Sanger片段利用自动化基因仪上分析据9、11、13和17号c-Kit外显子的DNA序列信息，与野生基因型比对，找出突变位点。该发明设计了特异性扩增引物，缩短了引物的长度，提高特异性扩增灵敏度，通过所述特异性扩增引物可以直观的看到PCR扩增的目的基因是否合格，从而决定是否进行下一步，避免浪费试剂。
综上所述，现有技术存在的问题是：
(1)现有技术中，没有通过对MC1R基因进行PCR扩增后，采用单端Sanger测序获得变异序列，基于构建的单倍型，对育种群毛色的基因型与表型进行关联分析，造成不能准确鉴定出控制黑羽的单倍型及黑羽纯合基因型。
(2)黑羽鸡育种测交试验需要花费大量的人力和物力，且试验时间长。
(3)国内地方鸡种MC1R基因存在大量遗传变异，未能区分黑羽中纯合和杂合个体。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种MC1R基因单倍型的鉴定与应用方法。
本发明是这样实现的，一种MC1R基因单倍型的鉴定方法，所述MC1R基因单倍型的鉴定方法包括：
步骤一，通过对MC1R基因进行PCR扩增后，采用单端Sanger测序获得变异序列。
步骤二，基于构建的单倍型，对育种群毛色的基因型与表型进行关联分析，准确鉴定出控制黑羽的单倍型及黑羽纯合基因型。
进一步，所述步骤一具体包括：
通过设计1组特异性识别鸡MC1R基因的引物，将酚-氯仿抽提法纯化的样品总DNA作为PCR检测的模板，制备20μL PCR反应体系，并按照反应程序(94℃变性/25s，60℃退火/60s，72℃延伸反应/25s，30次循环)实施PCR；用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将符合要求的PCR产物进行sanger测序。根据序列变异构建的单倍型来判定鸡毛色基因型。
进一步，所述鸡毛色基因型的具体判定方法为：采集黑羽鸡群与非黑羽鸡群个体，对MC1R基因进行PCR扩增并Sanger测序，比较分析黑羽与非黑羽鸡群中SNPs位点，挑选出4个SNPs位点(c.69C>T,c.212T>C,c.274G>A,c.644A>C)利用PHASE软件构建出三种单倍型，其中单倍型H1(TCAA)对H2(TCAC)和H3(CTGA)表现为完全显性，H1控制黑羽性状。在黑羽个体中，H1H1为纯合黑羽个体，而H1H2或H1H3为杂合黑羽个体。
进一步，所述步骤二具体包括：
通过测交获得待测个体的表型与基因型。利用黑羽个体与非黑羽个体交配，根据后代出现黑羽与非黑羽的情况，判定待测个体的基因型。随后对待测个体、非黑羽个体进行MC1R基因的遗传变异分析，基于单个变异位点基因型或多个变异位点单倍型与表型关联分析，最后分析测交所确认待测个体黑羽纯合个体和杂合个体所对应的基因型，确定黑羽纯合基因型。
进一步，所述通过对MC1R基因进行PCR扩增的方法为：
(1)、获取鸡血液或组织样本，进行DNA提取；
鸡血(5μL)或组织(30mg)样本的基因组DNA采用天根生化科技有限公司的血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(DP304)提取。或采用传统的酚-氯仿法提取基因组DNA。
(2)、根据鸡MC1R基因设计引物进行PCR扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳，PCR产物片段大小为1144bp；
PCR扩增正向引物为5’-ATCCTTGTGCCTGGGGTG-3’，反向引物为5’-CATCCATCCATCCTCCTGTC-3’，其退火温度60℃，延伸时间1min。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成并稀释为10pmol/L的工作浓度。
PCR反应体系为20μl：10μl2xTaq PCR Master Mix(含有DNA聚合酶，buffer，dNTPs等)，6.4μl ddH2O，上下游引物各0.8μl，DNA模板2μl。
反应程序：95℃变性3min，95℃变性45s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min。
电泳条件：2.5％EB电泳缓冲液中在180V的电压条件下电泳20min。
(3)、将电泳检测后符合目的片段大小的PCR产物送公司采用Sanger测序。测序引物序列为：5’-TGAGGATGAGGTGGAAGAAGAAGG-3’。Sanger测序方法参照测序公司要求进行。
(4)将Sanger测序所获得DNA序列利用SeqMan软件结合人工进行SNPs位点识别并判定每个SNPs位点的基因型。本方法中，重点关注c.69C>T(ss2727686850)、c.212T>C(ss2727686851)、c.274G>A(ss2727686852)和c.644A>C(ss2727686853)4个SNPs位点。
(5)利用PHASE软件对上述4个SNPs位点构建单倍型。本方法中，上述4个SNPs位点构建成三种单倍型，其中单倍型H1(TCAA)对H2(TCAC)和H3(CTGA)表现为完全显性，H1控制黑羽性状。
(6)结合已知基因型的黑羽个体和非黑羽个体信息，判定在黑羽个体中，H1H1为纯合黑羽个体，而H1H2或H1H3为杂合黑羽个体。从而实现对黑羽个体中纯合个体和杂合个体的准确区分，可应用于育种实践。
本发明另一目的在于提供一种利用所述MC1R基因单倍型的鉴定方法在野生动物对种质资源进行分型上的应用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明在一个测序反应下将关键的SNPs位点同时鉴定出来；而已有技术是用2个测序引物才能将SNPs位点同时鉴定出来。相比已有技术的PCR-RFLP鉴别方法，Sanger测序进一步提高了鉴定的准确性。
本发明以MC1R作为控制鸡毛色的主效基因，通过对MC1R基因进行PCR扩增后，采用单端Sanger测序获得变异序列，基于构建的单倍型，对育种群毛色的基因型与表型进行关联分析，准确鉴定出控制黑羽的单倍型及黑羽纯合基因型。利用该技术，可以对育种鸡群在出雏后直接筛选出黑羽纯合个体，达到快速建立黑羽纯系的目的。
本发明的基因分型技术基于MC1R作为控制鸡毛色的主效基因，利用MC1R基因编码区四个单核苷酸多态性(SNPs)位点信息，基因序列等需要给出组成的单倍型可以准确区分中国地方鸡种黑羽个体是否为纯合还是杂合基因型，通过筛选出黑羽纯合个体，达到快速建立黑羽纯系的目的。
本发明基于单倍型分析，可以快速、准确的区分黑羽个体中纯合与杂合个体，实现对黑羽纯系的快速建立。本发明能快速、准确地鉴定个体黑羽与非黑羽个体的基因型，亦可直接用于鉴定鸡毛色的试剂盒生产。
附图说明
图1是本发明实施例提供的MC1R基因单倍型的鉴定方法流程图。
图2是本发明实施例提供的鸡毛色基因型的判定图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
现有技术没有通过对MC1R基因进行PCR扩增后，采用单端Sanger测序获得变异序列，基于构建的单倍型，对育种群毛色的基因型与表型进行关联分析，造成不能准确鉴定出控制黑羽的单倍型及黑羽纯合基因型。本发明利用MC1R基因的单倍型组合直接区分育种素材中黑羽群体中的纯合基因型个体，育种过程不需进行测交，加快地方鸡种黑羽纯系培育速度，提高育种效率。
下面结合附图对本发明的技术方案作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的MC1R基因单倍型的鉴定方法包括：
S101：通过对MC1R基因进行PCR扩增后，采用单端Sanger测序获得变异序列；
S102：基于构建的单倍型，对育种群毛色的基因型与表型进行关联分析，准确鉴定出控制黑羽的单倍型及黑羽纯合基因型。
在本发明的优选实施例中，步骤一具体包括：通过设计1组特异性识别鸡MC1R基因的引物，将酚-氯仿抽提法纯化的样品总DNA作为PCR检测的模板，制备20μL PCR反应体系，并按照反应程序(94℃变性/25s，60℃退火/60s，72℃延伸反应/25s，30次循环)实施PCR；用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将符合要求的PCR产物进行sanger测序。根据序列变异构建的单倍型来判定鸡毛色基因型。
本发明的鸡毛色基因型的具体判定方法为：采集黑羽鸡群与非黑羽鸡群个体，对MC1R基因进行PCR扩增并Sanger测序，比较分析黑羽与非黑羽鸡群中SNPs位点，挑选出4个SNPs位点(c.69C>T,c.212T>C,c.274G>A,c.644A>C)利用PHASE软件构建出三种单倍型，其中单倍型H1(TCAA)对H2(TCAC)和H3(CTGA)表现为完全显性，H1控制黑羽性状。在黑羽个体中，H1H1为纯合黑羽个体，而H1H2或H1H3为杂合黑羽个体。
在本发明的优选实施例中，步骤二具体包括：通过测交获得待测个体的表型与基因型。利用黑羽个体与非黑羽个体交配，根据后代出现黑羽与非黑羽的情况，判定待测个体的基因型。随后对待测个体、非黑羽个体进行MC1R基因的遗传变异分析，基于单个变异位点基因型或多个变异位点单倍型与表型关联分析，最后分析测交所确认待测个体黑羽纯合个体和杂合个体所对应的基因型，确定黑羽纯合基因型。
本发明通过对MC1R基因进行PCR扩增的方法为：
(1)获取鸡血液或组织样本，进行DNA提取；
鸡血(5μL)或组织(30mg)样本的基因组DNA采用天根生化科技有限公司的血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(DP304)提取。或采用传统的酚-氯仿法提取基因组DNA。
(2)根据鸡MC1R基因设计引物进行PCR扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳，PCR产物片段大小为1144bp；
PCR扩增正向引物SEQ ID NO：1为5’-ATCCTTGTGCCTGGGGTG-3’，反向引物SEQ IDNO：2为5’-CATCCATCCATCCTCCTGTC-3’，其退火温度60℃，延伸时间1min。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成并稀释为10pmol/L的工作浓度。
PCR反应体系为20μl：10μl2xTaq PCR Master Mix(含有DNA聚合酶，buffer，dNTPs等)，6.4μlddH2O，上下游引物各0.8μl，DNA模板2μl。
反应程序：95℃变性3min，95℃变性45s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min。
电泳条件：2.5％EB电泳缓冲液中在180V的电压条件下电泳20min。
(3)将电泳检测后符合目的片段大小的PCR产物送公司采用Sanger测序。测序引物序列SEQ ID NO：3为：5’-TGAGGATGAGGTGGAAGAAGAAGG-3’。Sanger测序方法参照测序公司要求进行。
(4)将Sanger测序所获得DNA序列利用SeqMan软件结合人工进行SNPs位点识别并判定每个SNPs位点的基因型。本发明方法中，重点关注c.69C>T(ss2727686850)、c.212T>C(ss2727686851)、c.274G>A(ss2727686852)和c.644A>C(ss2727686853)4个SNPs位点。
(5)利用PHASE软件对上述4个SNPs位点构建单倍型。本方法中，上述4个SNPs位点构建成三种单倍型，其中单倍型H1(TCAA)对H2(TCAC)和H3(CTGA)表现为完全显性，H1控制黑羽性状。
(6)结合已知基因型的黑羽个体和非黑羽个体信息，判定在黑羽个体中，H1H1为纯合黑羽个体，而H1H2或H1H3为杂合黑羽个体。从而实现对黑羽个体中纯合个体和杂合个体的准确区分，可应用于育种实践。
本发明以MC1R作为控制鸡毛色的主效基因，基于MC1R基因编码区四个单核苷酸多态性(SNPs，c.69C>T,c.212T>C,c.274G>A,c.644A>C)位点组成的单倍型(H1：TCAA；H2：TCAC；H3：CTGA)可以准确区分中国地方鸡种黑羽个体是否为纯合(H1H1)还是杂合(H1H2和H1H3)基因型，建立利用基因分型技术，可以在出雏后直接筛选出黑羽纯合个体，达到快速建立黑羽纯系的目的。此外，本基因分型技术建立在PCR产物直接进行Sanger测序反应，相比采用PCR-RFLP法，极大的提高了基因型鉴定的准确性。
下面结合实验对本发明的技术效果作详细的描述。
利用本发明的方法，在随机选择的384只黑羽个体中，鉴定出134只黑羽纯合个体，黑羽纯合与杂合的比例符合1：2。随后利用134只黑羽纯合个体开展的自群交配，后代未发现非黑羽个体存在。因此，在鉴别黑羽纯合基因型的准确率可达100％。
此外，由于在随机黑羽个体中，黑羽纯合基因型与黑羽杂合基因型的比例为1：2。为降低鉴定成本和确保黑羽纯合基因型准确率，本发明可结合PCR-RFLP先进行基因型初选，对获得的纯合黑羽基因型个体再进行Sanger测序确认基因型。如限制性内切酶BstBAI识别YAC^GTR序列特征，可以同时识别c.212T>C和c.644A>C的SNPs差异。PCR产物进行酶切反应体系(10μl)为：1μl 10×NEbuffer，ddH2O 5.6μl，酶BsaAI 0.4μl，DNA(PCR产物)3μl。酶切反应程序：37℃消化30min，4℃保存。电泳条件：2.5％EB电泳缓冲液中在200V的电压条件下电泳20min。在本发明方法中的384只黑羽个体中，利用PCR-RFLP鉴定基因型的准确率为94.6％。因此，基于本发明所获得的单倍型基础上，利用PCR-RFLP方法并结合本发明的Sanger测序策略，将进一步降低基因型鉴定成本并确保黑羽纯合基因型准确率达100％。
利用本发明可在雏鸡出壳时就可选择黑羽纯合基因型个体，淘汰黑羽杂合个体；而传统测交试验区分黑羽纯合基因型和杂合基因型，至少需要将育种个体饲喂至性成熟(约180日龄左右)开展测交实验，且测交试验繁琐。因此，本发明可极大的降低选育黑羽纯系鸡的育种成本。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 西南大学
<120> 一种MC1R基因单倍型的鉴定与应用方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atccttgtgc ctggggtg 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
catccatcca tcctcctgtc 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgaggatgag gtggaagaag aagg 24

Claims (5)

1.一种MC1R基因单倍型的鉴定方法，其特征在于，所述MC1R基因单倍型的鉴定方法包括：
步骤一，通过对MC1R基因进行PCR扩增后，采用单端Sanger测序获得变异序列；具体为：采集黑羽鸡群与非黑羽鸡群个体，对MC1R基因进行PCR扩增并Sanger测序，比较分析黑羽与非黑羽鸡群中SNPs位点，挑选出4个SNPs位点、所述4个SNPs位点为c .69C>T ,c .212T>C ,c .274G>A ,c .644A>C，利用PHASE软件构建出三种单倍型，其中单倍型 H1对单倍型H2和单倍型H3表现为完全显性，所述单倍型 H1为TCAA、所述单倍型H2为TCAC、所述单倍型H3为CTGA；H1控制黑羽性状，在黑羽个体中，H1H1为纯合黑羽个体，而H1H2或H1H3为杂合黑羽个体；
步骤二，基于构建的单倍型，对育种群毛色的基因型与表型进行关联分析，鉴定出控制黑羽的单倍型及黑羽纯合基因型。
2.如权利要求1所述的 MC1R基因单倍型的鉴定方法，其特征在于，所述步骤一通过对MC1R基因进行PCR扩增后，采用单端Sanger测序获得变异序列具体包括：
通过设计1组特异性识别鸡MC1R基因的引物，将酚-氯仿抽提法纯化的样品总DNA作为PCR检测的模板，制备20μL PCR反应体系，并按照反应程序实施PCR；用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将符合要求的PCR产物进行sanger测序；根据序列变异构建的单倍型来判定鸡毛色基因型。
3.如权利要求1所述的MC1R基因单倍型的鉴定方法，其特征在于，所述步骤二的基于构建的单倍型，对育种群毛色的基因型与表型进行关联分析，鉴定出控制黑羽的单倍型及黑羽纯合基因型具体包括：
通过测交获得待测个体的表型与基因型；利用黑羽个体与非黑羽个体交配，根据后代出现黑羽与非黑羽的情况，判定待测个体的基因型；随后对待测个体、非黑羽个体进行MC1R基因的遗传变异分析，基于单个变异位点基因型或多个变异位点单倍型与表型关联分析，最后分析测交所确认待测个体黑羽纯合个体和杂合个体所对应的基因型，确定黑羽纯合基因型。
4.如权利要求1所述的MC1R基因单倍型的鉴定方法，其特征在于，所述通过对MC1R基因进行PCR扩增的方法为：
(1)、获取鸡血液或组织样本，进行DNA提取；
鸡血5μL或组织30mg样本的基因组DNA采用天根生化科技有限公司的血液/组织/细胞基因组提取试剂盒DP304提取或采用传统的酚-氯仿法提取基因组DNA；
(2)、根据鸡MC1R基因设计引物进行PCR扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳，PCR产物片段大小为1144bp；
PCR扩增正向引物为5’-ATCCTTGTGCCTGGGGTG-3’，反向引物为5’-CATCCATCCATCCTCCTGTC-3’，其退火温度60℃，延伸时间1min，引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成并稀释为10pmol/L的工作浓度；
PCR反应体系为20μl：10μl 2xTaq PCR Master Mix，6.4μl ddH 2 O，上下游引物各0.8μl，DNA模板2μl；
反应程序：95℃变性3min，95℃变性45s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min；
电泳条件：2.5％EB电泳缓冲液中在180V的电压条件下电泳20min；
(3)、将电泳检测后符合目的片段大小的PCR产物送公司采用Sanger测序，测序引物序列为：5’-TGAGGATGAGGTGGAAGAAGAAGG-3’；Sanger测序方法参照测序公司要求进行；
(4)将Sanger测序所获得DNA序列利用SeqMan软件结合人工进行SNPs位点识别并判定每个SNPs位点的基因型；
(5)利用PHASE软件对上述4个SNPs位点构建单倍型，4个SNPs位点构建成三种单倍型，其中单倍型H1对H2和H3表现为完全显性，H1控制黑羽性状；
(6)结合已知基因型的黑羽个体和非黑羽个体信息，判定在黑羽个体中，H1H1为纯合黑羽个体，而H1H2或H1H3为杂合黑羽个体，实现对黑羽个体中纯合个体和杂合个体的准确区分。
5.一种利用权利要求1所述MC1R基因单倍型的鉴定方法在黑羽鸡育种群体基因型鉴定中的应用。
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