CN113755609B - 一种利用mc1r基因单核苷酸遗传标记鉴定金丝牦牛品种的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用MC1R基因单核苷酸遗传标记鉴定金丝牦牛品种的方法。本发明利用全基因组关联分析和全基因组选择性清除信号计算两种方法，对金色毛色玉树牦牛的全基因组SNP进行分析，最终鉴定出这些牦牛的20号染色体上一个使MC1R基因密码子提前终止的特有突变，为玉树金牦牛实现品种鉴定提供了依据。同时根据该突变所在SNP位点可以在DNA水平上对玉树牦牛的金色毛色性状进行分子标记辅助选择育种，从而快速建立遗传资源优良的金牦牛种群。

Description

一种利用MC1R基因单核苷酸遗传标记鉴定金丝牦牛品种的 方法

技术领域

本发明涉及牦牛(Bos grunniens)引种和育种中的分子标记辅助鉴别，具体涉及在DNA水平上检测与牦牛金色毛色性状密切相关的SNP标记，以及利用MC1R基因单核苷酸遗传标记(SNP标记)鉴定玉树金牦牛。

背景技术

单核苷酸多态(SNP，single nucleotide polymorphism)是同一物种不同个体基因组DNA的等位序列上单个核苷酸存在差别的现象。相同长度的单链DNA因其顺序不同或单个碱基差异，所形成的构象就会不同。SNP是生物体基因组中存在最为广泛的一类变异，它是由于单个核苷酸的插入、缺失、转换和颠换而引起的。

某些SNP的存在导致个体基因组相应基因位点保留了与表型相关的无义突变等不同形式的变异。无义突变是编码某一氨基酸的三联体密码经碱基替换后，变成不编码任何氨基酸的终止密码UAA、UAG或UGA。虽然无义突变并不引起氨基酸编码的错误，但由于终止密码出现在一条mRNA的中间部位，会使多肽链的翻译就此终止，形成一条不完整的多肽链。

野牦牛的毛色一般为黑色和褐色(或棕色)。除此之外，在野牦牛群体中还存在较为罕见的金丝野牦牛，不同于普通野牦牛通体黑色或褐色的毛色性状，金丝野牦牛的背部和体侧都覆盖着一层浓密厚实的浅金色粗毛，即具有明显的金色毛色性状。金丝野牦牛主要分布在西藏阿里地区和青海省玉树藏族自治州。目前关于牦牛毛色基因位点的研究表明，MC1R基因的不同基因型可以通过调控黑色素的数量、分布而影响牦牛整体的毛色性状，但受该基因变异影响所形成的与黑色存在差异的毛色主要集中在棕色及白色。例如，北京大学罗述金教授团队通过候选基因法对棕色牦牛的主效基因进行了鉴定，发现了MC1R基因的氨基酸突变位点p.Gln64*，并认为该位点突变与棕色牦牛的毛色相关。

目前还未见到有金丝野牦牛金色毛色相关基因的研究，特别是玉树金牦牛的毛色主效基因仍然没有得到鉴定，主要的技术难点在于：牦牛的金色毛色与其他毛色在同一个体(例如玉树金丝野牦牛)中往往相互嵌合，金色毛色比例升高时相应性状才逐渐明显，由此导致对于决定金色毛色性状的基因位点的筛选更为困难，且容易受到其他毛色基因研究结果的干扰。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用MC1R基因单核苷酸遗传标记鉴定金丝牦牛品种的方法。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种利用MC1R基因单核苷酸遗传标记鉴定牦牛品种的方法，该鉴定牦牛品种的方法包括以下步骤：

对牦牛个体候选基因组区域的单核苷酸突变位点进行检测，若检测出该牦牛个体在所述候选基因组区域中位于牦牛参考基因组第20号染色体第34139085位的SNP位点存在导致MC1R基因发生无义突变(即p.Gln34*)的等位基因，则将所述牦牛个体的品种确定为金牦牛，即金色毛色牦牛。

优选的，所述候选基因组区域位于牦牛参考基因组第20号染色体的33.5MB至34.3MB以内。

优选的，所述牦牛参考基因组为Bos_grunniens.LU_Bosgru_v3.0.dna.fa(NCBI版本号为GCF_000003205.7)。

优选的，所述第34139085位的SNP位点为C>T突变，该SNP位点的突变等位基因T为导致MC1R基因发生无义突变的等位基因。

优选的，所述牦牛个体的来源为玉树牦牛，当检测到玉树牦牛个体位于牦牛参考基因组第20号染色体第34139085位的SNP位点存在突变等位基因(例如T)时，即可将该牦牛个体的品种确定为玉树金牦牛。

优选的，所述鉴定牦牛品种的方法还包括以下步骤：对以下与所述第34139085位的SNP位点连锁的位于牦牛参考基因组第20号染色体的一个或多个SNP位点进行突变等位基因检测：第34019998位、第34040688位、第34040724位、第34051926位、第34066814位、第34081010位、第34085511位、第34087263位、第34122879位、第34125783位、第34151019位、第34158760位、第34221165位、第34223208位、第34235107位、第34237936位、第34240232位、第34243657位、第34251467位、第34251583位、第34252710位、第34262746位。当牦牛(例如玉树牦牛)个体具有由第34139085位的SNP位点及上述与其连锁的其他22个SNP位点中的若干个位点的突变等位基因构成的单倍型时，也可以将该牦牛个体的品种确定为金牦牛(例如玉树金牦牛)。

一种鉴定牦牛品种的试剂盒，该试剂盒包括用于检测定位于与牦牛金色毛色性状相关的候选基因组区域(即上述候选基因组区域)内的单核苷酸突变位点的试剂(例如包括对待测突变位点及其附近区域进行PCR扩增的试剂、对扩增片段进行测序的试剂等)，所述单核苷酸突变位点包括位于牦牛参考基因组第20号染色体第34139085位的SNP位点。

优选的，所述单核苷酸突变位点还包括上述其他22个SNP位点中的一个或多个SNP位点。

一种MC1R基因单核苷酸多态性的检测方法，包括以下步骤：

以牦牛基因组DNA为模板，采用PCR扩增MC1R基因的部分片段作为候选基因组区域，然后鉴定该候选基因组区域中位于牦牛参考基因组第20号染色体第34139085位的SNP位点的基因型。

上述MC1R基因单核苷酸多态性的检测方法在牦牛分子标记辅助选择育种及牦牛品种鉴定中的应用。

牦牛参考基因组第20号染色体33.5-34.3Mb区域内的单核苷酸突变位点(例如第34139085位C>T突变位点)在牦牛分子标记辅助选择育种及牦牛品种鉴定中的应用。

优选的，在所述第34139085位的SNP位点具有T/T基因型的玉树牦牛个体具有更明显的金色毛色性状(金色毛色数量按覆盖面积计算占比达80％～90％)，而具有T/T基因型或C/T基因型的玉树牦牛个体的品种为玉树金牦牛。

本发明的有益效果体现在：

本发明通过基因组重测序、全基因组关联分析以及全基因组选择性清除方法，寻找到牦牛金色毛色性状的主效基因(MC1R基因)及主要变异位点(牦牛参考基因组第20号染色体第34139085位的SNP位点)，通过鉴定该位点的基因型以确定突变等位基因携带情况，即可有效的筛选金牦牛种公牛和母牛以及进行种用牦牛的分子标记辅助育种，且不受个体毛色随生长发育变化、其他毛色与金色在个体中分布及数量比例变化的影响，为快速建立遗传资源优良的金牦牛种群奠定基础。

进一步的，本发明以通过对具有金色毛色性状的玉树牦牛的特征SNP位点(牦牛参考基因组第20号染色体第34139085位的SNP位点)进行突变等位基因检测(例如基于DNA测序法的基因分型)，可以筛选出金色毛色性状更优的个体，从而提高金牦牛育种质量和效率。

进一步的，本发明通过揭示与牦牛参考基因组第20号染色体第34139085位的SNP位点连锁的其他22个SNP位点，可以有效克服实际基因分型检测误差等因素对利用单一SNP位点进行金牦牛筛选的影响，提高筛选效率和可靠性。

附图说明

图1为本发明实施例中对玉树金牦牛部分SNPs的连锁分析结果。

图2为本发明实施例中对牦牛品种(玉树金牦牛)的鉴定技术流程图(DNA测序法)。

图3为牦牛MC1R基因g.34139085C>T位点三种基因型的测序峰图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。

(一)利用全基因组重测序、全基因组关联分析以及全基因组选择性清除探寻金牦牛毛色基因候选遗传标记

(1)从青海省玉树藏族自治州采集20头玉树金牦牛的耳组织样本(耳组织样采集自青海省玉树藏族自治州牦牛良种繁育种畜场、青海省玉树藏族自治州曲麻莱县黄河源良种繁育有限公司，采集时间为2020年11月)，提取基因组DNA进行全基因组重测序，以47头黑牦牛(序列获取自公开数据库)和37头白牦牛(样本采集自甘肃省武威市天祝藏族自治县，采集时间2019年5月)的基因组DNA数据为对照。

(2)基因组比对：利用BWA软件将每一头玉树金牦牛的重测序结果比对到牦牛参考基因组Bos_grunniens.LU_Bosgru_v3.0.dna.fa(NCBI版本号GCF_000003205.7)。

(3)利用Picard和GATK等软件检测所有牦牛的所有SNP位点，并且进行注释。

(4)利用全基因组关联分析方法对牦牛的毛色进行关联分析，找出牦牛基因组中与玉树金牦牛毛色相关的基因及主要因果变异。同时，利用全基因组选择性清除方法，比较玉树金牦牛和黑牦牛在牦牛基因组中分化明显的区域，从中筛选玉树金牦牛特异的遗传变异，通过与全基因组关联分析的结果比较，将与玉树金牦牛毛色相关的候选区域定位在20号染色体33.5-34.3Mb区间内(参见图1)。

(5)再对候选区域中SNP位点进行过滤，标准如下：SNP位点必需只存在于玉树金牦牛群体中，且等位基因频率高于0.1，结果参见表1。

(6)在步骤5基础上，筛选出玉树金牦牛特有的单核苷酸突变位点(即特征SNP位点)。参见表2，特征SNP位点在牦牛参考基因组20号染色体中的位点位置为34139085，在玉树金牦牛群体中这一特征SNP的频率为85％(17/20)，而在其他品种牛群体中的频率极低(小于0.001)。该位点位于MC1R基因上，可以导致MC1R蛋白34位的氨基酸密码子由谷氨酰胺突变位终止密码子(p.Gln34*)。

(7)对主要因果变异位点(具体指上述特征SNP位点)进行基因分型(利用PCR技术扩增后测序鉴定)，并与玉树金牦牛的毛色性状进行关联分析。

表1.玉树金牦牛SNPs位点及其频率统计

注：表1中频率是指携带突变等位基因的个体在群体中占比。20头玉树金牦牛的毛色性状存在一定差异：其中17头具有高达80％～90％的金色毛色覆盖。

表2 MC1R基因KF790935.1:g34139085C>T位点在3个牦牛品种中的基因型和等位基因频率分布

参见表2，通过对定位到牦牛参考基因组20号染色体第34139085位具有C到T碱基突变(C>T突变)的特征SNP位点与玉树金牦牛的毛色性状的卡方检验结果显示，TT基因型与金色毛色性状显著相关(表3)。

表3.毛色与基因型的卡方检验

以上结果表明：本发明在牦牛MC1R基因上发现了一个金牦牛特有的SNP位点(牦牛参考基因组20号染色体第34139085位)，该位点突变导致牦牛毛色变成金色，其中突纯合基因型TT可作为玉树金牦牛毛色性状的标记辅助选择的重要候选分子标记(即MC1R基因单核苷酸遗传标记)。

(二)利用MC1R基因单核苷酸遗传标记鉴定玉树金牦牛

利用MC1R基因参考基因组序列，选择特征SNP位点，并在两侧各延伸一定长度，以此为模板设计PCR扩增引物。以新采集的20头金牦牛(样本采集自青海省玉树藏族自治州曲麻莱县，采集时间为2021年7月)的基因组DNA为模板，黑牦牛或白牦牛DNA为隐性对照，进行PCR扩增，对扩增产物进行测序。然后将测序结果与参考基因组序列比对，确认选择的SNP位点是参考碱基还是突变碱基，若为突变碱基则该牦牛为玉树金牦牛，否则不是玉树金牦牛，具体步骤如下(参见图2)：

(1)提取待测牦牛的基因组DNA。

(2)扩增引物设计

利用MC1R基因参考基因组序列，选择玉树金牦牛所特有的SNP(特征SNP)，两侧各延伸一定长度，以此为模板，使用Primer5.0等软件设计PCR扩增引物(表4)。

表4.引物序列

(3)PCR扩增及产物纯化

以待测牦牛的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行PCR产物的切胶回收及纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管中，然后用PCR产物回收纯化试剂盒纯化PCR扩增产物。

(4)测序与分析

把以上牦牛PCR扩增产物送测序公司进行DNA测序。将测序结果与参考序列利用DNA STAR软件进行比对(参见图3)，若SNP的对应位点为突变碱基(T)则该牦牛为玉树金牦牛，否则不是玉树金牦牛，从而实现鉴定待测牦牛的品种。

实验结果表明，品种鉴定的准确性或一致性达到97％，即鉴定为玉树金牦牛的个体有97％都满足金色毛色覆盖达80～90％。

总之，本发明提出的特征SNP位点是牦牛MC1R基因的一个无义突变位点(牦牛参考基因组第20染色体第34139085位)，该位点发生的基因变异可以更有效的解释玉树牦牛部分个体形成明显金色毛色性状的原因，利用这一基因变异可以建立在DNA水平上鉴别玉树金毛牛的方法，能有效用于玉树金牦牛的引种及分子标记辅助育种，为快速建立遗传资源优良的金牦牛种群奠定基础。

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种利用MC1R基因单核苷酸遗传标记鉴定金丝牦牛品种的方法

<160> 2

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 上游引物F

<400> 1

gacatttgtc cagccaggga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 下游引物R

<400> 2

ctgagaaaga gcccgtcagg 20

Claims (6)

1.一种利用MC1R基因单核苷酸遗传标记鉴定牦牛品种的方法，其特征在于：该鉴定牦牛品种的方法包括以下步骤：

对牦牛个体候选基因组区域的单核苷酸突变位点进行检测，若检测出该牦牛个体在所述候选基因组区域中位于牦牛参考基因组第20号染色体第34139085位的SNP位点存在导致MC1R基因发生无义突变的等位基因，则将所述牦牛个体的品种确定为金牦牛，即金色毛色牦牛；

所述候选基因组区域位于牦牛参考基因组第20号染色体的33.5MB至34.3MB以内；

所述牦牛参考基因组为Bos_grunniens.LU_Bosgru_v3.0.dna.fa；

所述第34139085位的SNP位点为C>T突变，该SNP位点的突变等位基因T为导致MC1R基因发生无义突变的等位基因；

所述牦牛个体的来源为玉树牦牛。

2.根据权利要求1所述一种利用MC1R基因单核苷酸遗传标记鉴定牦牛品种的方法，其特征在于：所述鉴定牦牛品种的方法还包括以下步骤：对以下与所述第34139085位的SNP位点连锁的位于牦牛参考基因组第20号染色体的一个或多个SNP位点进行突变等位基因检测：第34019998位、第34040688位、第34040724位、第34051926位、第34066814位、第34081010位、第34085511位、第34087263位、第34122879位、第34125783位、第34151019位、第34158760位、第34221165位、第34223208位、第34235107位、第34237936位、第34240232位、第34243657位、第34251467位、第34251583位、第34252710位、第34262746位。

3.一种鉴定牦牛品种的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于检测定位于与牦牛金色毛色性状相关的候选基因组区域内的单核苷酸突变位点的试剂，所述单核苷酸突变位点包括位于牦牛参考基因组第20号染色体第34139085位的SNP位点；

所述候选基因组区域位于牦牛参考基因组第20号染色体的33.5MB至34.3MB以内；

所述牦牛参考基因组为Bos_grunniens.LU_Bosgru_v3.0.dna.fa；

所述第34139085位的SNP位点为C>T突变，该SNP位点的突变等位基因T为导致MC1R基因发生无义突变的等位基因；

所述牦牛个体的来源为玉树牦牛。

4.根据权利要求3所述一种鉴定牦牛品种的试剂盒，其特征在于：所述单核苷酸突变位点还包括以下与所述第34139085位的SNP位点连锁的位于牦牛参考基因组第20号染色体的一个或多个SNP位点：第34019998位、第34040688位、第34040724位、第34051926位、第34066814位、第34081010位、第34085511位、第34087263位、第34122879位、第34125783位、第34151019位、第34158760位、第34221165位、第34223208位、第34235107位、第34237936位、第34240232位、第34243657位、第34251467位、第34251583位、第34252710位、第34262746位。

5.一种MC1R基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

以牦牛基因组DNA为模板，采用PCR扩增MC1R基因的部分片段作为候选基因组区域，然后鉴定该候选基因组区域中位于牦牛参考基因组第20号染色体第34139085位的SNP位点的基因型；

所述候选基因组区域位于牦牛参考基因组第20号染色体的33.5MB至34.3MB以内；

所述牦牛参考基因组为Bos_grunniens.LU_Bosgru_v3.0.dna.fa；

所述第34139085位的SNP位点为C>T突变，该SNP位点的突变等位基因T为导致MC1R基因发生无义突变的等位基因；

所述牦牛个体的来源为玉树牦牛。

6.一种如权利要求5所述的MC1R基因单核苷酸多态性的检测方法在牦牛分子标记辅助选择育种及牦牛品种鉴定中的应用。

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