CN105648071A - 一种用于鉴别猪种及其毛色的基因mc1r的snp标记及方法和应用 - Google Patents

一种用于鉴别猪种及其毛色的基因mc1r的snp标记及方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于鉴别猪种及其毛色的基因MC1R的SNP标记。本发明还公开了一种用于鉴别猪种及其毛色的基因MC1R的SNP标记引物，本发明还公开一种用于鉴别猪种及其毛色的基因MC1R的SNP标记方法。本发明提供的分子遗传标记不受猪的年龄、性别等限制，可用于本土黑毛家猪纯种的早期选育，也可以对未知来源的猪肉样品进行猪种及毛色的鉴别与遗传关系推断。筛选方法准确，操作简单，成本低，效率高。

Description

一种用于鉴别猪种及其毛色的基因MC1R的SNP标记及方法和应用
技术领域
本发明属于动物基因工程与分子生物学技术领域，具体涉及一种用于鉴别猪种及其毛色的基因MC1R的SNP标记，本发明还涉及一种用于鉴别猪种及其毛色的基因MC1R的SNP标记引物，本发明还涉及一种用于鉴别猪种及其毛色的基因MC1R的SNP标记方法，本发明还涉及一种用于鉴别猪种及其毛色的基因MC1R的SNP标记的应用。
背景技术
猪与人类的关系密不可分，并在人类进化的各个时期都扮演了重要角色。直到今天，养猪仍是很多贫困地区致富的有效途径。据联合国粮农组织对世界粮食与农业动物遗传资源状况的统计，全世界大约有十亿头家猪，每七个人一头。亚洲家猪数量占世界的66％，其中绝大多数在中国，而越南、印度和菲律宾也有相当数量的家猪分布。欧洲及高加索拥有家猪数量占世界20％，美洲占15％。全世界家猪品种大约有541种，占所记录世界哺乳类品种数的12％。亚洲家猪品种最多占世界的41％，其次为欧洲与高加索地区，大概占世界32％；其余地区占剩余的15％。(联合国粮食与农业组织，2007)。
目前全世界分布最广的五大品种全部来自欧洲和北美，依次为英国大白猪(117个国家)、美国杜洛克(93个国家)、瑞典长白猪(91个国家)、美国汉普夏(54个国家)和德国皮特兰(35个国家)。东亚家猪的数量虽然庞大(超过世界总数的一半以上)，但没有一个品种分布排在前21位中。然而亚洲猪种对世界的贡献巨大，许多欧洲猪品种都含有中国家猪的血统。(联合国粮食与农业组织，2007)。
中国是世界上家猪品种资源最丰富的国家之一，我国在20世纪80年代初完成的猪种资源普查，被认可后公布的地方品种有118个，国家承认并载入《中国猪品种志》的地方品种有48个，培育品种12个，引入品种6个，合计66个(张仲葛,1986)。地方品种指原产于我国的土著品种，根据其来源、分布、体质、外形和生产性能分为六个类型；培育品种是利用我国的地方品种与国外引进良种杂交选育而成的新品种。引进品种则是由国外直接引入的品种。
毛色对野猪和家猪都具有重要意义。驯化使家猪的毛色表型与野猪相比发生了显著的改变(Andersson,2001；Diamond,2002)。对野猪来说，毛色具有非常重要的生态与行为适应性，并至少提供了三大类的功能(隐蔽、交流、生理调控)(Stoneretal.,2003)。相反，家猪的毛色若受到人工选择作用，则主要代表人类的需求与文化偏好(InnanandKim,2004)。驯化会在分子水平留下人工选择或群体事件对驯化目标基因的印记。通过对比驯化基因在家猪与野猪中的变异模式与遗传多样性，可以了解家猪毛色变异的分子遗传基础。
动物的皮毛之所以有丰富多彩的颜色，是体内含有多种色素造成的。动物体内的色素有多种，其中与毛色有关的主要是酪氨酸源性色素，并以黑色素及其衍生物最重要。分布于毛囊内的黑色素细胞是黑色素的制造者。首先经过一系列的酶学反应生成黑色素小体，并最终生成黑色素。黑色素又分为两种：一种是褐黑色素(phaeomelanin)，为易溶于碱性溶液的圆形红色颗粒，产生黄色和红色两种毛色；另一种是真黑色素(eumelanin)，由酪氨酸和苯丙氨酸经一系列氨化酶的作用形成，比褐黑色素难溶解，产生黑色与褐色两种颜色。真黑色素/褐黑色素的种类、含量与分布在动物皮毛中的多态性，导致了动物不同的毛色类型。
目前对于猪的毛色类型还没有标准的分类原则，有多种不同的分类方法。根据现有资料整理，我们大致将猪的毛色分为以下十类。并且对国外家猪品种与中国家猪品种的主要毛色类型进行了统计，结果显示在统计的国外家猪54个品种中白色23个(占42.59％)，黑白花9个(占16.7％)，白色黑斑7个(占12.96％)，其余为暗红色或黑色。中国家猪72个土著品种中纯净黑色45个(占62.5％)，黑白花色25个(占34.72％)，白色仅2个(占2.7％)。
猪的毛色虽然属于质量性状，但其遗传基础非常复杂，目前所知，猪的毛色至少受到8个经典遗传位点的控制。促黑素皮质激素受体1(Themelanocortinreceptor1，MC1R)基因已被确定是调控哺乳动物毛发颜色的关键基因。MC1R在毛发的黑色素生成中起到重要作用，有MC1R的信号存在能产生真黑色素，没有MC1R的信号存在则产生褐黑色素。MC1R的变异与许多家养动物毛色的相关性也开展了一些研究，例如猪、狗、鸡、猫、牛和兔子。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于鉴别猪种及其毛色的基因MC1R的SNP标记，MC1R的功能主要表现在对真黑色素和褐黑色素的合成起关键性的调控作用，不同的MC1R基因SNP变异能导致不同的毛色。
本发明的另一目的是提供一种用于鉴别猪种及其毛色的基因MC1R的SNP标记引物。
本发明的另一目的是提供用于鉴别猪种及其毛色的基因MC1R的SNP标记方法，本发明人首次发现在中国本土黑毛家猪和野猪中存在两个SNP位点的差异，用常规分子生物学方法检测这两个位点的碱基类型，可以作为一种鉴定家猪血统以及猪肉样品是否是纯种本土黑毛家猪的分子生物学方法。
本发明的另一目的是提供一种MC1R基因SNP标记在猪肉样品的鉴别与遗传关系中的应用。
本发明所采用的第一技术方案是，一种用于鉴别猪种及其毛色的基因MC1R的SNP标记，基因MC1R的六个单倍型MC1R*1、MC1R*2、MC1R*3、MC1R*4、MC1R*5和MC1R*6的核苷酸序列分别如SEQIDNO.9、SEQIDNO.11、SEQIDNO.13、SEQIDNO.15、SEQIDNO.17及SEQIDNO.19所示，上述核苷酸序列所对应的氨基酸序列分别如SEQIDNO.10、SEQIDNO.12、SEQIDNO.14、SEQIDNO.16、SEQIDNO.18及SEQIDNO.20所示；其中，毛色、猪种与基因变异对应的关系如下表所示：
其中，表中的变异位置是完整编码区中的实际变异位置；上表中各单倍型的核苷酸与氨基酸变异如下表所示：
其中，表2中核苷酸变异位置是以472bp所测序列第一位为起点，完整编码区中的实际位置应在本位置上增加269个；氨基酸变异的实际位置应在本位置上增加90个。
本发明所采用的第二技术方案是，一种用于鉴别猪种及其毛色的基因MC1R的SNP标记引物，该引物序列如下：
正向引物MC1RF1，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，具体为：5'-ACCTGCACTCGCCCATGTACT-3'；
反向引物MC1RR1，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，具体为：5'-GAGAGGTGCAGGAAGAAGGGT-3'。
本发明所采用的第三技术方案是，一种用于鉴别猪种及其毛色的基因MC1R的SNP标记方法，包括如下步骤：
步骤1、采用酚/氯仿法提取家猪品种的血液或组织的基因组DNA；
步骤2、利用步骤1中提取的基因组DNA为模板进行特异性PCR扩增，并进行回收和纯化，得到纯化后的PCR产物；
步骤3、对步骤2的纯化后的PCR产物进行克隆与测序；
步骤4、对测序结果进行序列分析、单倍型划分、相关性统计，对变异位点以及单倍型进行判定。
进一步地，步骤4中将克隆产物进行测序，对基因型进行判定具体为：应用DNASTAR软件包中Seqman程序对测序结果进行人工核对与校正并保存为一样长的序列；只有正反链测序结果一致的序列才用于下一步的分析；然后使用MegAlign程序进行序列比对，最后在Bioedit程序里进行检查；使用MEGA软件统计单倍型及变异位点，如下表所示：
其中，表中的变异位置是完整编码区中的实际变异位置；上表中各单倍型的核苷酸与氨基酸变异如下表所示：
本发明所采用的第四技术方案是，上述MC1R基因SNP标记在猪肉样品的鉴别与遗传关系中的应用。
本发明的有益效果是：(一)本发明提供的分子遗传标记不受猪的年龄、性别等限制，可用于本土黑毛家猪纯种的早期选育。(二)本发明还可以用于肉的样品的检测，可以有效区分肉品是否来自纯种黑毛家猪还是杂交种。此外，本发明发现了两个异义替代G283A与T305C导致的氨基酸改变V95M与L102P存在于所有的中国纯种土著黑毛家猪序列中，而所有的野猪样品中都没有。凭借这两个突变可以有效的区分和鉴别未知来源猪肉样品是来自家猪还是野猪。(三)筛选方法准确，操作简单，成本低，效率高。
附图说明
图1是本发明实验方法流程图；
图2是正反两条序列在25位点出现双峰的示意图；
图3是正反两条序列在390位点出现双峰的示意图；
图4是五个单倍型氨基酸序列与变异位点；
图5是五个单倍型核苷酸序列与变异位点。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明以Genebank中发表的猪MC1R完整编码区序列为基础，该序列全长963bp，其序列如SEQIDNO.1所示；编码320个氨基酸，其序列如SEQIDNO.2所示，选取该完整编码区中包含SNP位点的269-741共472bp区段，设计引物进行PCR扩增，对获得的PCR产物进行纯化、克隆和测序，并进行序列比对获得SNP变异位点及单倍型结构，从而获得猪毛色、猪种与MC1R基因SNP的相关性，通过该相关性可以对不同猪种及其血液或组织样品进行分子鉴别，也为猪的育种提供一种新的分子标记。
实施例1用于检测猪毛色基因MC1R的SNP标记方法
步骤1、基因组DNA提取
采用常规酚/氯仿法提取不同家猪品种与野猪血液或组织的基因组DNA。
步骤2、PCR扩增
根据Genebank已发表的猪MC1R序列设计引物：
正向引物MC1RF1(5'-ACCTGCACTCGCCCATGTACT-3')，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；
反向引物MC1RR1(5'-GAGAGGTGCAGGAAGAAGGGT-3')，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；
用MC1RF1和MC1RR1这对引物扩增猪MC1R编码区的一段472bp的DNA序列；
所采用TaqDNA聚合酶及Buffer为大连宝生物公司产品。
注：为消除引物二聚体需要另加DMSO2.5μl。
以上PCR反应试剂由华美公司或大连宝生物公司产品，引物由上海生物工程公司或上海申友合成。
PCR循环参数：
每次PCR反应都要设立阴性对照。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶进行检测。检测时，每个样品取2μl与等量的loadingbuffer混匀点样检测。对于扩增产物充足(检测条带较亮)的样品进行回收。
步骤3、PCR扩增产物的回收和纯化
制备2％的低熔点琼脂糖回收凝胶，将loadingbuffer与PCR产物混合后全部加入点样孔，100伏电压电泳1小时左右，使目的条带完全分开。将承载有DNA的回收电泳胶置于紫外分析仪上(注意防护)，用酒精消毒后的切刀沿着亮带边缘切割(如果在切割过程中刀片触碰到任何亮带，则须用纯水冲洗再用酒精擦洗后方能用)，将切下的每个亮带样品置于1.5ml离心管中进行如下纯化步骤：
1)加500μlbufferS1静置30秒后在离心机上10000转离心30秒，然后置于恒温箱中溶解20分钟；
2)将溶解样转移到回收试剂盒(上海华舜生物试剂公司)的双层套管中，静置30秒后在离心机上10000转离心15秒，丢弃下套管中的液体；
3)从套管口加500μlbufferW1(bufferW1需按外包装说明稀释)，静置30秒后在离心机上10000转离心30秒，弃下套管中的液体；
4)再从套管口加500μlbufferW1，静置30秒后在离心机上10000转离心30秒，弃下套管中的液体；
5)双层空套管以10000转离心1分钟，弃下管，换上1.5ml的新离心管做下管；
6)用bufferT1(25μl体系的加22μl，50体系的加30μl)对套管的中间膜层吸附的回收产物进行溶解，需置于温箱中溶解2分钟，然后以11000转离心1分半钟，弃上套管后盖好离心管并于4度或-20度保存备用。
步骤4、PCR产物的测序
4.1测序反应
4.2测序PCR热循环程序(PCR仪BigDye程序)：
注：测序反应过程要尽量避光进行。
4.3纯化测序反应产物(异丙醇法)
1)从PCR仪上将产物取下，带膜96孔板以小于1000转离心1分钟，撕下盖膜每孔加入反应体系体积*4倍量的现配的75％(水和异丙醇的体积比1：3)异丙醇；
2)把膜重新盖上后以1400转在振荡器上混匀后静置30min，在离心机上以3200rpm/rcf离心30min；
3)撕下覆盖膜后倒置96孔板于吸水纸上，以500rpm/rcf离心1min，然后加反应体系体积8倍的75％异丙醇；
4)盖好膜后以1400rpm/rcf在振荡器上混匀，以3200rpm/rcf离心10min；
5)倒置在吸水纸上，以500rpm/rcf瞬时离心1min，弃吸水纸，在室稳下挥发残余的异丙醇约10min；
6)96孔板中加入灭菌离子水溶解DNA(第一板加25μl，第二板加30μl)，以500rpm/rcf瞬时离心1min；
7)ABI3700测序仪上样电泳测序；
8)测序引物与PCR引物相同。
步骤5、PCR产物的克隆与测序
对于直接测序得到的序列为含有两个和两个以上杂合子的个体，如图2和图3所示测序结果中会出现两个和两个以上的双峰。为了鉴别其单倍型，重新做PCR进行扩增，并进行克隆：pMD18-TVector作为载体，以大肠杆菌DH-5α制备感受态细胞，用X-gal、IPTG、Amp系统筛选，具体操作如下：
5.1、感受态细胞的制备：
①配制LB(PH7.0-7.2)培养基：5g/L酵母浸出物，10g/L胰蛋白胨，10g/LNaCl，蒸馏水定容至1000ml；分装后在120℃高压蒸汽灭菌20分钟，若需添加琼脂，应在灭菌前加入15g/L琼脂，若需添加抗生素溶液，应在灭菌后冷却至55℃后，再加入所需抗生素溶液。
②接种600μl菌液保存液到10ml的LB培养基中，170rpm摇菌1小时20分钟；1.5ml/管分装，7000rpm离心7分钟；去上清(倾倒后用枪头吸干净)，加500μl/管冰上预冷的0.1MCaCl2(从开始至结束一直置冰)，一定要在振荡器上振匀；置于冰内20分钟；5000rpm离心5分钟，去上清(倾倒后用枪头吸干净)，加75μl冰上预冷的CaCl2，振匀；置冰30分钟。
5.2、连接反应
在0.5mlEppendorf管中加入：
12～16℃连接16小时以上。
5.3、转化
将5μl连接产物加入制备的感受态细胞中，置冰上30分钟；42℃热激60秒，迅速置冰上2-3分钟。
5.4、复苏培养
加450μlLB液体培养基，摇床(100rpm,37℃)培养1小时。
5.5、筛选培养
取含氨苄的LB平板(100ug/ml)，取100μl菌液(余下的菌液置于4℃冰箱保存)涂板然后置于37℃，30分钟以后倒置。10小时左右可看到单克隆菌落，当菌落长到适当大小后放于4℃冰箱保存。
5.6、PCR检测克隆
(1)无菌操作台，从上步的平板中挑取单克隆菌放入含2mlLB培养液(含氨苄80ug/ml)的试管中。37℃、250转/分培养12小时左右。
(2)无菌操作台，取灭菌的1.5mlEppendorf管，由试管中直接倒500-1000μl菌液。
(3)10000转/分离心30秒，取出至无菌操作台。倒掉上清液，然后Eppendorf倒置于卫生纸上占几下以使上清液流尽。
(4)每Eppendorf管中加无菌水70μl。涡旋振荡，然后放入沸水中15分钟。12000转/分离心2分钟，取上清液1-1.5μl作为PCR反应的模板。PCR反应体系各组分如下(每个样品用量，10μl)：
5.7、提取质粒(上海生工试剂盒，SK192)
(1)将培养的菌液倒入1.5mlEppendorf中，10000转/分离心30秒。
(2)超净操作台，倒上清液使液体尽可能流尽。每管加SolutionI110μl,涡旋后用手弹直至均匀，然后置于冰上3-5分钟。2000转/分瞬时离心。
(3)每管加110μlSolutionⅡ，缓慢摇，加一个摇一个，直至清亮。
(4)每管加430μlSolutionⅢ，加一个摇一个，注意不要把絮状沉淀弄碎。室温放置2分钟，然后13200转/分离心17分钟。大枪头取上清液转移至吸附柱中，10000转/分离心30秒，倒掉收集管中的废液。
(5)吸附柱中加500μlWashingSolution液，10000转/分离心30秒，倒掉收集管中的废液。
(6)重复步骤5后，再10000转/分离心30秒。
将吸附柱转移至一干净的1.5mlEppendorf中，每管加30μlElutionbuffer，室温放置几分钟。然后12000转/分离心2分钟，提取的质粒就被洗脱到Eppendorf管中，取1-2μl用0.8％低熔点琼脂糖凝胶检测后确定含量即可用于测序反应。-20℃长期保存。
5.8、质粒测序
采用质粒通用引物进行测序，测序方法同步骤4的PCR产物直接测序。
表1质粒测序通用引物
引物名称 引物序列
M13F 5'TGTAAAACGACGGCCAGT3'(SEQIDNO.5)
M13R 5'CAGGAAACAGCTATGACC3'(SEQIDNO.6)
M13F(47) 5'CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC3'(SEQIDNO.7)
M13R(48) 5'AGCGGATAACAATTTCACACAGGA3'(SEQIDNO.8)
步骤6、测序数据分析
应用DNASTAR软件包(DNAStarInc.2000)中Seqman程序对测序结果进行人工核对与校正并保存为一样长的序列。只有正反链测序结果一致的序列才用于下一步的分析。然后使用MegAlign程序进行序列比对，最后在Bioedit程序(Hall，1999)里进行检查。使用MEGA软件(Kumaretal.,2004)统计单倍型及变异位点。
通过以上方法本发明获得以下效果：
1、MC1R基因克隆测序方法的建立
本发明建立了一套克隆测序获得猪毛色相关基因MC1R序列，并进行序列比对获得变异位点以及单倍型结构的方法。通过该方法可以分析猪毛色与MC1R基因SNP的相关性。
2、标记性状关联分析
利用步骤1-6的方法，我们成功获得了MC1R基因不同单倍型与不同猪种间五种不同毛色类型的对应关系。并可以通过检测该变异位点的多态性，推断该猪肉样品的毛色，并进而推断该样品来自于什么猪种。(见表2、表3、图4、图5)
具体毛色、猪种与变异的对应关系如下：
1)野生型毛色(野猪色)——欧洲和亚洲野猪的MC1R序列相差一个同义突变(MC1R*1和MC1R*5单倍型)，其中，MC1R*1的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示，氨基酸序列如SEQIDNO.10所示；MC1R*5单倍型的核苷酸序列如SEQIDNO.17所示，氨基酸序列如SEQIDNO.18所示。
2)显性黑色——MC1R*2单倍型，两个异义替代(G283A,T305C)导致的氨基酸改变V95M与L102P，该突变导致了显性黑色的毛色，其中，MC1R*2单倍型的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示，氨基酸序列如SEQIDNO.12所示。
3)部分黑色——部分黑色(MC1R*3)包括了两个功能突变：一个是22号密码子处两个核苷酸的插入，导致了移码突变并且翻译提前终止；另一个是与显性黑色相关的D124N替代突变。两个C的插入使六个C重复序列伸展为八个C的重复序列，而这种重复序列的易变性可能使这些发生插入突变的序列在一些体细胞中发生回复突变，从而在白色或者红色毛发的基础上，出现黑色的斑块；其中，MC1R*3单倍型的核苷酸序列如SEQIDNO.13所示，氨基酸序列如SEQIDNO.14所示。
4)隐性红色——MC1R*4与野生型序列相差两个氨基酸替代A164V和A243T，据推断，A243T可能是这一等位基因的功能变异，因为它发生在第六跨膜区一个高度保守的残基处。A164V不大可能是功能突变，这是一个保守的替代，其中，MC1R*4单倍型的核苷酸序列如SEQIDNO.15所示，氨基酸序列如SEQIDNO.16所示。
5)显性白色——MC1R*6单倍型，22号密码子处两个核苷酸CC的插入，导致了移码突变并且翻译提前终止，其中，MC1R*6单倍型的核苷酸序列如SEQIDNO.19所示，氨基酸序列如SEQIDNO.20所示。
表2毛色、猪种与MC1R变异对应表
注：表中的变异位置是完整编码区中的实际变异位置。
表3各单倍型的核苷酸与氨基酸变异
注：表中核苷酸变异位置是以472bp所测序列第一位为起点，完整编码区中的实际位置应在本位置上增加269；氨基酸变异的实际位置应在本位置上增加90。MC1R*6发生了两个碱基插入，未在本表中表现。
实施例2中国家猪与中国野猪样品的检测实验
本实验共采集了中国家猪143头、中国野猪70头(见表4、表5)。中国家猪肌肉样品从全国各地的地方品种中采得。中国野猪样品采自各地的动物园和保护区。
表4样品情况总计
表5所测猪肉样品信息表
实验结果如表10所示，M1-M5属于MC1R*5单倍型，M6-M12属于MC1R*1单倍型，M13对应MC1R*4单倍型，M14对应MC1R*3单倍型，M15-M19属于MC1R*2单倍型。我们测定的中国家猪143个个体286条序列中，共发现六个单倍型，其中M16-18三个单倍型都发生了两个异义突变(V92M、L99P)是绝对的主体单倍型，频率为96.5％，其余三个单倍型为稀有单倍型M2、M14(D124N)和M19(V92M、L99P、V119L)频率都在0.06以下。提示所检测的中国土著家猪中除6％带有部分黑色的基因外，其余都是显性黑色。
比较而言，中国野猪在MC1R位点单倍型多样度明显很高，在15个中国野猪群体70个个体140条染色体中共发现13个单倍型，其中M1-5、M9-12共9个单倍型均为同义突变，频率为0.83，其余四个发生异义突变的单倍型频率均在0.06之下，同义突变单倍型频率较高提示野猪群体MC1R基因可能受到了功能限制。
最终结论：本次实验发现两个异义替代G283A与T305C导致的氨基酸改变V95M与L102P存在于96.5％的中国土著黑毛家猪序列中，而所有的野猪样品中都没有。凭借这两个突变可以非常有效的把家猪和野猪的样品区分开。
该结论说明应用本发明的方法鉴别中国家猪与野猪非常有效。
实施例3中国土著家猪与国外猪种样品的检测实验
本实验采集了三个欧洲商品猪种：兰德瑞斯10头、杜洛克6头和约克夏猪1头(样品由云南省畜牧兽医研究院提供)。采集的中国家猪样品与实施例1相同(见表5)。
表6样品情况总计
表7所测猪肉样品信息表
如表10所示，在欧洲家猪三个品种的17个个体34条序列中，存在四个单倍型M1、M13-14与M17，虽然受到个体数有限的制约，但可以发现欧洲家猪品种带有与中国家猪不同的异义突变。
杜洛克猪主要为M13单倍型，该单倍型两个异义突变(A161V，A240T)均为隐性红色的单倍型(MC1R*4)。兰德瑞斯猪则主要携带M14单倍型为D124N的异义突变，该单倍型与MC1R*3相同。有趣的是杜洛克猪与兰德瑞斯猪都携带有中国家猪的主体单倍型M17，反映了中国家猪的基因渗入。所测的1个约克夏猪为M1/M14的杂合体，反映了该猪种是祖先单倍型与突变单倍型的杂合。
该实验说明，本发明的方法能够有效区分中国土著家猪与国外引进商品猪种。
实施例4对未知猪种样品的遗传关系推断实验
本实验采集了来自东南亚3个国家的野猪12头样品与2个国家的家猪样品11头样品，完全不知道该样品的毛色、猪种等情况。该样品由国外大学提供。
表8样品情况总计
表9所测猪肉样品信息表
如表10所示，测定的6d头om泰est国ic家pi猪g中，有10条染色体分布在中国家猪主体单倍型M17和M16(A161V，A240T)，仅有2条为M14，提示采自泰国的家猪与中国家猪遗传关系较近，应该是中国土著黑毛家猪品种或近缘种。检测的7头万象家猪中有10条染色体分布在M14，提示该样本是欧洲的引进的商品猪种皮特兰或者汉普夏。
本实验中马来西亚野猪1条染色体为MC1R*5，3条染色体为MC1R*1，4条染色体为MC1R*2，提示检测的4头马来西亚野猪是欧洲野猪、亚洲野猪和中国家猪的杂交种。同理，可以推断检测的5头老挝野猪是欧洲野猪与亚洲野猪的杂交种，而越南野猪存在2条M16-17单倍型，其余全部都是同义突变单倍型，同样提示检测的越南野猪是亚洲野猪与中国家猪的杂交种。
该实验说明，本发明可用于推断猪种间的遗传关系。
其中，表10中：CWB：中国野猪；MWB：马来西亚野猪；LWB：老挝野猪；VWB：越南野猪；CDP：中国家猪；TDP：泰国家猪；LDP：老挝家猪；YOR：约克夏；DUR：杜洛克；LAN：兰德瑞斯。染色体数目是样品个数的两倍。表中核苷酸变异位置是以472bp所测序列第一位为起点，完整编码区中的实际位置应在本位置上增加269；氨基酸变异的位置已变换为完整编码区中的实际位置。

Claims (5)

1.一种用于鉴别猪种及其毛色的基因MC1R的SNP标记，其特征在于，基因MC1R的六个单倍型MC1R*1、MC1R*2、MC1R*3、MC1R*4、MC1R*5和MC1R*6的核苷酸序列分别如SEQIDNO.9、SEQIDNO.11、SEQIDNO.13、SEQIDNO.15、SEQIDNO.17及SEQIDNO.19所示，上述核苷酸序列所对应的氨基酸序列分别如SEQIDNO.10、SEQIDNO.12、SEQIDNO.14、SEQIDNO.16、SEQIDNO.18及SEQIDNO.20所示；其中，毛色、猪种与基因变异对应的关系如下表1所示：
表1毛色、猪种与MC1R变异对应表
其中，表中的变异位置是完整编码区中的实际变异位置；
上表1中各单倍型的核苷酸与氨基酸变异如下表2所示：
表2各单倍型的核苷酸与氨基酸变异
其中，表2中核苷酸变异位置是以472bp所测序列第一位为起点，完整编码区中的实际位置应在本位置上增加269个；氨基酸变异的实际位置应在本位置上增加90个。
2.一种用于鉴别猪种及其毛色的基因MC1R的SNP标记引物，其特征在于，该引物序列如下：
正向引物MC1RF1，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，具体为：5'-ACCTGCACTCGCCCATGTACT-3'；
反向引物MC1RR1，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，具体为：5'-GAGAGGTGCAGGAAGAAGGGT-3'。
3.一种用于鉴别猪种及其毛色的基因MC1R的SNP标记方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、采用酚/氯仿法提取家猪品种的血液或组织的基因组DNA；
步骤2、利用步骤1中提取的基因组DNA为模板进行特异性PCR扩增，并进行回收和纯化，得到纯化后的PCR产物；
步骤3、对步骤2的纯化后的PCR产物进行克隆与测序；
步骤4、对测序结果进行序列分析、单倍型划分、相关性统计，对变异位点以及单倍型进行判定。
4.根据权利要求3所述的用于检测猪毛色基因MC1R的SNP标记方法，其特征在于，所述步骤4中将克隆产物进行测序，对基因型进行判定具体为：应用DNASTAR软件包中Seqman程序对测序结果进行人工核对与校正并保存为一样长的序列；只有正反链测序结果一致的序列才用于下一步的分析；然后使用MegAlign程序进行序列比对，最后在Bioedit程序里进行检查；使用MEGA软件统计单倍型及变异位点：
表1毛色、猪种与MC1R变异对应表
其中，表中的变异位置是完整编码区中的实际变异位置；
上表1中各单倍型的核苷酸与氨基酸变异如下表2所示：
表2各单倍型的核苷酸与氨基酸变异
其中，表2中核苷酸变异位置是以472bp所测序列第一位为起点，完整编码区中的实际位置应在本位置上增加269个；氨基酸变异的实际位置应在本位置上增加90个。
5.权利要求1所述的用于鉴别猪种及其毛色的基因MC1R的SNP标记在猪肉样品的鉴别与遗传关系中的应用。
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