CN110408723B - 一种与茶树咖啡碱含量连锁的snp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一组与茶树咖啡碱(Caffeine，CAF)含量连锁的SNP分子标记及其应用，本发明首次发现了位于茶树基因组上Scaffold115：803980和Scaffold720：596655位点的与茶树咖啡碱含量相关的SNP分子标记位点，其基因型与咖啡碱含量极显著相关。进一步建立了检测各位点的检测方法，可利用其中的一个或几个分子标记位点评价茶树的咖啡碱含量，以进一步用于不同咖啡碱水平的茶树资源筛选及分子育种，具有很大的研究价值。
Description
技术领域
本发明涉及分子遗传育种技术领域，更具体地，涉及一种与茶树咖啡碱含量连锁的SNP分子标记及其应用。
背景技术
茶(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)属于山茶科山茶属茶组，起源于中国的西南地区，距今有5000多年的栽培历史。茶与咖啡、可可并称为世界三大无酒精饮料，有着重要的经济价值，并对社会和文化有着重要影响。
茶树新稍中的特征性次级代谢产物咖啡碱(Caffeine，CAF)是茶叶滋味的主要影响因子之一。咖啡碱是茶叶中一种含量很高的生物碱，一般含量为2～5％，每杯150ml的茶汤中含有40mg左右咖啡碱。咖啡碱是一种中枢神经的兴奋剂，因此具有提神的作用；另外咖啡碱还具有增强体力、毅力和耐久度的作用，有研究显示，咖啡碱能够增强肌肉活力，尤其是上肢肌肉；咖啡碱还可以促进新陈代谢，摄入200mg咖啡碱，新陈代谢率会在之后的3个小时里提升7％，脂肪燃烧的速率会得到大幅提升；咖啡碱能够辅助止疼，因为它可以加速其他止疼药物的起效；咖啡碱还具有提高抗氧化的作用，能够让抗氧化酚类物质的功效翻倍。
但是部分人群对咖啡因十分敏感，即使是少量咖啡碱的摄入也会造成严重失眠、心跳加速、血压升高，摄入过量咖啡碱后心肌梗死的几率会更大。
现有研究表明不同的产地、不同的品种之间咖啡碱不尽相同。为了满足不同人群的需求，需要培育不同咖啡碱含量的茶树。同时，由于咖啡碱对茶叶品质及生理功能的重要性，选育咖啡碱含量特异的茶树品种具有重要意义。但目前茶树育种主要通过常规方法进行，从野生群体、杂交后代中选择优良单株进行系统选育。该方法时间长、效率低，使得新品种更新换代慢，不能快速满足大众对新产品的需求。分子标记辅助育种由于可以在苗期对育种材料进行选择，可显著提高育种效率。
发掘与茶树优良性状紧密连锁的分子标记是开展茶树分子标记辅助选择育种的基础，但是目前由于传统QTL定位研究进展的局限，一直未能找到影响咖啡碱含量的SNP分子标记位点。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种与茶树咖啡碱含量连锁的SNP分子标记及其应用。
本发明的第一个目的是提供一个茶树咖啡碱含量数量性状连锁的分子标记组合。
本发明的第二个目的是提供所述分子标记组合或其中的任意一个分子标记在评价茶树咖啡碱含量中的应用。
本发明的第三个目的是提供所述分子标记组合或其中的任意一个分子标记的引物在评价茶树咖啡碱含量中的应用。
本发明的第四个目的是提供检测所述的SNP位点1的引物。
本发明的第五个目的是提供检测所述的SNP位点2的引物。
本发明的第六个目的是提供一种评价茶树咖啡碱含量的试剂盒。
本发明的第七个目的是提供一种评价茶树咖啡碱含量的方法。
本发明的第八个目的是提供所述分子标记组合或其中的任意一个分子标记、所述引物、或所述试剂盒中的一种或几种在分子辅助育种或茶品质评价中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
发明人经过长期探索性的研究发现了两个与咖啡碱(Caffeine)连锁的SNP位点分子标记。进一步利用其建立检测该位点的检测方法，可用于评价茶树的咖啡碱含量，以进一步用于资源筛选和分子育种。
因此本发明要求保护一个茶树咖啡碱含量数量性状连锁的分子标记组合，包括SNP位点1和2，分别位于茶树基因组Scaffold115：803980和Scaffold720：596655，即SEQ IDNO:1所示核苷酸序列的第501个碱基和SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的第501个碱基。
SNP位点1位于茶树基因组Scaffold115：803980(即SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的第501个碱基)，该位点为G或者为A，其基因型与茶树干物质中咖啡碱含量极显著相关，通过相关性分析和显著性验证表明，GG基因型样本对应的茶树干物质中咖啡碱含量与AA和GA基因型样本相比具有极显著差异。从统计学上判断，当样本基因型为双突变GG时，茶树中干物质中咖啡碱含量大概率低于基因型为野生型AA或单突变GA的样本。
SNP位点2位于茶树基因组Scaffold720：596655(即SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的第501个碱基)，该位点为T或者为C，其基因型与茶树干物质中咖啡碱含量极显著相关，通过相关性分析和显著性验证表明，CC基因型样本对应的茶树干物质中咖啡碱含量与CT基因型样本相比具有极显著差异。从统计学上判断，当样本基因型为单突变CT时，茶树中干物质中咖啡碱含量大概率低于正常平均水平的CC型。
本发明所述茶树咖啡碱含量具体为茶鲜叶干物质咖啡碱的比例。
所述分子标记组合或其中的任意一个分子标记在评价茶树咖啡碱含量中的应用，也属于本发明的保护范围。
本发明还要求所述分子标记组合或其中的任意一个分子标记的引物在评价茶树咖啡碱含量中的应用。
所述的SNP位点1的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2～3所示。
引物F：CTTCATCTCCACCACACTTC(SEQ ID NO：2)；
引物R：GCCCAAAGTAGCAAAGAGAG(SEQ ID NO：3)。
所述的SNP位点2的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5～6所示。
引物F：CAACTTTGGTGATGACGGAC(SEQ ID NO：5)；
引物R：TTCAACTGGTGTGTAGACGC(SEQ ID NO：6)。
进一步，本发明要求保护一种评价茶树咖啡碱含量的试剂盒，包括检测所述分子标记组合或其中的任意一个分子标记的试剂。
优选地，试剂为核苷酸序列如SEQ ID NO：2～3所示SNP位点1的引物，和/或核苷酸序列如SEQ ID NO：5～6所示SNP位点2的引物。
最优选地，所述试剂盒含有核苷酸序列如SEQ ID NO：2～3所示SNP位点1的引物和/或核苷酸序列如SEQ ID NO：5～6所示SNP位点2的引物、2×Taq PCR Master Mix、ddH2O。
其使用方法为：
(1)采用CTAB法提取茶树嫩芽总DNA，并确保每个DNA样品的A260/A280在1.8～2.0之间，浓度大于100μg/μl；
(2)PCR扩增
PCR体系(10μl)如下：
| 2×Taq PCR Master Mix | 5μl |
| 引物 | 各0.5μl |
| DNA template | 1μl |
| ddH<sub>2</sub>O | 3μl |
PCR扩增程序如下：
(3)产物纯化
将PCR扩增产物进行凝胶电泳，之后使用市售凝胶电泳DNA回收试剂盒进行回收纯化。
选取SEQ ID NO：2～3所示引物的扩增产物中片段长度在240bp左右的条带进行回收纯化。
选取SEQ ID NO：5～6所示引物的扩增产物中片段长度在250bp左右的条带进行回收纯化。
(4)测序及结果判读
将回收纯化的产物送测序公司进行Sanger法测序，在Scaffold115：803980位点，从统计学上判断，当样本基因型为双突变GG时，茶树中干物质中咖啡碱含量大概率低于正常平均水平的基因型为野生型AA或单突变GA的样本。
在Scaffold720：596655位点，从统计学上判断，当样本基因型为单突变CT时，茶树中咖啡碱含量大概率低于正常平均水平的基因型CC样本。
同时，本发明要求保护一种评价茶树咖啡碱含量的方法，检测所述分子标记组合或其中的任意一个或几个分子标记的基因型。
优选地，利用所述引物检测所述的分子标记SNP位点的基因型。
所述分子标记组合或其中的任意一个或几个分子标记、所述引物、或所述试剂盒中的一种或几种在分子辅助育种或茶品质评价中的应用，也属于本发明的保护范围。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明首次发现了一个茶树咖啡碱含量数量性状连锁的分子标记组合，包括SNP位点1和2，分别位于茶树基因组Scaffold115：803980和Scaffold720：596655。其基因型与咖啡碱含量显著相关。
SNP位点1位于茶树基因组Scaffold115：803980，其基因型与茶树干物质中咖啡碱含量极显著相关，通过相关性分析和显著性验证表明，GG基因型样本对应的茶树干物质中咖啡碱含量与AA和GA基因型样本相比具有极显著差异。从统计学上判断，当样本基因型为双突变GG时，茶树中干物质中咖啡碱含量大概率低于正常平均水平的基因型为野生型AA或单突变GA的样本。
SNP位点2位于茶树基因组Scaffold720：596655，其基因型与茶树干物质中咖啡碱含量极显著相关，通过相关性分析和显著性验证表明，CC基因型样本对应的茶树干物质中咖啡碱含量与CT基因型样本相比具有极显著差异。从统计学上判断，当样本基因型为单突变CT型时，茶树中干物质中咖啡碱含量大概率低于正常平均水平的CC基因型的样本。
进一步建立检测该位点这两个SNP位点的检测方法，可用于评价茶树的咖啡碱含量，以进一步用于茶树资源筛选及分子育种。这是开展茶树分子标记辅助选择育种的基础，有很大的研究价值。
附图说明
图1为所用群体在不同季节的咖啡碱含量。
图2为Scaffold115：803980位点与引物示意图，N表示Scaffold115：803980位置上的待测碱基，加粗并下划线部分为上下游引物。
图3为Scaffold720：596655位点与引物示意图，N表示Scaffold720：596655位置上的待测碱基，加粗并下划线部分为上下游引物。
图4为样本2-77在Scaffold720：596655位点的基因型SNaPshot测序结果。
图5为样本2-81在Scaffold720：596655位点的基因型SNaPshot测序结果。
图6为样本2-23在Scaffold115：803980位点的基因型SNaPshot测序结果(反向互补)。
图7为样本2-97在Scaffold115：803980位点的基因型SNaPshot测序结果(反向互补)。
图8为样本2-80在Scaffold115：803980位点的基因型SNaPshot测序结果(反向互补)。
图9为Scaffold115：803980位点基因型测序图，AA基因型。
图10为Scaffold115：803980位点基因型测序图，GA基因型。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
一、实验样本
采集位于广东省茶树种质资源库(广东，英德，113.3OE,24.3ON)的191份茶树材料，其中广东124份、福建20份、广西15份，浙江9份，湖南6份，云南6份，江西1份，贵州1份，台湾1份。另外8份肯尼亚茶种后代，1份格鲁吉亚种后代，所选材料具有广泛代表性。
所选用的资源随机分布在资源库中。采用双行单株种植，每行4m，行距1.5m，株距35cm。资源库进行常规水肥管理。在2016年年末对资源进行修剪并深坑施基肥，每亩4吨有机肥、0.75吨花生麸和10斤复合肥。2017年春茶及夏茶之后进行修剪并在根外追肥，每亩30斤复合肥和60斤尿素。分别在2017年的3月15日、6月25日和9月28日采摘茶树新梢一芽二叶，制作蒸青样，并按照水浸提法制备茶汤。
二、表型数据分析
1、实验步骤
利用高效液相色谱法对茶汤中咖啡碱进行检测，参照国标法进行检测。
2、实验结果
咖啡碱含量见表1。
表1 不同季节不同茶树资源CAF占干物质的百分比
群体的咖啡碱含量变异情况见表2和图1。
表2 咖啡碱性状表型变异
三、基因型和性状关联分析
1、实验步骤
采用CTAB法提取191个茶树资源嫩芽总DNA，并确保每个DNA样品的A260/A280在1.8～2.0之间，浓度大于100μg/μl。将提取好的DNA样品，检测分别位于“舒茶早”CSS栽培种茶树基因组(http://tpia.teaplant.org/index.html)的SNP位点1(Scaffold115：803980)和2(Scaffold720：596655)的基因型。进行性状和标记的关联分析，关联的显著性水平以P值进行判断，p值小于1.25E-05为显著性水平。
2、实验结果
这两个SNP位点不同季节的P值见表3。
表3 两个SNP位点不同季节的P值
实施例2 SNP位点的验证
一、实验方法
将SNP位点1(Scaffold115：803980)和SNP位点2(Scaffold720：596655)在另一个含98个种质的群体中进行验证。
1、检测各样本的咖啡碱含量。具体检测方法同实施例1。
2、利用SnaPShot技术平台检测各样本的SNP位点1(Scaffold115：803980)和2(Scaffold720：596655)。
该方法针对不同突变位点设计不同长度的引物SNaPshot反应后，产物通过电泳分离、五色荧光检测、Gene mapper分析，可在一个测序反应中检测多个SNP位点。应用SNaPshot进行定点的序列分析，其基本原理遵循了DNA直接测序中的双脱氧终止法，所不同的是PCR反应中只有不同荧光标记的ddNTP。由于每个SNP位点的引物3′端都紧靠SNP点，因此每一种引物在聚合酶作用下，根据模板的的序列，只延伸一个核苷酸。然后用先进的荧光检测系统，检测延伸的那个核苷酸的种类。
(1)引物设计
根据Scaffold115：803980在基因组的位置设计引物并进行合成。其中，Scaffold115：803980上下游各延伸500bp。其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示(图2，其中N表示Scaffold115：803980位置上的待测碱基)。
PCR引物：
F：CTTCATCTCCACCACACTTC(SEQ ID NO：2)；
R：GCCCAAAGTAGCAAAGAGAG(SEQ ID NO：3)。
单碱基延伸引物：
gactgactgactgactgactgactcaGCAGAGCTTGGCAAAGAGGGATG。
根据Scaffold720：596655在基因组的位置设计引物并进行合成。其中，Scaffold720：596655上下游各延伸500bp。其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示(图3，其中N表示Scaffold720：596655位置上的待测碱基)。
PCR引物：
引物F：CAACTTTGGTGATGACGGAC(SEQ ID NO：5)；
引物R：TTCAACTGGTGTGTAGACGC(SEQ ID NO：6)。
单碱基延伸引物：
gactgactgactgactagGCTACAGTTCGGACTCGAATTGTCAC。
(2)PCR扩增
PCR体系(10μl)如下：
| 2×Taq PCR Master Mix | 5μl |
| PrimerMix(按扩增情况配比) | 1μl |
| DNA template | 1μl |
| ddH<sub>2</sub>O | 3μl |
PCR扩增程序如下：
(3)PCR产物纯化
使用虾碱酶纯化法进行纯化。虾碱酶MIX(EX-SAP)的主要功能成分为SAP及ExoI.SAP酶，可以将残余dNTPs去磷酸化，ExoI降解游离单链引物。取4μl的PCR产物，加入2μl的EX-SAP酶。具体反应体系如下所示：
| 消化体系组分 | 体积(μl) |
| ddH<sub>2</sub>O | 0.75 |
| SAP(1U/μl) | 0.5 |
| ExoI(5U/μl) | 0.15 |
| 10*SAP buffer | 0.6 |
| PCR产物 | 4 |
| 总体积 | 6 |
之后在PCR仪上进行消化温育：37℃40min，85℃5min，4℃forever。
(4)SNaPshot反应
PCR产物当做模板进行SNaPshot反应。
SNaPshot反应体系如下所示：
| 试剂 | 用量(μl) |
| SNaPshot Mix | 0.5 |
| Pooled PCR Products | 3 |
| Pooled Primers | 1 |
| dH<sub>2</sub>O | 0.5 |
| 总体积 | 5 |
SNaPshot反应程序为：
之后，对SNaPshot产物进行纯化，直接向SNaPshot反应产物中加入2μl的SAP mix，具体反应体系如下：
| 组分 | 体积(μl) |
| 水 | 0.9 |
| SAP(1U/μl) | 0.5 |
| 10*SAP buffer | 0.6 |
| 总计 | 2 |
在PCR仪上进行SNaPshot产物消化反应，反应程序为：37℃40min，75℃15min，4℃forever。
(5)上机检测
取2μl消化后的SNaPshot反应产物加入到8μl含有0.4％LIZ120的去离子甲酰胺中，95℃变性5min，然后放-20℃骤冷，然后上3730XL测序。
(6)结果分析
用GeneMarker分析得到的.fsa结果，导出峰图及表格文件，并统计出每个样品的SNP突变型。
二、实验结果
各样本的咖啡碱含量及SNP1、SNP2位点的基因型见表4，部分样本SNaPshot测序结果见图4～图8。
表4 群体中资源咖啡碱的占干物质的含量及基因型
显著性分析结果显示，Scaffold115：803980的基因型与咖啡碱含量极显著相关，相关系数为-0.4，p-value为3.66×10-5，F值(6.91/3.94)为18.7，为隐性突变，GG基因型样本对应的茶树干物质中咖啡碱含量与AA和GA基因型样本相比差异显著。从统计学上判断，当样本基因型为双突变GG时，茶树中干物质中咖啡碱含量大概率低于正常平均水平的基因型为野生型AA或单突变GA的样本。
Scaffold720：596655的基因型与咖啡碱含量极显著相关，相关系数为-0.51，p-value为5.78×10-6，F值(6.91/3.94)为23.1，为显性突变，野生型CC基因型样本对应的茶树干物质中咖啡碱含量与单突变CT基因型样本相比差异显著。从统计学上判断，当样本基因型为单突变CT基因型时，茶树中干物质中咖啡碱含量大概率低于正常平均水平的野生型CC基因型的样本。
实施例3一种评价茶树咖啡碱含量的试剂盒
一、组成
其核苷酸序列如SEQ ID NO：2～3所示的检测SNP位点1的引物或/和其核苷酸序列如SEQ ID NO：5～6所示的检测SNP位点2的引物、2×Taq PCR Master Mix、ddH2O。
其中，SNP位点1引物F：CTTCATCTCCACCACACTTC(SEQ ID NO：2)；
SNP位点1引物R：GCCCAAAGTAGCAAAGAGAG(SEQ ID NO：3)。
SNP位点2引物F：CAACTTTGGTGATGACGGAC(SEQ ID NO：5)；
SNP位点2引物R：TTCAACTGGTGTGTAGACGC(SEQ ID NO：6)。
二、使用方法
(1)采用CTAB法提取茶树嫩芽总DNA，并确保每个DNA样品的A260/A280在1.8～2.0之间，浓度大于100μg/μl；
(2)PCR扩增
分别使用其核苷酸序列如SEQ ID NO：2～3和SEQ ID NO：5～6所示的检测引物检测SNP位点1和SNP位点2。
PCR体系(10μl)如下：
| 2×Taq PCR Master Mix | 5μl |
| 引物 | 各0.5μl |
| DNA template | 1μl |
| ddH<sub>2</sub>O | 3μl |
PCR扩增程序如下：
(3)产物纯化
将PCR扩增产物进行凝胶电泳，之后使用市售凝胶电泳DNA回收试剂盒进行回收纯化。
选取SEQ ID NO：2～3所示引物的扩增产物中片段长度在240bp左右的条带进行回收纯化。
选取SEQ ID NO：5～6所示引物的扩增产物中片段长度在250bp左右的条带进行回收纯化。
(4)测序及结果判读
将SEQ ID NO：2～3所示引物的扩增产物回收纯化送测序公司进行Sanger法测序，将测序结果与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列进行比对，根据图3所示(加粗并下划线部分为上下游引物)，Scaffold115：803980位点位于扩增产物的第164个碱基。从统计学上判断，当样本基因型为双突变GG时，茶树中干物质中咖啡碱含量大概率低于正常平均水平的基因型为野生型AA或单突变GA的样本。
将SEQ ID NO：5～6所示引物的扩增产物回收纯化送测序公司进行Sanger法测序，将测序结果与SEQ ID NO：4所示核苷酸序列进行比对，根据图3所示(加粗并下划线部分为上下游引物)，Scaffold720：596655位点位于扩增产物的第189个碱基。从统计学上判断，当样本基因型为单突变CT基因型时，茶树中干物质中咖啡碱含量大概率低于正常平均水平的野生型CC基因型的样本。
实施例4一种评价茶树咖啡碱含量的试剂盒的应用
一、实验方法
用实施例3的试剂盒检测实施例2中的98个茶树样本。
二、实验结果
检测结果与实施例2采用SnaPShot技术平台检测的结果一致，本试剂盒可以用于评价茶树咖啡碱含量。部分样本测序峰图如图9和10所示。
序列表
<110> 广东省农业科学院茶叶研究所
<120> 一种与茶树咖啡碱含量连锁的SNP分子标记及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1001
<212> DNA
<213> Camellia sinensis
<400> 1
aatcattaag agtcattatg gtaatcatga gcttaattac tccaagtaaa gccaatcttc 60
atcatagaaa taaaaattac aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa agtctttcag ctgaacaacc 120
catccctgca actgcaccac cataattgag atctaaatct gaaggaactt gcttgagatc 180
taaatctgaa ggaacttgct tgcttaggaa catccacatc catgatttct acaatttttg 240
gaagacacag aaccagagaa gatgactcaa aatcaagcag caattgtaag aaaattcgac 300
caatcgaaat catcttggaa ttaatcattg tagcctcctt catctccacc acacttctcc 360
tcctacttcc atgcgattac gtcgacggca gccctattcc caccatcata ttcaaaggac 420
tcccctccac cttccacgcc ttcgtcgtct ccctcatctt cgccttctcc ggagccttga 480
gcgccttgtt gatccacgac ncatccctct ttgccaagct ctgcgagttc tcttccatgg 540
cctccatgac ctctgctctc tctttgctac tttgggctat gttcttcacc tgttttcaac 600
cacaacccag gtaaaactcg aattcagaca tcacatggta agaaaacaag ttattaaggt 660
ttttaacctt ataaagactt tttttctttt ttcttttcct tcctgtccaa cggacacgtg 720
gtgtgtttta aaattaataa atcgtgtatc agatatggat atacaatcgc gtggtcagtt 780
gaaattacta ttggtatgct ttatataccg tgtcgtgtgt aaaattaaaa cttgttttgt 840
gatgttgttg gtctgttatg tacttggtgt tgttgaaata atattaccat aaatttgaat 900
aagcctttat tatgtggaga tccgatggat taatgatgca tattgtcaca gaattcaaaa 960
tgatttcatt ttgagcatgg tgacgagggt tccaagccct g 1001
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cttcatctcc accacacttc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcccaaagta gcaaagagag 20
<210> 4
<211> 1001
<212> DNA
<213> Camellia sinensis
<400> 4
gcccactaga taatggcaaa accatctttt ctaaagccca cttgagggtg gcaaaatctg 60
cattttagcc tacttgcgag tagcaaacca ttttcagaac aaacatgaaa tgttttgttc 120
caatttaggc gatttggtct acacttgttt gctgtgcgca taacatagta attctaggct 180
aataaccgga ataaaagcat ataatgtttt caaaacaaga tatcatggtt agtagaggcc 240
gatctttgat cgggcgagtg ggtatgctca tagctgacct gccccaattg tacccaagtt 300
cccgagccga gacaactttg gtgatgacgg acacgtgccc tttggcaccg agtcagggtt 360
tcttaaattc tcccaaaata aaatatttag gtggcgactc tgtatctggc aaagcagtcc 420
atgtttggca cttcttttct aaaaatctgt tttctcaaaa caatttgccg gatttggact 480
ctttggttca gattaagaac ngtgacaatt cgagtccgaa ctgtagcatg gggcccacgg 540
gcgcgtctac acaccagttg aaggtaaaga cagaagatgt tgagaaaatt gcattcagag 600
cgaggtatgg tcattatgaa ttccttgtta tgccatttgg agtaactaat gcccctgcaa 660
cgtttataga cctaatgaac tgtattttta agacttatct tgatgatttt gttgtgattt 720
tattaatgat atcttggtgt attcaaagaa tagacttgaa catgaacacc acttgagaac 780
tttcttgcaa acacttaaag aaaagaaatt attttccaaa ctaaaaaaat gtgaattttg 840
gttggatgaa gtcattttct tagggcatgt tatcaacaag gaagaaattt cagtagatcc 900
acagaaaatt gaagcaattg tgaattgacc cactccaaca aatataacag aagtccatag 960
tttcgtgggc ttagctgggt actacagaag atttgtgaag g 1001
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttcaactggt gtgtagacgc 20
Claims (4)
1.一种茶树咖啡碱含量数量性状连锁的分子标记组合或其中的任意一个分子标记的引物在评价茶树咖啡碱含量中的应用，其特征在于，所述组合中的分子标记为SNP位点1和2：
其中，所述SNP位点1位于茶树基因组Scaffold115：803980，即SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的第501个碱基，该位点为G或者为A，当样本基因型为双突变GG时，茶树中干物质中咖啡碱含量大概率低于基因型为野生型AA或单突变GA的样本；
所述SNP位点2位于茶树基因组Scaffold720：596655，即SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的第501个碱基，该位点为T或者为C，当样本基因型为单突变CT时，茶树中干物质中咖啡碱含量大概率低于正常平均水平的CC型。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述SNP位点1的引物的核苷酸序列如SEQID NO：2～3所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述SNP位点2的引物的核苷酸序列如SEQID NO：5～6所示。
4.一种评价茶树咖啡碱含量的方法，其特征在于，检测权利要求1所述分子标记组合或其中的任意一个分子标记的基因型。
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Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105505957B (zh) * | 2015-11-17 | 2017-05-31 | 中国农业科学院茶叶研究所 | 筛选具有低咖啡碱性状的茶组植物的特异引物对、等位基因、分子标记及筛选方法 |
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Application publication date: 20191105 Assignee: GUANGDONG TAK SON PLANTING CO.,LTD. Assignor: TEA Research Institute GUANGDONG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES Contract record no.: X2022980014155 Denomination of invention: A SNP Molecular Marker Linked to Tea Tree Caffeine Content and Its Application Granted publication date: 20200908 License type: Common License Record date: 20220830 |
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Application publication date: 20191105 Assignee: Shixing Haihan Tea Co.,Ltd. Assignor: TEA Research Institute GUANGDONG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES Contract record no.: X2022980021331 Denomination of invention: A SNP Molecular Marker Linked to Caffeine Content in Tea Plant and Its Application Granted publication date: 20200908 License type: Common License Record date: 20221115 |