CN110714092B

CN110714092B - 一种位于黄酮醇合成酶基因中与茶树(+)-儿茶素含量连锁的分子标记位点及其应用

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Publication number: CN110714092B
Application number: CN201910833670.4A
Authority: CN
Inventors: 方开星; 吴华玲; 李红建; 姜晓辉; 秦丹丹; 李波; 王秋霜; 潘晨东
Original assignee: Tea Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Tea Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-09-04
Filing date: 2019-09-04
Publication date: 2020-09-08
Anticipated expiration: 2039-09-04
Also published as: CN110714092A

Abstract

本发明公开了一种位于黄酮醇合成酶基因中与茶树(+)‑儿茶素((+)‑catechin，C)含量连锁的分子标记位点及其应用，本发明首次发现了位于茶树基因组Scaffold3727:442660上的与茶树(+)‑儿茶素含量相关的SNP分子标记位点，AA基因型样本对应的茶汤干物质中(+)‑儿茶素含量与GG和GA基因型样本相比极差异显著。从统计学上判断，当样本基因型为双突变AA时，茶树中干物质中(+)‑儿茶素含量大概率高于正常平均水平的基因型为野生型GG或单突变GA的样本。进一步建立检测该位点的检测方法，可用于评价茶树的(+)‑儿茶素含量，以进一步用于高(+)‑儿茶素茶树资源筛选及分子育种，具有很大的研究价值。

Description

一种位于黄酮醇合成酶基因中与茶树(+)-儿茶素含量连锁的分子标记位点及其应用

技术领域

本发明涉及分子遗传育种技术领域，更具体地，涉及一种位于黄酮醇合成酶基因中与茶树(+)-儿茶素含量连锁的分子标记位点及其应用。

背景技术

茶(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)属于山茶科山茶属茶组，起源于中国的西南地区，距今有5000多年的栽培历史。茶叶与咖啡、可可并称为世界三大无酒精饮料，有着重要的经济价值，并对社会和文化有着重要影响。

(+)-儿茶素((+)-catechin，C)是茶树中的一种重要的影响风味的次级代谢产物。其不仅影响茶叶品质，还具有多种生理功能，研究表明(+)-儿茶素是茶叶的重要保健成分，具有防治心血管疾病、预防癌症等多种功能。它为还原性多元酚类物质，在水溶液中易被空气氧化，常用作抗氧化剂。研究表明，(+)-儿茶素(C) 对人肝癌细胞(HepG2)的增殖、迁移能力的抑制及诱导凋亡作用；右旋(+)-儿茶素还有降低毛细血管的通透性、止泻、止血、抗病毒、杀真菌、抑制ACE及预防胃溃疡等多种作用；(+)-儿茶素(C)对铁超载引起的血脂异常有保护作用；(+)- 儿茶素(C)能改善铝超载所致的小鼠学习记忆障碍，并且具有很强的抗氧化能力。

基于(+)-儿茶素对茶叶品质及生理功能的重要性，选育(+)-儿茶素含量特异的茶树资源具有重要意义。目前茶树育种主要通过常规方法进行，从野生群体、杂交后代中选择优良单株进行系统选育。该方法时间长、效率低，使得新品种更新换代慢，不能快速满足大众对新产品的需求。分子标记辅助育种由于可以在苗期对育种材料进行选择，可显著提高育种效率。但是目前一直未能找到影响(+)-儿茶素含量的SNP分子标记位点。

黄酮醇合成酶(flavonol synthase,FLS)属于2-酮戊二酸依赖性双加氧酶(2-oxoglutarate-dependentdioxygenase,2-ODD)家族成员，是黄酮醇合成的直接调控酶。研究表明FLS在调节类黄酮代谢流向黄酮醇分支途径和花青素分支途径中其重要作用。目前并没有黄酮醇合成酶调控(+)-儿茶素含量的报导。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种位于黄酮醇合成酶基因中与茶树(+)-儿茶素含量连锁的分子标记位点及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种茶树(+)-儿茶素含量数量性状连锁的分子标记。

本发明的第二个目的是提供所述分子标记在评价茶树(+)-儿茶素含量中的应用。

本发明的第三个目的是提供所述分子标记的引物。

本发明的第四个目的是提供所述引物在评价茶树(+)-儿茶素含量中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种评价茶树(+)-儿茶素含量的试剂盒。

本发明的第六个目的是提供一种评价茶树(+)-儿茶素含量的方法。

本发明的第七个目的是提供所述分子标记SNP位点、所述引物、或所述试剂盒在分子辅助育种中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

发明人经过长期探索性的研究发现了在黄酮醇合成酶(flavonol synthase,FLS)基因上存在一个与茶树中(+)-儿茶素含量连锁的分子标记，该分子标记为单个核苷酸的变异(SNP)，位于茶树基因组Scaffold3727:442660(“舒茶早”CSS栽培种茶树基因组http://tpia.teaplant.org/index.html)(图1)，该为点位于类黄醇合成酶基因第353个碱基位置，ATG下游228个碱基位置。进一步利用其建立检测该位点的检测方法，可用于评价茶树的(+)-儿茶素含量，以进一步用于资源筛选和分子育种。

因此本发明要求保护一种茶树(+)-儿茶素含量数量性状连锁的分子标记，所述分子标记为位于茶树基因组Scaffold3727:442660的SNP位点，即SEQ ID NO:1 所示核苷酸序列的第501个碱基。

茶树基因组Scaffold3727:442660，该位点为G或者为A，其基因型与茶树干物质中(+)-儿茶素含量极显著相关，通过相关性分析和显著性验证表明，AA基因型样本对应的茶汤干物质中(+)-儿茶素含量与GG和GA基因型样本相比具有极显著差异。从统计学上判断，当样本基因型为双突变AA时，茶树中干物质中 (+)-儿茶素含量大概率高于正常平均水平的基因型为野生型GG或单突变GA的样本。

本发明所述茶树(+)-儿茶素含量具体为茶鲜叶干物质(+)-儿茶素的比例。

所述分子标记SNP位点在评价茶树(+)-儿茶素含量中的应用，也属于本发明的保护范围。

本发明还要求检测所述分子标记的引物，所述引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2～3所示。

引物F：TTGTCCGTGTCCAATCCTTG(SEQ ID NO：2)；

引物R：ATTGACCACCTGGAAGAAGC(SEQ ID NO：3)。

所述引物在评价茶树(+)-儿茶素含量中的应用，也属于本发明的保护范围。

进一步，本发明要求保护一种评价茶树(+)-儿茶素含量的试剂盒，包括检测所述分子标记SNP位点的试剂。

优选地，所述试剂为所述引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2～3所示。

最优选地，所述试剂盒含有核苷酸序列如SEQ ID NO：2～3所示的引物、 2×TaqPCR Master Mix、ddH₂O。

其使用方法为：

(1)采用CTAB法提取茶树嫩芽总DNA，并确保每个DNA样品的A260/A280在1.8～2.0之间，浓度大于100μg/μL；

(2)PCR扩增

PCR体系(10μl)如下：

2×Taq PCR Master Mix	5μl
		引物	各0.5μl
DNA template	1μl
		ddH<sub>2</sub>O	3μl

PCR扩增程序如下：

(3)产物纯化

将PCR扩增产物进行凝胶电泳，之后使用市售凝胶电泳DNA回收试剂盒进行回收纯化。

(4)测序及结果判读

将回收纯化的产物送测序公司进行Sanger法测序，在Scaffold3727:442660 位点，从统计学上判断，当样本基因型为双突变AA时，茶树中干物质中(+)-儿茶素含量大概率高于正常平均水平的基因型为野生型GG或单突变GA的样本。

同时，本发明要求保护一种评价茶树(+)-儿茶素含量的方法，检测所述的分子标记SNP位点的基因型。

优选地，利用所述引物检测所述的分子标记SNP位点的基因型。

所述分子标记、所述引物、所述试剂盒、或所述试剂盒任一在分子辅助育种或茶品质评价中的应用，也属于本发明的保护范围。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明首次发现了与茶树(+)-儿茶素含量相关的SNP分子标记位点，其位于茶树基因组Scaffold3727:442660上，其基因型与(+)-儿茶素含量极显著相关，AA 基因型样本对应的茶汤干物质中(+)-儿茶素含量与GG和GA基因型样本相比具有极显著差异。从统计学上判断，当样本基因型为双突变AA时，茶树中干物质中(+)-儿茶素含量大概率高于正常平均水平的基因型为野生型GG或单突变GA 的样本。进一步建立检测该位点的检测方法，可用于评价茶树的(+)-儿茶素含量，以进一步用于茶树资源筛选及分子育种。这是开展茶树分子标记辅助选择育种的基础，有很大的研究价值。

附图说明

图1为Scaffold3727:442660位点在ABC(ATP-binding cassette)转运蛋白基因的位置。

图2为不同季节的(+)-儿茶素含量。

图3为Scaffold3727:442660位点与引物示意图，N表示Scaffold3727:442660 位置上的待测碱基，加粗并下划线部分为上下游引物。

图4为样本2-51在Scaffold3727:442660位点的基因型SNaPshot测序结果。

图5为样本2-35在Scaffold3727:442660位点的基因型SNaPshot测序结果。

图6为样本2-44在Scaffold3727:442660位点的基因型SNaPshot测序结果。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

一、实验样本

采集位于广东省茶树种质资源库(广东，英德，113.3OE,24.3ON)的191 份茶树材料，其中广东124份、福建20份、广西15份，浙江9份，湖南6份，云南6份，江西1份，贵州1份，台湾1份。另外8份肯尼亚茶种后代，1份格鲁吉亚种后代，所选材料具有广泛代表性。

所选用的资源随机分布在资源库中。采用双行单株种植，每行4m，行距1.5 m，株距35cm。资源库进行常规水肥管理。在2016年年末对资源进行修剪并深坑施基肥，每亩4吨有机肥、0.75吨花生麸和10斤复合肥。2017年春茶及夏茶之后进行修剪并在根外追肥，每亩30斤复合肥和60斤尿素。分别在2017年的3月15日、6月25日和9月28日采摘茶树新梢一芽二叶，制作蒸青样，并按照水浸提法制备茶汤。

二、表型数据分析

1、实验步骤

利用高效液相色谱法对茶汤中与茶树滋味相关的(+)-儿茶素(+)-catechin(C)进行检测，参照国标法进行检测。

利用SPSS软件对(+)-儿茶素含量的指数大小范围、平均值、标准差和变异系数进行分析。将数量性状以0.5个标准差，将数据分为10个等级，用于计算性状的Shannon-Wiener多样性指数。使用最佳线性无偏预测(Best Liner Unbiased Prediction,BLUP)方法，采用一年多点模型估计育种值，同时估算广义遗传力。

2、实验结果

(+)-儿茶素含量见表1。

表1不同季度不同资源C占干物质的百分比：

群体的(+)-儿茶素含量变异情况见表2和图2。

表2 C性状((+)-儿茶素含量)表型变异：

三、基因型和性状关联分析

1、实验步骤

采用CTAB法提取191个茶树资源嫩芽总DNA，并确保每个DNA样品的 A260/A280在1.8～2.0之间，浓度大于100μg/μL。将提取好的DNA样品，检测分别位于“舒茶早”CSS栽培种茶树基因组(http：//tpia.teaplant.org/index.html) 的SNP位点(Scaffold3727:442660)的基因型，进行性状和标记的关联分析，关联的显著性水平以P值进行判断，p值小于1.25E-05为显著性水平。

2、实验结果

该SNP位点不同季节的P值见表3。

表3：不同季节Scaffold3727:442660位点的P值

实施例2分子标记在另外一个群体中的验证

一、实验方法

将位于Scaffold3727:442660的SNP位点在另一个含98个种质的群体中进行验证。

1、检测各样本的(+)-儿茶素含量。具体检测方法同实施例1。

2、利用SnaPShot技术平台检测各样本的Scaffold3727:442660的SNP位点的基因型。

该方法针对不同突变位点设计不同长度的引物SNaPshot反应后，产物通过电泳分离、五色荧光检测、Gene mapper分析，可在一个测序反应中检测多个SNP 位点。应用SNaPshot进行定点的序列分析，其基本原理遵循了DNA直接测序中的双脱氧终止法，所不同的是PCR反应中只有不同荧光标记的ddNTP。由于每个SNP位点的引物3′端都紧靠SNP点，因此每一种引物在聚合酶作用下，根据模板的序列，只延伸一个核苷酸。然后用先进的荧光检测系统，检测延伸的那个核苷酸的种类。

(1)引物设计

根据Scaffold3727:442660在基因组的位置设计引物并进行合成。其中，Scaffold3727:442660上下游各延伸500bp。其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示 (图3，其中N表示Scaffold3727:442660位置上的待测碱基)。

PCR引物：

F：TTGTCCGTGTCCAATCCTTG(SEQ ID NO：2)；

R：ATTGACCACCTGGAAGAAGC(SEQ ID NO：3)。

单碱基延伸引物：

ataaTCTAAGAGCAACCACCATAGCCCA。

(2)PCR扩增

PCR体系(10μl)如下：

2×Taq PCR Master Mix	5μl
		PrimerMix(按扩增情况配比)	1μl
DNAtemplate	1μl
		ddH<sub>2</sub>O	3μl

PCR扩增程序如下：

(3)PCR产物纯化

使用虾碱酶纯化法进行纯化。虾碱酶MIX(EX-SAP)的主要功能成分为SAP 及ExoI.SAP酶，可以将残余dNTPs去磷酸化，ExoI降解游离单链引物。取4μl 的PCR产物，加入2μl的EX-SAP酶。具体反应体系如下所示：

消化体系组分	体积(μl)
		ddH<sub>2</sub>O	0.75
SAP(1U/μl)	0.5
		ExoI(5U/μl)	0.15
10*SAPbuffer	0.6
		PCR产物	4
总体积	6

之后在PCR仪上进行消化温育：37℃40min，85℃5min，4℃forever。

(4)SNaPshot反应

PCR产物当做模板进行SNaPshot反应。

SNaPshot反应体系如下所示：

试剂	用量(μl)
		SNaPshot Mix	0.5
Pooled PCR Products	3
		Pooled Primers	1
dH<sub>2</sub>O	0.5
		总体积	5

SNaPshot反应程序为：

之后，对SNaPshot产物进行纯化，直接向SNaPshot反应产物中加入2μl的 SAPmix，具体反应体系如下：

在PCR仪上进行SNaPshot产物消化反应，反应程序为：37℃40min，75℃15 min，4℃forever。

(5)上机检测

取2μl消化后的SNaPshot反应产物加入到8μl含有0.4％LIZ120的去离子甲酰胺中，95℃变性5min，然后放-20℃骤冷，然后上3730XL测序。

(6)结果分析

用GeneMarker分析得到的.fsa结果，导出峰图及表格文件，并统计出每个样品的SNP突变型。

二、实验结果

各样本的(+)-儿茶素含量及Scaffold3727:442660的SNP位点的基因型见表 4，部分样本SNaPshot测序结果见图4到图6。

表4验证群体中资源C((+)-catechin)的占干物质的含量及基因型：

显著性分析结果显示，Scaffold3727:442660的基因型与(+)-儿茶素含量极显著相关，相关系数为0.64，p-value为1.60×10^-12，F值(6.91/3.94)为65.9，为隐性突变，AA基因型样本对应的茶汤干物质中(+)-儿茶素含量与GG和GA基因型样本相比具有极显著差异。从统计学上判断，当样本基因型为双突变AA时，茶树中干物质中(+)-儿茶素含量大概率高于正常平均水平的基因型为野生型GG 或单突变GA的样本。

实施例3一种评价茶树(+)-儿茶素含量的试剂盒

一、组成

其核苷酸序列如SEQ ID NO：2～3所示的引物、2×Taq PCR Master Mix、 ddH₂O。

其中，引物F：TTGTCCGTGTCCAATCCTTG(SEQ ID NO：2)；

引物R：ATTGACCACCTGGAAGAAGC(SEQ ID NO：3)。

二、使用方法

(1)采用CTAB法提取茶树嫩芽总DNA，并确保每个DNA样品的 A260/A280在1.8～2.0之间，浓度大于100μg/μL；

(2)PCR扩增

PCR体系(10μl)如下：

2×Taq PCR Master Mix	5μl
		引物	各0.5μl
DNAtemplate	1μl
		ddH<sub>2</sub>O	3μl

PCR扩增程序如下：

(3)产物纯化

(4)测序及结果判读

将回收纯化的产物送测序公司进行Sanger法测序，将测序结果与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列进行比对，根据图3所示(加粗并下划线部分为上下游引物)，Scaffold3727:442660位点位于扩增产物的第197个碱基。从统计学上判断，当样本基因型为双突变AA时，茶树中干物质中(+)-儿茶素含量大概率高于正常平均水平的基因型为野生型GG或单突变GA的样本。

实施例4一种评价茶树(+)-儿茶素含量的试剂盒的应用

一、实验方法

用实施例3的试剂盒检测实施例2中的98个茶树样本。

二、实验结果

检测结果与实施例2采用SnaPShot技术平台检测的结果一致，本试剂盒可以用于评价茶树(+)-儿茶素含量。

序列表

<110> 广东省农业科学院茶叶研究所

<120> 一种位于黄酮醇合成酶基因中与茶树(+)-儿茶素含量连锁的分子标记位点及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1001

<212> DNA

<213> Camellia sinensis

<400> 1

ccctacactt tttttttaaa tggtgagttg tccccacact tcaatatcgc acataataca 60

cgttttcatt tcatgtcgtc ttcaatacag aagactcgca ccactattag ctagcctatt 120

atagcccctc ctcttaacta cctctacccc caattcctct ctctctctct ctctctctct 180

ctctctctct ctctctataa aatcaaaaat aaggacttgt ttgtttcatc gtactttgtt 240

ttataggatc aaccttggaa gccacaccta ggcatgagtt gctcaataga ttggccagaa 300

ccaattgtcc gtgtccaatc cttgtccgac agcggcaccc ccaccatccc cgactgctac 360

gtcaaaccgc cacaggaccg gccggtagtc aactcctcct ccaaccacca tgacaccgat 420

gtaaacatcc ccttaattga cctcggagtt ttaacatccg gggacgacaa tactactcta 480

agagcaacca ccatagccca natatccgaa gcgtgtcgtg agtggggctt cttccaggtg 540

gtcaatcacg gagtgagccc ccacttgatg gatcgcgcca gggatatctg gcgcgatttc 600

ttccatcttc caatggaaga aaagcaagtt tatgcgaatt cacccaaaac gtacgaaggg 660

tatggaagtc ggttaggcgt ccagaaaggt gccattctcg actggagcga ctactacttc 720

ttgcactttc ttccgtgctc gcttaaagat cataacaagt ggcccgcctt gccagctcct 780

ctcaggtgaa ttgctttaat ttttaatttt ttaatgtaat aataatatat aaatgttggt 840

gacttgtata ctttaatgta acaaccacca tctatttgga ctttactgat ctaattttat 900

gtattactat attactggtt gtgtttaggg aagtgataga tgagtacgcg gaccacttag 960

taaagctaag tgggcgatta atgaaggttt tgtcaataaa t 1001

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Camellia sinensis

<400> 2

ttgtccgtgt ccaatccttg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Camellia sinensis

<400> 3

attgaccacc tggaagaagc 20

Claims

1.一对检测评价茶树(+)-儿茶素含量的分子标记的引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2～3所示，所述分子标记为位于茶树基因组Scaffold3727:442660的SNP位点，即SEQ ID NO:1的第501个碱基。

2.权利要求1所述引物在评价茶树(+)-儿茶素含量中的应用。

3.一种评价茶树(+)-儿茶素含量的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述检测评价茶树(+)-儿茶素含量的分子标记的引物，所述分子标记为位于茶树基因组Scaffold3727:442660的SNP位点，即SEQ ID NO:1的第501个碱基。

4.一种评价茶树(+)-儿茶素含量的方法，其特征在于，使用权利要求1所述检测评价茶树(+)-儿茶素含量的分子标记的引物，所述分子标记为位于茶树基因组Scaffold3727:442660的SNP位点，即SEQ ID NO:1的第501个碱基。

5.权利要求1所述检测评价茶树(+)-儿茶素含量的分子标记的引物或权利要求3所述试剂盒在茶树(+)-儿茶素含量分子辅助育种中的应用，所述分子标记为位于茶树基因组Scaffold3727:442660的SNP位点，即SEQ ID NO:1的第501个碱基。