CN110468231B

CN110468231B - 一组与茶树(+)-儿茶素含量连锁的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN110468231B
Application number: CN201910834177.4A
Authority: CN
Inventors: 方开星; 吴华玲; 李红建; 姜晓辉; 秦丹丹; 李波; 王秋霜; 潘晨东
Original assignee: Tea Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Tea Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-09-04
Filing date: 2019-09-04
Publication date: 2020-09-18
Anticipated expiration: 2039-09-04
Also published as: CN110468231A

Abstract

本发明公开了一组与茶树(+)‑儿茶素含量连锁的分子标记及其应用，本发明首次发现了位于茶树基因组上Scaffold3614：66549、Scaffold349：3413816和Scaffold1989：2316385位点的与茶树(+)‑儿茶素含量相关的SNP分子标记位点，其基因型与(+)‑儿茶素含量极显著相关。进一步建立了检测各位点的检测方法，可利用其中的一个或几个分子标记位点评价茶树的儿茶素含量，以进一步用于高(+)‑儿茶素((+)‑catechin)茶树资源筛选及分子育种，具有很大的研究价值。

Description

一组与茶树(+)-儿茶素含量连锁的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子遗传育种技术领域，更具体地，涉及一组与茶树(+)-儿茶素含量连锁的分子标记及其应用。

背景技术

茶(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)属于山茶科山茶属茶组，起源于中国的西南地区，距今有5000多年的栽培历史。茶叶与咖啡、可可并称为世界三大无酒精饮料，有着重要的经济价值，并对社会和文化有着重要影响。

茶树新稍中的特征性次级代谢产物儿茶素类化合物是茶叶滋味的主要影响因子。儿茶素类化合物是2-苯基苯并吡喃的衍生物，属类黄酮化合物中的黄烷-3-醇类，占茶叶干重的12％～24％。根据其B环的羟基数目、C环上2,3位同分异构体、C环上3位是否连接没食子基团，儿茶素类化合物可分为C((+)-儿茶素，(+)-catechin)、GC(没食子儿茶素，gallocatechin)、EGC(表没食子儿茶素，epigallocatechin)、EC(表儿茶素，epicatechin)、EGCG(表没食子儿茶素没食子酸酯，epigallocatechin-3-gallate)、GCG(没食子儿茶素没食子酸酯，Galloca techin gallate)、ECG(表儿茶素没食子酸酯，epicatechin-3-gallate)和CG(儿茶素没食子酸酯，Catechin gallate)，它们与茶汤的苦涩味相关。

儿茶素类化合物，又称茶单宁，儿茶酚，是茶叶中黄烷醇类物质的总称，儿茶素类化合物是茶多酚中最重要的一种，约占茶多酚含量的75％到80％，是茶叶中多酚类物质的主体成分，也是茶的苦涩味的来源之一。苦味具有对味觉产生强烈的刺激作用，但食品中苦味与其他各种味道相协调，则可起丰富和改进食品风味的作用。涩味是口腔中所感觉到的一种干燥、收敛性的感觉，是多酚类物质与唾液蛋白和糖蛋白相互作用产生的。儿茶素类化合物，其组合和浓度，不仅构成苦涩味的主体，也是茶汤浓淡、茶叶优劣的主体物。在红茶加工过程中，儿茶素组分还可被多酚氧化酶(PPO)氧化产生茶黄素，对茶汤的滋味和色泽具有显著影响。

茶叶的次生代谢产物不仅影响茶叶品质，还具有多种生理功能，研究表明儿茶素类化合物是茶叶的重要保健成分，具有防治心血管疾病、预防癌症等多种功能，具有抗炎症、抗菌、抗病毒及抗氧化等效用，可通过清除活性氧簇(ROS)、NO或与ROS反应生成稳定化合物的方式有效平衡人体内自由基。茶中的儿茶素类化合物可有利于胆固醇降低。它为还原性多元酚类物质，在水溶液中易被空气氧化，常用作抗氧化剂。

基于儿茶素类化合物对茶叶品质及生理功能的重要性，选育儿茶素类化合物含量特异的茶树资源具有重要意义。目前茶树育种主要通过常规方法进行，从野生群体、杂交后代中选择优良单株进行系统选育。该方法时间长、效率低，使得新品种更新换代慢，不能快速满足大众对新产品的需求。分子标记辅助育种由于可以在苗期对育种材料进行选择，可显著提高育种效率。

发掘与茶树优良性状紧密连锁的分子标记是开展茶树分子标记辅助选择育种的基础，但是目前由于传统QTL定位研究进展的局限，一直未能找到影响儿茶素含量的SNP分子标记位点。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一组与茶树(+)-儿茶素含量连锁的分子标记及其应用。

本发明的第一个目的是提供一个(+)-茶树儿茶素含量数量性状连锁的分子标记组合。

本发明的第二个目的是提供所述分子标记组合或其中的任意一个或两个分子标记在评价茶树(+)-儿茶素含量中的应用。

本发明的第三个目的是提供所述分子标记组合或其中的任意一个或两个分子标记的引物在评价茶树(+)-儿茶素含量中的应用。

本发明的第四个目的是提供检测所述的SNP位点1的引物。

本发明的第五个目的是提供检测所述的SNP位点2的引物。

本发明的第六个目的是提供检测所述的SNP位点3的引物。

本发明的第七个目的是提供一种评价茶树(+)-儿茶素含量的试剂盒。

本发明的第八个目的是提供一种评价茶树(+)-儿茶素含量的方法。

本发明的第九个目的是提供所述分子标记组合或其中的任意一个或两个分子标记、所述引物、或所述试剂盒中的一种或几种在分子辅助育种中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

发明人经过长期探索性的研究发现了三个与(+)-儿茶素连锁的SNP位点分子标记。进一步利用其建立检测该位点的检测方法，可用于评价茶树的(+)-儿茶素含量，以进一步用于资源筛选和分子育种。

因此本发明要求保护一个茶树(+)-儿茶素含量数量性状连锁的分子标记组合，包括SNP位点1、2和3，分别位于茶树基因组Scaffold3614：66549、Scaffold349：3413816和Scaffold1989：2316385。

SNP位点1位于茶树基因组Scaffold3614：66549(即SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的第501个碱基)，该位点为T或者为C，其基因型与茶树干物质中(+)-儿茶素含量极显著相关，通过相关性分析和显著性验证表明，CC基因型样本对应的干物质中(+)-儿茶素含量与TT和CT基因型样本相比具有极显著差异。从统计学上判断，当样本基因型为双突变CC时，茶树中干物质中(+)-儿茶素含量大概率高于正常平均水平的基因型为野生型TT或单突变CT的样本。

SNP位点2位于茶树基因组Scaffold349：3413816(即SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的第501个碱基)，该位点为G或者为A，其基因型与茶树干物质中(+)-儿茶素含量极显著相关，通过相关性分析和显著性验证表明，GG基因型样本对应的茶汤干物质中(+)-儿茶素含量与GA和AA基因型样本相比具有极显著差异。从统计学上判断，当样本基因型为双突变GG时，茶树中干物质中(+)-儿茶素含量大概率高于正常平均水平的基因型为野生型AA或单突变GA的样本。

SNP位点3位于茶树基因组Scaffold1989：2316385(即SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的第501个碱基)，该位点为G或者为A，其基因型与茶树干物质中(+)-儿茶素含量极显著相关，通过相关性分析和显著性验证表明，AA基因型样本对应的茶汤干物质中(+)-儿茶素含量与GA和GG基因型样本相比具有极显著差异。从统计学上判断，当样本基因型为双突变AA时，茶树中干物质中(+)-儿茶素含量大概率高于正常平均水平的基因型为野生型GG或单突变GA的样本。

本发明所述茶树(+)-儿茶素含量具体为茶鲜叶干物质(+)-儿茶素的比例。

所述分子标记组合或其中的任意一个或两个分子标记在评价茶树(+)-儿茶素含量中的应用，也属于本发明的保护范围。

本发明还要求保护所述分子标记组合或其中的任意一个或两个分子标记的引物在评价茶树(+)-儿茶素含量中的应用。

所述的SNP位点1的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2～3所示。

引物F：GATGACACAACCCTCATCTG(SEQ ID NO：2)；

引物R：AATGTATGCCCGGTAAGGAC(SEQ ID NO：3)。

所述的SNP位点2的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5～6所示。

引物F：TCTCTGCACTGTTGTCACTC(SEQ ID NO：5)；

引物R：CACCACACTTTCTTAGAAGG(SEQ ID NO：6)。

所述的SNP位点3的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8～9所示。

引物F：GATTTGACCTTCAACGTGGG(SEQ ID NO：8)；

引物R：TGCAGCGTTTGTGTTTGCAG(SEQ ID NO：9)。

进一步，本发明要求保护一种评价茶树(+)-儿茶素((+)-catechin，C)含量的试剂盒，包括检测所述分子标记组合或其中的任意一个或几个分子标记的试剂。

优选地，试剂为核苷酸序列如SEQ ID NO：2～3所示SNP位点1的引物、核苷酸序列如SEQ ID NO：5～6所示SNP位点2的引物、和/或核苷酸序列如SEQ ID NO：8～9所示SNP位点3的引物。

最优选地，所述试剂盒含有核苷酸序列如SEQ ID NO：2～3所示SNP位点1的引物、核苷酸序列如SEQ ID NO：5～6所示SNP位点2的引物、和/或核苷酸序列如SEQ ID NO：8～9所示SNP位点3的引物、2×Taq PCR Master Mix、ddH₂O。

其使用方法为：

(1)采用CTAB法提取茶树嫩芽总DNA，并确保每个DNA样品的A260/A280在1.8～2.0之间，浓度大于100μg/μl；

(2)PCR扩增

PCR体系(10μl)如下：

2×Taq PCR Master Mix	5μl
		引物	各0.5μl
DNA template	1μl
		ddH<sub>2</sub>O	3μl

PCR扩增程序如下：

(3)产物纯化

将PCR扩增产物进行凝胶电泳，之后使用市售凝胶电泳DNA回收试剂盒进行回收纯化。

(4)测序及结果判读

将回收纯化的产物送测序公司进行Sanger法测序，在Scaffold3614：66549位点，当基因型为双突变CC时，则茶树中(+)-儿茶素含量大概率高于正常平均水平的CT和TT基因型资源。

在Scaffold349：3413816位点。当基因型为双突变GG时，则茶树中(+)-儿茶素含量大概率高于正常平均水平的AA和GA基因型资源。

在Scaffold1989：2316385位点，当基因型为双突变AA时，则茶树中(+)-儿茶素含量大概率高于正常平均水平的GG和GA基因型资源。

同时，本发明要求保护一种评价茶树(+)-儿茶素含量的方法，检测所述分子标记组合或其中的任意一个或两个分子标记的基因型。

优选地，利用所述引物检测所述的分子标记SNP位点的基因型。

所述分子标记组合或其中的任意一个或两个分子标记、所述引物、或所述试剂盒中的一种或几种在分子辅助育种中的应用，也属于本发明的保护范围。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明首次发现了一个茶树(+)-儿茶素含量数量性状连锁的分子标记组合，包括SNP位点1、2和3，分别位于茶树基因组Scaffold3614：66549、Scaffold349：3413816和Scaffold1989：2316385，其基因型与(+)-儿茶素含量极显著相关。

SNP位点1位于茶树基因组Scaffold3614：66549，其基因型与茶树干物质中(+)-儿茶素含量极显著相关，通过相关性分析和显著性验证表明，CC基因型样本对应的干物质中(+)-儿茶素含量与TT和CT基因型样本相比显著极差异。从统计学上判断，当样本基因型为双突变CC时，茶树中干物质中(+)-儿茶素含量大概率高于正常平均水平的基因型为野生型TT或单突变CT的样本。

SNP位点2位于茶树基因组Scaffold349：3413816，其基因型与茶树干物质中(+)-儿茶素含量极显著相关，通过相关性分析和显著性验证表明，GG基因型样本对应的茶汤干物质中(+)-儿茶素含量与GA和AA基因型样本相比具有极显著差异。从统计学上判断，当样本基因型为双突变GG时，茶树中干物质中(+)-儿茶素含量大概率高于正常平均水平的基因型为野生型AA或单突变GA的样本。

SNP位点3位于茶树基因组Scaffold1989：2316385其基因型与茶树干物质中(+)-儿茶素含量极显著相关，通过相关性分析和显著性验证表明，AA基因型样本对应的茶汤干物质中(+)-儿茶素含量与GA和GG基因型样本相比具有极显著差异。从统计学上判断，当样本基因型为双突变AA时，茶树中干物质中(+)-儿茶素含量大概率高于正常平均水平的基因型为野生型GG或单突变GA的样本。

进一步建立检测该位点这三个SNP位点的检测方法，可用于评价茶树的(+)-儿茶素含量，以进一步用于茶树资源筛选及分子育种。这是开展茶树分子标记辅助选择育种的基础，有很大的研究价值。

附图说明

图1为所用群体在不同季节的(+)-儿茶素含量。

图2为Scaffold3614：66549位点与引物示意图，N表示Scaffold3614：66549位置上的待测碱基，加粗并下划线部分为上下游引物。

图3为Scaffold349：3413816，位点与引物示意图，N表示Scaffold349：3413816位置上的待测碱基，加粗并下划线部分为上下游引物。

图4为Scaffold1989：2316385位点与引物示意图，N表示Scaffold1989：2316385位置上的待测碱基，加粗并下划线部分为上下游引物。

图5为样本2-62在Scaffold1989：2316385位点的基因型SNaPshot测序结果(反向互补)。

图6为样本2-77在Scaffold1989：2316385位点的基因型SNaPshot测序结果(反向互补)。

图7为样本2-69在Scaffold1989：2316385位点的基因型SNaPshot测序结果(反向互补)。

图8为样本2-22在Scaffold3614：66549位点的基因型SNaPshot测序结果(反向互补)。

图9为样本2-14在Scaffold3614：66549位点的基因型SNaPshot测序结果(反向互补)。

图10为样本2-24在Scaffold3614：66549位点的基因型SNaPshot测序结果(反向互补)。

图11为样本2-15在Scaffold349：3413816位点的基因型SNaPshot测序结果。

图12为样本2-19在Scaffold349：3413816位点的基因型SNaPshot测序结果。

图13为样本2-66在Scaffold349：3413816位点的基因型SNaPshot测序结果。

图14为Scaffold1989：2316385位点基因型测序图。

图15为Scaffold349：3413816位点基因型测序图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

一、实验样本

采集位于广东省茶树种质资源库(广东，英德，113.3OE,24.3ON)的191份茶树材料，其中广东124份、福建20份、广西15份，浙江9份，湖南6份，云南6份，江西1份，贵州1份，台湾1份。另外8份肯尼亚茶种后代，1份格鲁吉亚种后代，所选材料具有广泛代表性。

所选用的资源随机分布在资源库中。采用双行单株种植，每行4m，行距1.5m，株距35cm。资源库进行常规水肥管理。在2016年年末对资源进行修剪并深坑施基肥，每亩4吨有机肥、0.75吨花生麸和10斤复合肥。2017年春茶及夏茶之后进行修剪并在根外追肥，每亩30斤复合肥和60斤尿素。分别在2017年的3月15日、6月25日和9月28日采摘茶树新梢一芽二叶，制作蒸青样，并按照水浸提法制备茶汤。

二、表型数据分析

1、实验步骤

利用高效液相色谱法对茶汤中与茶树滋味相关的(+)-儿茶素，[(+)-catechin](C)进行检测，参照国标法进行检测。

2、实验结果

儿茶素含量见表1。

表1 不同季度不同资源C((+)-catechin)占干物质的百分比：

群体的(+)-儿茶素含量变异情况见表2和图1。

表2 C性状((+)-儿茶素含量)表型变异：

三、基因型和性状关联分析

1、实验步骤

采用CTAB法提取191个茶树资源嫩芽总DNA，并确保每个DNA样品的A260/A280在1.8～2.0之间，浓度大于100μg/μl。将提取好的DNA样品，检测分别位于“舒茶早”CSS栽培种茶树基因组(http://tpia.teaplant.org/index.html)的SNP位点1(Scaffold3614：66549)、SNP位点2(Scaffold349：3413816)和SNP位点3(Scaffold1989：2316385)的基因型。进行性状和标记的关联分析，关联的显著性水平以P值进行判断，p值小于1.25E-05为显著性水平。

2、实验结果

这三个SNP位点不同季节的P值见表3。

表3：三个SNP位点不同季节的P值

实施例2SNP位点的验证

一、实验方法

将SNP位点1(Scaffold3614：66549)、SNP位点2(Scaffold349：3413816)和SNP位点3(Scaffold1989：2316385)的基因型在另一个含98个种质的群体中进行验证。

1、检测各样本的(+)-儿茶素含量。具体检测方法同实施例1。

2、利用SnaPShot技术平台检测各样本的SNP位点1(Scaffold3614：66549)、SNP位点2(Scaffold349：3413816)和SNP位点3(Scaffold1989：2316385)的基因型。

该方法针对不同突变位点设计不同长度的引物SNaPshot反应后，产物通过电泳分离、五色荧光检测、Gene mapper分析，可在一个测序反应中检测多个SNP位点。应用SNaPshot进行定点的序列分析，其基本原理遵循了DNA直接测序中的双脱氧终止法，所不同的是PCR反应中只有不同荧光标记的ddNTP。由于每个SNP位点的引物3′端都紧靠SNP点，因此每一种引物在聚合酶作用下，根据模板的的序列，只延伸一个核苷酸。然后用先进的荧光检测系统，检测延伸的那个核苷酸的种类。

(1)引物设计

根据Scaffold3614：66549在基因组的位置设计引物并进行合成。其中，Scaffold3614：66549上下游各延伸500bp。其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示(图2，其中N表示Scaffold3614：66549位置上的待测碱基)。

PCR引物：

F：GATGACACAACCCTCATCTG(SEQ ID NO：2)；

R：AATGTATGCCCGGTAAGGAC(SEQ ID NO：3)。

单碱基延伸引物：

gactACTAACTTTACGCCCACGACCCA。

根据Scaffold349：3413816在基因组的位置设计引物并进行合成。其中，Scaffold349：3413816上下游各延伸500bp。其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示(图3，其中N表示Scaffold349：3413816位置上的待测碱基)。

PCR引物：

引物F：TCTCTGCACTGTTGTCACTC(SEQ ID NO：5)；

引物R：CACCACACTTTCTTAGAAGG(SEQ ID NO：6)。

单碱基延伸引物：

actgactgactaAGGATCTAGTCCCTGCATAAATAACA。

根据Scaffold1989：2316385在基因组的位置设计引物并进行合成。其中，Scaffold1989：2316385上下游各延伸500bp。其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示(图4，其中N表示Scaffold1989：2316385位置上的待测碱基)。

PCR引物：

引物F：GATTTGACCTTCAACGTGGG(SEQ ID NO：8)；

引物R：TGCAGCGTTTGTGTTTGCAG(SEQ ID NO：9)。

单碱基延伸引物：

CTGCTGCCACCACCAACACCCACT。

(2)PCR扩增

PCR体系(10μl)如下：

2×Taq PCR Master Mix	5μl
		PrimerMix(按扩增情况配比)	1μl
DNA template	1μl
		ddH<sub>2</sub>O	3μl

PCR扩增程序如下：

(3)PCR产物纯化

使用虾碱酶纯化法进行纯化。虾碱酶MIX(EX-SAP)的主要功能成分为SAP及ExoI.SAP酶，可以将残余dNTPs去磷酸化，ExoI降解游离单链引物。取4μl的PCR产物，加入2μl的EX-SAP酶。具体反应体系如下所示：

消化体系组分	体积(μl)
		ddH<sub>2</sub>O	0.75
SAP(1U/μl)	0.5
		ExoI(5U/μl)	0.15
10*SAPbuffer	0.6
		PCR产物	4
总体积	6

之后在PCR仪上进行消化温育：37℃ 40min，85℃ 5min，4℃ forever。

(4)SNaPshot反应

PCR产物当做模板进行SNaPshot反应。

SNaPshot反应体系如下所示：

试剂	用量(μl)
		SNaPshot Mix	0.5
Pooled PCR Products	3
		Pooled Primers	1
dH<sub>2</sub>O	0.5
		总体积	5

SNaPshot反应程序为：

之后，对SNaPshot产物进行纯化，直接向SNaPshot反应产物中加入2μl的SAP mix，具体反应体系如下：

在PCR仪上进行SNaPshot产物消化反应，反应程序为：37℃ 40min，75℃ 15min，4℃ forever。

(5)上机检测

取2μl消化后的SNaPshot反应产物加入到8μl含有0.4％ LIZ120的去离子甲酰胺中，95℃变性5min，然后放-20℃骤冷，然后上3730XL测序。

(6)结果分析

用GeneMarker分析得到的.fsa结果，导出峰图及表格文件，并统计出每个样品的SNP突变型。

二、实验结果

各样本的儿茶素含量及SNP1、SNP2和SNP3位点的基因型见表4，部分样本SNaPshot测序结果见图5到13。

表4 群体中资源C((+)-catechin)的占干物质的含量及基因型：

显著性分析结果显示，Scaffold3614：66549的基因型与(+)-儿茶素含量极显著相关，相关系数为0.59，p-value为1.24×10^-10，F值(6.91/3.94)为52.1，为隐性突变，CC基因型样本对应的干物质中(+)-儿茶素含量与TT和CT基因型样本相比具有极显著差异。从统计学上判断，当样本基因型为双突变CC时，茶树中干物质中(+)-儿茶素含量大概率高于正常平均水平的基因型为野生型TT或单突变CT的样本。

Scaffold349：3413816的基因型与(+)-儿茶素含量极显著相关，相关系数为0.48，p-value为4.78×10^-7，F值(6.91/3.94)为29.2，为隐性突变，GG基因型样本对应的茶汤干物质中(+)-儿茶素含量与GA和AA基因型样本相比具有极显著差异。从统计学上判断，当样本基因型为双突变GG时，茶树中干物质中(+)-儿茶素含量大概率高于正常平均水平的基因型为野生型AA或单突变GA的样本。

Scaffold1989：2316385的基因型与(+)-儿茶素含量极显著相关，相关系数为0.45，p-value为3.16×10^-6，F值(6.91/3.94)为18.7，为隐性突变，AA基因型样本对应的茶汤干物质中(+)-儿茶素含量与GA和GG基因型样本相比具有极显著差异。从统计学上判断，当样本基因型为双突变AA时，茶树中干物质中(+)-儿茶素含量大概率高于正常平均水平的基因型为野生型GG或单突变GA的样本。

实施例3一种评价茶树(+)-儿茶素含量的试剂盒

一、组成

其核苷酸序列如SEQ ID NO：2～3所示的检测SNP位点1的引物、其核苷酸序列如SEQ ID NO：5～6所示的检测SNP位点2的引物、其核苷酸序列如SEQ ID NO：8～9所示的检测SNP位点3的引物、2×Taq PCR Master Mix、ddH₂O。

其中，SNP位点1引物F：GATGACACAACCCTCATCTG(SEQ ID NO：2)；

SNP位点1引物R：AATGTATGCCCGGTAAGGAC(SEQ ID NO：3)；

SNP位点2引物F：TCTCTGCACTGTTGTCACTC(SEQ ID NO：5)；

SNP位点2引物R：CACCACACTTTCTTAGAAGG(SEQ ID NO：6)；

SNP位点3引物F：GATTTGACCTTCAACGTGGG(SEQ ID NO：8)；

SNP位点3引物R：TGCAGCGTTTGTGTTTGCAG(SEQ ID NO：9)；

二、使用方法

(2)PCR扩增

分别使用其核苷酸序列如SEQ ID NO：2～3、SEQ ID NO：5～6和SEQ ID NO：8～所示的检测引物检测SNP位点1、SNP位点2和SNP位点3。

PCR体系(10μl)如下：

PCR扩增程序如下：

(3)产物纯化

(4)测序及结果判读

将SEQ ID NO：2～3所示引物的扩增产物回收纯化送测序公司进行Sanger法测序，将测序结果与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列进行比对，根据图2所示(加粗并下划线部分为上下游引物)，Scaffold3614：66549位点位于扩增产物的第137个碱基。从统计学上判断，当样本基因型为双突变CC时，茶树中干物质中(+)-儿茶素含量大概率高于正常平均水平的基因型为野生型TT或单突变CT的样本。

将SEQ ID NO：5～6所示引物的扩增产物回收纯化送测序公司进行Sanger法测序，将测序结果与SEQ ID NO：4所示核苷酸序列进行比对，根据图3所示(加粗并下划线部分为上下游引物)，Scaffold349：3413816位点位于扩增产物的第160个碱基。从统计学上判断，当样本基因型为双突变GG时，茶树中干物质中(+)-儿茶素含量大概率高于正常平均水平的基因型为野生型AA或单突变GA的样本。

将SEQ ID NO：8～9所示引物的扩增产物回收纯化送测序公司进行Sanger法测序，将测序结果与SEQ ID NO：4所示核苷酸序列进行比对，根据图4所示(加粗并下划线部分为上下游引物)，Scaffold1989：2316385位点位于扩增产物的第175个碱基。从统计学上判断，当样本基因型为双突变AA时，茶树中干物质中(+)-儿茶素含量大概率高于正常平均水平的基因型为野生型GG或单突变GA的样本。

实施例4一种评价茶树(+)-儿茶素含量的试剂盒的应用

一、实验方法

用实施例3的试剂盒检测实施例2中的98个茶树样本。

二、实验结果

检测结果与实施例2采用SnaPShot技术平台检测的结果一致，本试剂盒可以用于评价茶树(+)-儿茶素含量。SNP3的部分样本测序峰图如图14所示，SNP2的部分样本测序峰图如图15所示。

序列表

<110> 广东省农业科学院茶叶研究所

<120> 一组与茶树(+)-儿茶素含量连锁的分子标记及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1001

<212> DNA

<213> Camellia sinensis

<400> 1

gagtcatggg tttcttaaat ttctctaaaa aatatttagg tggtgactct gtatctggca 60

aaatagtcca tttttggcaa tttgattcaa aatcagtttt ccaacatatt tgccgaattg 120

ggactttttg gtgattatct atttcacatt gcacatgtga aatcagattc agaaccgtgg 180

gagtccgata ctgtagggct tattcgtctt ccgaaaaggg gcatgcaaag tcgaactaca 240

agtcccctgg ggaggatgga ttgcaaaatt accgtacaca gtagcaatcc cgtctttaaa 300

ggcgtacttt accaactgat ggaccattga tgacacaacc ctcatctgat gtagccaggg 360

tcttcccagt agtagattga aagtgtccga aacatccatg acatagaatt taacctgatg 420

ctcagacggg ccgagtagga tatggctctt aaacattacc atgacatctt ggctcgtatt 480

gtcatataag cctaaacggc ntgggtcgtg ggcgtaaagt tagtcggcct cacaccgatg 540

gcataggcgg tccttaccgg gcatacatta atcgccgatc cgttatctac caacaccact 600

ggaatccact ttttctgact ttccagcgtt acatataagg gccaattgtg gttagcaccc 660

tcaggtggta actctttatc tataaaagat atcactggcg taacatcccc ggatgtaacc 720

aatgatacca attggtcagc agtggtttcg atagggagtt tggtccggtt cattgcctct 780

agcagcagtg cctgtctatg ctcccgagat gccatgatta gcccccagat tgatatgtcg 840

gcctgaatct tcttaagctg tttcaagacc aggttttctt caacatcctt ctcttttgat 900

ttctcgaccc ccactgtcct tgatatatgc catcttttag ggttatcacc cattggtacc 960

cctttcggtc tagattaccc tgactttaag gtctccttct c 1001

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cttcatctcc accacacttc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aatgtatgcc cggtaaggac 20

<210> 4

<211> 1001

<212> DNA

<213> Camellia sinensis

<400> 4

ataatctttt tgtacttgtt caggtggaat gaagcaatca accgagagtc caggaacatt 60

gaatgctagg tcgtcgatct tccaagtctc ctccatccgt gtgattgctg tgcccgctct 120

cagattgtcc ccaaatcttg agatgatcac acttgattgg ccagaatgcg cgatcatcgt 180

gccctccacc atccgatagt cctcgatttt cgtgcccatg gtggtctccc aataggtagg 240

gtaggttccg ggggactgga ttctggtgag gtaagagtcc tctaaataca ctagcagacc 300

acttctttgg ctgaagtaac caaacatgac atgcttgatc atctctgcac tgttgtcact 360

ccgatcggct aggtccgtct gatccgcgga caatttcaac acgaagcaat cgacgctcaa 420

gattcgtttt tcgcccacgt attgtgctag ggaaaacaca gccgatacag ccacaggatc 480

tagtccctgc ataaataaca ntatgttttt tacatagagg aaaataatat ctgtcacatg 540

aattctactc cattttttaa ccttctaaga aagtgtggtg aaaaaaatat taaatccatt 600

gggtaaaata taacagtctt taacataaca atatggcgaa ctatacattc aattctagaa 660

aatgtctcat ttttatagat ttttatgaaa gggatcaacc ttcttttttt ttattggaag 720

cactatataa ataatgtcaa atagttttcc aaacttatct aaataaagtt ttaataattt 780

taatccacac attttgaatt taatttactt atttttagta gataacatta ccacagtcaa 840

aaagagtgcc aacatgaacc tccagcacac ttgaagagca cttgacgatc atattgggaa 900

agttaccagc cagcactccc aaaaaaaaaa aaagaaaaaa agataaaaga ttaaaaaaat 960

tagtaaaaag tgactttaca aaaaggaata ttccacctct g 1001

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tctctgcact gttgtcactc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caccacactt tcttagaagg 20

<210> 7

<211> 1001

<212> DNA

<213> Camellia sinensis

<400> 7

aattaataaa gacttgaaca gtgaggagga caatggagag agggatttca tggaggagtt 60

tcagagaatt agcttatttg atgagttgtt tattttattt tattttattt ttacttacag 120

tggtagatgc atcccatccc catcatcgtc ccaatcgtta ttgccatgat tttcatgttt 180

catcaggtgt tgcttctctt gtttgtgctt ccaactttcc atcctctctt tccaagctac 240

gctgccatag ccataagcag ccaaatcctt ggaaggatcc atggatcgag attgcactgc 300

aaaaatgggc aggggattat catacagatt tgaccttcaa cgtgggaggg aggggagata 360

aaaggaaacc atagcgtagc gtagcatagc ataggaaagc aaagcagaat taattaaaat 420

taccgggtag gctaggatct gagaaaggaa gtggatgaat ccttctgctg ctgctgctgc 480

tgccaccacc aacacccact ntcgatggaa ccaatgcatg ttgttcagga ggaatatcat 540

catccacctg caaacacaaa cgctgcaggt ctcaggctcc tgctgtctga aatttgcata 600

caatgatttt tagaattcca cagcaacagc aacagcaaca gcaacggtag tcgtaccata 660

tggccgttgg taaggagggg aagttgaggc aaagtattac tattattagt attgtgaaag 720

acatgtgggt gcaattcgga tgagtcgaaa atatggccat agctcatgtg cgaaccaccg 780

tgaccgtgaa gtatagcctc tgaacgagca agagagtgct gctgtgaatc cagtagttta 840

gcactgtcac gaaccctccc ttcaaaattg aactcgtttt ccacatcgtc aatgtcatct 900

tcttcttcat caccctccac tctagcacac cctgcatcat tcatccatcc attgatcatc 960

cgggtagaac taacaaattt taacaaatat cgaatccccc c 1001

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gatttgacct tcaacgtggg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgcagcgttt gtgtttgcag 20

Claims

1.一组检测评价茶树(+)-儿茶素含量数量性状分子标记的引物组合，其特征在于，包括用于检测SNP位点1、2和3的引物1、2和3；

其中，引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO：2～3所示，所检测的SNP位点1位于茶树基因组Scaffold3614：66549，即SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的第501个碱基，当样本基因型为双突变CC时，茶树中干物质中(+)-儿茶素含量大概率高于正常平均水平的基因型为野生型TT或单突变CT的样本；

引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO：5～6所示，所检测的SNP位点2位于茶树基因组Scaffold349：3413816，即SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的第501个碱基，当样本基因型为双突变GG时，茶树中干物质中(+)-儿茶素含量大概率高于正常平均水平的基因型为野生型AA或单突变GA的样本；

引物3的核苷酸序列如SEQ ID NO：8～9所示，所检测的SNP位点3位于茶树基因组Scaffold1989：2316385，即SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的第501个碱基，当样本基因型为双突变AA时，茶树中干物质中(+)-儿茶素含量大概率高于正常平均水平的基因型为野生型GG或单突变GA的样本。

2.权利要求1所述引物组合在评价茶树(+)-儿茶素含量中的应用。

3.一种评价茶树(+)-儿茶素含量的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述检测评价茶树(+)-儿茶素含量的分子标记的引物组合中的一个或多个引物，所述引物为检测SNP位点1、2和3的引物1、2和3；

4.一种评价茶树(+)-儿茶素含量的方法，其特征在于，使用权利要求1所引物组合，所述引物组合包括用于检测SNP位点1、2和3的引物1、2和3；

5.权利要求1所述检测评价茶树(+)-儿茶素含量的分子标记的引物组合或权利要求3所述试剂盒在茶树(+)-儿茶素含量分子辅助育种中的应用。