CN107164459B

CN107164459B - 一种鉴定和筛选高儿茶素指数茶树的功能标记及其应用

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Publication number: CN107164459B
Application number: CN201611115275.5A
Authority: CN
Inventors: 金基强; 陈亮; 姚明哲; 马建强; 马春雷
Original assignee: Tea Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Tea Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2016-12-07
Filing date: 2016-12-07
Publication date: 2020-07-07
Anticipated expiration: 2036-12-07
Also published as: CN107164459A

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种茶树类黄酮3′,5′‑羟化酶基因功能标记，该功能标记的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示。本发明还提供茶树类黄酮3′,5′‑羟化酶基因功能标记在鉴定和筛选具有高儿茶素指数茶树中的应用以及应用方法。本发明中的功能标记运用于分子标记辅助选择，能快速准确地鉴定和筛选出具有高儿茶素指数（CI值>2.5）的茶树资源。

Description

一种鉴定和筛选高儿茶素指数茶树的功能标记及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种鉴定和筛选高儿茶素指数茶树的功能标记及其应用、应用方法。

背景技术

儿茶素是2-苯基苯并吡喃的衍生物，根据儿茶素B环的羟基数目、C环上2,3位同分异构体、C环上3位是否连接没食子酸等可以划分为若干种组分。根据儿茶素B 环的羟基数目，儿茶素主要可以分为B环二羟基儿茶素和三羟基儿茶素，其中表没食子儿茶素(EGC) 和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG) 属于B 环三羟基儿茶素，而表儿茶素(EC) 和表儿茶素没食子酸酯(ECG) 属于B环二羟基儿茶素。在红茶发酵过程中，每个茶黄素分子的形成需要1个二羟基儿茶素和1个三羟基儿茶素，即儿茶素指数CI（即二羟基儿茶素/三羟基儿茶素）值为1的鲜叶原料最有利于茶黄素的形成。国外已有多项研究发现，儿茶素指数CI值与红茶品质密切相关。

但专利申请人研究发现，与肯尼亚等优质红茶主产国家相比，我国不乏有高儿茶素资源，但这些资源所含的儿茶素EGCG占比偏大（约60%），CI值多在0.2-0.5（Jin et al.,2014）。近期，在贵州的少量茶树资源中，发现了CI值高达5的茶树。利用高儿茶素指数的资源与其它高儿茶素总量的资源进行杂交，有望培育出儿茶素总量高、儿茶素组分比例合适的优质红茶品种，高儿茶素指数茶树资源对改良我国茶树品种有较大的潜在应用价值。但迄今为止，国内外茶叶儿茶素含量的鉴定大都采取生化测定方法，该方法受茶树发育时期和生存环境影响、且需要一定量的茶树叶片，无法做到对野外资源的准确鉴定和杂交子代个体的早期鉴定。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种基于茶树类黄酮3′,5′-羟化酶基因上游调控区域序列存在的插入缺失（InDel）突变开发的分子标记，及其应用在鉴定和筛选高儿茶素指数茶树中的技术方案。高儿茶素指数茶树指的是CI值大于2.5的特异茶树材料。

所述的一种茶树类黄酮3′,5′-羟化酶基因功能标记，其特征在于该功能标记的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示。

所述的一种茶树类黄酮3′,5′-羟化酶基因功能标记在鉴定和筛选具有高儿茶素指数茶树中的应用，其特征在于该功能标记的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示,所述的高儿茶素指数茶树指的是CI值大于2.5的特异茶树材料。

所述的一种茶树类黄酮3′,5′-羟化酶基因功能标记在鉴定和筛选具有高儿茶素指数茶树中的应用方法，其特征在于包括以下步骤：

利用功能标记对各茶树材料中的F3′5′H基因起始密码子ATG上游837bp至上游686bp的DNA片段进行PCR扩增和琼脂糖凝胶分析，如扩增产物显示为152bp的片段则该茶树确定为常规资源，如扩增产物显示为138bp的片段则该茶树确定为高儿茶素指数茶树。

所述的应用方法，其特征在于所述的PCR扩增的体系和反应程序为：PCR反应体系：32 µL ddH₂O，2 µL DNA，5 µL 10×PCR Buffer，4 µL 25 mM MgCl₂，5 µL 2 Mm dNTP，1µLKOD-Plus-Neo酶，10 µM 的上、下游引物各3 µL；PCR扩增程序为：94℃ 2 min，然后进行以下循环，94℃ 15 sec，56℃ 25 sec，68℃ 5 sec，共 35个循环；最后68℃延伸2min；扩增产物在3%的琼脂糖胶电泳分离。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：将本发明中的功能标记运用于分子标记辅助选择，能快速准确地鉴定和筛选出具有高儿茶素指数（CI值>2.5）的茶树资源。利用高儿茶素指数的资源与其它高儿茶素含量的资源进行杂交，可规模化创制儿茶素总量高、儿茶素指数CI值接近于1的茶树育种材料，从而加快优质红茶茶树品种的育成步伐。

附图说明

图1是福鼎大白茶和兴义6号单株1类黄酮3′,5′-羟化酶基因F3′5′H上游调控区域序列的比对谱图；

图1中：FDDB为福鼎大白茶，XY6a为兴义6号单株1。

图2 是福鼎大白茶和兴义6号单株1PCR产物的比对谱图；

图2中：M为Marker；1和2分别为福鼎大白茶和兴义6号单株1用引物对1和2扩增的PCR产物的条带，分别为152bp和138bp。

图3是用功能标记InDel-F3′5′H对27份茶树资源的扩增结果；

图3中：M为Marker；1-19依次为福鼎大白茶、龙井43、云抗10号、钟山雷电茶、昌宁4号、兴义4号、明通群体、凫早2号、景谷老仓群体、迎霜、万源4号、河洲茶、贺县种、城步洞茶、锡茶49、贵州大茶树、巴东长纹岩群体、藤茶和白石牙茶，PCR产物条带大小为152bp，为常规资源；20-27依次为兴义6号单株1、兴义6号单株2、兴义6号单株3、纳雍古菁茶1号、纳雍古菁茶6、纳雍古菁茶22号、纳雍古菁茶28号和纳雍古菁茶48号，PCR产物条带大小为138bp，为CI值大于2.5的高CI资源。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细的说明。

下述实施例中所用的试剂，如无特殊说明，可以从常规生化试剂商店购买得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1 F3′5′H上游调控区域特异等位基因差异序列的发现、引物对及功能标记InDel-F3′5′H的开发

1. 供试材料

选择福鼎大白茶和兴义6号单株1为研究材料。

2. 儿茶素含量测定

采摘茶树春季新梢的一芽二叶，采用120℃热风干燥5min及时固样，75℃烘至足干低温保存。待测定时用机械磨碎，过40目筛后低温保存，备用。称取0.2g样品（精确到0.0001g），置于10mL离心管中。加入70℃预热的70%甲醇溶液5mL，混匀后70℃水浴。水浴10min，中间揺匀2-3次。3,500r/min离心10min，转移上清液。重复加入70℃预热的70%甲醇溶液5mL、再浸提一次，合并两次收集的上清液，定容至10mL。移取2ml提取液置于容量瓶中，用稳定液（5%的10mg/mL EDTA溶液、5%的10mg/mL抗坏血酸溶液、10%的乙腈）定容至10ml，混匀后用0.45μm的滤膜过滤。采用高压液相色谱法（HPLC）进行检测，以外标法对生物碱和儿茶素进行定性和定量分析。液相色谱测定条件：C12色谱柱4.6 mm×250 mm (4μm，广州菲罗门)；流动相A为0.5％甲酸，流动相B为乙腈，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长280nm，进样量10μL，梯度洗脱：流动相B在16min内由6.5％线性梯度变化到16％，第16min到20min由16％线性梯度变化到25％，保持5min，回到初始状态，再平衡5min。测定结果表明，与福鼎大白茶相比，兴义6号单株1的三羟基儿茶素含量很低，仅为18.1mg/g（表1）。兴义6号单株1的儿茶素指数CI为5.58，远高于福鼎大白茶。

表1 2份茶树材料春茶儿茶素性状的差异（mg/g）

材料名称	EGC	EGCG	EC	ECG	三羟基儿茶素（EGC+EGCG）	二羟基儿茶素（EC+ECG）	儿茶素指数CI
								福鼎大白茶	19.2	93.7	8.8	31.4	112.9	40.2	0.38
兴义6号单株1	3.1	15.0	6.6	95.5	18.1	102.1	5.58

3. 基因组DNA的提取

取1g新鲜嫩梢，加液氮研磨至粉末状。将0.2g粉末置入1.5mL离心管，加700μLCTAB提取液，充分混匀后65℃下水浴1h，每20min揺匀一次。加入等体积氯仿/异戊醇（24：1），混匀后静置2min。室温下14,000g离心10min，取上清。加入等体积预冷的异丙醇，-20℃静置1h。14,000g离心10min，弃上清。加入300μL高盐溶液，65℃温育30min至沉淀溶解。室温下10,000g离心10min，取上清。加入1/10体积预冷的NaAc（pH 5.2），2/3体积预冷的异丙醇，充分混合，-20℃放置30min。14,000g离心5min，弃上清。70%乙醇洗涤沉淀1次，无水乙醇洗涤一次。放在超净工作台上吹干30min，溶于200μL灭菌水中，-20℃保存。

4. PCR测序及序列分析

设计特异引物，扩增各茶树材料中的F3′5′H起始密码子ATG上游1417 bp至下游892 bp的DNA片段，引物由软件Primer5.0设计，序列如下：

上游引物（如SEQ ID No.3所示）：5′－TGAAAGCGGTTTTTCGTGTG－3′，

下游引物（如SEQ ID No.4所示）：5′－GTGCCTTGATGTTGGTCGTG－3′；

PCR反应体系：32 µL ddH₂O，2 µL DNA，5 µL 10×PCR Buffer，4 µL 25 mM MgCl₂，5 µL 2 Mm dNTP，1µL KOD-Plus-Neo酶，10 µM 的正、反向引物各3 µL。PCR扩增程序为：94℃ 2 min，然后进行以下循环，94℃ 15 sec，54 25 sec，68℃ 1 min，共 35个循环；最后68℃延伸7 min。PCR扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳，在紫外灯下观察并切胶回收，连入载体、转化，菌液PCR筛选阳性克隆测序。分析发现两份材料间1417bp的上游调控区域（TRR）中有多个单核苷酸突变（SNP）和1个14bp的插入缺失（InDel）变异（图1）。

5. 功能标记InDel-F3′5′H的开发

根据两材料间14bp的插入缺失设计特异引物，扩增各茶树材料中的F3′5′H基因起始密码子ATG上游837bp至上游686bp间的DNA片段，引物由软件Primer5.0设计。序列如下：

上游引物（如SEQ ID No.1所示）：5′－ACCAACACAGTCCCCGTTGT－3′，

下游引物（如SEQ ID No.2所示）：5′－GTAATTGTGGTGACAGTGA－3′；

利用所述的引物序列分别进行PCR扩增和琼脂糖凝胶分析。

PCR反应体系：32 µL ddH₂O，2 µL DNA，5 µL 10×PCR Buffer，4 µL 25 mM MgCl₂，5 µL 2 Mm dNTP，1µL KOD-Plus-Neo酶，10 µM 的正、反向引物各3 µL。

PCR扩增程序为：94℃ 2 min，然后进行以下循环，94℃ 15 sec，56℃ 25 sec，68℃ 5 sec，共 35个循环；最后68℃延伸2min。PCR扩增产物在3%的琼脂糖胶电泳分离。

分析发现，福鼎大白茶的电泳条带大小为152bp，而兴义6号单株1电泳条带大小为138bp，两个材料的PCR扩增产物可用3%的琼脂糖胶电泳检测到明显的差异（图2）。利用功能标记InDel-F3′5′H可以检测茶树资源F3′5′H基因上游调控区域的序列变异，并可把含高儿茶素指数的茶树材料筛选出来。

实施例2 功能标记InDel-F3′5′H的应用

1. 供试材料

本实验所研究的材料列于表2中，包括27份茶树资源，于8月份采集一芽二叶新梢进行DNA提取和儿茶素性状鉴定。

表2 27份茶树资源的PCR扩增结果及其儿茶素指数值

编号	资源名称	儿茶素指数（CI）值	PCR扩增产物大小（bp）
				1	福鼎大白茶	0.432	152
2	龙井43	0.452	152
				3	云抗10号	0.542	152
4	钟山雷电茶	0.417	152
				5	昌宁4号	0.921	152
6	兴义4号	0.332	152
				7	明通群体	0.247	152
8	凫早2号	0.249	152
				9	景谷老仓群体	0.668	152
10	迎霜	0.196	152
				11	万源4号	0.388	152
12	河洲茶	0.248	152
				13	贺县种	0.319	152
14	城步洞茶	0.241	152
				15	锡茶49	0.269	152
16	贵州大茶树	0.289	152
				17	巴东长纹岩群体	0.308	152
18	藤茶	0.286	152
				19	白石牙茶	0.267	152
20	兴义6号单株1	3.966	138
				21	兴义6号单株2	2.796	138
22	兴义6号单株3	3.647	138
				23	纳雍古菁茶1号	3.069	138
24	纳雍古菁茶6号	6.771	138
				25	纳雍古菁茶22号	6.880	138
26	纳雍古菁茶28号	5.916	138
				27	纳雍古菁茶48号	3.407	138

2. 功能标记对不同茶树资源F3′5′H基因的基因型检测

利用功能标记InDel-F3′5′H对27份材料的进行基因型检测。DNA提取、PCR扩增体系、程序和琼脂糖凝胶条件同实施例1。结果如图3所示，其中在材料1—19的PCR产物大小为152bp，材料20—27的PCR产物大小为138bp。

3. 27份茶树材料的儿茶素指数CI值鉴定

儿茶素鉴定方法高效液相色谱法同实施例1所述。27份材料中，PCR产物大小为152bp的19份材料儿茶素指数CI值均低于1，平均为0.37±0.18，PCR产物大小为138bp的8份材料儿茶素指数CI值均高于2.5，平均为4.56±1.69，两类材料间的儿茶素指数CI值具有极显著差异（P<0.0001），InDel-F3′5′H可以作为鉴定和筛选高儿茶素指数茶树的功能标记。

本文中所描述的具体实施例仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院茶叶研究所

<120> 一种鉴定和筛选高儿茶素指数茶树的功能标记及其应用

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

accaacacagtccccgttgt 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gtaattgtgg tgacagtga 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

tgaaagcggtttttcgtgtg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gtgccttgatgttggtcgtg 20

Claims

1.一种茶树类黄酮3′,5′-羟化酶基因扩增引物，其特征在于该扩增引物的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示。

2.一种茶树类黄酮3′,5′-羟化酶基因扩增引物在鉴定和筛选具有高儿茶素指数茶树中的应用，其特征在于该扩增引物的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ IDNo.2所示，所述的高儿茶素指数茶树指的是CI值大于2.5的特异茶树材料。

3.一种茶树类黄酮3′,5′-羟化酶基因扩增引物在鉴定和筛选具有高儿茶素指数茶树中的应用方法，其特征在于包括以下步骤：

利用扩增引物对各茶树材料中的F3′5′H基因起始密码子ATG上游837bp至上游686bp的DNA片段进行PCR扩增和琼脂糖凝胶分析，所示扩增引物的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示，如扩增产物显示为152bp的片段则该茶树确定为常规资源，如扩增产物显示为138bp的片段则该茶树确定为高儿茶素指数茶树。

4.如权利要求3所述的应用方法，其特征在于所述的PCR扩增的体系和反应程序为：PCR反应体系：32 µL ddH₂O，2 µL DNA，5 µL 10×PCR Buffer，4 µL 25 mM MgCl₂，5 µL 2 mMdNTP，1µL KOD-Plus-Neo酶，10 µM 的上、下游引物各3 µL；PCR扩增程序为：94℃ 2 min，然后进行以下循环，94℃ 15 sec，56℃ 25 sec，68℃ 5 sec，共 35个循环；最后68℃延伸2min；扩增产物在3%的琼脂糖胶电泳分离。