CN106011228A

CN106011228A - 一种鉴定枸杞品种的est-ssr核心引物组及其鉴定方法和应用

Info

Publication number: CN106011228A
Application number: CN201610250639.4A
Authority: CN
Inventors: 王瑛; 曾少华; 胡伟明; 黄珊珊
Original assignee: South China Botanical Garden of CAS
Current assignee: South China Botanical Garden of CAS
Priority date: 2016-04-20
Filing date: 2016-04-20
Publication date: 2016-10-12
Anticipated expiration: 2036-04-20
Also published as: CN106011228B

Abstract

本发明公开了一种鉴定枸杞品种的EST‑SSR核心引物组及其鉴定方法和应用。本发明通过筛选黑果枸杞和宁夏枸杞的EST序列，开发大量的SSR分子标记，建立了包括10个标记的符合SSR标记荧光检测技术体系，用于枸杞品种和物种鉴定。这10个标记多态性好，扩增稳定，扩增结果清晰，重复性好，可以用于大规模检测枸杞种苗的真伪、种苗的纯度，可以为种苗市场的规范化提供技术基础，有利于中药枸杞的开发利用。

Description

一种鉴定枸杞品种的EST-SSR核心引物组及其鉴定方法和应用

技术领域：

本发明属于分子标记与药材鉴定领域，具体涉及一种鉴定枸杞品种的EST-SSR核心引物组及其鉴定方法和应用。

背景技术：

枸杞是茄科(Solanaceae)枸杞属(Lycium L.)落叶灌木植物；是我国传统的名贵中药材，润肺、清肝、滋肾、益气、生精、助阳、补虚劳、强筋骨、祛风、明目等；主要药用成分枸杞多糖(polysaccharide，LBP)具有促进免疫、抗衰老、抗肿瘤、清除自由基、抗疲劳、抗紫外辐射、抗辐射、保肝、神经保护作用等。宁夏枸杞分布最为广泛，在我国西、北方地区(如新疆、西藏、青海、甘肃、内蒙古、宁夏、陕西、山西、河北等)广泛分布，对干旱、盐碱、低温具有很强的适应能力。黑果枸杞为藏医用药，藏医称做“旁玛”，是一种盐生植物。在传统藏药中以成熟的紫黑色果实入药，用于清心热和治疗妇科疾病。黑果枸杞和宁夏枸杞同属于枸杞属，亲缘关系较近，经测定基因组序列一致性高，基于两种枸杞开发的SSR标记在二者中的通用性强。

枸杞在中国有超过4000年的栽培历史，在宁夏的栽培历史也超过了600年。随着市场需求和栽培规模的扩大，农艺专家们选育出了一批优异的枸杞品种，从最早的大麻叶、小麻叶，到近些年选育的宁杞一号、宁杞四号、宁杞七号、蒙杞一号、中科绿川一号等等。育种目标也从单纯的追求产量，提升到对于枸杞质量、抗病性等农艺性状上来。随着枸杞品种的增多，在枸杞市场上不可避免地出现了品种混杂、以次充好等欺瞒杞农和消费者的情况，所以枸杞品种鉴定工作迫在眉睫。传统上，我们利用一些形态学标记进行品种鉴定，例如叶片大小、果实大小和单节坐果数量等。但是对于枸杞品种而言，比较易于区分的性状集中在花期果期。对于幼苗期或者市场上的枸杞商品(例如干果和饮品等)的鉴定，形态学鉴定则无能为力。这就迫切需要一种不依赖于枸杞形态学标记进行枸杞品种鉴定的“金标准”。

随着分子遗传学的不断发展，分子标记进入物种/品种鉴定领域。DNA标记在基因组中丰度高且分布均匀，遗传多态性高，并且不受环境影响。并且DNA比较稳定，从新鲜的组织材料、干燥的组织材料，即使加工之后的商品成品(如果汁果酱)和成药(如中药丸剂等)中都可以提取DNA用于物种/品种鉴定。酶切、PCR等分子生物学技术和生物信息学的发展，更使得DNA分子标记在开发和使用中成本更低更为快捷，检测手段更高效更加自动化，稳定性方面也极大提高。因此，DNA分子标记已经作为主流标记技术，应用于物种/品种鉴定的“金标准”。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种能鉴定中药枸杞品种的EST-SSR核心引物组，该EST-SSR核心引物组可以用于枸杞品种鉴定、种苗纯度鉴定，以及枸杞加工产品鉴定。

本发明的鉴定枸杞品种的EST-SSR核心引物组，其特征在于，包括10对EST-SSR核心引物对和通用M13引物：

(1)、LrESSR022：

F:5’-GTAAAACGACGGCCAGTCAAGTCATCACGTGGACGC-3’(如SEQ ID NO.1所示)；

R:5’-CTCTGAAACGAGAAGGACGG-3’(如SEQ ID NO.2所示)；

(2)、LrESSR243

F:5’-GTAAAACGACGGCCAGTATGGTTGCCTTCACTTGTCC-3’(如SEQ ID NO.3所示)；

R:5’-CAACCACTAGCCAAAGCACA-3’(如SEQ ID NO.4所示)；

(3)、LrESSR244

F:5’-GTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCTGCAAAGGGTTT-3’(如SEQ ID NO.5所示)；

R:5’-TCCTTTCACCCAGTCTCACC-3’(如SEQ ID NO.6所示)；

(4)、LrESSR040

F:5’-GTAAAACGACGGCCAGTCGAAACCTTCATACCAAACACA-3’(如SEQ ID NO.7所示)；

R:5’-AGGAAAGCAAGCAATCATCA-3’(如SEQ ID NO.8所示)；

(5)、LrESSR130

F:5’-GTAAAACGACGGCCAGTCAGATAGCAACGGAGCAGTG-3’(如SEQ ID NO.9所示)；

R:5’-GATTTGTTGCTGAATTGCGA-3’(如SEQ ID NO.10所示)；

(6)、LrESSR107

F:5’-GTAAAACGACGGCCAGTTGCCCTTATTTTCAAATGGC-3’(如SEQ ID NO.11所示)；

R:5’-AGGGTGATTGATGGTAACGG-3’(如SEQ ID NO.12所示)；

(7)、LrESSR059

F:5’-GTAAAACGACGGCCAGTTTGTCAGGGGCTATCCAGTC-3’(如SEQ ID NO.13所示)；

R:5’-CTAAACCTCGCATTTCCCAA-3’(如SEQ ID NO.14所示)；

(8)、LrESSR179

F:5’-GTAAAACGACGGCCAGTCCTTTTTCTCTTACAGGGCTTG-3’(如SEQ ID NO.15所示)；

R:5’-AGCTTAGGCGTGCAGTTCAT-3’(如SEQ ID NO.16所示)；

(9)、LrESSR142

F:5’-GTAAAACGACGGCCAGTCTGATCTGCTCCTTGACACG-3’(如SEQ ID NO.17所示)；

R:5’-TGATTTCAAGCCAATCAACG-3’(如SEQ ID NO.18所示)；

(10)、LrESSR203

F:5’-GTAAAACGACGGCCAGTCTGGGGGAAAGTGAAACAGA-3’(如SEQ ID NO.19所示)；

R:5’-ACGATCATATCTTGCGTGGT-3’；(如SEQ ID NO.20所示)；

(11)、通用M13引物

5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’。(如SEQ ID NO.20所示)；

本发的第二个目的是提供一种鉴定枸杞品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：

提取待测样品基因组DNA，以该基因组DNA为模板，用上述EST-SSR核心引物组进行PCR扩增反应，所述的PCR扩增反应包括4个PCR反应，具体如下：

I：以基因组DNA为模板，以LrESSR022、LrESSR243和LrESSR244的上下游引物以及通用M13引物作为扩增引物，在同一个反应体系中进行多重PCR反应，得到扩增产物；

II：以基因组DNA为模板，以LrESSR040、LrESSR130和LrESSR107的上下游引物以及通用M13引物作为扩增引物，在同一个反应体系中进行多重PCR反应，得到扩增产物；

III：以基因组DNA为模板，以LrESSR059和LrESSR179的上下游引物以及通用M13引物作为扩增引物，在同一个反应体系中进行多重PCR反应，得到扩增产物；

IV：以基因组DNA为模板，以LrESSR142和LrESSR203的上下游引物以及通用M13引物作为扩增引物，在同一个反应体系中进行多重PCR反应，得到扩增产物；

由此得到不同长度的扩增引物，再对不同长度的扩增引物进行分型，鉴定待测样品的品种。

本发明的第三个目的是上述EST-SSR核心引物组在鉴定枸杞品种中的应用。

本发明通过筛选黑果枸杞和宁夏枸杞的EST序列，开发大量的SSR分子标记，建立了包括10个标记的符合SSR标记荧光检测技术体系，用于枸杞品种和物种鉴定。这10个标记多态性好，扩增稳定，扩增结果清晰，重复性好，可以用于大规模检测(图1)枸杞种苗的真伪、种苗的纯度，可以为种苗市场的规范化提供技术基础，有利于中药枸杞的开发利用。

附图说明

图1为宁杞四号枸杞品种6个SSR分子标记的检测结果，其中图1中的A-F分别是LrESSR022、LrESSR243、LrESSR107、LrESSR203、LrESSR244、LrESSR130引物对的检测结果。

图2为7个枸杞品种植物的聚类分析图，其是利用EST-SSR核心引物组中的10个引物对和通用M13引物进行扩增检测的检测结果(10个SSR的基因型检测结果)，分析7个主要品种的遗传距离，用MEGA建立的系统发育树，其中Lvchuan No.1代表中科绿川一号，NingqiNo.1、Ningqi No.4、Ningqi No.5、Ningqi No.7、Ningqi No.9分别代表宁杞一号，宁杞四号，宁杞五号，宁杞七号，宁杞九号，Mengqi No.1代表蒙杞一号。

具体实施方式

以下将结合具体实施例对本发明做进一步的阐述。

实施例中所用植物材料如下：

7份枸杞品种：宁杞一号，宁杞四号，宁杞五号，宁杞七号，宁杞九号，中科绿川一号和蒙杞一号。

实施例1：基于枸杞转录组序列的EST-SSR核心引物组的开发

1、枸杞EST序列中SSR位点筛选

利用MicroSAtellite(MISA)(http://pgra.ipk-gatersleben.de/misa)软件对数据库中的枸杞转录组unigenes中的所有SSR位点进行搜索，搜索的限制条件为：二碱基重复最少重复6次，三碱基、四碱基、五碱基和六碱基重复最少重复5次，两个SSR位点之间如果小于100bp则视为复合型SSR。

2、EST-SSR引物设计与合成

用primer3软件针对unigenes中的SSR位点开发设计目标引物，设计标准为：引物长度为18-25bp，退火温度为57-63℃，GC含量为40-70％，PCR产物的长度为100-300bp，选取能与NCBI非冗余蛋白质数据库进行比对的SSR位点合成出300对引物，每对引物由上游引物A和下游引物B组成；

3、提取DNA

采取改良的CTAB法提取上述7个枸杞品种植物叶的DNA，紫外分光光度计定量后，稀释到50ng/μl，4℃或-20℃保存待用；

具体步骤如下：

1)取鲜样300mg(或干样100mg)在液氮(或磨样机)中研磨至粉末；

2)加入2ml CTAB-free缓冲液(200mM Tris-HCl，50mM EDTA，250mM NaCl，1％β-巯基乙醇)(4℃预冷)，继续研磨至样品溶解，将样品转移至2ml离心管中；4℃放置10min，8,000rpm离心10min，弃上清；

3)重复2；

4)加入1ml 65℃预热的2％的CTAB溶液(2％CTAB，100mM Tris-HCl，25mM EDTA，1.5M NaCl，含1％β-巯基乙醇，V/V，使用前加入)，混匀，65℃水浴30-60min，间隔10min混合一次；

5)加入1ml氯仿-异戊醇(V/V，24:1)溶液，混匀，12,000rpm，离心10min；将上清液转移至一新的2ml离心管中(上清液约800μl)；

6)加入1μl RNaseA(10mg/ml)，37℃(或室温)放置1h；

7)加入等体积(约800μl)氯仿-异戊醇(24:1)溶液，混匀，12,000rpm，离心10min；将上清液转移至一新的1.5ml离心管中(约600μl)；

8)加入等体积(约600μl)异丙醇(-20℃预冷)，轻轻混匀，-20℃放置30min；

9)12,000rpm，4℃，离心10min，弃上清；可见管底的DNA沉淀(透明至白色)；

10)加入75％乙醇1ml，洗涤DNA沉淀；12,000rpm，瞬时离心，将DNA沉淀离心到管底，弃乙醇；

11)重复10两次；

12)吸出剩余乙醇，静置至乙醇完全挥发；

13)加入30-50μl无菌水(或TE缓冲液)；

14)用紫外分光光度计测量DNA浓度，并调节DNA浓度为50ng/μl，4℃或-20℃保存。

4、PCR扩增

以步骤3提取的DNA为模版，采用“三引物”的扩增策略进行PCR扩增，“三引物”包括一个上游引物、一个下游引物和一个5’荧光标记(FAM、HEX、TAMRA、或ROX，本专利中使用单一FAM荧光即可满足鉴定需求)的通用M13引物(SEQ ID NO.21)，所述上游引物为在步骤2合成的上游引物A的5’端拼接有5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’(M13)，所述下游引物为步骤2合成的下游引物B。拼接有“M13”的上游引物扩增后，为通用M13引物提供了反向互补序列，通用M13引物引导的PCR扩增产生带有荧光的PCR产物。

扩增使用的PCR仪为SensoQuestLabCycler(SensoQuest，Germany)。PCR反应体系为：50ng/μl模板DNA、10mM Tris-HCl(pH 8)，50mM KCl，2.5mM MgCl₂，0.0125μM拼接有“M13”的上游引物，0.25μM下游引物，200μM dNTPs，1U/μl Taq DNA聚合酶和0.15μM荧光通用M13引物，余量用水补齐。

PCR反应程序采用“Touchdown”的策略：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃(每个循环降1℃)退火30s，72℃延伸30s，循环10次；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；最后72℃延伸20min，得到扩增产物。

5、电泳检测

取2.5μL扩增产物加入1.5μL Loading Buffer混匀上样，2％的琼脂糖凝胶电泳20min后进行检测，有扩增条带的产物用于测序分型；

6、引物的筛选

将不同长度的PCR产物按照等比例混合，用3730xlDNA测序仪(ABI，USA)进行分型，分型结果用GeneMarker(soft Genetics LLC，USA)进行条带判别。如图1所示，图中六个SSR标记的信号强、噪音低，且重复性好。从300对引物中共筛选出86对多态性引物，进一步在所有枸杞品种中筛选出多态性高、扩增带型单一的10对核心引物，每对核心引物由一个上游引物和一个下游引物组成，并且按照不同标记的扩增长度进行组合，用于多重PCR检测，进一步大规模检测的节约时间和经济成本。10对EST-SSR核心引物对如表1所示：

表1 用于枸杞品种鉴定的10对EST-SSR核心引物对

实施例2 利用EST-SSR标记鉴定中药枸杞的品种

1、提取DNA

采取改良的CTAB法提取上述7种枸杞品种植物叶的DNA，紫外分光光度计定量后，稀释到50ng/μl，4℃或-20℃保存待用；

具体步骤同实施例1。

2、PCR扩增

以步骤1提取的DNA为模版，用实施例1开发的10对EST-SSR核心引物对进行PCR扩增，扩增方法同实施例1(按照表1组合进行多重PCR，即各组合中所有上游引物和所有下游引物加入PCR体系，同一PCR反应得到两个或三个SSR标记的扩增产物，具体为：

反应体系I：PCR反应体系：50ng/μl模板DNA、10mM Tris-HCl(pH 8)，50mM KCl，2.5mM MgCl₂，0.0125μM LrESSR022的上游引物，0.25μM LrESSR022的下游引物，0.0125μMLrESSR243的上游引物，0.25μM LrESSR243的下游引物，0.0125μM LrESSR244的上游引物，0.25μM LrESSR244的下游引物，200μM dNTPs，1U/μl Taq DNA聚合酶和0.15μM荧光通用M13引物，余量用水补齐。

反应体系II：PCR反应体系为：50ng/μl模板DNA、10mM Tris-HCl(pH 8)，50mM KCl，2.5mM MgCl₂，0.0125μM LrESSR040的上游引物，0.25μM LrESSR040的下游引物，0.0125μMLrESSR130的上游引物，0.25μM LrESSR130的下游引物，0.0125μM LrESSR107的上游引物，0.25μM LrESSR107的下游引物，200μM dNTPs，1U/μl Taq DNA聚合酶和0.15μM荧光通用M13引物，余量用水补齐。

反应体系Ⅲ：PCR反应体系为：50ng/μl模板DNA、10mM Tris-HCl(pH 8)，50mM KCl，2.5mM MgCl₂，0.0125μM LrESSR059的上游引物，0.25μM LrESSR059的下游引物，0.0125μMLrESSR179的上游引物，0.25μM LrESSR179的下游引物，200μM dNTPs，1U/μl Taq DNA聚合酶和0.15μM荧光通用M13引物，余量用水补齐。

反应体系IV：PCR反应体系为：50ng/μl模板DNA、10mM Tris-HCl(pH 8)，50mM KCl，2.5mM MgCl₂，0.0125μM LrESSR142的上游引物，0.25μM LrESSR142的下游引物，0.0125μMLrESSR203的上游引物，0.25μM LrESSR203的下游引物，200μM dNTPs，1U/μl Taq DNA聚合酶和0.15μM荧光通用M13引物，余量用水补齐。

PCR反应程序采用“Touchdown”的策略：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃(每个循环降1℃)退火30s，72℃延伸30s，循环10次；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；最后72℃延伸20min，得到扩增产物。)

由此得到带有荧光标记的不同长度的PCR产物；

3、检测分析

带有荧光标记的不同长度的PCR产物送交测序公司，用3730xlDNA测序仪(ABI，USA)进行分型，再利用NTsys 2.10e软件进行聚类分析，结果参见图2。结果表明：用这10对EST-SSR核心引物对，可以清楚地将7个枸杞品种区分开来，其中宁杞一号、宁杞四号、宁杞七号之间的亲缘关系最近，蒙杞一号和和宁杞九号的关系较近，而中科绿川一号与其他品种的亲缘关系最远，这与根据形态学进行鉴定的结果也是符合的。由此可见，利用这10个SSR位点，已经建立了7个品种的分子指纹图谱，可作为育种和资源评价的主要依据。

在对待测样品进行鉴定的时候，首先提取待测样品基因组DNA，以该基因组DNA为模板，用上述EST-SSR核心引物组进行PCR扩增反应，所述的PCR扩增反应包括4个PCR反应，具体如下：

III：以基因组DNA为模板，以LrESSR059和LrESSR179以及通用M13引物作为扩增引物，在同一个反应体系中进行多重PCR反应，得到扩增产物；

IV：以基因组DNA为模板，以LrESSR142和LrESSR203以及通用M13引物作为扩增引物，在同一个反应体系中进行多重PCR反应，得到PCR扩增产物；

将不同长度和不同荧光的PCR扩增产物按照等比例混合，用3730xlDNA测序仪(ABI，USA)进行毛细管电泳、分型，后用GeneMarker(soft Genetics LLC，USA)对分型结果进行条带判别，再根据判别结果利用NTsys 2.10e软件进行聚类分析，能与待测样品聚为一类的即为同一个种。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.鉴定枸杞品种的EST-SSR核心引物组，其特征在于，包括10对EST-SSR核心引物对和通用M13引物：

(1)、LrESSR022：

F:5’-GTAAAACGACGGCCAGTCAAGTCATCACGTGGACGC-3’；

R:5’-CTCTGAAACGAGAAGGACGG-3’；

(2)、LrESSR243

F:5’-GTAAAACGACGGCCAGTATGGTTGCCTTCACTTGTCC-3’；

R:5’-CAACCACTAGCCAAAGCACA-3’；

(3)、LrESSR244

F:5’-GTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCTGCAAAGGGTTT-3’；

R:5’-TCCTTTCACCCAGTCTCACC-3’；

(4)、LrESSR040

F:5’-GTAAAACGACGGCCAGTCGAAACCTTCATACCAAACACA-3’；

R:5’-AGGAAAGCAAGCAATCATCA-3’；

(5)、LrESSR130

F:5’-GTAAAACGACGGCCAGTCAGATAGCAACGGAGCAGTG-3’；

R:5’-GATTTGTTGCTGAATTGCGA-3’；

(6)、LrESSR107

F:5’-GTAAAACGACGGCCAGTTGCCCTTATTTTCAAATGGC-3’；

R:5’-AGGGTGATTGATGGTAACGG-3’；

(7)、LrESSR059

F:5’-GTAAAACGACGGCCAGTTTGTCAGGGGCTATCCAGTC-3’；

R:5’-CTAAACCTCGCATTTCCCAA-3’；

(8)、LrESSR179

F:5’-GTAAAACGACGGCCAGTCCTTTTTCTCTTACAGGGCTTG-3’；

R:5’-AGCTTAGGCGTGCAGTTCAT-3’；

(9)、LrESSR142

F:5’-GTAAAACGACGGCCAGTCTGATCTGCTCCTTGACACG-3’；

R:5’-TGATTTCAAGCCAATCAACG-3’；

(10)、LrESSR203

F:5’-GTAAAACGACGGCCAGTCTGGGGGAAAGTGAAACAGA-3’；

R:5’-ACGATCATATCTTGCGTGGT-3’；；

(11)、通用M13引物

5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’。

2.一种鉴定枸杞品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：

提取待测样品基因组DNA，以该基因组DNA为模板，用权利要求1所述的EST-SSR核心引物组进行PCR扩增反应，所述的PCR扩增反应包括4个PCR反应，具体如下：

3.权利要求1所述的EST-SSR核心引物组在鉴定枸杞品种中的应用。