CN103060318B - 基于谷子全基因组序列开发的ssr核心引物组及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于谷子全基因组序列开发的SSR核心引物组及其应用，属于分子生物学技术领域。所述核心引物组，包括30对引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1～60所示。上述引物具有分布均匀、扩增稳定、电泳条带清晰、多态性丰富的优点。本发明还提供了SSR核心引物组在谷子遗传多样性和品种鉴定中的应用。该组引物能准确快速鉴定谷子品种，准确反映谷子品种间的遗传关系。

Description

基于谷子全基因组序列开发的SSR核心引物组及其应用

技术领域

本发明涉及谷子SSR标记，具体地说是基于谷子全基因组序列开发的SSR核心引物组及其应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

谷子(Setaria Italica Beauv.）属禾本科（Gramineae）狗尾草属［Setaria（L.）Beauv.］，是中国起源的世界最古老作物和中华民族的哺育作物，曾经为中国革命和新中国初期的吃饭问题起过非常重要的作用，也是当时的战略储备粮食。谷子营养价值丰富，富含维生素A、E，人体必需氨基酸中的蛋氨酸为八一粉的118倍、大米的2125倍，具有良好的保健作用，可开发、加工成一系列食用方便的食品。谷类籽粒蛋白质还具有抗动脉粥样硬化的作用。

谷子属C4植物，具有耐旱、耐盐、耐瘠薄、高光合作用效率等特性，是开展作物抗旱机理及C4光合系统发育与调控研究的新模式作物，也是应对气候变暖和干旱形势的战略储备作物，是国家现代农业产业技术体系建设的重要组成部分。

我国作为谷子的主产国，对于谷子新品种培育和产量发展具有重要的意义。近五年来，我国各省新培育品种呈现良好的发展势头，培育出大量新品种。随着植物育种和种子贸易的发展，植物新品种保护的重要性日益突出。准确、快速进行农作物品种的鉴定，对于农作物品种审定、品种保护、真假品种辨别、品种的产权纠纷等方面均有重要作用。植物新品种测试，又称DUS测试，是对申请保护的植物新品种进行特异性(Distinctness)、一致性(Uniformity)和稳定性(Stability)的栽培鉴定试验或室内分析测试，并根据试验或测试结果判定该植物品种是否属于新品种，为植物新品种保护提供可靠的判定依据。目前，DUS测试方法仍然采用田间种植鉴定，是将申请品种与近似品种在相同的生长条件下，从植物的种子、幼苗、开花期、成熟期等各个阶段对多个质量性状、数量性状及抗病性等作出观察记载，并与近似品种进行结果比较，一般要经过2~3年的重复观察，才能最后作出合理、客观的评价。自相关标准颁布以来，在植物新品种DUS测试中起着重要作用。但因存在鉴定周期长、易受环境影响、测试性状多、工作量大等问题，无法适应大量品种的测试需求。

分子标记是以个体间核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映。分子标记检测技术具有测试周期短、不受环境影响和季节限制、没有组织特异性、供选择的标记数量多、可以进行高通量测试分析等优势，已逐步用于新品种鉴定、种子纯度及品种真实性检测中。王志民用小麦和珍珠粟的RFLP探针，可以有效区分谷子品种。杨天育利用RAPD标记，可以将不同生态类型的谷子品种区别开。但是，RAPD重复性较差；AFLP操作较复杂，稳定性较差；RFLP操作过程繁琐，效率低，成本高。SSR(Simple SequenceRepeats)，是以1~6个核苷酸为单位、呈串联重复的DNA序列，广泛分布于真核生物基因组中。与其他分子标记相比，SSR标记具有共显性、多态性高、重复性好、操作简单等优点，已经作为重要的DNA标记广泛应用于植物遗传多样性研究、品种鉴定、遗传图谱的构建、QTL定位、标记辅助选择及比较基因组研究等领域。与水稻、小麦等作物相比，现有的谷子SSR标记数量少，不能满足谷子研究的需要，大量开发覆盖全基因组的SSR标记仍是目前谷子研究的重要工作之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一套基于谷子全基因组序列开发的SSR核心引物组，这些引物具有扩增稳定、电泳条带清晰、多态性丰富的优点，可有效用于谷子遗传多样性、品种鉴定、DNA指纹图谱构建等研究。本发明的另一目的在于提供了SSR核心引物组在谷子遗传多样性和品种鉴定中的应用，该方法可靠、迅速，能准确区分谷子品种间差异并最大限度准确反映谷子品种间的亲缘关系。

本发明的技术方案是：基于谷子全基因组序列开发的SSR核心引物组，其特征是，它包括30对引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1～60所示。

上述的SSR核心引物组在谷子遗传多样性分析和品种鉴定方面的应用。

上述的SSR核心引物组进行谷子遗传多样性分析的方法，其特征是，

（1）DNA提取

利用改良的CTAB法提取待鉴定样品总DNA；

（2）引物扩增及电泳检测

以步骤（1）提取的待鉴定样品为模板，利用如序列表SEQ ID No.1～60所示的引物进行PCR扩增；扩增产物采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显色。

PCR体系（12.5μL）包括1.25μL10×Taq Buffer，1.5mmol/L Mg²⁺，0.25mmol/L dNTP，上下游引物各0.4mmol/L，0.5UTaq酶和20~50ngDNA模板。PCR程序为：94℃预变性4min；94℃45s，（Tm）℃45s，72℃45s，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物加入6ul6×loading buffer，95℃变性5min，冰浴5min，采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。电泳在Sequi-Gen GT核酸电泳系统(Bio-Rad，USA)中进行。取3ul样品，以pBR322DNA/MspI为DNA分子量标准，60W恒功率电泳1.5h，银染显色。

（3）根据DNA分子量标准和引物的迁移率记录结果，迁移率最大（分子量最小）的条带记为1，迁移率次之的记为2，依次类推，无条带记为0，建立供试材料SSR基因型信息数据库，进行谷子品种鉴定或遗传多样性分析。

所述谷子品种鉴定方法为：统计每个品种在引物中的扩增情况，构建DNA指纹图谱，一一比较各引物位点差异。差异引物数≧2，判定两个品种为不同品种；差异引物数=1，判定两个品种为近似品种；差异引物数=0，判定两个品种为相同品种。

所述遗传多样性分析为：利用PowerMarker V3.25计算引物的等位基因数（Na）、基因多样性指数（He）、多态性信息量（PIC）。利用NTSYS-pc V2.10e软件计算品种间的遗传相似系数，用UPGMA法进行聚类分析，绘制树状图。

本发明的有益效果：本发明的30对SSR核心引物（即SSR标记）在谷子基因组中分布均匀、多态性丰富、扩增稳定、扩增条带易于鉴定，可用于谷子品种指纹图谱数据库构建、品种鉴定、品种权保护、品种审定、种质资源管理和遗传多样性评价等领域，有利于保护育种者、生产者和消费者的合法权益，促进谷子遗传育种水平的提高和谷子产业的发展。

附图说明

图1为SSRHunter1.3软件搜索结果示意图；

图2为引物S226在41份谷子品种中检测到的多态性；

图3为聚类分析结果图。

具体实施方式

实施例1：谷子基因组SSR标记在品种鉴定中的应用

1.谷子基因组DNA的提取

（1）材料

从谷子核心种质材料中选取41份有代表性的地方品种和育成品种，共涉及东北平原、华北平原、淮河以南、黄土高原、内蒙高原及西北内陆6个生态区（见表1），用于谷子引物的评价和品种鉴定研究。

表1本发明中用于谷子品种鉴定的材料信息

（2）CTAB法提取基因组DNA

采用改良的CTAB法提取谷子DNA，具体步骤如下：

1）对参试谷子材料进行发芽培养，两叶一心期时提取DNA。

2）剪取适量叶片，置于1.5ml离心管中，磨碎，加入500μl65℃预热的CTAB提取液，摇匀。

表2CTAB提取液配方(200ml)

3）65℃水浴30min，每5~10min颠倒混匀一次。

4）从水浴锅中取出，静置片刻，加入等体积氯仿与异戊醇的混合液（氯仿与异戊醇体积比为24:1），涡旋混匀，静置20min，13500g室温离心10min，取上清液。

5）向上清液中加入1.5倍体积的冰乙醇，颠倒混匀，置于-20℃10min，13500g离心10min，取白色沉淀。

6）加入500μlWashing（70%乙醇，10mmol/L乙酸胺），室温放置半小时，13500g离心10min，弃上清液；加入500μl75%乙醇，13500g离心10min，弃上清液，室温风干。加入200μlTE溶液，溶解DNA。

7）利用紫外分光光度计检测DNA浓度，1%（质量体积比）的琼脂糖凝胶电泳和WD-9403C紫外仪检测DNA的质量。

2.谷子基因组SSR引物的开发

（1）谷子基因组序列的获得

谷子全基因组测序结果从谷子基因组数据库Phytozome（http://www.phytozome.net/Setariaitalica）下载（时间截止到2012年02月09日），约405.7Mb，共包含336个scaffolds，基因组覆盖率为83%。

（2）谷子基因组序列中SSR位点的鉴定

采用SSR搜索软件SSRHunter1.3对谷子基因组序列进行SSR位点搜索。搜索条件为：重复次数至少为5、构成重复基元的核苷酸数最多是6个。统计完全型SSR、不完全型SSR和复合型SSR。SSRHunter1.3软件搜索结果如图1所示。

（3）谷子基因组SSR引物的设计

依据步骤（2）获得的SSR位点，选择重复次数在20以上或者重复碱基数在40以上的SSR位点，利用重复序列两端的保守侧翼序列，用Primer5.0设计引物。引物设计的条件是：PCR产物长度为100~350bp；退火温度（Tm）为50~70℃，保证两引物间Tm值相差不超过4℃；GC%含量为40~65%；引物长度为18~28bp；引物5’端最好是G/C，3’端避免出现A。为了保证引物的特异性，用于设计引物的保守侧翼序列与微卫星位点至少间隔20～30个碱基。引物设计成功后，由上海生工生物工程有限公司合成。

（4）谷子基因组SSR引物的扩增与筛选

选择8份谷子品种，用于检测谷子基因组SSR标记的扩增情况及多态性。

采用步骤（3）合成的引物，以8份材料的基因组DNA进行扩增，根据扩增结果，筛选可稳定扩增、带型清晰且多态性丰富的引物149对。

（5）根据步骤（4）的筛选结果，从谷子每条染色体上选取3~4对多态性最丰富且带型清晰的引物，共30对（如表3），对41份谷子品种进行扩增。

表3谷子30对基因组核心引物信息

PCR体系（12.5μL）包括1.25μL10×Taq Buffer，1.5mmol/L Mg²⁺，0.25mmol/L dNTP，上下游引物各0.4mmol/L，0.5UTaq酶和20~50ngDNA模板。PCR反应在MyCycler ThermalCycler(Bio-Rad)上进行，反应程序为：94℃预变性4min；94℃45s，（Tm）℃45s，72℃45s，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

PCR产物采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。电泳在Sequi-Gen GT核酸电泳系统(Bio-Rad，USA)中进行。取3ul样品，以pBR322DNA/MspI为DNA分子量标准，60W恒功率电泳1.5h，银染显色。

具体电泳步骤如下：

1）PCR产物加入6ul6×loading buffer（98%甲酰胺，0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯氰，0.5MEDTA），95℃变性5min，冰浴5min。

2）电泳在Sequi-Gen GT核酸电泳系统(Bio-Rad，USA)中进行。电泳上槽缓冲液为0.25×TBE，下槽缓冲液为1×TBE。取3μl样品，以pBR322DNA/MspI为DNA分子量标准，60W恒功率电泳1.5h。

3）将凝胶在10%冰醋酸中固定20min，然后在蒸馏水中漂洗1-2次。

4）将凝胶在0.1%硝酸银溶液中染色30min，然后用蒸馏水轻微漂洗。

5）将凝胶置于1%氢氧化钠，0.2%甲醛显色液中，低温显色5-10min。

6）当条带与背景对比度最清楚时，用10%醋酸终止显色。然后用蒸馏水漂洗2min。

（6）数据分析

根据DNA分子量标准和引物的迁移率记录结果，迁移率最大（分子量最小）的条带记为1，迁移率次之的记为2，依次类推，无条带记为0，建立供试材料SSR基因型信息数据库。

统计每个品种在引物中的扩增情况，构建DNA指纹图谱（表4），比较各引物位点差异发现任意两个品种的DNA指纹图谱都不相同。

利用PowerMarkerV3.25软件计算引物位点的等位基因数（Na）、基因多样性指数（He）、多态性信息量（PIC）。在41份材料中，30个SSR标记共检测出291个等位基因，每个位点检测出的等位基因数为4~16个，平均每个位点9.7个。引物多态性信息量（PIC）变化范围是0.5683~0.8895，平均为0.7837，其中PIC值在0.8以上的引物有16对，表明这些引物能检测到丰富的遗传变异。图2为引物S226在41份谷子品种中的指纹带型。

利用NTSYS软件计算谷子各品种间的Dice遗传相似系数，然后基于相似系数矩阵，利用SHAN子程序按照UPGMA算法进行聚类分析。聚类分析结果见图3。

41份谷子品种间遗传相似系数(GS)值变动于0.0328～0.5614之间。其中来自辽宁的红苗老来变和山东的鲁谷5号、河南的绳头黄谷和张家口的坝低1之间的遗传相似系数最小，为0.0328，分别有25对、27对引物有差异，亲缘关系最远；来自河北的冀谷20和山东的鲁谷5号之间的遗传相似系数最大，为0.5614，有13对引物有差异。对41个谷子品种进行聚类分析，当遗传相似系数为0.14时，所有品种可以聚成两大组。第一组主要是来自黄土高原、西北内陆和内蒙高原的材料，第二组主要是来自华北平原和东北平原的材料。当遗传相似系数为0.164时，所有品种可以分成六组：第一组包括黑龙江的老来变和黑谷2号，甘肃的永昌小白谷。第二组包括11个材料，分别是吉林的鸭子嘴、长扩1，河北的鸭子嘴，雁北的早二白谷，张家口的二黄米，山西的腰谷、爬坡糙，陕西的老来变，宁夏的狼尾巴，青海的黄袍谷，新疆的吐鲁番谷子，代表了内蒙高原、黄土高原和西北内陆生态区。第三组是四份育成品种，分别是嫩选15、坝低1、陇谷5号和大凉州谷。第四组是山西的红杆谷、内蒙古的金香玉以及3份育成引物品种。第五组包括17份材料，其中7份来源于华北平原，3份来源于东北平原，2份淮河以南的材料。第六组为河北的黑谷。聚类分析表明，来自同一生态区的谷子品种基本聚合在一起。

表441份谷子品种DNA指纹图谱

注：表头中，行标题为引物，列标题为品种编号；

/表示品种在该位点为杂合，/前后代表不同的等位基因；

00表示品种在该位点数据缺失。

Claims (6)

1.基于谷子全基因组序列开发的SSR核心引物组，其特征是，它包括30对引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1～60所示。

2.权利要求1所述的SSR核心引物组在谷子品种鉴定方面的应用。

3.利用权利要求1所述的SSR核心引物组进行谷子品种鉴定的方法，其特征是，

（1）DNA提取 

利用改良的CTAB法提取待鉴定样品总DNA；

（2）引物扩增及电泳检测

以步骤（1）提取的待鉴定样品为模板，利用如序列表SEQ ID No.1～60所示的引物进行PCR扩增；扩增产物采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显色；

（3）根据DNA分子量标准和引物的迁移率记录结果，迁移率最大的条带记为1，迁移率次之的记为2，依次类推，无条带记为0，建立供试材料SSR基因型信息数据库，进行谷子品种鉴定；所述谷子品种鉴定方法为：统计每个品种在引物中的扩增情况，构建DNA指纹图谱，一一比较各引物位点差异，差异引物数≧2，判定两个品种为不同品种；差异引物数=1，判定两个品种为近似品种；差异引物数=0，判定两个品种为相同品种。

4.权利要求1所述的SSR核心引物组在谷子遗传多样性分析方面的应用。

5.利用权利要求1所述的SSR核心引物组进行谷子遗传多样性分析的方法，其特征是，

（1）DNA提取 

利用改良的CTAB法提取待鉴定样品总DNA；

（2）引物扩增及电泳检测

以步骤（1）提取的待鉴定样品为模板，利用如序列表SEQ ID No.1～60所示的引物进行PCR扩增；扩增产物采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显色；

（3）根据DNA分子量标准和引物的迁移率记录结果，迁移率最大的条带记为1，迁移率次之的记为2，依次类推，无条带记为0，建立供试材料SSR基因型信息数据库，进行遗传多样性分析；所述遗传多样性分析为：利用PowerMarker V3.25计算引物的等位基因数、基因多样性指数、多态性信息量；利用NTSYS pc V2.10e软件计算品种间的DICE遗传相似系数，用UPGMA法进行聚类分析，绘制树状图。

6.如权利要求5所述的谷子遗传多样性分析的方法，其特征是，所述步骤（2）电泳在Sequi-Gen GT 核酸电泳系统中进行；取3μ l样品，以pBR322 DNA/MspI为DNA分子量标准，60W恒功率电泳1.5h，银染显色。