CN104232785B

CN104232785B - 梨小食心虫荧光pcr检测方法与应用

Info

Publication number: CN104232785B
Application number: CN201410536526.1A
Authority: CN
Inventors: 王凤军; 冯俊丽; 华鹏; 张祥林; 张伟; 郭铁群; 刘永杰; 王鹏举
Original assignee: Korla Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau Of People's Republic Of China
Current assignee: Korla Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau Of People's Republic Of China
Priority date: 2014-10-11
Filing date: 2014-10-11
Publication date: 2017-01-11
Anticipated expiration: 2034-10-11
Also published as: CN104232785A

Abstract

本发明公开了一种梨小食心虫实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤：①、待鉴定样品基因组DNA的提取；②、实时荧光定量PCR扩增体系设置：以基因组DNA为扩增模板，用特异性引物和探针，进行实时荧光PCR检测；③、扩增结果分析及结果判断。探针为：Probe：5’‑(FAM)CGAAATCTTAATACTTCATTTTTTGACCCTG(TAMRA)‑3’。本发明能用于有效地从蛀果性害虫(包括梨小食心虫、苹果蠹蛾和香梨优斑螟等)中区分出梨小食心虫。

Description

梨小食心虫荧光PCR检测方法与应用

技术领域

本发明涉及一种梨小食心虫污染的分子检测方法，具体地说，涉及一种梨小食心虫荧光PCR检测方法，其属于生物技术领域。

背景技术

梨小食心虫(Grapholitha molesta(Busck))属鳞翅目卷蛾科，简称梨小，又名东方果蠹蛾、梨姬食心虫、桃折梢虫、小食心虫、桃折心虫，俗称蛀虫、黑膏药，广泛分布于世界各地，国内遍布个省区，是梨树的重要害虫，在梨、桃树混栽的果园为害尤为严重。幼虫蛀果多从萼洼处蛀入，直接蛀到果心，在蛀孔处有虫粪排出，被害果上有幼虫脱出的脱果孔。幼虫蛀害嫩梢时，多从嫩梢顶端第三叶叶柄基部蛀入，直至髓部，向下蛀食。蛀孔处有少量虫粪排出，蛀孔以上部分易萎蔫干枯。主要寄主除桃和梨外，还有李、杏、苹果、山楂等，既危害果实，也危害新梢，严重影响果品产量和品质。近年来其发生出现上升趋势，是世界性的主要蛀果害虫之一，为出口检疫对象。

梨小食心虫的形态特征，成虫：体长5—7毫米，翅展9—15毫米，全身灰褐色无光泽，触角丝状，下唇须灰褐上翘；前翅灰黑，前缘有7-10组白色短针纹，在翅的中部有一小白点，近外缘处有10个小黑斑点，是其显著特征。幼虫：末龄幼虫体长10～13毫米。全体非骨化部分淡黄白色或粉红色，腹部橙黄，头黄褐色，前胸背板黄白色，透明，体背桃红色。腹足趾钩30～40个。蛹：体长6--7毫米，纺锤形，黄褐色，腹部3～7节背面各具两排短刺，排列整齐，8～10节各生一排稍大刺，腹未有8根钩状臀棘。茧丝质白色，长椭圆形，稍扁平，长约10mm。卵：黄白色，扁椭圆形，中央隆起，周缘扁平，直径0.5～0.8mm，半透明。

梨小食心虫的发生特点：发生世代多，各代发生时期不整，各代发生期很长，世代明显重叠。辽宁、河北、新疆地区1年发生3～4代，河南、安徽、江苏、陕西、山东地区为4～5代，四川5～6代，江西和广西分别为6和7代。以老熟幼虫在果树枝干和根颈裂缝处及土中结成灰白色薄茧越冬，华北第4代多为不完全世代，以3代和部分4代幼虫越冬。翌年春季4月上中旬开始化蛹，越冬部位较分散，树干、主枝分杈、根颈部的粗裂、翘皮下，树下落叶里、草根上和土里都有分布。

苹果蠹蛾(Cydia pomonella L.)，香梨优斑螟(Euzophera pyriella Yang)和梨小食心虫为我国常见的蛀果性害虫，此三种害虫的低龄幼虫在外部形态上非常相似，没有显著差异，目前，我国检疫部门对梨小食心虫的分类鉴定主要是以老熟幼虫或成虫的外部形态特征为依据，在果品出口、运输和实施检疫控制前准确地区分检疫性害虫是相当必要的，目前大多凭借形态学特征只能区分成虫、晚龄期害虫，大多数的检疫性有害生物较短暂的幼虫阶段很难依靠形态学特征精确区分，但苹果蠹蛾、香梨优斑螟和梨小食心虫等有害生物的幼虫基本是在水果采收时大量出现，同时中、外双方截获的食心虫形态特点都不明显，有时以残体形式出现，给种类的鉴定带来很大困难。国外在截获有害生物时，截获检疫性有害生物和截获一般有害生物，对货物处理，产地的制裁，出口的限制有很大的区别。从收到的国外通报看，对方国对截获有害生物的鉴定结果五花八门，我方想对对方结果进行质疑，缺乏有力的证据和方法。检验方法的不成熟和低分辨率依然会造成进口国在截获检疫性有害生物时采取严厉制裁措施的风险。带来过多的技术纠纷，增加禁止出口的风险，增加检疫性处理或者退货会产生较大的费用消耗。因此，建立一种梨小食心虫快速、灵敏、准确的分子生物学检测方法是十分必要和紧迫的，对口岸检疫和防治监测都有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种梨小食心虫实时荧光PCR检测方法，本发明具体给出了用于梨小食心虫实时荧光PCR检测的特异性引物和Taqman探针，本发明能用于有效地从蛀果性害虫(包括梨小食心虫、苹果蠹蛾和香梨优斑螟等)中区分出梨小食心虫。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种梨小食心虫实时荧光PCR检测方法，检测中所用特异性引物和探针的核苷酸分别为：

特异性引物为：

F-Primer:5’-CAGCTCTTTTATTACTACTTTCACTACCA-3’

R-Primer:5’-AATAGGATCTCCTCCTCCT-3’；

探针为：

Probe：5’-(FAM)CGAAATCTTAATACTTCATTTTTTGACCCTG(TAMRA)-3’。

即，本发明首先提供了一种梨小食心虫的鉴定引物，其核酸序列如SEQ ID No.1和2所示，其中，SEQ ID No.1所示的核苷酸序列为正向引物，SEQ ID No.2所示的核苷酸序列为反向引物。

LX-FP：5’-CAGCTCTTTTATTACTACTTTCACTACCA-3’(SEQ ID No.1)或其互补链；

LX-RP：5’-AATAGGATCTCCTCCTCCT-3’(SEQ ID No.2)或其互补链；

本发明用于梨小食心虫实时荧光PCR检测的Taqman探针，该探针针对上述引物的扩增区域内，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，即本发明所述的Taqman探针为：5’-(FAM)CGAAATCTTAATACTTCATTTTTTGACCCTG(TAMRA)-3’(SEQ ID No.3)或其互补链。

本发明所述的特异性引物和Taqman探针由Takara(大连，中国)公司委托合成及标记。

特别地，本发明利用通用引物对不同地区的31次采样的近500只梨小食心虫、苹果蠹蛾和香梨优斑螟样本进行PCR扩增，产物纯化、克隆、测序后，分别得到517bp、504bp和527bp的序列，各物种的COI基因长片段用CLUSTAL 2.1和DNA-star等软件进行比对分析，筛选出差异位点较多的区段，进而在该区段使用Primer premier 5.0和ABI Primer Express3.0软件设计特异性引物和荧光探针，并用BLAST程序验证引物特异性。该引物/探针组合具有较高的检测灵敏度和扩增特异性，能高效的将梨小食心虫与其他相似的检验检疫性害虫区分开。

本发明还提供了一种使用上述梨小食心虫特异性引物和Taqman探针鉴定梨小食心虫的方法，包括以下步骤：

①、待鉴定样品基因组DNA的提取；

②、实时荧光定量PCR扩增体系设置：

以基因组DNA为扩增模板，用上述引物和探针(Taqman探针)，进行实时荧光PCR检测；

③、扩增结果分析及结果判断：

根据实时荧光扩增曲线判定样品检测结果。

作为本发明的梨小食心虫实时荧光PCR检测方法的改进：

探针的5’端标记有报告荧光染料，根据所采用的实时荧光PCR仪的配置而定，所述报告荧光染料为FAM、HEX、JOE、VIC、NED、FITC、CY3或CY5，探针的3’端标记有淬灭荧光染料，所述淬灭荧光染料为TAMRA、ROX、dabcy1、BHQ或ECLIPSE。

在本发明中：

步骤①提取样品基因组DNA的具体步骤为：将待鉴定样品放入研钵内，导入液氮，充分研磨后，加入裂解液，待溶化后用移液器转移至1.5mL离心管内，采用试剂盒离心柱法提取基因组DNA，试剂盒共采用了北京全式金(EE111)、天根(DP304)、北京鼎国(NEP001)、Qiagen(69504)等4种植物DNA提取试剂盒。DNA浓度及纯度通过ND-2000C核酸蛋白分析仪检测。

所述样品为梨小食心虫成虫，老熟幼虫，小龄幼虫，蛹和残体，或经糖醋液捕捉到的虫体。

步骤②所用检测体系的具体组成如下：25μL总体积中含有10×PCR Buffer(含Mg² ⁺)2.5μL，dNTP(2.5mM，each)2μL，上下游引物(10μM)各0.5μL，探针(10μM)0.5μL，500U TaqDNA聚合酶0.25μL和DNA模板(由步骤①提取得到的溶液)2μL，补水至25μL。

在本发明中，同时设置重复实验和阳性对照、阴性对照以及空白对照实验，阳性对照由经形态学专家验证的梨小食心虫体提取的DNA为模板，可确保核酸提取和扩增反应的有效性；空白对照中不加模板DNA，而以灭菌蒸馏水代替，用于检验是否存在PCR污染和较高的引物二聚体污染；阴性对照为苹果蠹蛾、香梨优斑螟提取的DNA为模板，避免出现假阴性结果；设置三个重复确保数据可靠准确。

步骤②所述的实时荧光PCR检测时的反应参数为：95℃预处理15s，再以95℃变性5s，60℃退火/延伸34s，进行40个循环，在每个循环的60℃退火/延伸阶段收集荧光信号。

步骤③中检测结果的判定标准为：根据样品扩增出具有指数增长型的荧光扩增曲线，当其Ct值小于35，且阴性对照和空白对照无荧光信号，说明该样品受到梨小食心虫污染，否则不是梨小食心虫污染。当检测样品Ct值小于35，但阴性对照/空白对照有荧光信号，说明该检测结果不可信，整个检测过程需要重新做。

本发明中所述的水均为无核酸酶污染的双蒸水。

本发明中还可以通过标准曲线验证所设计引物和探针的扩增效率以及对建立的荧光PCR反应进行重复性和灵敏性分析。所述标准曲线是以前述的DNA扩增模板的连续的5个浓度梯度为样品，每个样品设置3个重复，扩增得到的平均Ct值为纵坐标，模板起始浓度为横坐标的关系曲线。

本发明的优点在于：

特异性高：本发明利用梨小食心虫COI基因中的差异性序列设计特异性引物，用该引物扩增苹果蠹蛾、香梨优斑螟和梨小食心虫，1％琼脂糖凝胶电泳结果仅有梨小食心虫样本中出现一条114bp的清晰条带，其它对照样品均无条带产生。此外，本发明还设计了一条特异性荧光探针，在实时荧光检测过程中对靶片段进行双重质控，利用上述的引物和探针序列进行实时荧光PCR扩增验证，仅有梨小食心虫样品出现了指数型的扩增曲线,其余对照样品无荧光信号，本发明设计的引物和探针可以保证扩增的特异性，避免假阳性检测结果。

重复性好：本发明使用DNA扩增模板的连续5个浓度梯度样品做标准曲线，每个样品设置三个重复，这三个重复之间的变异系数在0.243-0.978之间，标准曲线的R²值为0.9900，试验数据具有良好的线性关系，重复性较好。

灵敏度高：本发明梨小食心虫COI基因扩增效率为96.74％，在可接受的PCR扩增效率范围内(90-110％)。DNA溶液在4.75×10^-3～47.52ng/μL的检测范围内荧光定量PCR起始模板浓度和C_t值之间具有较好的线性关系，本发明建立的分子检测体系灵敏度较高，最低检出限在4.75×10^-3ng/μL，即4.75pg/μL，满足检验检疫日常检测需求。

本发明所涉及的操作方法简单，易行，能够在较短时间内(约3小时)完成梨小食心虫的鉴定，一次可检测多个样品，特别适合于大批量的抽样检查，可应用到实际检疫工作中，不仅能大大缩短进出口物品的通关时间，而且还能降低检疫人员的工作强度，为进出口安全提供了技术保障。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为使用本发明特异性引物和探针实时荧光PCR扩增待检样本，阳性对照，阴性对照等成虫以及空白对照的扩增曲线图谱；

1.通过形态学专家鉴定为梨小食心虫成虫的样本为阳性对照；

2.疑似梨小食心虫成虫的待检样本；

3.通过形态学专家鉴定为苹果蠹蛾成虫的样本为阴性对照；

4.通过形态学专家鉴定为香梨优斑螟成虫的样本为阴性对照；

5.以灭菌蒸馏水为模板的空白对照。

图2为使用本发明特异性引物和探针实时荧光PCR扩增待检样本，阳性对照，阴性对照等幼虫以及空白对照的扩增曲线图谱；

1.通过形态学专家鉴定为梨小食心虫幼虫的样本为阳性对照；

2.疑似梨小食心虫幼虫的待检样本；

3.通过形态学专家鉴定为苹果蠹蛾幼虫的样本为阴性对照；

4.通过形态学专家鉴定为香梨优斑螟幼虫的样本为阴性对照；

5.以灭菌蒸馏水为模板的空白对照。

图3为使用10倍梯度稀释的标准品在实时荧光PCR体系中扩增的标准曲线图谱。

图4为使用本发明特异性引物和探针实时荧光PCR进行盲样测试的扩增曲线图谱；

2.盲1(成虫)

3.盲2(成虫)

4.盲3(幼虫)

5.盲4(幼虫)

6.盲5(幼虫)

7.通过形态学专家鉴定为苹果蠹蛾成虫的样本为阴性对照；

8.通过形态学专家鉴定为香梨优斑螟成虫的样本为阴性对照；

9.以灭菌蒸馏水为模板的空白对照。

图5为序列表1的比对。

图6为序列表2的比对。

具体实施方式

本发明基于目前的分子生物学技术手段，从待鉴定样品的DNA模板提取，特异性引物和探针设计和实时荧光PCR反应及结果判断等入手，通过开发新的方法以达到准确、快速检测梨小食心虫的目的。下面实施例用于本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。

备注说明：以下幼虫均指老熟幼虫。

实施例1、引物和探针的设计与合成

通过采集新疆巴州不同地区的梨小食心虫成虫及幼虫样本，以COI通用引物：正向引物:5’-GGWGGATTTGGAAATTGAYTAGTWCC-3’、反向引物:5’-CCHGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3’经常规PCR扩增和产物测序得到梨小食心虫COI基因片段序列。通过NCBI中的BLAST比对梨小食心虫COI特征序列，序列同源性达99％(AB603521.1、HQ538466.1、JF733841.1)，即COI区域的保守性较高，保证了引物设计的准确性。此外，我们还将梨小食心虫与苹果蠹蛾、香梨优斑螟的COI序列进行比对分析，寻找到他们之间的差异位点，在差异性序列区域设计种属特异性的引物和探针，并委托Takara(大连，中国)公司合成和标记。

上游引物LX-FP：5’-CAGCTCTTTTATTACTACTTTCACTACCA-3’

下游引物LX-RP：5’-AATAGGATCTCCTCCTCCT-3’

探针LX-P：5’-CGAAATCTTAATACTTCATTTTTTGACCCTG-3’

该探针的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团TRAMA。

备注说明：梨小食心虫特异性引物和探针的设计是本发明的关键，为了保证设计的准确性，我们开展了以下研究：

1.梨小食心虫种内COI基因保守性研究：将采集到的梨小食心虫成虫、幼虫及残骸标本，DNA提取后，以COI通用引物扩增，经常规PCR扩增和测序得到梨小食心虫线粒体基因COI片段序列。同时，我们从NCBI上下载了4条梨小食心虫的相关序列(KJ027508、AB603521.1、HQ538466.1、JF733841.1)。用CLUSTAL 2.1软件对上述的COI序列进行比对分析(见图5所述的序列表1)，同源性达99％，表明不同来源的梨小食心虫在COI区域的保守性很高，保证了引物设计的准确性。

2.香梨优斑螟、苹果蠹蛾种内COI基因保守性研究：将采集到的苹果蠹蛾和香梨优斑螟的成虫、幼虫及残骸标本，DNA提取后，以COI通用引物扩增，经常规PCR扩增和测序得到香梨优斑螟、苹果蠹蛾种内COI基因片段。同时，我们从NCBI上下载了3条苹果蠹蛾的相关序列(FJ217755.2、FJ217756.2、FJ217764.2)和3条香梨优斑螟的相关序列(KC215198.1、KC442311.1、KC442309.1)。用CLUSTAL 2.1软件对上述的COI序列进行比对分析，同源性分别达99％和97％，表明苹果蠹蛾和香梨优斑螟的COI区域的均具有较高的保守性。

3.梨小食心虫与其他两种害虫的COI序列比对：为了设计出针对梨小食心虫的特异性引物和探针，我们对梨小食心虫、苹果蠹蛾和香梨优斑螟的COI序列进行了比对分析(见图6所述的序列表2)，寻找出种间变异区，该区域的序列差异较大，而在种内又相当保守，因此选定该区域作为梨小食心虫引物和探针设计的靶序列。

4.通过实验验证梨小食心虫引物和探针的特异性(见实施例4)。

综上所述，本发明利用梨小食心虫与苹果蠹蛾和香梨优斑螟的序列差异，设计出了针对梨小食心虫特异的引物和探针，开发出了一种基于该引物和探针的实时荧光定量PCR鉴别梨小食心虫的快速检测方法。

实施例2总DNA的提取

取梨小食心虫及苹果蠹蛾、香梨优斑螟等阴性对照样本，放入研钵中，加液氮充分研磨，用DNeasy blood kit(Qiagen公司)提取样品DNA，按照试剂盒说明书操作。样品提取时所用的肌肉组织量：苹果蠹蛾：单头2.5-5.0mg，多头(4-5只)15-20mg；梨小食心虫：单头0.8-1.2mg，多头(12-13只)12-16mg；香梨优斑螟：单头1.8-2.2mg，多头(3-5只)8-12mg；地老虎：单头8-12mg；单头加30μL TE缓冲液进行洗脱，多头加60μL TE缓冲液洗脱。DNA溶液于-20℃保存备用。

提取得到的DNA溶液经核酸蛋白分析仪检测，OD260/280大于1.5，OD260/230大于1.0，提取效果均良好，浓度在30-200ng/μL(未经RNase降解)，经10-100倍稀释后可用于实时荧光PCR检测。

备注说明：以下实施例3～实施例5采用的是单头所得的DNA。

实施例3实时荧光PCR检测

25μL实时荧光PCR反应体系中包括：灭菌蒸馏水16.75μL，10×PCR Buffer(含Mg²⁺)2.5μL，dNTP(2.5mM，each)2μL，上下游引物(10μM)各0.5μL，探针(10μM)0.5μL，500U TaqDNA聚合酶0.25μL和DNA模板(实施例2提取得到的DNA溶液)2μL。反应混合液在ABI 7500实时定量PCR仪中进行扩增。反应条件设置为95℃预处理15s，再以95℃变性5s，60℃退火/延伸34s，进行40个循环。同时设置重复实验和阳性对照、阴性对照以及空白对照实验。实验结果应用ABI 7500software v2.0.1进行分析处理。

实施例4实时荧光PCR检测特异性试验

将通过形态学鉴定的梨小食心虫，香梨优斑螟，苹果蠹蛾的成虫和幼虫的样本分别按照实施例2所述方法进行DNA的提取，分别以上述DNA为模板，以通过形态学鉴定的梨小食心虫为阳性对照，以香梨优斑螟、苹果蠹蛾为阴性对照，以灭菌蒸馏水为空白对照，以待测虫体作为待测样本；进行实时荧光PCR反应，反应条件及设置同实施例3，目的是验证梨小食心虫COI基因引物和探针的特异性。结果如图1和图2所示。结果显示：只有以梨小食心虫成虫和幼虫的DNA为模板的反应管中显示了指数型扩增曲线，其他虫体样本均无信号，证明梨小食心虫COI基因引物和探针具有特异性。

表1各检测样本(成虫)实时荧光PCR反应的Ct值分析表

表2各检测样本(幼虫)实时荧光PCR反应的Ct值分析表

实施例5实时荧光PCR检测重复性和灵敏性试验

提取梨小食心虫样本的基因组DNA，将测定好浓度的基因组DNA作为标准品，进行10倍梯度稀释，共设置5个梯度，分别为47.52ng/μL、4.752ng/μL、0.4752ng/μL、0.04752ng/μL和0.004752ng/μL，稀释介质为基因组DNA提取时所用的洗脱液(即实施例2中的TE缓冲液)。对5个梯度的标准品为模板进行实时荧光PCR反应，每个梯度设置3个重复。以标准品浓度的自然对数值为横坐标，以Ct值为纵坐标做标准曲线(图3)，其R²为0.990。对Ct值统计分析(表3)，同一参照样品重复间Ct值变异较小，梨小食心虫COI基因Ct值变化范围在19.01-34.39之间，标准偏差在0.243-0.978之间，表明该方法具有较好的重复性和稳定性。

表3梨小食心虫浓度梯度标准品Ct值分析表

由表3可示，在最高稀释度的样品中，梨小食心虫COI基因得到扩增，Ct值为34.39，接近检测临界限(Ct＝35)，结果表明梨小食心虫COI基因在模板浓度为0.004752ng/μL时为有效扩增，即确定该浓度为最低定量限，最低检测限为0.004752ng/μL，即4.752pg/μL。

实施例6、单多头DNA样本和DNA混合样本检测

将梨小食心虫的单(包括仅剩余头部或腹部的残体样本)、多头DNA样品以及苹果蠹蛾、香梨优斑螟和梨小食心虫混合DNA样品分别用梨小食心虫的特异性引物和探针进行扩增，检验单多头取样和混合样本提取的模板DNA对后续扩增反应以及对引物探针特异性的影响。结果显示只有梨小食心虫存在的样本才能得到扩增，其他样本无信号。各个反应的PCR扩增C_t值汇总如表4所示。

表4单多头DNA样本和DNA混合样本荧光定量PCR检测结果

由表4可示，在苹果蠹蛾、香梨优斑螟的单、多头DNA样本中，所得到扩增曲线的Ct值均大于40，为阴性，即无梨小食心虫存在。而在梨小食心虫单头、多头和3种害虫混合样本中，所得到扩增曲线的Ct值分别为17.45、16.71和18.29，为阳性，即有梨小食心虫存在。

实施例7盲样测试

将上述所建立的荧光定量PCR检测体系应用于梨小食心虫的日常检测。项目组形态学专家制作了成虫和幼虫盲样，分别以盲1～盲5标记，使用本发明研究确立的引物探针以及实时荧光定量PCR体系方法检测鉴定是否是梨小食心虫，见表5和图4，结果表明用本发明建立的分子检测方法鉴定的结果同形态学专家鉴定的一致。

表5盲样测试结果表

对比例1-1、

将实施例1中的特异性引物改成：

LX-FP-1：5'TTCATCCTGTTCCTGCTC 3'

LX-RP-1：5'TATTAGGTGCCCCAGATA 3'；

其余同实施例1。然后按照实施例2～实施例4所述方法进行检测，最终所得结果为：空白对照中有荧光信号，即该引物产生了非特异性扩增，不能准确有效扩增目的片段，不能作为梨小食心虫的特异性引物。

对比例1-2、

将实施例1中的特异性引物改成：

LX-FP-2：5'AGTCTACTGAGCTTCCTC 3'

LX-RP-2：5'TTGATTATTACCTCCTTC 3'

其余同实施例1。然后按照实施例2～实施例4所述方法进行检测，最终所得结果为：苹果蠹蛾阴性对照管中有微弱荧光信号，即该引物是在梨小食心虫和苹果蠹蛾COI序列差异较小的区域进行设计的，引物特异性差，不能区分这两种害虫，不能作为梨小食心虫的特异性引物。

对比例2、

将实施例1中的探针改成：

5'CTGGTGCTATTACTATACTTTTAACAGATCGAAA 3'；

其余同实施例1。然后按照实施例2～实施例4所述方法进行检测，最终所得结果为：苹果蠹蛾阴性对照管中有微弱荧光信号，即该探针是在梨小食心虫和苹果蠹蛾COI序列差异较小的区域进行设计的，探针特异性差，不能区分这两种害虫，不能作为梨小食心虫的特异性探针。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

<110> 中华人民共和国库尔勒出入境检验检疫局

<120> 梨小食心虫荧光PCR检测方法与应用

<160> 3

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物LX-FP

<400> 1

cagctctttt attactactt tcactacca 29

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物LX-RP

<400> 2

aataggatct cctcctcct 19

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Taqman探针

<400> 3

cgaaatctta atacttcatt ttttgaccct g 31

Claims

1.梨小食心虫实时荧光PCR检测方法，其特征是：

检测中所用特异性引物和探针的核苷酸分别为：

特异性引物为：

F-Primer:5’-CAGCTCTTTTATTACTACTTTCACTACCA-3’

R-Primer:5’-AATAGGATCTCCTCCTCCT-3’；

探针为：

Probe：5’-(FAM)CGAAATCTTAATACTTCATTTTTTGACCCTG(TAMRA)-3’。

2.根据权利要求1所述的梨小食心虫实时荧光PCR检测方法，其特征是包括以下步骤：

①、待鉴定样品基因组DNA的提取；

②、实时荧光定量PCR扩增体系设置：

以基因组DNA为扩增模板，用上述特异性引物和探针，进行实时荧光PCR检测；

③、扩增结果分析及结果判断。

3.根据权利要求2所述的梨小食心虫实时荧光PCR检测方法，其特征是：

4.根据权利要求2或3所述的梨小食心虫实时荧光PCR检测方法，其特征是：

所述步骤②实时荧光定量PCR扩增体系设置为：

25μL总体积中含有10×PCR Buffer 2.5μL，2.5mM、each的dNTP2μL，10μM的上下游引物各0.5μL，10μM的探针0.5μL，500U Taq DNA聚合酶0.25μL和DNA模板2μL，补水至25μL。

5.根据权利要求4所述的梨小食心虫实时荧光PCR检测方法，其特征是：

实时荧光PCR扩增条件为：95℃预处理15s，再以95℃变性5s，60℃退火/延伸34s，进行40个循环，在每个循环的60℃退火/延伸阶段收集荧光信号。

6.根据权利要求5所述的梨小食心虫实时荧光PCR检测方法，其特征是：

所述步骤③的扩增结果分析及结果判断为：根据样品扩增出具有指数增长型的荧光扩增曲线，当其Ct值小于35，且阴性对照和空白对照无荧光信号，说明该样品受到梨小食心虫污染，否则不是梨小食心虫污染；当检测样品Ct值小于35，但阴性对照/空白对照有荧光信号，说明该检测结果不可信，整个检测过程需要重新做。

7.根据权利要求6所述的梨小食心虫实时荧光PCR检测方法，其特征是：

所述步骤①的梨小食心虫待检样品的DNA的提取可采用CTAB法、SDS法、高盐低pH法或试剂盒法进行提取。