CN104293970B - 木薯绵粉蚧特异性ss-coi引物对及快速pcr检测方法和试剂盒 - Google Patents

木薯绵粉蚧特异性ss-coi引物对及快速pcr检测方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及木薯绵粉蚧特异性SS‑COI引物对及快速PCR检测方法和试剂盒。所述引物对包括引物PMZWMEF1：5′‑CTTGATAAAACAGGAATTGAG‑3′；和引物PMZWMER1：5′‑CCTTTGATGATTTCTTCTTCT‑3′。该引物只对木薯绵粉蚧具有扩增能力，对单粒卵、初孵若虫以及成虫残体亦有良好的检测效果。是对木薯绵粉蚧形态学检测鉴定方法的补充和改进。同时，本方法采用SS‑COI PCR技术，提高了检测的准确性，节约了检测时间，可以试剂盒的形式在我国口岸、木薯生产基地、有机蔬菜和有机水果生产基地、鲜切花生产基地、棉花种植区，以及蔬菜、观赏植物、果树种苗/植株调运中推广。

Description

木薯绵粉蚧特异性SS-COI引物对及快速PCR检测方法和试 剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地，本发明涉及木薯绵粉蚧特异性SS-COI引物对及快速PCR检测方法和试剂盒。
背景技术
木薯绵粉蚧(Cassava mealybug)Phenacoccus manihoti Matile-Ferrero，属半翅目、粉蚧科、绵粉蚧属，是一种世界性检疫害虫，2011年6月20日中华人民共和国农业部和国家质量监督检验检疫总局联合发布公告将其列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》(农业部国家质检总局公告第1600号)，并要求各出人境检验检疫机构依法加强对该虫发生国家或地区寄主植物的检验检疫。木薯绵粉蚧嗜食木薯尤其是甜木薯，并常在木薯上暴发成灾，而在其寄主植物上迄今尚未有成灾的报道。已有的研究表明，木薯绵粉蚧的寄主植物有15科27种加3属，包括农作物、园林植物、杂草和果树等，严重受害的植物有大戟科的木薯、一品红、木薯胶、异叶南洋杉、飞扬草、苦竹等；马齿苋科的菜用土人参、马齿苋等；菊科Aspilla属植物、胜红蓟、金腰箭属的苦草Sydrella nodiflora、紫茎泽兰、飞机草等；椴树科的黄麻属植物；茜草科的伞房花耳草；荨麻科的甜麻；苋科苋属植物；蔷薇科的木瓜；茄科的番茄、马铃薯、辣椒等；豆科的花生、大豆等；锦葵科的秋葵、棉花等；薯蓣科薯蓣属的一种植物Dioscera sp.、甘薯等；凤梨科的菠萝；芸香科的柑橘；葫芦科的南瓜等。而且，随着木薯绵粉蚧入侵区域的逐渐扩大和定居时间的推移，其寄主植物的种类和危害程度有进一步增加的趋势。木薯绵粉蚧营孤雌生殖，主要以雌性成虫和若虫群居在寄主植物的幼嫩部位进行刺吸为害，为害部位包括嫩枝、嫩叶、嫩梢、花芽和叶柄以及窖储块根、块茎等，受害木薯叶片发黄、卷曲、脱落，受害植株长势衰弱，生长缓慢或停滞，失水干枯，亦可造成叶片大量脱落、生长点丛生、枝条畸形、嫩枝枯死；而成虫和若虫分泌的蜜露诱发的煤污病不仅严重影响植物的光合作用，还可导致叶片枯萎脱落，严重时可造成植株成片死亡；此外，木薯绵粉蚧还可传播重大检疫性病原物非洲木薯花叶病毒。如上世纪70年代木薯绵粉蚧传入非洲刚果，并迅速扩散至非洲所有的木薯种植区，成为非洲木薯的主要害虫，导致木薯减产84％，每年造成的经济损失高达20亿美元；又如，在我国的邻邦泰国，2009年初发现木薯绵粉蚧，5月份其危害面积就达16万公顷，仅20个府的损失就有28亿铢(约合8629.6万美元)，用于防治木薯绵粉蚧的费用达6500万铢(约合200万美元)。
木薯绵粉蚧原产于南美洲中部，是当地木薯上的一种重要害虫，后随寄主植物及其产品传播扩散，陆续在西非、中非、东非发现，给非洲木薯产业造成巨大损失。2008年(或许更早)传入泰国，目前已在亚洲的泰国、老挝、柬埔寨、越南、印度尼西亚，非洲的安哥拉、贝宁、布隆迪、刚果、科特迪瓦、冈比亚、加纳、几内亚、几内亚比绍、肯尼亚、马拉维、莫桑比克、尼日利亚、卢旺达、塞内加尔、塞拉利昂、苏丹、坦赞尼亚、扎伊尔、中非共和国，南美洲的阿根廷、玻利维亚、巴西、哥伦比亚、巴拉圭、圭亚那等31个国家和地区严重发生，是威胁世界木薯生产安全的重大入侵害虫。经多方考证，目前我国尚未发现木薯绵粉蚧，然而，木薯绵粉蚧在我国广东、广西、海南等省的绝大部分地区以及福建、江西、贵州、云南等省份部分地区高度适生，在重庆、四川等部分地区中度适生。因此，尽快研发木薯绵粉蚧快速检测技术，加强对木薯绵粉蚧的监测检测，是保障我国木薯及蔬菜花卉产业和水果、棉花产业健康发展的必要前提。
木薯绵粉蚧为小型昆虫，营孤雌生殖，雌性成虫卵圆形，活体粉红色，被白色蜡粉，体长1.17-2.37mm；卵长0.31-0.42mm，初孵若虫体长0.49-0.75mm，淡粉红色，略微透明，肉眼难以发现。雌性成虫将卵产于生殖孔附近的棉絮状的卵囊内，初孵若虫活跃，从卵囊爬出后短时间内即可取食危害，并可迁移至邻近植株。而加强检疫和监测必需建立一套快速准确的分子检测方法。目前国际上用于木薯绵粉蚧鉴定的方法主要有：1)形态特征鉴定。但目前国内针对木薯绵粉蚧尚没有任何标准的检测方法，并且基于形态学特征的《木薯绵粉蚧检疫鉴定方法》的行业标准尚未纳入制定规划。
COI技术曾用于鉴别木薯绵粉蚧的近缘种。mtDNA COI技术检测是利用通用型的引物，在DNA聚合酶的催化下，对目标DNA进行体外扩增，然后将PCR产物回收、纯化、测序，根据序列比对和系统发育树构建来判断检测结果。SS-COI PCR技术检测是在mtDNA COI技术的基础上发展起来的特异序列扩增区域标记，是利用特异性的引物，根据预期DNA条带的有无来判断检测结果，无需测序和序列比对，具有灵敏度高、特异性强、快速、简便且重现性好和稳定性强等优点。
发明内容
本发明的目的为提供木薯绵粉蚧特异性SS-COI引物对。
本发明的再一目的为提供一种木薯绵粉蚧特异性基因片段。
本发明的另一目的为提供一种木薯绵粉蚧的特异性快速PCR检测方法。
本发明的再一目的为提供一种木薯绵粉蚧的特异性快速PCR检测试剂盒。
本发明根据木薯绵粉蚧的线粒体DNA序列，设计一对种特异性引物，该引物只对木薯绵粉蚧具有扩增能力。是对木薯绵粉蚧形态学检测鉴定方法的补充和改进。同时，本方法采用SS-COI PCR技术，提高了检测的准确性和灵敏度，节约了检测时间，在木薯绵粉蚧检测监测方面具有很高的应用价值，可以试剂盒的形式在我国口岸、木薯生产基地、有机蔬菜和有机水果生产基地、鲜切花生产基地，以及蔬菜、观赏植物、果树种苗/植株调运中推广。
根据本发明的一对木薯绵粉蚧特异性SS-COI引物为：
引物PMZWMEF1：5′-CTTGATAAAACAGGAATTGAG-3′；和
引物PMZWMER1：5′-CCTTTGATGATTTCTTCTTCT-3′。
根据本发明的木薯绵粉蚧特异性基因片段的核苷酸序列如PMZWME ID No:1所示。
根据本发明的木薯绵粉蚧种特异性检测方法包括使用上述SS-COI引物进行PCR扩增的步骤。
根据本发明的木薯绵粉蚧种特异性检测试剂盒包括上述木薯绵粉蚧特异性SS-COI引物。
本发明的木薯绵粉蚧种特异性SS-COI引物及快速PCR检测方法，用于快速检测木薯绵粉蚧。与国际现有方法相比，本发明具有以下的技术优势：
1)检测准确性高。本方法根据木薯绵粉蚧种特异性SS-COI标记设计的引物PMZWMEF1和PMZWMER1，在PCR快速检测木薯绵粉蚧时，可扩增出353bp的片段，不仅对木薯绵粉蚧的单头成虫、2龄和3龄若虫可以进行检测，对于单粒卵和单头初孵若虫也能准确检测。
2)操作简便快捷。本发明采用PCR技术，操作过程简单、快速、高效。一般整个过程可在5个小时内完成。
3)特异性强。本发明设计的引物可特异性检测木薯绵粉蚧，在其近缘种、属粉蚧中无扩增产物。
因此本方法实用性强，可满足植物检疫及害虫监测/检测的需要。
附图说明
图1为引物PMZWMEF1/PMZWMER1对木薯绵粉蚧及其近缘种、属粉蚧的SS-COI PCR扩增结果，
M:分子量标准Trans2KTM；1:木薯绵粉蚧Phenacoccus manihoti Matile-Ferrero；2:扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis Tinsley；3:石蒜绵粉蚧Phenacoccus solani(Ferris)；4:新菠萝灰粉蚧Dysmicoccus neobrevipes Beardsley；5:菠萝粉蚧Dysmicoccus brevipes(Cockerell)；6:双条拂粉蚧Ferrisia virgata Cockerell；7:木槿曼粉蚧Maconellicoccus hirsutus Green；8:长尾粉蚧Pseudococcus longispinusTargioni；9:暗色粉蚧Pseudococcus viburni(Signoret)；10:阴性对照(超纯水)。
图2为引物PMZWMEF1/PMZWMER1对木薯绵粉蚧不同虫态、龄期和残体以及寄主植物的SS-COI PCR扩增结果，
M:分子量标准Trans2KTM；1-5:寄主植物为南瓜，1:单粒卵，2:1龄若虫，3:2龄若虫，4:3龄若虫，5:雌性成虫；6:寄主植物为木薯，6:雌性成虫；7-10:寄主植物为南瓜，7:头部，8:胸部，9:腹部，10:足；11:阴性对照(超纯水)。
图3为引物PMZWMEF1/PMZWMER1对木薯绵粉蚧检测阈值的测定，
M:分子量标准Trans2KTM；1-12分别为:1:1/40；2:1/80；3:1/160；4:1/320；5:1/640；6:1/1280；7:1/2560；8:1/5120；9:1/10240；10:1/20480；11:1/40960；12:1/81920头雌性成虫；13:阴性对照(超纯水)。
具体实施方式
实施例1：引物PMZWMEF1/PMZWMER1对木薯绵粉蚧的扩增效果
1)粉蚧模板DNA的制备
将单头粉蚧置于滴有20μL提取缓冲液(10mM Tris-HCl、50mM EDTA、0.5％SDS、100mM NaCl、0.2％β-巯基乙醇,pH 8.0)的parafilm膜上,以0.2mL的PCR管底部作为匀浆器充分研磨，匀浆液以微量移液器移入1.5mL离心管；然后以180μL缓冲液分2次清洗匀浆器和Parafilm膜，移入同一离心管，混匀，加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀后于65℃水浴40min(中途混匀2次)；然后沸水浴8min，加入200μL氯仿/异戊醇(V:V＝24:1)抽提液，轻柔混匀数十次后，冰上放置30min；4℃、7500r/min离心10min，取上清液约200μL移入另一离心管，加入400μL预冷的异丙醇，轻轻混匀，待出现少量絮状沉淀后于-20℃放置30min；4℃、12000r/min离心15min，小心弃去上清液。加入400μL预冷的75％乙醇洗涤，4℃、12000r/min离心10min，小心弃去上清液；然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥20min后每管加入40μL超纯水，充分溶解后于-20℃保存备用。
2)检验木薯绵粉蚧的特异性引物的合成
Primer PMZWMEF1：5’-CTTGATAAAACAGGAATTGAG-3’
Primer PMZWMER1：5’-CCTTTGATGATTTCTTCTTCT-3’由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
3)PCR扩增反应
反应体系为25μL，其中10×PCR buffer 2.5μL(含Mg2+)、dNTP(10mM)0.4μL、Taq聚合酶(2.5U/μL)0.3μL、上游引物和下游引物(10μM)各0.4μL、模板DNA 1.0μL、超纯水20.0μL。
4)PCR扩增程序
95℃预变性2min；38个循环：94℃30sec、51℃30sec、72℃30sec；最后72℃延伸5min。
5)PCR产物的鉴定
取4μL PCR产物用含有Gold view的1.0％(重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，后于凝胶成像系统根据扩增产物的大小判定结果。
结果
利用引物primer PMZWMEF1/PMZWMER1以木薯绵粉蚧DNA为模板，以扶桑绵粉蚧、石蒜绵粉蚧、新菠萝灰粉蚧、菠萝粉蚧、双条拂粉蚧、木槿曼粉蚧、长尾粉蚧、暗色粉蚧等8种同属/科其他常见种类的粉蚧为对照进行SS-COI PCR扩增。在1泳道的木薯绵粉蚧中扩增出了353bp的目的条带(见附图1的1泳道)，在其他8种近缘属、种的粉蚧中均无扩增产物。说明所筛选的来自木薯绵粉蚧线粒体DNA的特异性SS-COI PCR扩增引物的特异性强。
353bp片段的序列：
实施例2：引物PMZWMEF1/PMZWMER1对木薯绵粉蚧不同虫态、龄期和残体以及寄主植物的扩增效果
1)木薯绵粉蚧模板DNA的制备
将来自南瓜的不同虫态(成虫、卵、若虫)和龄期(1龄、2龄、3龄)的单头/单粒木薯绵粉蚧，以及单头雌性成虫(分别来自南瓜和木薯)及其头部、胸部、腹部、足(均来自南瓜)分别置于滴有20μL提取缓冲液(10mM Tris-HCl、50mM EDTA、0.5％SDS、100mM NaCl、0.2％β-巯基乙醇,pH 8.0)的parafilm膜上,以0.2mL的PCR管底部作为匀浆器充分研磨，匀浆液以微量移液器移入1.5mL离心管；然后以180μL缓冲液分2次清洗匀浆器和Parafilm膜，移入同一离心管，混匀，加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀后于65℃水浴40min(中途混匀2次)；然后沸水浴8min，加入200μL氯仿/异戊醇(V:V＝24:1)抽提液，轻柔混匀数十次后，冰上放置30min；4℃、7500r/min离心10min，取上清液约200μL移入另一离心管，加入400μL预冷的异丙醇，轻轻混匀，待出现少量絮状沉淀后于-20℃放置30min；4℃、12000r/min离心15min，小心弃去上清液。加入400μL预冷的75％乙醇洗涤，4℃、12000r/min离心10min，小心弃去上清液；然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥20min后每管加入30μL(其中卵20μL，成虫40μL)超纯水，充分溶解后于-20℃保存备用。
2)检验木薯绵粉蚧的特异性引物的合成
Primer PMZWMEF1：5’-CTTGATAAAACAGGAATTGAG-3’
Primer PMZWMER1：5’-CCTTTGATGATTTCTTCTTCT-3’由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
3)PCR扩增反应
反应体系为25μL，其中10×PCR buffer 2.5μL(含Mg2+)、dNTP(10mM)0.4μL、Taq聚合酶(2.5U/μL)0.3μL、上游引物和下游引物(10μM)各0.4μL、模板DNA 1.0μL、超纯水20.0μL。
4)PCR扩增程序
95℃预变性2min；38个循环：94℃30sec、51℃30sec、72℃30sec；最后72℃延伸5min。
5)PCR产物的鉴定
取4μL PCR产物用含有Gold view的1.0％(重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，后于凝胶成像系统根据扩增产物的大小判定结果。
结果
利用引物PMZWMEF1/PMZWMER1以不同虫态、龄期和残体以及寄主植物的木薯绵粉蚧DNA为模板进行PCR扩增。木薯绵粉蚧的雌性成虫(寄主植物分别为南瓜和木薯)扩增出了353bp的目的条带(见附图2的5、6泳道)；同时木薯绵粉蚧的单粒卵、单头初孵若虫、2龄若虫、3龄若虫，以及雌性成虫的头部、胸部、腹部和足也扩增出了353bp的目的条带(见附图2的1、2、3、4泳道，以及附图2的7、8、9、10泳道)；说明所筛选的木薯绵粉蚧的种特异性SS-COIPCR扩增引物的准确性高。
实施例3：引物PMZWMEF1/PMZWMER1对木薯绵粉蚧检测阈值的测定
1)木薯绵粉蚧模板DNA的制备
将单头木薯绵粉蚧雌性成虫置于滴有20μL提取缓冲液(10mM Tris-HCl、50mMEDTA、0.5％SDS、100mM NaCl、0.2％β-巯基乙醇,pH 8.0)的parafilm膜上,以0.2mL的PCR管底部作为匀浆器充分研磨，匀浆液以微量移液器移入1.5mL离心管；然后以180μL缓冲液分2次清洗匀浆器和Parafilm膜，移入同一离心管，混匀，加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀后于65℃水浴40min(中途混匀2次)；然后沸水浴8min，加入200μL氯仿/异戊醇(V:V＝24:1)抽提液，轻柔混匀数十次后，冰上放置30min；4℃、7500r/min离心10min，取上清液约200μL移入另一离心管，加入400μL预冷的异丙醇，轻轻混匀，待出现少量絮状沉淀后于-20℃放置30min；4℃、12000r/min离心15min，小心弃去上清液。加入400μL预冷的75％乙醇洗涤，4℃、12000r/min离心10min，小心弃去上清液；然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥20min后每管加入40μL超纯水，充分溶解。原模板溶液以2倍进行递减梯度稀释至1/81920头，取1μL作为PCR扩增的模板，直接加到PCR反应体系中。
2)检验木薯绵粉蚧的特异性引物的合成
Primer PMZWMEF1：5’-CTTGATAAAACAGGAATTGAG-3’
Primer PMZWMER1：5’-CCTTTGATGATTTCTTCTTCT-3’由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
3)PCR扩增反应
反应体系为25μL，其中10×PCR buffer 2.5μL(含Mg2+)、dNTP(10mM)0.4μL、Taq聚合酶(2.5U/μL)0.3μL、上游引物和下游引物(10μM)各0.4μL、模板DNA 1.0μL、超纯水20.0μL。
4)PCR扩增程序
95℃预变性2min；38个循环：94℃30sec、51℃30sec、72℃30sec；最后72℃延伸5min。
5)PCR产物的鉴定
取4μL PCR产物用含有Gold view的1.0％(重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，后于凝胶成像系统根据扩增产物的大小判定结果。
结果
利用引物PMZWMEF1/PMZWMER1做检测阈值的测定，以不同稀释倍数的木薯绵粉蚧DNA为模板进行PCR扩增，能检测到的最低模板DNA浓度为1/20480头雌性成虫(见附图3)。

Claims (3)

1.木薯绵粉蚧特异性SS-COI引物对，其特征在于，所述引物序列为：
引物PMZWMEF1：5′-CTTGATAAAACAGGAATTGAG-3′；和
引物PMZWMER1：5′-CCTTTGATGATTTCTTCTTCT-3′。
2.一种木薯绵粉蚧特异性检测方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1所述SS-COI引物对进行PCR扩增的步骤。
3.一种木薯绵粉蚧检测特异性检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的木薯绵粉蚧特异性SS-COI引物对。
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