CN113025724B - 一种鉴定小圆胸小蠹昆虫的双重pcr引物、方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴定小圆胸小蠹昆虫的双重PCR引物、方法及应用。所述鉴定小圆胸小蠹昆虫的双重PCR引物，包含引物XdCOIF、XdCOIR、Xd16SF和Xd16SR，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示。本发明所提供的引物具有扩增效率高，特异性强的特点，使用本发明设计的引物和双重PCR方法不仅可以保证小圆胸小蠹鉴定的高准确率，减少DNA样本量的消耗，而且可以明显缩短鉴定时间，克服了以往依据形态特征鉴定小圆胸小蠹的局限性问题，适用于小圆胸小蠹昆虫的鉴定。

Description

一种鉴定小圆胸小蠹昆虫的双重PCR引物、方法及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种鉴定小圆胸小蠹昆虫的双重PCR引物、方法及试剂盒。

背景技术

小圆胸小蠹(EuwallaceafornicatusEichhoff)，也称茶枝小蠹、茶材小蠹，隶属于鞘翅目(Coleoptera)象甲科(Curculionidae)小蠹亚科(Scolytinae)方胸小蠹属(Euwallacea)。小圆胸小蠹是一种国际性的重大林木害虫，也是近年来国内外爆发成灾的重大蛀干害虫之一。小圆胸小蠹在我国主要分布于广东、广西、海南、四川、云南、贵州、福建和台湾等地；国外主要分布于斯里兰卡、孟加拉国、柬埔寨、日本、印度、印度尼西亚、马来西亚、缅甸、泰国等24个国家和地区。小圆胸小蠹的寄主十分广泛，包括漆树科、使君子科、五加科、紫葳科、番荔枝科、槭树科、木麻黄科、红木科、橄榄科、木槿科等，共计36科100余种，其主要通过虫、菌结合危害阔叶树种和茶树、橡胶树、荔枝、龙眼等经济林、果树。寄主植物种类多是该虫的特点之一，成虫在寄主植物体内羽化后，即开始寻找新的寄主植物，并钻蛀到新寄主植物枝干内进行产卵。在成虫钻蛀过程中，其体表携带的真菌孢子散落在蛀道内并开始生长。真菌菌丝的过度生长可阻塞寄主植物的维管束，影响树体水分传导，与该虫共同危害致死树木。

对害虫进行快速、准确地鉴定是实施害虫防治的基础和关键。目前对于小圆胸小蠹的成虫鉴定还是以其形态特征为主，但由于小圆胸小蠹的体型较小，且同一属内物种形态极为相似等特点，增加了对其准确鉴定的难度。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有小圆胸小蠹昆虫鉴定方法的缺陷和不足，提供一种鉴定小圆胸小蠹昆虫的双重PCR引物、方法及试剂盒。

本发明的目的是提供一种鉴定小圆胸小蠹昆虫的双重PCR引物。

本发明另一目的是提供一种鉴定小圆胸小蠹昆虫的方法。

本发明再一目的是提供所述双重PCR引物在鉴定小圆胸小蠹昆虫试剂/剂盒中的应用。

本发明的再一目的是提供一种用于鉴定小圆胸小蠹昆虫的试剂盒。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种鉴定小圆胸小蠹昆虫的双重PCR引物，包含引物XdCOIF、XdCOIR和Xd16SF、Xd16SR，所述引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示。

本发明以小圆胸小蠹的COI和16S基因序列为模板，通过Geneious 7.1.4，遵循PCR引物设计原则设计出对应的特异性引物，经筛选，确定了两对高效特异性强的引物XdCOIF/XdCOIR和Xd16SF/Xd16SR，引物的核苷酸序列依次如如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供所述双重PCR引物在检测/鉴定小圆胸小蠹昆虫的应用。

本发明还提供一种检测/鉴定鉴定小圆胸小蠹昆虫的双重PCR方法，包含以下步骤：

S1.提取待测样本基因组DNA；

S2.以步骤S1所得基因组DNA为模板，以权利要求1所述引物进行双重PCR扩增，并对扩增产物进行电泳；

S3.将步骤S2中两条条带大小分别为413bp和292bp左右的条带进行回收并测序，测序结果拼接、剪除两端引物后，在NCBI上通过BLAST同源相似性比对鉴定其是否为小圆胸小蠹。

优选地，步骤S1中选取成虫的胸部肌肉组织为样本进行DNA提取。

优选地，步骤S2中，PCR的扩增体系为：PCR Super Mix 24μL，10μmol/L上下游引物各1μL，DNA模板1μL，加无菌水补充至50μL。

优选地，步骤S2中，PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，50℃退火30s，68℃延伸2min，35个循环；68℃最终延伸10min。

本发明还提供所述双重PCR引物在制备检测/鉴定小圆胸小蠹昆虫的试剂或试剂盒中的应用。

一种检测/鉴定小圆胸小蠹昆虫的试剂盒，含有上述述双重PCR引物。

优选地，所述试剂盒还含有PCR扩增反应所需试剂。

本发明还提供所述试剂盒在检测/鉴定小圆胸小蠹昆虫中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种快速鉴定小圆胸小蠹昆虫的双重PCR引物及方法，克服了以往依据形态特征鉴定小圆胸小蠹的局限性问题。本发明所提供的引物具有扩增效率高，特异性强的特点，使用本发明设计的引物和双重PCR方法不仅可以保证小圆胸小蠹鉴定的高准确率，减少DNA样本量的消耗，而且可以明显缩短鉴定时间，适用于小圆胸小蠹的快速鉴定。

附图说明

图1为小圆胸小蠹的双重PCR检测结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

材料：血液/组织/细胞基因组提取试剂盒购于天根生化科技有限公司，全式金(TransGen Biotech，Beijing)Super Mix，无菌水，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

仪器：PCR仪、电泳仪和电泳槽为美国Bio-Rad公司生产的产品，离心机由德国Eppendorf公司生产。

实施例1双重PCR引物的设计

引物的设计与合成

以小圆胸小蠹的COI(GenBank登录号：MG642816和MH729189)和16S基因序列(GenBank登录号：KU727059、KU727060、KU727063)为模板，通过Geneious 7.1.4，遵循PCR引物设计原则设计出多对引物并进行特异性筛选。经过最终筛选，确定了两对高效特异性强的引物对XdCOIF/XdCOIR和Xd16SF/Xd16SR。所得引物如表1所示：引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1

实施例2双重PCR鉴定方法

1、样本基因组DNA的提取

采用DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit)，选取成虫胸部肌肉组织用于DNA的提取，提取步骤严格按照试剂盒说明进行。提取后的DNA置于-20℃下保存备用。。

2、双重PCR扩增

采用上述表1中所述引物XdCOIF/XdCOIR和Xd16SF/Xd16SR对所得样本DNA进行双重PCR检测。

双重PCR的反应体系为50μL体系：PCR Super Mix 24μL，上下游引物(10μmol/L)各1μL，DNA模板1μL，最后加无菌水补充至50μL。

双重PCR的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，50℃退火30s，68℃延伸2min，35个循环；68℃最终延伸10min。

3、PCR产物鉴定

取5μL PCR最终产物于绿如蓝核酸染料(DNA Green 10000×)染色的1％琼脂糖凝胶中电泳，然后在紫外灯照射下观察是否出现特异性条带，条带大小是否正确。结果如图1所示，其中泳道1为16S和COI的双重PCR反应结果，泳道2为16S的PCR反应结果，泳道3为COI的PCR反应结果。所得条带的大小符合所设计引物扩增的目的片段长度，将有条带的样品送上海生工生物工程股份有限公司进行序列测定。

4、序列拼接和鉴定

将测序的结果在Geneious 7.1.4中进行拼接，剪除两端引物，在NCBI上使用BLAST同源相似性检索对小圆胸小蠹进行鉴定。如果相似性结果大于98％，即可表明所鉴定的样本为小圆胸小蠹。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<120> 一种鉴定小圆胸小蠹昆虫的双重PCR引物、方法及试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 小圆胸小蠹(Euwallacea fornicatus Eichhoff)

<400> 1

gcattccctc ggcttaataa 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 小圆胸小蠹(Euwallacea fornicatus Eichhoff)

<400> 2

ccaaaaaatc agaatagat 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 小圆胸小蠹(Euwallacea fornicatus Eichhoff)

<400> 3

ggatgaggaa actactgtct c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 小圆胸小蠹(Euwallacea fornicatus Eichhoff)

<400> 4

cttaatttta atccaacatc g 21

Claims (9)

1.一种鉴定小圆胸小蠹昆虫的双重PCR引物，其特征在于，包含引物XdCOIF、XdCOIR和Xd16SF、Xd16SR，所述引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示。

2.权利要求1所述双重PCR引物在检测/鉴定小圆胸小蠹昆虫的应用。

3.权利要求1所述双重PCR引物在制备检测/鉴定小圆胸小蠹昆虫的试剂或试剂盒中的应用。

4.一种检测/鉴定小圆胸小蠹昆虫的双重PCR方法，其特征在于，包含以下步骤：

S1.提取待测样本基因组DNA；

S2.以步骤S1所得基因组DNA为模板，以权利要求1所述双重PCR引物进行双重PCR扩增，并对扩增产物进行电泳；

S3.将步骤S2中两条条带大小分别为413 bp和292 bp的条带进行回收并测序，测序结果拼接、剪除两端引物后，在NCBI上通过BLAST同源相似性比对鉴定其是否为小圆胸小蠹。

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤S2中，双重PCR的扩增体系为：PCR SuperMix 24 µL，10 µmol/L双重PCR引物各1 µL，DNA模板1 µL，加无菌水补充至50 µL。

6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤S2中，双重PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，68℃延伸2 min，35个循环；68℃最终延伸10min。

7.一种检测/鉴定小圆胸小蠹昆虫的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述双重PCR引物。

8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，还含有PCR扩增反应所需试剂。

9.权利要求7或8所述试剂盒在检测/鉴定小圆胸小蠹昆虫中的应用。

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