CN106434645A

CN106434645A - 一种降香黄檀的its区序列及用其鉴定降香黄檀的方法

Info

Publication number: CN106434645A
Application number: CN201611068677.4A
Authority: CN
Inventors: 朱爽; 李奇威; 王业胜; 林月霞; 周林
Original assignee: Guangdong Pharmaceutical University
Current assignee: Guangdong Pharmaceutical University
Priority date: 2016-11-29
Filing date: 2016-11-29
Publication date: 2017-02-22

Abstract

本发明公开一种降香黄檀的ITS区序列及用其鉴定降香黄檀的方法，该降香黄檀的ITS区序列的核苷酸性序列如SEQ ID NO：1所示。本发明的方法是采用引物ITS4和ITS5对待测木材样品的DNA进行PCR扩增得到ITS区序列，然后将两个ITS区序列进行匹配对比，通过核对10个位点的碱基信息从而判定待测木材样品是否为降香黄檀。本发明的方法可以简单快速有效地在分子生物学水平对降香黄檀进行分子鉴定，不但成本低廉、操作简单、而且鉴定准确很高。

Description

一种降香黄檀的ITS区序列及用其鉴定降香黄檀的方法

技术领域

本发明涉及植物种属鉴定技术，尤其涉及黄檀红木的鉴定技术，具体涉及一种降香黄檀的ITS区序列及用该ITS区序列鉴定降香黄檀的方法。

背景技术

红木是一类用于制作红木家具及红木工艺品的木材的总称。根据中华人民共和国国家标准GB/T 18107-2000《红木》的规定，红木共有5属（紫檀属、黄檀属、崖豆属、铁刀木属、柿属）8类（紫檀木类、花梨木类、香枝木类、黑酸枝木类、红酸枝木类、鸡翅木类、乌木类、条纹乌木类）33种。其中降香黄檀（Dalbergia odorifera T. Chen）是海南濒危物种，为国家二级保护植物，市场上俗称海南香枝木或海南黄花梨，由于其材质坚硬、心材极耐腐且具有美丽外观而成为高端红木家具的主要原料；且其心材可入药，具行气活血、抗氧化、抑制中枢等作用，因此其价格一直高居不下。正是由于降香黄檀的珍贵，它与市场上其他红木物种具有较大的价格差异，因此时常出现一些不发分子将廉价木材冒充高价木材的现象，对生产者和消费者造成巨大的经济损失。因此木材识别技术对于木材的生产加工，保护珍稀濒危材种，规范市场秩序，维护消费者权益等方面具有重要意义。

传统的红木识别和区分主要是以宏观特征（如密度、结构、材色和纹理等）为依据，辅以必要的木材微观解剖学方法来确定其属种，然而这些方法需要鉴定者具有丰富的木材形态解剖学知识及鉴定经验，且由于近缘物种之间具有相似的形态学特征，传统的形态解剖学鉴定方法通常很难准确将木材鉴定到种的水平，给红木鉴别带来较大困难，无法满足市场需求。沈明月等人（2012）利用高效液相色谱法（HPLC）、朱涛等人（2013）利用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）技术成功对红木进行种别鉴定，但这些方法对设备等硬件要求较高，局限性较高。

随着分子生物学的发展，DNA条形码及DNA指纹等DNA分子遗传学技术逐渐被广泛应用于物种鉴定。其中DNA条形码技术因具有种内变异小、不同种变异大，片段短、易于提取、变异区两端序列高度保守等特点，逐渐成为一种物种鉴定的工具，弥补了传统鉴定方法的不足。

ITS（Internal Transcribed Spacer）：内转录间隔区，是真菌核糖体RNA（rRNA）基因非转录区的一部分。ITS鉴定是指对ITS序列进行DNA测序，通过将测序得到的ITS序列与已知真菌ITS序列比较，从而获得未知真菌种属信息的一种方法。由于ITS 的序列分析能实质性地反映出属间、种间以及菌株间的碱基对差异，此外ITS 序列片段较小、易于分析，目前已被广泛应用于真菌属内不同种间或近似属间的系统发育研究中。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一段可用于鉴定降香黄檀的ITS区序列。

本发明还提供采用上述ITS区序列的，操作简单、准确性高且快速的降香黄檀的鉴定方法。

本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：

一种降香黄檀的ITS区序列，其核苷酸性序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供一种利用上述降香黄檀ITS区序列对待测木材是否为降香黄檀进行鉴定的方法，该鉴定方法具体包括如下步骤：

步骤1

提取待测木材样品的DNA；

步骤2

以步骤1提取的DNA为模板，用引物ITS4和ITS5进行PCR扩增反应得到待测木材的ITS区序列；

上述引物ITS4和ITS5是针对SEQ ID NO：1所述的降香黄檀ITS区序列而设计的专用引物，其中，引物ITS4的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，引物ITS5的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示；

上述PCR扩增的反应体系总体积为20μL ，该反应体系含有10×PCR Buffer（含2.5mmol/L MgCl₂）2 μL、四种2.5 mmol/L单核苷酸1.6 μL、10 μmol/L引物ITS4 0.8 μL、10 μmol/L引物ITS5 0.8 μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.1 μL和模板DNA 50ng，余量为无菌超纯水。

上述PCR扩增反应过程为：95℃预变性3 min，“94℃变性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min”30个循环，72℃延伸10 min。

步骤3

将步骤2得到的待测木材ITS区序列与SEQ ID NO：1所示降香黄檀ITS区序列导入软件MEGA（版本6.06）并进行比对匹配后，若待测木材ITS区序列的匹配区的第19位碱基为C、第62位碱基为G、第66位碱基为A、第107位碱基为A、第146位碱基为T、第179位碱基为A、第535位碱基为A、第564位碱基为C和第591位碱基为C，且第106位碱基为R时，则可判定该待测样品为降香黄檀，反之则不是降香黄檀；所述碱基R是A或G，本发明人通过分析发现，SEQ IDNO：1所示序列与NCBI上已经公开发布的降香黄檀序列在106位碱基上有一个种内突变，即A/G突变。

上述步骤1中，待测木材样品需要先进行预处理后才进行DNA的提取，所述预处理是取待测木材的边材，浸泡于质量百分比浓度为75%的乙醇溶液中5分钟后放置于无菌环境中风干，然后再在液氮冷却的条件下研磨至粉末状，该粉末状物质即为待测木材样品；将该待测木材样品采用DNA提取试剂盒进行DNA的提取，或者采用CTAB法提取DNA均可。

上述步骤3中，待测木材ITS区序列的匹配区比必须满足第19位碱基为C、第62位碱基为G、第66位碱基为A、第107位碱基为A、第146位碱基为T、第179位碱基为A、第535位碱基为A、第564位碱基为C和第591位碱基为C，且第106位碱基为R，这十个条件时该待测木材才能判定为降香黄檀，或全部不满足，或只满足＜10个条件，则判定该待测木材不是降香黄檀。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了一段可用于鉴定降香黄檀的ITS区序列，并且将

该序列与NCBI上已经公开发布的黄檀属9个种的23条序列进行比对分析，得到降香黄檀区分黄檀属其它红木树种的10个信息位点，通过比对序列和10个信息位点，可以简单快速有效地在分子生物学水平对降香黄檀进行分子鉴定，不但成本低廉、操作简单、而且鉴定准确很高，有利于大规模推广使用。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作出进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。

实例中未注明的具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。本实例所使用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均可通过购买获得，且试剂均为分析纯。

实施例1 降香黄檀ITS区序列的获得

1、样品DNA提取

（1）待测样品：从不同地区采集多份降香黄檀样品，如表1所示。

表1 降香黄檀样品采集地点

序号	样品	取样部位	采集地
				01	降香黄檀	边材	海南省文昌市文城镇
02	降香黄檀	边材	广东省雷州市北河镇
				03	降香黄檀	边材	广东省广州市华南农业大学五山校园

（2）按照下述方法分别对表1的降香黄檀样品进行降香黄檀DNA的提取：

将待测样品浸泡在75%乙醇中5分钟，取出，放置在无菌环境中自然风干。

（3）取2 g待测样品，加液氮研磨至粉末状，置于10ml离心管中，然后加入65℃预热的4×CTAB提取液5ml，混匀后65℃水浴2h，且每隔15-20min轻轻震荡摇匀；所述的4×CTAB提取液配方为：4% CTAB，0.1mol/L Tris-HCl，1.4mol/LNaCl，2%PVPP，25mmol/LEDTA，高温高压灭菌；其中，2%β-巯基乙醇为灭菌、冷却后加入；体系中的“%”代表体积分数。

水浴结束后，12 000rpm离心5min，取上清分装至1.5ml离心管，加等体积Tris饱和酚-氯仿-异戊醇（25:24:1），混匀后12000rpm离心10min，取上清至新1.5ml离心管，加等体积氯仿-异戊醇（24:1），混匀后12000rpm离心10min。

取上清，加0.6倍体积异丙醇，再加3mol/L 醋酸钠至终浓度为0.3mol/L，-20℃沉淀1h，12 000rpm离心10min，弃上清。用1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀，12 000rpm离心5min，弃上清，重复洗涤2-3次。洗涤完毕后风干沉淀，加100ul无菌水或1×TE溶液进行溶解，置于-20℃保存，得到DNA样品。

2、ITS区序列扩增

利用下述方法分别对三种降香黄檀DNA进行ITS区序列的扩增：

（1）利用引物ITS4和ITS5对降香黄檀DNA进行rDNA-ITS序列的扩增。

引物ITS4和ITS5的序列如下所示：

引物ITS4的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示

5’ TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’；

引物ITS5的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示

5’ GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3’。

引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

（2）PCR 反应体系：在20 μL 体系中含有10×PCR Buffer（2.5 mmol/L，含MgCl2 )2 μL，dNTP（2.5 mmol/ L）1.6 μL，10 μmol/L引物ITS4 0.8 μL，10 μmol/L引物ITS5 0.8 μL， Taq（5U/μL）0.1 μL，加入约50 ng 的模板DNA，其余体积以无菌超纯水补足。

（3）PCR 扩增反应过程为：95℃预变性3 min，94℃变性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环，72℃延伸10 min。

本实施例PCR扩增采用宝生物工程有限公司TaKaRa试剂盒。

3、PCR产物纯化、连接及转化

PCR扩增产物采用DNA凝胶回收试剂盒（TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNAExtraction Kit）进行割胶回收。降香黄檀rDNA-ITS序列的PCR扩增产物从1% 的琼脂凝胶中割胶纯化。纯化产物连接到pMD18-T-Vecter，连接产物转化到Escherichia coli JM109感受态细胞，进行氨苄青霉素选择。

4、ITS区序列测定：

挑取单克隆菌落送至睿博兴科生物技术有限公司进行测序，测序引物与上述PCR引物一致（引物ITS4、ITS5）。

5、ITS区序列分析：

（1）选取我国国家标准GB/T 18107-2000《红木》中规定的黄檀属物种，包括降香黄檀（Dalbergia odorifera）、刀状黑黄檀（Dalbergia cultrate）、阔叶黄檀（Dalbergia latifolia）、东非黑黄檀（Dalbergia melanoxylon）、巴西黑黄檀（Dalbergia nigra）、亚马逊黄檀（Dalbergia spruceana）、赛州黄檀（Dalbergia cearensis）、交趾黄檀（Dalbergia cochinchinensis）和奥氏黄檀（Dalbergia oliveri）共9种，并在NCBI数据库上查询和下载其ITS区序列，适当挑取每一种有代表性的一条或多条共23条序列，序列号分别为：KM521377，KM521389，KM521368，KM276112，KM276117，KM276119，KM276120，KM276141，KM276148，KM276149，KM276150，EF451074，EF451075，AB828660，AB828663，FR854123，FR854124，KM521363，KM521364，FR854134，FR854137，KM521394，KM521395。

其中微凹黄檀（Dalbergia retusa）、黑黄檀（Dalbergia fusca）、卢氏黑黄檀（Dalbergia louvelii）、伯利兹黄檀（Dalbergia stevensonii）、巴里黄檀（Dalbergia bariensis）、绒毛黄檀（Dalbergia frutescens var. tomentosa）和中美洲黄檀（Dalbergia granadillo）共7种由于数据库中没有其ITS区序列，故没有做比对。

（2）根据测序的结果可知，3条降香黄檀序列完全相同，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。将待测样品的3条序列和以上23条序列进行比对，并以01号降香黄檀序列作为参考序列进行两端对齐，序列之间的比对通过MEGA（版本6.06）软件完成，获得175个变异位点。其中作为鉴定降香黄檀的变异位点有10个。

6、降香黄檀的鉴定

根据上述获得的10个变异位点进行降香黄檀的鉴定，具体标准是：19位为C、62位为G、66位为A、107位为A、146位为T、179位为A、535位为A、564位为C、591位为C，当这9个位点全部与上述标准一致，且106位为R（A或G）时，可判定待测样品为降香黄檀。

当待测样品的ITS区序列不符合上述标准时，可判定待测样品不是降香黄檀。

以上所述的利用MEGA（版本6.06）软件对序列进行比对的实施方式，本领域技术人员可以根据测序的峰图特征和密码子的简并性，将得到的比对结果进一步调整成最适当的比对结果。

实施例2 红木鉴定试验

从市场上采购三种红木，分别是阔叶黄檀、降香黄檀和巴西黑黄檀，将三个样品分别取边材后，分别按照下述方法进行鉴定：

步骤1

将待测样品浸泡在75%乙醇中5分钟，取出，放置在无菌环境中自然风干，取2 g待测样品，加液氮研磨至粉末状，置于10ml离心管中，然后加入65℃预热的4×CTAB提取液5ml，混匀后65℃水浴2h，且每隔15-20min轻轻震荡摇匀；所述的4×CTAB提取液配方为：4% CTAB，0.1mol/L Tris-HCl，1.4mol/LNaCl，2%PVPP，25mmol/LEDTA，高温高压灭菌；其中，2%β-巯基乙醇为灭菌、冷却后加入；体系中的“%”代表体积分数。

步骤2

以步骤1提取的DNA为模板，用引物ITS4和ITS5进行PCR扩增；

PCR扩增的反应体系总体积为20μL ，该反应体系含有10×PCR Buffer（含2.5 mmol/LMgCl₂）2 μL、四种2.5 mmol/L单核苷酸1.6 μL、10 μmol/L引物ITS5 0.8 μL，10 μmol/L引物ITS4 0.8 μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.1 μL，模板DNA 50ng，余量为无菌超纯水；

PCR扩增反应过程为：95℃预变性3 min，94℃变性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10 min；

采用TaKaRa的PCR产物回收试剂盒纯化回收扩增产物并送交测序；

步骤3

将步骤2的测序结果与SEQ ID NO：1所示降香黄檀ITS区序列利用MEGA（版本6.06）软件对序列进行比对，三个样品的的比对结果分别为：

降香黄檀样品的匹配区的第19位碱基为C、第62位碱基为G、第66位碱基为A、第107位碱基为A、第146位碱基为T、第179位碱基为A、第535位碱基为A、第564位碱基为C和第591位碱基为C，且第106位碱基为R（A或G）；

阔叶黄檀样品的匹配区的第19位碱基不为C、第62位碱基不为G、第66位碱基不为A、第107位碱基不为A、第146位碱基不为T、第179位碱基不为A、第535位碱基不为A、第564位碱基不为C和第591位碱基不为C，且第106位碱基不为A；

巴西黑黄檀样品的匹配区的第19位碱基不为C、第62位碱基不为G、第66位碱基不为A、第107位碱基不为A、第146位碱基不为T、第179位碱基不为A、第535位碱基不为A、第564位碱基不为C和第591位碱基不为C，且第106位碱基不为A。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东药科大学

<120> 一种降香黄檀的ITS区序列及用其鉴定降香黄檀的方法

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 591

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agacccgcgg acacgtttca acacccggga cagacgaagc tgcccagcag ctcgccttcc 60

cgaaaagtcg ggacggagcc gcgccccgcg gcctctcgtc ccggcraaac aaccaacaaa 120

ccccggcgcg gaaagcgcca aggaatcaac aatcgcagag cgcgtcccgt cggcccggaa 180

acggtgctcg cacgggcgac gtcgcaacac tcgagtccaa aacgactctc ggcaacggat 240

atctcggctc ttgcatcgat gaagaacgta gcgaaatgcg atacttggtg tgaattgcag 300

aatcccgtga accatcgagt ctttgaacgc aagttgcgcc cgaagccact aggccaaggg 360

cacgcctgcc tgggtgtcac caatcgccgc cccaacccct gtgcctccgg ccacggagcg 420

gggcgaatgc tggcctcccg tgagcaccgc ctcgcggctg gctgaaaatc gggttcgtgg 480

tggatgcagc gccatgacag acggtggttg agcgtgttct cgaggccagt catgagggcg 540

gcctccacca gctccgtacc cagcgacccg cgagcgatgt cgatcgccca c 591

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22

Claims

1.一种降香黄檀的ITS区序列，其特征在于该ITS区序列的核苷酸性序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种降香黄檀的鉴定方法，其特征在于该鉴定方法包括如下步骤：

步骤1

提取待测木材样品的DNA；

步骤2

以步骤1提取的DNA为模板，用引物ITS4和ITS5进行PCR扩增反应得到待测木材的ITS区序列；所述引物ITS4的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述ITS5的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示；

步骤3

将步骤2得到的待测木材ITS区序列与SEQ ID NO：1所示降香黄檀ITS区序列进行比对匹配后，若待测木材ITS区序列的匹配区的第19位碱基为C、第62位碱基为G、第66位碱基为A、第107位碱基为A、第146位碱基为T、第179位碱基为A、第535位碱基为A、第564位碱基为C和第591位碱基为C，且第106位碱基为R时，则可判定该待测样品为降香黄檀，反之则不是降香黄檀。

3.根据权利要求2所述降香黄檀的鉴定方法，其特征在于所述待测木材的采样部位为木材边材。

4.根据权利要求2所述降香黄檀的鉴定方法，其特征在于所述待测木材先经过预处理后才进行DNA的提取，所述预处理是取待测木材的边材，浸泡于质量百分比浓度为75%的乙醇溶液中5分钟后放置于无菌环境中风干，然后再在液氮冷却的条件下研磨至粉末状，该粉末状物质即为待测木材样品。

5.根据权利要求2所述降香黄檀的鉴定方法，其特征在于所述PCR扩增的反应体系总体积为20μL ，该反应体系包含含2.5 mmol/L MgCl₂的10×PCR Buffer 2 μL、四种2.5 mmol/L单核苷酸1.6 μL、10 μmol/L引物ITS4 0.8 μL、10 μmol/L引物ITS5 0.8 μL， 5U/μL TaqDNA聚合酶0.1 μL和模板DNA 50ng，余量为无菌超纯水。

6.根据权利要求2所述降香黄檀的鉴定方法，其特征在于所述

PCR扩增反应过程为：95℃预变性3 min，94℃变性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10 min。

7.根据权利要求2所述降香黄檀的鉴定方法，其特征在于所述比对采用版本6.06的MEGA软件。