CN103966210B - 桃ssap分子标记引物组合、分子标记组合及其在桃品种遗传多样性分析上的应用 - Google Patents
桃ssap分子标记引物组合、分子标记组合及其在桃品种遗传多样性分析上的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103966210B CN103966210B CN201410231891.1A CN201410231891A CN103966210B CN 103966210 B CN103966210 B CN 103966210B CN 201410231891 A CN201410231891 A CN 201410231891A CN 103966210 B CN103966210 B CN 103966210B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- ltr
- peach
- seq
- ssap
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种桃SSAP分子标记引物组合,包括LTR引物、选择性扩增引物和尾巴引物;还公开了一种桃SSAP分子标记组合,包括10个分子标记JY01、JY02、JY03、JY04、JY05、JY06、JY07、JY08、JY09和JY10;并公开了上述桃SSAP分子标记组合在桃品种遗传多样性分析上的应用。本发明通过设计桃逆转座子LTR序列引物,选择性扩增产物经过荧光毛细管电泳检测表明,扩增条带清晰且丰富,更具有高效性、可靠性和实用性;另外本发明对选择性扩增PCR反应体系进行优化,通过加入尾巴序列改进了传统选择性扩增PCR反应体系,为应用该分子标记进行相关研究节省了成本。本发明中公布的SSAP分子标记组合在多个桃品种中均具有较高的多态性,且是稳定存在的标记,可以用于桃品种鉴定及遗传多样性分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种桃SSAP 分子标记引物组合、桃SSAP 分子标记组合及其在桃品种遗传多样性分析中的应用,属于分子生物学领域。
背景技术
桃[Prunus persica (L.) Batsch]属于蔷薇科(Rosaceae),李属(Prunus L.),种质资源丰富,起源于我国西部地区。据统计,我国拥有世界上最丰富的桃种质资源,自然变异和人工选育积累了各种各样的品种和优系,三个国家级资源圃(北京市农林科学院林业果树研究所、中国农业科学院郑州果树研究所、江苏省农业科学院园艺研究所)保存的桃种质资源共有1600多份。
大量的研究表明我国桃种质资源在DNA分子水平上存在极其丰富的遗传多样性。充分了解桃种质资源的遗传多样性与谱系关系是种质创新与遗传育种的基本要求和前提。丰富的遗传变异也为品种鉴别和指纹图谱的构建带来了可行性。
分子标记广泛应用于种质资源遗传多样性分析以及辅助育种工作中。逆转座子分子标记之一的SSAP(sequence-specific amplification polymorphism)是根据AFLP改进而来,它被认为是多态性最丰富、灵敏度最高、反映的多态信息含量最多的一种类型,且该标记多为共显性,对隐性的性状的选择十分便利;基因组变异极其丰富,分子标记的数量几乎是无限的;在生物发育的不同阶段,不同组织的DNA都可用于标记分析;分子标记揭示来自DNA的变异;表现为中性,不影响目标性状的表达,与不良性状无连锁;检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展,现在DNA分子标记技术已有数十种,广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。
目前,SSAP分子标记技术已经成功用于葡萄、大麦、苹果等物种的遗传多样性分析(Labra,2004;Queen,2004;Venturi,2006),但是逆转座子引物的开发具有种族特异性,不同物种之间的逆转座子引物异质性很大,至今尚无SSAP分子标记技术在桃品种遗传多样性分析应用的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种可用于桃品种遗传多样性分析的SSAP分子标记技术以及筛选具有较高多态性的桃SSAP分子标记引物组合。
为达到上述目的,本发明采用的技术方案为:一种桃SSAP分子标记引物组合,包括LTR引物、选择性扩增引物和尾巴引物;
其中LTR引物组序列包括:
LTR-1:5’-TGGGGACTCCATTTTTACAACAG-3’(SEQ ID No.1),
LTR-2:5’-CATAGTTTTCATATTTTAGCAG-3’ (SEQ ID No.2),
LTR-3:5’-TAGGGGCTGTTCTACATCAG-3’ (SEQ ID No.3),
LTR-4:5’-ATAATATGCATTCTGCATCAG-3’ (SEQ ID No.4),
LTR-5:5’-CTACGAGTTGTTCTGCATCAG-3’ (SEQ ID No.5),
LTR-7:5’-TCATCATTGATACTCTTACAG-3’ (SEQ ID No.6),
LTR-8:5’-ACATTCCTAATTTCCAACAG-3’ (SEQ ID No.7),
LTR-12:5’-TTGAGTTAGGGAAGGGGAAGC-3’ (SEQ ID No.8),
LTR-13:5’-ATCTTGGAGTGTTTTCGCACA -3’ (SEQ ID No.9);
特异选择性扩增引物的序列包括:
M-cgt:5’-TGTAAAACGACGGCCAGTGATGAGTCCTGAGTAACGT-3’ (SEQ ID No.10),
M-ggt:5’-TGTAAAACGACGGCCAGTGATGAGTCCTGAGTAAGGT-3’ (SEQ ID No.11),
M-gag:5’-TGTAAAACGACGGCCAGTGATGAGTCCTGAGTAAGAG-3’ (SEQ ID No.12);
尾巴引物序列为:
Tail:5’-<FAM>/<HEX>/<NED>/<PET>TGTAAAACGACGGCCAGT-3’( SEQ ID No.13)。
本发明还公开了一种桃SSAP分子标记组合,包括10个分子标记JY01、JY02、JY03、JY04、JY05、JY06、JY07、JY08、JY09和JY10,为桃基因组DNA基于SSAP方法经酶切、连接、预扩增,再加上上述的桃SSAP分子标记引物扩增而成,其中JY01的引物组合为M-cgt& LTR-1,JY02的引物组合为M-cgt& LTR-2,JY03的引物组合为M-cgt& LTR-3,JY04的引物组合为M-cgt& LTR-4,JY05的引物组合为M-cgt& LTR-7,JY06的引物组合为M-cgt& LTR-12,JY07的引物组合为M-cgt& LTR-13,JY08的引物组合为M-ggt& LTR-1,JY09的引物组合为M-ggt<R-5,JY10的引物组合为M-gag& LTR-8,以上所有引物组合均需要配合尾巴引物用于选择性扩增反应。
本发明还公开了上述的桃SSAP分子标记组合在桃品种遗传多样性分析上的应用,其步骤包括:
(1)引物设计合成:除设计合成权利要求1所述的全部引物外,另外需要合成Mse I和EcoR I接头引物以及预扩增PCR引物,
Mse I接头序列 Mse I-adapter:5’- GACGATGAGTCCTGAG-3’
Mse I-adapter-plus:5’- TACTCAGGACTCAT -3’,
EcoR I接头序列 EcoR I-adapter:5’- CTCGTAGACTGCGTACC-3’
EcoR I-adapter-plus:5’- AATTGGTACGCAGTCTAC-3’,
预扩增反应引物 EcoR I:5’- GACTGCGTACCAATTC-3’
Mse I:5’- GATGAGTCCTGAGTAA-3’;
(2)DNA的提取:提取桃嫩叶中的基因组DNA;
(3)酶切:用EcoR I和Mse I两种限制性核酸内切酶将步骤(2)提取的基因组DNA酶切;
(4)连接:将Mse I接头序列混合制备Mse I接头,将EcoR I接头序列混合制备EcoRI接头,将Mse I接头和EcoR I接头与酶切片段进行连接;
(5)预扩增:用预扩增PCR引物对连接后的产物进行预扩增;
(6)选择性扩增:在预扩增产物中加入上游引物和下游引物进行扩增,上游引物为特异选择性扩增引物组中的一个和Tail,下游引物为LTR引物中的一个,特异选择性扩增引物和LTR引物的组合遵循10个分子标记的组合规则;
(7) 扩增产物检测与分析:对扩增产物于ABI遗传分析仪上进行分析,使用GeneMapper version 4.0 读取扩增片段数据,然后利用Microsoft Excel 2007 和FreeTree分别进行数据统计及聚类分析。
进一步的,步骤(6)中上游引物和下游引物的组合规则按照权利要求2中所述的10个桃逆转座子分子标记的组合规则。
进一步的,其详细步骤为:
(1)引物设计合成:使用逆转座子预测软件LTR_STRUC version 1.1对桃全基因组序列进行分析。在预测结果数据中优先选择两端LTR序列相似度大于99%的逆转座子,使用Primer Premier 5.0并参考3’端LTR区域序列设计SSAP分子标记中选择性扩增所需的下游引物,在该引物设计时仅选择从本区域5’端第一个碱基开始,同时替换第一个碱基为错配碱基,设计引物长度为19-23bp,在特异选择性扩增引物末端添加三个选择性碱基,分别为GAG、CGT和GGT,从而形成不同引物组合,同时在其5’端添加18bp的通用引物序列(M13)TGTAAAACGACGGCCAGT,Tail中的5’端分别添加四种不同的荧光基团,即FAM、HEX、PET和NED中选择,便于后期使用遗传分析仪进行扩增产物的检测与分析;
(2)DNA的提取:①用液氮研磨1 g左右的幼叶成粉末状,取约0.4g样品置于2 mL离心管中;
②加入1 mL 提取液后混匀,提取液的配方为:0.4 mol/L葡萄糖、3% PVP、10mmol/L β-巯基乙醇;
③4℃,10000 rpm,10 min,弃上清液,加入1 mL提取液后混匀;
④4℃,10000 rpm,10 min,弃上清液,加入0.7 mL 65℃预热的SDS裂解液,65℃水浴40 min,期间不时轻轻摇动,水浴结束待冷却后加入0.8 mL抽提混合液,混匀并于室温下静置10 min,SDS裂解液的配方为:100 mmol/L Tris•Cl,pH 8.0,20 mmol/L EDTA,1.4mmol/L Nacl,1.5% SDS,抽提混合液的配方为:氯仿:乙醇:异戊醇=20:4:1(V:V:V);
⑤4℃,10000 rpm,10 min,小心将上清液移入新的2 mL离心管中,加入等体积的异丙醇,混匀,室温静置30 min;小心吸出絮团状沉淀,用70%乙醇洗涤,
⑥超净工作台吹干剩余乙醇后,用0.4 mL TE溶液溶解DNA, TE溶液的配方为:10mmol/L Tris•Cl,1 mmol/L EDTA,pH 8.0;
⑦采用紫外分光光度计检测DNA,确定其浓度和质量,同时取1~2 μl在1.0%的琼脂糖凝胶上检测,DNA原液稀释成浓度为100 ng/μl的工作液保存于-20℃冰箱;
(3)酶切,该反应体系为:基因组DNA模板200 ng,10×NEB Buffer 5 μL,BSA(10mg/mL)0.2 μL,Mse I (10 U/μL) 0.25 μL,EcoR I(10 U/μL) 0.25 μL,ddH20补足至25 μL,混匀后37℃保温6 h,75℃灭活20 min;
(4)连接:①接头的制备:分别取EcoR I-adapter和EcoR I-adapter-plus等体积的量混合配成10 μmol/L的浓度,再加等量的H20稀释成5 μmol/L的终浓度;分别取MseI-adapter和MseI-adapter-plus等体积的量混合配成50 μmol/L的浓度,在PCR仪上执行以下程序:94℃,3 min;65℃,10 min;37℃,10 mim;25℃,10 mim,退火后-20℃保存备用;
②连接反应体系:在酶切产物中加入5 μL如下混合液:EcoR I 接头(5 μmol/L) 1μL,Mse I接头(50 μmol/L) 1μL,10×T4 Buffer 2 μL,T4连接酶(3 U/μL) 1 uL,16℃连接过夜,65℃灭活20 min;
(5)预扩增:预扩增20 μL反应体系为:DNA酶切连接产物 2 μL,10×PCR Buffer 2μL,dNTP Mix (10 nM each) 0.5 μL,Mg2+(25 mM)2 μL,EcoR I预扩增引物(10 μM)1 μL,Mse I预扩增引物(10 μM)1 μL,rTaq酶(5 U/μL) 0.2 μL,ddH2O 11.7 μL,预扩增PCR程序如下:94℃ 5 min,94℃ 30 s,56℃ 1 min,30个循环,72℃ 1 min,72℃ 10 min;反应完成后,取5 μL产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果,其余产物于-20℃保存备用;
(6)选择性扩增:将预扩增产物稀释10倍作为选择性扩增的模板,选择性扩增反应体系体积为25 μL,包括:选择性扩增模板 2 μL,10×PCR Buffer 2 μL,dNTP Mix (10 nMeach ) 1.0 μL,Mg2+(25 mM)1.6 μL,特异选择性扩增引物(10 μM) 1.6 μL,LTR引物(10 μM)0.4 μL,尾巴引物(10 μM) 2.0 μL,rTaq 酶(5 U/μL) 0.3 μL,ddH2O 14.1 μL。选择性扩增PCR程序如下:94℃ 5 min,94℃ 30 s,65℃(-0.7/cyc) 30 s 13个循环,72℃ 1 min,94℃ 30s,56℃ 30s 19个循环,72℃ 1 min,94℃ 30s,53℃ 30s 8个循环,72℃ 1 min,72℃10 min,反应完成后,取5 μL产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果,其余产物于-20℃保存备用;
(7)扩增产物检测与分析:经上述扩增过程得到的PCR产物,取4 μl 加ddH2O稀释至25 ul,吸取稀释液加入到加有12 ul 甲酰胺变性缓冲液(Formamide)和0.3ul 内标(LIZ500,75-500 bp)的96孔PCR上样板中,95℃ 变性5 min, 在ABI3130遗传分析仪上进行检测,用genemapper 4.0 软件进行片段大小读数,只统计长度范围在100-500 bp内的扩增产物片段,然后使用Microsoft Excel 2007 和FreeTree分别进行数据统计及聚类分析,聚类图的修改使用软件Treeview 1.6.6。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
(1)本发明中10个桃SSAP分子标记的引物组合带型稳定、清晰且重复性好,在多个桃品种中均具有较高的多态性,利用这10个桃SSAP分子标记成功的对多个桃品种进行聚类分析,为桃品种鉴定以及遗传多样性分析建立了新的方法。
(2)本发明将通用引物M13序列添加在特异选择性扩增引物的5’端,同时加入已经添加荧光基团的Tail序列共同用于选择性扩增,经验证后发现该方法稳定可靠,今后大量应用该方法时,即使选用再多的分子标记组合,也只需要合成四条荧光引物即可,降低了实验成本。
(3)本发明的试验步骤均为常规分子生物学技术,成本低,在短时间内可完成大批实验材料鉴定。同时应用荧光标记,在ABI3130遗传分析仪(荧光毛细管电泳)上鉴定,效果可靠,可广泛用于今后的桃种质评价、创新、杂交育种亲本选择等研究。
附图说明
图1为SSAP分子标记技术原理路线示意图。
图2为桃SSAP分子标记选择性扩增产物的荧光毛细管电泳检测图,其中:A,M-cgt/LTR-7;B,M-cgt/LTR-12;C,M-ggt/LTR-1。
图3为基于10个桃SSAP分子标记组合分型数据构建的45份桃品种 NJ法(Neighbour-joining)聚类图,其中“△”代表半离核溶质,“□”代表离核溶质,“○”代表粘核溶质,“♠”代表Story-hard类型,“●”代表粘核不溶质。
图4为基于10个桃SSAP分子标记组合分型数据构建的8份观赏桃品种 NJ法(Neighbour-joining)聚类图。
下面结合附图对本发明的实施方式做进一步说明。
具体实施方式
实施例1
SSAP分子标记在桃品种遗传多样性分析中的应用,其步骤包括:
(1)引物设计合成:使用逆转座子预测软件LTR_STRUC version 1.1对桃全基因组序列进行分析。在预测结果数据中优先选择两端LTR序列相似度大于99%的逆转座子,使用Primer Premier 5.0并参考3’端LTR区域序列设计SSAP分子标记中选择性扩增所需的下游引物,在该引物设计时仅选择从本区域5’端第一个碱基开始,同时替换第一个碱基为错配碱基,设计引物长度为19-23bp,在特异选择性扩增引物末端添加三个选择性碱基,分别为GAG、CGT和GGT,从而形成不同引物组合,同时在其5’端添加18bp的通用引物序列(M13)TGTAAAACGACGGCCAGT,Tail中的5’端分别添加四种不同的荧光基团,即FAM、HEX、PET和NED,便于后期使用ABI3130遗传分析仪进行分型分析,引物序列见表1
表1:相关引物序列
引物名称 | 序列(5’-3’) |
LTR-1 | TGGGGACTCCATTTTTACAACAG |
LTR-2 | CATAGTTTTCATATTTTAGCAG |
LTR-3 | TAGGGGCTGTTCTACATCAG |
LTR-4 | ATAATATGCATTCTGCATCAG |
LTR-5 | CTACGAGTTGTTCTGCATCAG |
LTR-7 | TCATCATTGATACTCTTACAG |
LTR-8 | ACATTCCTAATTTCCAACAG |
LTR-12 | TTGAGTTAGGGAAGGGGAAGC |
LTR-13 | ATCTTGGAGTGTTTTCGCACA |
EcoR I-adapter | CTCGTAGACTGCGTACC |
EcoR I-adapter-plus | AATTGGTACGCAGTCTAC |
Mse I-adapter | GACGATGAGTCCTGAG |
Mse I-adapter-plus | TACTCAGGACTCAT |
EcoR I | GACTGCGTACCAATTC |
Mse I | GATGAGTCCTGAGTAA |
*M-gag | TGTAAAACGACGGCCAGTGATGAGTCCTGAGTAAGAG |
*M-cgt | TGTAAAACGACGGCCAGTGATGAGTCCTGAGTAACGT |
*M-ggt | TGTAAAACGACGGCCAGTGATGAGTCCTGAGTAAGGT |
Tail | <FAM>/<HEX>/<NED>/<PET>TGTAAAACGACGGCCAGT |
(2)不同桃品种(45份桃品种特征信息见表1)嫩叶采集与DNA的提取:①用液氮研磨1 g左右的幼叶成粉末状,取约0.4g样品置于2 mL离心管中;
②加入1 mL 提取液后混匀,提取液的配方为:0.4 mol/L葡萄糖、3% PVP、10mmol/L β-巯基乙醇;
③4℃,10000 rpm,10 min,弃上清液,加入1 mL提取液后混匀;
④4℃,10000 rpm,10 min,弃上清液,加入0.7 mL 65℃预热的SDS裂解液,65℃水浴40 min,期间不时轻轻摇动,水浴结束待冷却后加入0.8 mL抽提混合液,混匀并于室温下静置10 min,SDS裂解液的配方为:100 mmol/L Tris•Cl,pH 8.0,20 mmol/L EDTA,1.4mmol/L Nacl,1.5% SDS,抽提混合液的配方为:氯仿:乙醇:异戊醇=20:4:1(V:V:V);
⑤4℃,10000 rpm,10 min,小心将上清液移入新的2 mL离心管中,加入等体积的异丙醇,混匀,室温静置30 min;小心吸出絮团状沉淀,用70%乙醇洗涤,
⑥超净工作台吹干剩余乙醇后,用0.4 mL TE溶液溶解DNA, TE溶液的配方为:10mmol/L Tris•Cl,1 mmol/L EDTA,pH 8.0;
⑦采用紫外分光光度计检测DNA,确定其浓度和质量,同时取1~2 μl在1.0%的琼脂糖凝胶上检测,DNA原液稀释成浓度为100 ng/μl的工作液保存于-20℃冰箱;
(3)酶切,该反应体系为:基因组DNA模板200 ng,10×NEB Buffer 5 μL,BSA(10mg/mL)0.2 μL,Mse I (10 U/μL) 0.25 μL,EcoR I(10 U/μL) 0.25 μL,ddH20补足至25 μL,混匀后37℃保温6 h,75℃灭活20 min;
(4)连接:①接头的制备:分别取EcoR I-adapter和EcoR I-adapter-plus等体积的量混合配成10 μmol/L的浓度,再加等量的H20稀释成5 μmol/L的终浓度;分别取Mse I-adapter和Mse I-adapter-plus等体积的量混合配成50 μmol/L的浓度,在PCR仪上执行以下程序:94℃,3 min;65℃,10 min;37℃,10 mim;25℃,10 mim,退火后-20℃保存备用;
②连接反应体系:在酶切产物中加入5 μL如下混合液:EcoR I 接头(5 μmol/L) 1μL,Mse I接头(50 μmol/L) 1μL,10×T4 Buffer 2 μL,T4连接酶(3 U/μL) 1 uL,16℃连接过夜,65℃灭活20 min;
(5)预扩增:预扩增20 μL反应体系为:DNA酶切连接产物 2 μL,10×PCR Buffer 2μL,dNTP Mix (10 nM each) 0.5 μL,Mg2+(25 mM)2 μL,EcoR I预扩增引物(10 μM)1 μL,Mse I预扩增引物(10 μM) 1 μL,rTaq酶(5 U/μL) 0.2 μL,ddH2O 11.7 μL,预扩增PCR程序如下:94℃ 5 min,94℃ 30 s,56℃ 1 min,30个循环,72℃ 1 min,72℃ 10 min;反应完成后,取5 μL产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果,其余产物于-20℃保存备用;
(6)选择性扩增:将预扩增产物稀释10倍作为选择性扩增的模板,选择性扩增反应体系体积为25 μL,包括:选择性扩增模板 2 μL,10×PCR Buffer 2 μL,dNTP Mix (10 nMeach ) 1.0 μL,Mg2+(25 mM)1.6 μL,特异选择性扩增引物(10 μM) 1.6 μL,LTR引物(10 μM)0.4 μL,尾巴引物(10 μM) 2.0 μL,rTaq 酶(5 U/μL) 0.3 μL,ddH2O 14.1 μL。选择性扩增PCR程序如下:94℃ 5 min,94℃ 30 s,65℃(-0.7/cyc) 30 s 13个循环,72℃ 1 min,94℃ 30s,56℃ 30s 19个循环,72℃ 1 min,94℃ 30s,53℃ 30s 8个循环,72℃ 1 min,72℃10 min,反应完成后,取5 μL产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果,其余产物于-20℃保存备用;
(7)扩增产物检测与分析:经上述扩增过程得到的PCR产物,取4 μl 加ddH2O稀释至25 ul,吸取稀释液加入到加有12 ul 甲酰胺变性缓冲液(Formamide)和0.3ul 内标(LIZ500,75-500 bp)的96孔PCR上样板中,95℃ 变性5 min, 在ABI3130遗传分析仪上进行检测,用genemapper 4.0 软件进行片段大小读数,只统计长度范围在100-500 bp内的扩增产物片段,得出桃SSAP分子标记多态性信息见表2;使用POPGENE32计算每个SSAP分子标记组合的有效等位基因数(Ne)和Shannon's遗传多样性指数(I);使用Microsoft Excel 2007和FreeTree分别进行数据统计及聚类分析,聚类树状图的修改使用软件Treeview 1.6.6。
(8)如图2所示,本发明中的SSAP分子标记组合选择性扩增产物经荧光毛细管电泳(ABI3130遗传分析仪)检测,条带清晰且丰富;表2所示,本发明中10个SSAP引物组合共产生928个条带,平均值为93,由此可见这些引物组合具有较高的多态性。图3所示,10个SSAP分子标记组合将45份桃品种全部区分,同时分类结果基本符合桃品种实际特征及亲缘关系,表明该SSAP分子标记技术可应用于桃品种遗传多样性分析中。
表 1 本发明实例中所用到的45份桃品种相关特征信息
序号 | 品种 | 果肉质地 | 粘离核 | 来源 |
1 | 早美 | 溶质 | 粘核 | 北京,中国 |
2 | 雪白桃 | 溶质 | 粘核 | 昌黎,河北,中国 |
3 | 皮球桃 | 溶质 | 粘核 | 成都,四川,中国 |
4 | 红甘露 | 溶质 | 粘核 | 大连,辽宁,中国 |
5 | 早奉化玉露 | 溶质 | 粘核 | 奉化,浙江,中国 |
6 | 晚奉化玉露 | 溶质 | 粘核 | 奉化,浙江,中国 |
7 | 花玉露 | 溶质 | 粘核 | 奉化,浙江,中国 |
8 | 奉化蟠桃 | 溶质 | 粘核 | 奉化,浙江,中国 |
9 | 早凤王 | 溶质 | 粘核 | 固安,河北,中国 |
10 | 晖雨露 | 溶质 | 粘核 | 南京,江苏,中国 |
11 | 霞晖5号 | 溶质 | 粘核 | 南京,江苏,中国 |
12 | 霞晖6号 | 溶质 | 粘核 | 南京,江苏,中国 |
13 | 霞晖8号 | 溶质 | 粘核 | 南京,江苏,中国 |
14 | 白蜜蟠桃 | 溶质 | 粘核 | 南京,江苏,中国 |
15 | 白芒蟠桃 | 溶质 | 粘核 | 上海,中国 |
16 | Galaxy | 溶质 | 粘核 | 美国 |
17 | Mayfire | 溶质 | 粘核 | 美国 |
18 | 白花水蜜 | 溶质 | 粘核 | 无锡,江苏,中国 |
19 | 宣城甜桃 | 溶质 | 粘核 | 宣城,安徽,中国 |
20 | 扬州早甜桃 | 溶质 | 粘核 | 扬州,江苏,中国 |
21 | 一线白 | 溶质 | 离核 | 北京,中国 |
22 | 北京一线红 | 溶质 | 离核 | 北京,中国 |
23 | 吊枝白 | 溶质 | 离核 | 亳州,安徽,中国 |
24 | 半斤桃 | 溶质 | 离核 | 灌阳,广西,中国 |
25 | 早霞露 | 溶质 | 半离核 | 杭州,浙江,中国 |
26 | Fertini Morettini | 溶质 | 离核 | 意大利 |
27 | Okubo | 溶质 | 离核 | 日本 |
28 | 野鸡红 | 溶质 | 离核 | Jurong,Jiangsu,中国 |
29 | 喀什李光 | 溶质 | 离核 | Kashi,Xinjiang,中国 |
30 | 黑油桃 | 溶质 | 离核 | Jiangsu, 中国 |
31 | 火珠 | 溶质 | 离核 | 南京,江苏,中国 |
32 | 雨花露 | 溶质 | 半离核 | 南京,江苏,中国 |
33 | 早上海水蜜 | 溶质 | 半离核 | 南京,江苏,中国 |
34 | 春蕾 | 溶质 | 半离核 | 上海,中国 |
35 | 南山甜桃 | 溶质 | 离核 | 深圳,广东,中国 |
36 | 五月鲜扁干 | 不溶质 | 粘核 | 北京,中国 |
37 | 燕窝红 | 不溶质 | 粘核 | 河北,中国 |
38 | 肉蟠桃 | 不溶质 | 粘核 | 金塔,甘肃,中国 |
39 | Yumyeoung | Story-hard | 粘核 | 韩国 |
40 | 金旭 | 不溶质 | 粘核 | 南京,江苏,中国 |
41 | 金晖 | 不溶质 | 粘核 | 南京,江苏,中国 |
42 | 霞脆 | Story-hard | 粘核 | 南京,江苏,中国 |
43 | Phillips | 不溶质 | 粘核 | 美国 |
44 | Troubador | 不溶质 | 粘核 | 美国 |
45 | Babygold 6 | 不溶质 | 粘核 | 美国 |
表2:桃SSAP分子标记多态性指数信息表
编号 | 引物组合 | 扩增片段数量总计 | 片段数量 | Ne | I |
JY01 | M-cgt/ LTR-1 | 102 | 21-68 | 1.2799 | 0.3079 |
JY02 | M-cgt/ LTR-2 | 96 | 21-53 | 1.1983 | 0.2441 |
JY03 | M-cgt/LTR-3 | 102 | 23-79 | 1.2439 | 0.2723 |
JY04 | M-cgt/LTR-4 | 72 | 21-60 | 1.1223 | 0.1593 |
JY05 | M-cgt/LTR-7 | 76 | 21-50 | 1.2532 | 0.2958 |
JY06 | M-cgt/LTR-12 | 113 | 22-65 | 1.2377 | 0.2703 |
JY07 | M-cgt/LTR-13 | 102 | 24-80 | 1.2133 | 0.2307 |
JY08 | M-ggt/LTR-1 | 76 | 22-50 | 1.3000 | 0.3259 |
JY09 | M-ggt/LTR-5 | 85 | 21-73 | 1.1678 | 0.2137 |
JY10 | M-gag/LTR-8 | 104 | 22-79 | 1.1362 | 0.1816 |
Average | - | 93 | - | 1.21526 | 0.25016 |
Total | - | 928 | - | - | - |
注:Ne代表有效等位基因数;I代表Shannon's遗传多样性指数;
实施例2
10个SSAP分子标记组合在8份观赏桃品种遗传多样性分析中的应用,其步骤包括:
(1)引物合成:合成表1中所示的所有引物。
表 3 实施例2中所用到的8份观赏桃品种相关特征信息
序号 | 品种 | 枝条类型 | 花瓣颜色 |
1 | 金陵锦桃 | 直枝型 | 杂色 |
2 | 白碧桃 | 直枝型 | 白色 |
3 | 红粉佳人 | 直枝型 | 粉红 |
4 | 人面桃 | 直枝型 | 粉红 |
5 | 红叶桃 | 直枝型 | 红色 |
6 | 五宝 | 直枝型 | 杂色 |
7 | 鸳鸯垂枝 | 垂枝型 | 杂色 |
8 | 洒红桃 | 直枝型 | 杂色 |
(2)8份观赏桃品种(8份观赏桃品种特征信息见表3)嫩叶采集与DNA的提取:①用液氮研磨1 g左右的幼叶成粉末状,取约0.4g样品置于2 mL离心管中;
②加入1 mL 提取液后混匀,提取液的配方为:0.4 mol/L葡萄糖、3% PVP、10mmol/L β-巯基乙醇;
③4℃,10000 rpm,10 min,弃上清液,加入1 mL提取液后混匀;
④4℃,10000 rpm,10 min,弃上清液,加入0.7 mL 65℃预热的SDS裂解液,65℃水浴40 min,期间不时轻轻摇动,水浴结束待冷却后加入0.8 mL抽提混合液,混匀并于室温下静置10 min,SDS裂解液的配方为:100 mmol/L Tris•Cl,pH 8.0,20 mmol/L EDTA,1.4mmol/L Nacl,1.5% SDS,抽提混合液的配方为:氯仿:乙醇:异戊醇=20:4:1(V:V:V);
⑤4℃,10000 rpm,10 min,小心将上清液移入新的2 mL离心管中,加入等体积的异丙醇,混匀,室温静置30 min;小心吸出絮团状沉淀,用70%乙醇洗涤,
⑥超净工作台吹干剩余乙醇后,用0.4 mL TE溶液溶解DNA, TE溶液的配方为:10mmol/L Tris•Cl,1 mmol/L EDTA,pH 8.0;
⑦采用紫外分光光度计检测DNA,确定其浓度和质量,同时取1~2 μl在1.0%的琼脂糖凝胶上检测,DNA原液稀释成浓度为100 ng/μl的工作液保存于-20℃冰箱;
(3)酶切,该反应体系为:基因组DNA模板200 ng,10×NEB Buffer 5 μL,BSA(10mg/mL)0.2 μL,Mse I (10 U/μL) 0.25 μL,EcoR I(10 U/μL) 0.25 μL,ddH20补足至25 μL,混匀后37℃保温6 h,75℃灭活20 min;
(4)连接:①接头的制备:分别取EcoR I-adapter和EcoR I-adapter-plus等体积的量混合配成10 μmol/L的浓度,再加等量的H20稀释成5 μmol/L的终浓度;分别取Mse I-adapter和Mse I-adapter-plus等体积的量混合配成50 μmol/L的浓度,在PCR仪上执行以下程序:94℃,3 min;65℃,10 min;37℃,10 mim;25℃,10 mim,退火后-20℃保存备用;
②连接反应体系:在酶切产物中加入5 μL如下混合液:EcoR I 接头(5 μmol/L) 1μL,Mse I接头(50 μmol/L) 1μL,10×T4 Buffer 2 μL,T4连接酶(3 U/μL) 1 uL,16℃连接过夜,65℃灭活20 min;
(5)预扩增:预扩增20 μL反应体系为:DNA酶切连接产物 2 μL,10×PCR Buffer 2μL,dNTP Mix (10 nM each) 0.5 μL,Mg2+(25 mM)2 μL,EcoR I预扩增引物(10 μM)1 μL,Mse I预扩增引物(10 μM) 1 μL,rTaq酶(5 U/μL) 0.2 μL,ddH2O 11.7 μL,预扩增PCR程序如下:94℃ 5 min,94℃ 30 s,56℃ 1 min,30个循环,72℃ 1 min,72℃ 10 min;反应完成后,取5 μL产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果,其余产物于-20℃保存备用;
(6)选择性扩增:将预扩增产物稀释10倍作为选择性扩增的模板,选择性扩增反应体系体积为25 μL,包括:选择性扩增模板 2 μL,10×PCR Buffer 2 μL,dNTP Mix (10 nMeach ) 1.0 μL,Mg2+(25 mM)1.6 μL,按照表3中组合规则,特异选择性扩增引物(10 μM)1.6 μL,LTR引物(10 μM)0.4 μL,尾巴引物(10 μM) 2.0 μL,rTaq 酶(5 U/μL) 0.3 μL,ddH2O 14.1 μL。选择性扩增PCR程序如下:94℃ 5 min,94℃ 30 s,65℃(-0.7/cyc) 30 s13个循环,72℃ 1 min,94℃ 30s,56℃ 30s 19个循环,72℃ 1 min,94℃ 30s,53℃ 30s 8个循环,72℃ 1 min,72℃ 10 min,反应完成后,取5 μL产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果,其余产物于-20℃保存备用;
(7)扩增产物检测与分析:经上述扩增过程得到的PCR产物,取4 μl 加ddH2O稀释至25 ul,吸取稀释液加入到加有12 ul 甲酰胺变性缓冲液(Formamide)和0.3ul 内标(LIZ500,75-500 bp)的96孔PCR上样板中,95℃ 变性5 min, 在ABI3130遗传分析仪上进行检测,用genemapper 4.0 软件进行片段大小读数,只统计长度范围在100-500 bp内的扩增产物片段。使用Microsoft Excel 2007 和FreeTree分别进行数据统计及聚类分析。
(8)如图4所示,10个SSAP分子标记组合将8份观赏桃品种全部区分,同时分类结果基本符合桃品种实际亲缘关系,表明该SSAP分子标记技术可用于观赏桃品种遗传多样性分析。
Claims (4)
1.一种桃SSAP分子标记引物组合,由LTR引物、选择性扩增引物和尾巴引物组成;
其中LTR引物序列为:
LTR-1:5’-TGGGGACTCCATTTTTACAACAG-3’(SEQ ID No.1),
LTR-2:5’-CATAGTTTTCATATTTTAGCAG-3’(SEQ ID No.2),
LTR-3:5’-TAGGGGCTGTTCTACATCAG-3’(SEQ ID No.3),
LTR-4:5’-ATAATATGCATTCTGCATCAG-3’(SEQ ID No.4),
LTR-5:5’-CTACGAGTTGTTCTGCATCAG-3’(SEQ ID No.5),
LTR-7:5’-TCATCATTGATACTCTTACAG-3’(SEQ ID No.6),
LTR-8:5’-ACATTCCTAATTTCCAACAG-3’(SEQ ID No.7),
LTR-12:5’-TTGAGTTAGGGAAGGGGAAGC-3’(SEQ ID No.8),
LTR-13:5’-ATCTTGGAGTGTTTTCGCACA-3’(SEQ ID No.9);
特异选择性扩增引物的序列为:
M-cgt:5’-TGTAAAACGACGGCCAGTGATGAGTCCTGAGTAACGT-3’(SEQ ID No.10),
M-ggt:5’-TGTAAAACGACGGCCAGTGATGAGTCCTGAGTAAGGT-3’(SEQ ID No.11),
M-gag:5’-TGTAAAACGACGGCCAGTGATGAGTCCTGAGTAAGAG-3’(SEQ ID No.12);
尾巴引物序列为:
Tail:5’-<FAM>/<HEX>/<NED>/<PET>TGTAAAACGACGGCCAGT-3’(SEQ ID No.13)。
2.一种桃SSAP分子标记组合,由10个分子标记JY01、JY02、JY03、JY04、JY05、JY06、JY07、JY08、JY09和JY10组成,为桃基因组DNA基于SSAP方法经酶切、连接、预扩增,再加上权利要求1中所述的桃SSAP分子标记引物扩增而成,其中JY01的引物组合为M-cgt<R-1,JY02的引物组合为M-cgt<R-2,JY03的引物组合为M-cgt<R-3,JY04的引物组合为M-cgt<R-4,JY05的引物组合为M-cgt<R-7,JY06的引物组合为M-cgt<R-12,JY07的引物组合为M-cgt<R-13,JY08的引物组合为M-ggt<R-1,JY09的引物组合为M-ggt<R-5,JY10的引物组合为M-gag<R-8,以上所有引物组合均需要配合尾巴引物用于选择性扩增反应。
3.一种权利要求2所述的桃SSAP分子标记组合在桃品种遗传多样性分析上的应用,其步骤包括:
(1)引物设计合成:除设计合成权利要求1所述的全部引物外,另外需要合成Mse I和EcoR I接头引物及预扩增PCR引物,
Mse I接头引物序列Mse I-adapter:5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’(SEQ ID No.14)
Mse I-adapter-plus:5’-TACTCAGGACTCAT-3’(SEQ ID No.15),
EcoR I接头引物序列EcoR I-adapter:5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’(SEQ ID No.16)
EcoR I-adapter-plus:5’-AATTGGTACGCAGTCTAC-3’(SEQ ID No.17),
预扩增PCR引物EcoR I:5’-GACTGCGTACCAATTC-3’(SEQ ID No.18)
Mse I:5’-GATGAGTCCTGAGTAA-3’(SEQ ID No.19);
(2)DNA的提取:提取桃嫩叶中的基因组DNA;
(3)酶切:用EcoR I和Mse I两种限制性核酸内切酶将步骤(2)提取的基因组DNA进行酶切;
(4)连接:将Mse I接头引物混合制备Mse I接头,将EcoR I接头引物混合制备EcoR I接头,将Mse I接头和EcoR I接头与酶切片段进行连接;
(5)预扩增:用预扩增引物对连接后的产物进行预扩增;
(6)选择性扩增:在预扩增产物中加入上游引物和下游引物进行扩增,上游引物为特异选择性扩增引物中的一个和Tail,下游引物为LTR引物中的一个,特异选择性扩增引物和LTR引物的组合遵循10个桃SSAP分子标记的组合规则;
(7)扩增产物检测与分析:对扩增产物进行分析,读取扩增片段数据,然后对数据进行统计及聚类分析。
4.根据权利要求3所述的桃SSAP分子标记组合在桃品种遗传多样性分析上的应用,其详细步骤为:
(1)引物设计合成:使用逆转座子预测软件LTR_STRUC version 1.1对桃全基因组序列进行分析,在预测结果数据中优先选择两端LTR序列相似度大于99%的逆转座子,使用Primer Premier 5.0并参考3’端LTR区域序列设计S-SAP分子标记中选择性扩增所需的下游引物,在该引物设计时仅选择从本区域5’端第一个碱基开始,同时替换第一个碱基为错配碱基,设计引物长度为19-23bp,在特异选择性扩增引物末端添加三个选择性碱基,分别为GAG、CGT和GGT,从而形成不同引物组合,同时在其5’端添加18bp的M13通用引物序列TGTAAAACGACGGCCAGT,Tail中的5’端分别添加四种不同的荧光基团,即FAM、HEX、PET和NED,便于后期使用遗传分析仪进行扩增产物的检测与分析;
(2)DNA的提取:①用液氮研磨1g左右的幼叶成粉末状,取约0.4g样品置于2mL离心管中;
②加入1mL提取液后混匀,提取液的配方为:0.4mol/L葡萄糖、3%PVP、10mmol/Lβ-巯基乙醇;
③4℃,10000rpm,10min,弃上清液,加入1mL提取液后混匀;
④4℃,10000rpm,10min,弃上清液,加入0.7mL 65℃预热的SDS裂解液,65℃水浴40min,期间不时轻轻摇动,水浴结束待冷却后加入0.8mL抽提混合液,混匀并于室温下静置10min,SDS裂解液的配方为:100mmol/L Tris·Cl,pH 8.0,20mmol/L EDTA,1.4mmol/LNacl,1.5%SDS,抽提混合液的配方为:氯仿:乙醇:异戊醇体积比=20:4:1;
⑤4℃,10000rpm,10min,小心将上清液移入新的2mL离心管中,加入等体积的异丙醇,混匀,室温静置30min;小心吸出絮团状沉淀,用70%乙醇洗涤,
⑥超净工作台吹干剩余乙醇后,用0.4mL TE溶液溶解DNA,TE溶液的配方为:10mmol/LTris·Cl,1mmol/L EDTA,pH 8.0;
⑦采用紫外分光光度计检测DNA,确定其浓度和质量,同时取1~2μl在1.0%的琼脂糖凝胶上检测,DNA原液稀释成浓度为100ng/μl的工作液保存于-20℃冰箱;
(3)酶切,该反应体系为:基因组DNA模板200ng,10×NEB Buffer 5μL,10mg/mL的BSA0.2μL,10U/μL的Mse I 0.25μL,10U/μL的EcoR I 0.25μL,ddH20补足至25μL,混匀后37℃保温6h,75℃灭活20min;
(4)连接:①接头的制备:分别取EcoR I-adapter和EcoR I-adapter-plus等体积的量混合配成10μmol/L的浓度,再加等量的H20稀释成5μmol/L的终浓度;分别取Mse I-adapter和Mse I-adapter-plus等体积的量混合配成50μmol/L的浓度,在PCR仪上执行以下程序:94℃,3min;65℃,10min;37℃,10mim;25℃,10mim,退火后-20℃保存备用;
②连接反应体系:在酶切产物中加入5μL如下混合液:5μmol/L的EcoR I接头1μL,50μmol/L的Mse I接头1μL,10×T4Buffer 2μL,3U/μL的T4连接酶1uL,16℃连接过夜,65℃灭活20min;
(5)预扩增:预扩增20μL反应体系为:DNA酶切连接产物2μL,10×PCR Buffer 2μL,浓度为10nM的dNTP Mix 0.5μL,25mM的Mg2+2μL,10μM的EcoR I预扩增引物1μL,10μM的Mse I预扩增引物1μL,5U/μL的rTaq酶0.2μL,ddH2O 11.7μL,预扩增PCR程序如下:94℃5min,94℃30s,56℃1min,30个循环,72℃1min,72℃10min;反应完成后,取5μL产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果,其余产物于-20℃保存备用,其中10nM的dNTP Mix指dNTP混合物中dATP、dCTP、dGTP和dTTP各自的浓度为10nM;
(6)选择性扩增:将预扩增产物稀释10倍作为选择性扩增的模板,选择性扩增反应体系体积为25μL,包括:选择性扩增模板2μL,10×PCR Buffer 2μL,浓度为10nM的dNTP Mix 1.0μL,25mM的Mg2+1.6μL,10μM的特异选择性扩增引物1.6μL,10μM的LTR引物0.4μL,10μM的尾巴引物2.0μL,5U/μL的rTaq酶0.3μL,ddH2O 14.1μL;选择性扩增PCR程序如下:94℃5min,94℃30s,65℃·-0.7/cyc·30s 13个循环,72℃1min,94℃30s,56℃30s 19个循环,72℃1min,94℃30s,53℃30s 8个循环,72℃1min,72℃10min,反应完成后,取5μL产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果,其余产物于-20℃保存备用;
(7)扩增产物检测与分析:经上述扩增过程得到的PCR产物,取4μl加ddH2O稀释至25ul,吸取稀释液加入到加有12ul甲酰胺变性缓冲液和0.3ul内标的96孔PCR上样板中,95℃变性5min,在ABI3130遗传分析仪上进行检测,用genemapper 4.0软件进行片段大小读数,只统计长度范围在100-500bp内的扩增产物片段。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410231891.1A CN103966210B (zh) | 2014-05-29 | 2014-05-29 | 桃ssap分子标记引物组合、分子标记组合及其在桃品种遗传多样性分析上的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410231891.1A CN103966210B (zh) | 2014-05-29 | 2014-05-29 | 桃ssap分子标记引物组合、分子标记组合及其在桃品种遗传多样性分析上的应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103966210A CN103966210A (zh) | 2014-08-06 |
CN103966210B true CN103966210B (zh) | 2016-06-29 |
Family
ID=51236217
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201410231891.1A Active CN103966210B (zh) | 2014-05-29 | 2014-05-29 | 桃ssap分子标记引物组合、分子标记组合及其在桃品种遗传多样性分析上的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN103966210B (zh) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110241252B (zh) * | 2019-07-30 | 2022-08-02 | 中国农业科学院郑州果树研究所 | 用于构建桃dna指纹图谱的snp分子标记组合及应用和方法 |
CN110541044A (zh) * | 2019-08-12 | 2019-12-06 | 宁波市农业科学研究院 | 鉴定桃果实离核性状的分子标记引物组合及其应用 |
CN111455087B (zh) * | 2020-05-12 | 2023-01-06 | 江苏省农业科学院 | 一种基于菜豆cacta转座子研发的新型分子标记、引物对、分子标记设计方法及应用 |
CN111607662B (zh) * | 2020-06-30 | 2022-06-10 | 北部湾大学 | 基于白骨壤转录组hAT转座子的分子标记引物组及其应用 |
CN111979346B (zh) * | 2020-08-11 | 2022-07-29 | 中国农业科学院郑州果树研究所 | 一种基于kasp分子标记的良种桃选育方法 |
CN112280900A (zh) * | 2020-11-06 | 2021-01-29 | 宁波市农业科学研究院 | 快速同步鉴定柑橘黄龙病、溃疡病、衰退病、碎叶病和裂皮病的分子标记引物组合及方法 |
CN113981123B (zh) * | 2021-09-28 | 2023-09-22 | 山东农业大学 | 一种用于筛选甘肃油桃品种的snp分子标记 |
CN113881685B (zh) * | 2021-10-09 | 2024-03-29 | 江苏省农业科学院 | 促进植物器官产生红色色泽的基因PpHSP20-like1及其应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1163619C (zh) * | 1996-01-23 | 2004-08-25 | 佳根基因组学公司 | 测定核酸分子序列的方法和组合物 |
CN103184290A (zh) * | 2013-03-29 | 2013-07-03 | 河南科技大学 | 一种ssap分子标记技术在牡丹上的标记方法 |
CN103333950A (zh) * | 2013-05-14 | 2013-10-02 | 广州大学 | 一种开发烟草中具多态性ssr分子标记的方法 |
-
2014
- 2014-05-29 CN CN201410231891.1A patent/CN103966210B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1163619C (zh) * | 1996-01-23 | 2004-08-25 | 佳根基因组学公司 | 测定核酸分子序列的方法和组合物 |
CN103184290A (zh) * | 2013-03-29 | 2013-07-03 | 河南科技大学 | 一种ssap分子标记技术在牡丹上的标记方法 |
CN103333950A (zh) * | 2013-05-14 | 2013-10-02 | 广州大学 | 一种开发烟草中具多态性ssr分子标记的方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
Development of Ty1-copia retrotransposon-based SSAP molecular markers for the study of genetic diversity in peach;Yun Jiao et al.;《Biochemical Systematics and Ecology》;20140919;第57卷;270-277 * |
Transferability of retrotransposon primers derived from Persimmon (Diospyros kaki Thunb.) across other plant species;X.Y.Du et al.;《Genetics and Molecular Research》;20130606;第12卷(第2期);1781-1795 * |
桃品种特异性荧光SSR分子标记数据库构建;李雄伟 等;《果树学报》;20131231;第30卷(第6期);924-932 * |
桃性状遗传评价和分子标记技术研究;俞明亮;《中国博士学位论文全文数据库》;20050215;D048-3 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN103966210A (zh) | 2014-08-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN103966210B (zh) | 桃ssap分子标记引物组合、分子标记组合及其在桃品种遗传多样性分析上的应用 | |
CN113430300B (zh) | 一种果桑品种‘粤椹123’的ssr分子标记及其核心引物组、试剂盒和应用 | |
CN112980999B (zh) | 一种果桑品种‘粤椹74’的ssr分子标记及其核心引物组、试剂盒和应用 | |
US20210198756A1 (en) | Dna barcode for variety identification of wolfberry and identification method therefor | |
CN113637794B (zh) | 一种果桑新品种‘粤椹201’的ssr分子标记及其核心引物组、试剂盒和应用 | |
Diaz et al. | Identification of Phoenix dactylifera L. varieties based on amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers | |
CN114262748B (zh) | 一种鉴定果桑品种‘粤椹143’的分子标记、鉴定引物组、试剂盒和应用 | |
CN103114145B (zh) | 一种大豆抗花叶病毒主效基因位点及应用 | |
CN107385052B (zh) | 用于鉴定桉树无性系的str引物及其应用 | |
CN106434645A (zh) | 一种降香黄檀的its区序列及用其鉴定降香黄檀的方法 | |
CN107354222B (zh) | 用于鉴定桉树无性系的str引物、pcr试剂盒及方法 | |
CN116144819B (zh) | 与南瓜果肉类胡萝卜素主效qtl紧密连锁的snp分子标记及其应用 | |
CN103290102B (zh) | 一种基于pcr的snp分型方法及应用 | |
CN104611329B (zh) | 樱花品种“松月”和“郁金”的分子特异性标记引物 | |
CN108841983A (zh) | 一种甘蔗全长转录组数据大规模开发的ssr引物 | |
CN104087668B (zh) | 大白菜ssr核心引物及品种检测试剂盒 | |
CN104593367B (zh) | 樱花品种红丰、市原虎尾和平野妹背的特异性标记引物 | |
CN106399566B (zh) | 一套适于栽培绿豆品种鉴定的ssr引物组合及其应用 | |
CN102296124B (zh) | 一种利用rapd快速区分枣品种的方法 | |
CN104560977B (zh) | 樱花品种“平野妹背”的分子特异性标记引物及检测方法 | |
CN114634991B (zh) | 一组用于鉴别高种椰子的InDel标记及其应用 | |
CN109355422A (zh) | 一种鉴定紫苏种质的ssr标记引物及其应用 | |
CN103789304B (zh) | 基于梨基因组开发的irap标记及其应用 | |
CN104611330B (zh) | 樱花品种“红丰”和“市原虎尾”的分子特异性标记引物 | |
CN114438239B (zh) | 一种鉴定果桑品种粤椹大10的分子标记、鉴定引物组、试剂盒和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |