CN110241252B

CN110241252B - 用于构建桃dna指纹图谱的snp分子标记组合及应用和方法

Info

Publication number: CN110241252B
Application number: CN201910694486.6A
Authority: CN
Inventors: 曹珂; 关利平; 朱更瑞; 方伟超; 王新卫; 陈昌文; 李勇
Original assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Current assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Priority date: 2019-07-30
Filing date: 2019-07-30
Publication date: 2022-08-02
Anticipated expiration: 2039-07-30
Also published as: CN110241252A

Abstract

本发明公开了用于构建桃DNA指纹图谱的SNP分子标记组合及应用和方法，所述SNP分子标记组合包括SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.17所示的SNP分子标记。本发明通过对360份桃种质样品的测序比对，鉴定出16658391个SNPs，对这些SNP进行过滤和筛选，获得用于鉴定种质的SNP集合。本发明利用80份桃育成品种来预测开发的SNP集合的区分效率，结果表明，本发明对育成品种的区分率可达100％。这说明，利用本发明的单核苷酸标记位点进行检测具有简单、快速、成本低的优点，能够实现生产中大规模的应用。由于原始SNP数量庞大，从而保证了得到的SNP的多态性，有效提高了利用该SNP集合鉴定的准确性。

Description

用于构建桃DNA指纹图谱的SNP分子标记组合及应用和方法

技术领域

本发明涉及一种用于构建桃DNA指纹图谱的SNP分子标记组合及应用和方法，属于桃分子生物技术领域。

背景技术

我国作为桃的起源中心，桃种质资源丰富，3个国家桃种质资源圃(北京、南京、郑州) 及众多地方桃资源圃，收集保存了6个种2000余份桃种质资源。近年来结合地方优质品种与国外品种又保存了许多品种。如此繁多的品种和复杂的遗传背景，给桃品种鉴定带来了巨大的挑战。据不完全统计，全世界栽培的桃品种就有5000个以上，美国选育及引进的桃品种有 700余个，中国选育的品种也有1000余个。丰富的种质资源为桃产业的可持续发展提供了可靠的遗传物质基础，未来世界桃遗传背景的扩展寄托于中国桃野生近缘种和地方品种优异基因的发掘与利用。中国作为世界上桃种质资源最为丰富的国家，加强品种保护和鉴定显得尤为迫切。

DNA指纹能从本质上反映生物个体差异，具有高度个体特异性和稳定可靠性，能够准确、快速的对新品种及现存品种进行鉴定。DNA指纹技术多种多样，如RFLP分析、RAPD分析、 AFLP分析、ISSR分析、SSR分析、SNP分析等等，各种分析方法均以DNA的多态性为基础，产生具有高度个体特异性的DNA指纹图谱。RFLP、RAPD、AFLP技术曾被应用到建库上，但因技术的稳定性、复杂性及数据整合等问题未广泛应用，国际新品种保护联盟建议SSR 和SNP作为首选的DNA指纹标记技术。由于SNP标记具有覆盖全基因组、高通量、位点特异、共显性遗传、误检率低、开发和检测成本急剧降低、数据易整合等优点，将成为未来基因型鉴定的主要标记类型。

随着二代测序技术的发展，测序通量呈现指数增长趋势，而测序成本则急剧降低，为全基因组水平SNP标记的检测提供了强有力的技术支持。每个物种上存在丰富的SNP，如何根据不同鉴定目标，制定SNP位点筛选原则、位点数目、位点组合、判定阈值等成为筛选SNP 构建指纹图谱的关键。本发明基于桃重测序获得的SNP，通过SNP测序质量的控制、SNP位点质量控制、SNP筛选的判定阈值设定(π和E值，π值与多样性成正比，E值与序列特异性成反比)等，以获得标准化的SNP构建指纹图谱的流程，用来建立桃的分子身份证。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种用于构建桃DNA指纹图谱的SNP分子标记组合及应用和方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：

用于构建桃DNA指纹图谱的SNP分子标记组合，包括以下SNP分子标记：

第一个SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中，R为G或A；

第二个SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其中，W为T或A；

第三个SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其中，Y为C或T；

第四个SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，其中，R为A或G；

第五个SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其中，R为A或G；

第六个SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，其中，R为G或A；

第七个SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，其中，M为A或C；

第八个SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，其中，S为C或G；

第九个SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，其中，Y为T或C；

第十个SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，其中，M为A或C；

第十一个SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，其中，Y为C或T；

第十二个SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，其中，S为G或C；

第十三个SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，其中，R为A或G；

第十四个SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，其中，K为G或T；

第十五个SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，其中，W为T或A；

第十六个SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，其中，K为T或G；

第十七个SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，其中，S为G或C。

扩增上述SNP分子标记组合的PCR扩增引物对组合为根据SNP分子标记位点上游150bp 和下游150bp序列进行设计。

针对第一个SNP分子标记的PCR扩增引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.18-19所示；

针对第二个SNP分子标记的PCR扩增引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.20-21所示；

针对第三个SNP分子标记的PCR扩增引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.22-23所示；

针对第四个SNP分子标记的PCR扩增引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.24-25所示；

针对第五个SNP分子标记的PCR扩增引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.26-27所示；

针对第六个SNP分子标记的PCR扩增引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.28-29所示；

针对第七个SNP分子标记的PCR扩增引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.30-31所示；

针对第八个SNP分子标记的PCR扩增引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.32-33所示；

针对第九个SNP分子标记的PCR扩增引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.34-35所示；

针对第十个SNP分子标记的PCR扩增引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.36-37所示；

针对第十一个SNP分子标记的PCR扩增引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.38-39所示；

针对第十二个SNP分子标记的PCR扩增引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.40-41所示；

针对第十三个SNP分子标记的PCR扩增引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.42-43所示；

针对第十四个SNP分子标记的PCR扩增引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.44-45所示；

针对第十五个SNP分子标记的PCR扩增引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.46-47所示；

针对第十六个SNP分子标记的PCR扩增引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.48-49所示；

针对第十七个SNP分子标记的PCR扩增引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.50-51所示。

一种上述SNP分子标记组合在构建桃DNA指纹图谱中的应用。

一种上述SNP分子标记组合在鉴定桃种质中的应用。

一种利用上述SNP分子标记组合鉴定桃种质的方法，包括以下步骤：

(1)DNA提取：采用常规CTAB法提取样品DNA；

(2)SNP位点检测：采用Sanger法对样品DNA中SNP位点进行检测；

(3)基因分型：根据SNP位点的检测结果进行判定。

步骤(2)的方法为：

①PCR扩增及电泳检测：首先利用PCR扩增引物对进行PCR扩增；配制PCR扩增体系：5×PCR Buffer 4.0μl、dNTP Mix(2.5μM each)1.6μl、上下游引物(10μM each)的混合物2.0μl、5U/μl Taq DNA聚合酶0.15μl、20ng/μl DNA 2.0μl、ddH₂O 10.25μl；将上述试剂转移到PCR管或板中，PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，54℃30s，72℃30s，共30 个循环；72℃10min；4℃保存；配制2％琼脂糖凝胶，取2μl PCR扩增产物，于100V-15min 条件下进行电泳检测；

②SNP检测：将电泳检测结果显示条带的PCR产物送测序公司进行Sanger测序。

本发明的有益效果：

本发明通过对360份桃种质样品的测序比对，鉴定出16658391个SNPs，对这些SNP进行过滤和筛选，获得用于鉴定种质的SNP集合。

本发明利用80份桃育成品种来预测开发的SNP集合的区分效率，结果表明，本发明对育成品种的区分率可达100％。这说明，利用本发明的单核苷酸标记位点进行检测具有简单、快速、成本低的优点，能够实现生产中大规模的应用。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1 SNP标记位点的获得

本发明以从中国农业科学院郑州果树研究所桃种质资源圃获得的360份桃种质为样品，采用常规CTAB法提取样品DNA，并通过Illumina HiSeq 2000测序仪对360份桃种质进行重测序，得到151Gb数据，平均测序深度为8.4×左右。根据测序得到的50-150bp的reads，与桃参考基因组第2版(http://www.rosaceae.org/node/355)进行比对，鉴定出16658391个SNPs。

实施例2 SNP标记位点的过滤

使用软件vcftools v0.1.13对SNP标记位点进行过滤，具体方法如下：

(1)缺失率过滤

利用vcftools进行每个SNP位点缺失率计算，过滤掉在360个样本中有缺失的SNP位点，输出包含939004个SNPs的vcf文件。

(2)SNP测序深度过滤

计算步骤(1)输出的vcf文件中SNP的测序深度，根据统计结果，过滤掉测序深度低于 10×的SNP位点，输出包含310260个SNPs的vcf文件。

(3)SNP质量值过滤

计算步骤(2)输出的vcf文件中SNP的质量值Q，过滤掉质量值低于1000的SNP位点，输出包含141076个SNPs的vcf文件。

(4)π值过滤

计算步骤(3)输出的vcf文件中SNP的π值，过滤掉π值低于0.48的SNP位点，输出包含1043个SNPs的vcf文件。

(5)等位基因数目过滤

计算步骤(4)输出的vcf文件中SNP的等位基因，过滤掉大于两个等位基因的SNP位点，获得775个只有两个等位基因的SNP位点的vcf文件。

实施例3 SNP标记位点的筛选

(1)π值排序

对实施例2步骤(5)含有775个SNP的vcf文件进行π值计算，输出txt文件，根据π值对SNP进行排序，以π值最大的SNP(Chr1：9204153)作为集合的第一个SNP位点。

(2)查看序列特异性

利用Samtools软件获得SNP(Chr1：9204153)分子标记上下游各150bp的序列，利用blast(https://www.rosaceae.org/tools/ncbi_blast)查看序列特异性(E≥e-157)。

(3)确定最佳SNP组合

将第一个SNP分子标记(Chr1：9204153)与剩余的774个SNP分子标记进行组合(Perl 程序)，获得区分7个品种且上下游300bp序列的E＝e-157的SNP分子标记(Chr2：28221961)，作为第二个SNP位点。

包含上述两个SNP分子标记的集合与剩余的773个SNP分子标记进行组合(Perl程序)，获得区分15个品种且其上下游300bp序列的E＝2e-155的SNP分子标记(Chr6：28389195)，作为第三个SNP位点。

包含上述三个SNP分子标记的集合与剩余的772个SNP分子标记进行组合(Perl程序)，获得区分26个品种且其上下游300bp序列的E＝e-157的SNP分子标记(Chr4：24189168)，作为第四个SNP位点。

包含上述四个SNP分子标记的集合与剩余的771个SNP分子标记进行组合(Perl程序)，获得区分44个品种且其上下游300bp序列的E＝e-157的SNP分子标记(Chr8：17158710)作为第五个SNP位点。

包含上述五个SNP分子标记的集合与剩余的770个SNP分子标记进行组合(Perl程序)，获得区分97个品种且其上下游300bp序列的E＝e-157的SNP分子标记(Chr7：6409951)作为第六个SNP位点。

包含上述六个SNP分子标记的集合与剩余的769个SNP分子标记进行组合(Perl程序)，获得区分182个品种且其上下游300bp序列的E＝e-157的SNP分子标记(Chr1：4975413)，作为第七个SNP位点。

包含上述七个SNP分子标记的集合与剩余的768个SNP分子标记进行组合(Perl程序)，获得区分256个品种且上下游300bp序列的E＝e-157的SNP分子标记(Chr7：84627)，作为第八个SNP位点。

包含上述八个SNP分子标记的集合与剩余的767个SNP分子标记进行组合(Perl程序)，获得区分306个品种且其上下游300bp序列的E＝e-157的SNP分子标记(Chr4：10643695)，作为第九个SNP位点。

包含上述九个SNP分子标记的集合与剩余的766个SNP分子标记进行组合(Perl程序)，获得区分327个品种且上下游300bp序列的E＝e-157的SNP分子标记(Chr3：3926296)，作为第十个SNP位点。

包含上述十个SNP分子标记的集合与剩余的765个SNP分子标记进行组合(Perl程序)，获得区分342个品种且上下游300bp序列的E＝e-157的SNP分子标记(Chr8：19345619)，作为第十一个SNP位点。

包含上述十一个SNP分子标记的集合与剩余的764个SNP分子标记进行组合(Perl程序)，获得区分349个品种且其上下游300bp序列的E＝e-157的SNP分子标记(Chr5：9339225) 作为第十二个SNP位点。

包含上述十二个SNP分子标记的集合与剩余的763个SNP分子标记进行组合(Perl程序)，获得区分352个品种且其上下游300bp序列的E＝e-157的SNP分子标记(Chr3：24412971)，作为第十三个SNP位点。

包含上述十三个SNP分子标记的集合与剩余的762个SNP分子标记进行组合(Perl程序)，获得区分354个品种且其上下游300bp序列的E＝e-157的SNP分子标记(Chr2：16695847)，作为第十四个SNP位点。

包含上述十四个SNP分子标记的集合与剩余的761个SNP分子标记进行组合(Perl程序)，获得区分356个品种且其上下游300bp序列的E＝e-157的SNP分子标记(Chr6：11029785)，作为第十五个SNP位点。

包含上述十五个SNP分子标记的集合与剩余的760个SNP分子标记进行组合(Perl程序)，获得区分359个品种且其上下游300bp序列的E＝e-157的SNP分子标记(Chr1：5348399)，作为第十六个SNP位点。

包含上述十六个SNP分子标记的集合与剩余的759个SNP分子标记进行组合(Perl程序)，获得区分360个品种且其上下游300bp序列的E＝e-157的SNP分子标记(Chr2：28250686)，作为第十七个SNP位点。

结果表明筛选的17个SNP分子标记的集合能将360份种质完全区分，且尽量在8条染色体均匀分布，序列特异性强。

表1区分种质的17个SNP上下300bp序列信息

(4)构建360份桃种质的SNP指纹库

根据每个SNP位置对应一个SNP标记，SNP标记按照SNP1在前，之后依次为SNP2、SNP3、SNP4、SNP5、SNP6、SNP7、SNP8、SNP9、SNP10、SNP11、SNP12、SNP13、SNP14、 SNP15、SNP16及SNP17的顺序组成17个字符串，为每个品种的分子身份证。如安农水蜜的SNP分子身份证为KWYGGRMSCACSRKWTG。对表2中17个SNP位点在360份种质的分型一致性进行检测(测序的数据库中SNP信息)，发现不同品种的17个SNP位点分型不一致，即每个品种的SNP分子身份证(指纹)均为特异的，17个位点对360份种质的鉴定效率达100％。

表2 360份种质的SNP指纹库

其中，R为A或G，Y为C或T，M为A或C，K为G或T，S为G或C，W为A或T。

实施例4 SNP集合的应用

1、试材

以从中国农业科学院郑州果树研究所收集的80份桃育成品种为试材，提取DNA。

2、引物设计

根据17个桃SNP位点上游150bp，下游150bp序列(具体的核苷酸序列见表1)，设计引物，引物序列见表3。

表3引物序列

3、17个SNP位点检测

本发明采用一代测序(Sanger法)对17个SNP位点进行检测：

①PCR扩增及电泳检测：首先利用表3引物进行PCR扩增；配制PCR扩增体系、：5×PCR Buffer 4.0μl、dNTP Mix(2.5μM each)1.6μl、上下游引物的混合物(10μM each)2.0μl、5 U/μl Taq DNA聚合酶0.15μl、20ng/μl DNA 2.0μl、ddH₂O 10.25μl；将上述试剂转移到PCR管或板中，PCR扩增程序为：94℃3min；94℃30s，54℃30s，72℃30s，共30个循环； 72℃10min；4℃保存；配制2％琼脂糖凝胶，取2μl PCR扩增产物，于100V-15min条件下进行电泳检测。

4、SNP位点对80份育成品种的鉴定能力

从鉴定结果(表4)可以看出，80份样本均能被这17个SNP位点鉴定，鉴定能力为100％，与预期结果符合。

表4 17个SNP位点在80份育成品种中的鉴定

综上所述，本发明的SNP分子标记能够用于构建桃DNA指纹图谱，该方法是利用对360 份桃种质进行重测序得到的16658391个SNPs中过滤筛选得到的位点，重新开发所得到的。由于原始SNP数量庞大，从而保证了得到的SNP的多态性，有效提高了利用该SNP集合鉴定的准确性。

序列表

<110> 中国农业科学院郑州果树研究所

<120> 用于构建桃DNA指纹图谱的SNP分子标记组合及应用和方法

<160> 51

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 301

<212> DNA

<213> 桃(Amygdalus persica L.)

<220>

<221> misc_feature

<223> r=a或g

<400> 1

tgtcatcatc tagtttgtag gttcttgagt tttctagaat tgtgtactta catctacaca 60

aatatgcatt actttttcaa caaatttaaa tgaaataaat cttgcgattc tgttgctgat 120

tatatccttc atagaataaa gctgagctga rtgcaagtct tttcactccc attaatttac 180

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t 301

<210> 2

<211> 301

<212> DNA

<213> 桃(Amygdalus persica L.)

<220>

<221> misc_feature

<223> w=a或t

<400> 2

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c 301

<210> 3

<211> 301

<212> DNA

<213> 桃(Amygdalus persica L.)

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<223> y=c或t

<400> 3

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aaagcaatga aacagggatc acctcttttg cacgaataag aacgtcacta gcaggcatca 300

g 301

<210> 4

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<212> DNA

<213> 桃(Amygdalus persica L.)

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<212> DNA

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<213> 桃(Amygdalus persica L.)

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<212> DNA

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<221> misc_feature

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<400> 11

aaatattatt ctacacaaac atgggtttac atagatgctt acctcacgtc tgatcaatca 60

atgggtctga caaaaaaatg cggttgagtt aggtacgttt gatcttgttt aatcaaactt 120

ctatttcaat caccaccctc aaattcagct tyatttattc ttgaatagtt cattagatta 180

tcatctattt acgcaagggt ttcttctttg tatagtgttt gttggtttgt aattaaggga 240

gaataaagct gttaaatgtt gtaactaaca aaatgattag cttttgattt tgattgatat 300

cg 302

<210> 12

<211> 302

<212> DNA

<213> 桃(Amygdalus persica L.)

<220>

<221> misc_feature

<223> s=g或c

<400> 12

ttctaaccca accaggctat gaatatgaga agttataaat ttttcttttt actgttttgt 60

aaatttttga caacaccata ttcctctctt ccttactcta acaagtaagc aagtaaacta 120

ccttaacggg gagggtaatc ttctcttatg csccttcacc aatcgcccgg tgactaagaa 180

agaaattggt ttgcgcattt ttttataatc aaaaggacga gatctatttg ctttgctgcc 240

cacacatttg aaacaattga tttggtgtta acggccatct aaaaaattaa tttgacgtta 300

at 302

<210> 13

<211> 302

<212> DNA

<213> 桃(Amygdalus persica L.)

<220>

<221> misc_feature

<223> r=a或g

<400> 13

agatgcccat gctttgattc gaaagcccta gccagtgatg aatccccagt aagatcggag 60

tattgaattt atcctccctt cagtcctgtt tgaacccgtc ccagcaacga ccaccttcct 120

actgcaaggt gaggctctgc ccttccccta graatccact ccgggtcgga ggagctgcta 180

gtccaacttc ttgagcagcc gagatattga acaacgaaca ttgaattcct tgcctcaccc 240

tgagatgaga ggggaggggt gcgcttcctt ccggaaaaaa aagtggttct taccttcctg 300

ta 302

<210> 14

<211> 302

<212> DNA

<213> 桃(Amygdalus persica L.)

<220>

<221> misc_feature

<223> k=g或t

<400> 14

tgattttttt ttattccaac agtcttttct taaagtttga agttgtgcac acttcagcct 60

tgctgagcct agtacttttt cttcatggat tctcatatgt ttttggttgt atgcttttgg 120

agaatagtct ccaaaatagc atgatcaata tkcctagagt aaataattct tcaccttcaa 180

atatttcagc ctctgatcat taagtttctt ctattgttgt tgtgtcagta gtggtcattc 240

ttctggcact tcatatcctc tctccacaag atctcaatat tctttggacc ttagaaagtt 300

ct 302

<210> 15

<211> 302

<212> DNA

<213> 桃(Amygdalus persica L.)

<220>

<221> misc_feature

<223> w=a或t

<400> 15

tctgaaattt aattgaattt acaaaattct aaagtgaaag tacgagttta accttaaggt 60

tcctcggtag tttagagttg actttttact catggctcat gttgggaagt ttcttggttc 120

ctttacgtag agctcgagct cacgagtttg awagacatgt ggtggaccca aatcgaagtt 180

gaaatgaaga agttacgatc tacaaaaatg tagtggcaca accgtaattt ttataaagtt 240

aaattataaa aagctggacg gatagcttat tctcactcac ttctctctct ctccccccct 300

cc 302

<210> 16

<211> 302

<212> DNA

<213> 桃(Amygdalus persica L.)

<220>

<221> misc_feature

<223> k=g或t

<400> 16

agagacaaaa ggcacgaatc taaaatatac atttgtcgga gaatccgctg aagtagctct 60

tttgaatctt caaagacagg cttccaccaa tcgacgtttc tcacatttca gatggtggta 120

aagtgagacc acataaagag ctcttcctca gktccgtctg attattcagt aagatatggt 180

ttgacccttt tttttttttg tttgaatctt cataaagaaa gcagaatcag ttggtcaaga 240

aaagagaaaa agaggccaag gaaaaggagg aggataacca catgatcacc aaaccttatc 300

cg 302

<210> 17

<211> 302

<212> DNA

<213> 桃(Amygdalus persica L.)

<220>

<221> misc_feature

<223> s=g或c

<400> 17

aattgctttt gttgatggta ctgatttccc gtattcataa cttagctttg ctccaccagc 60

atgaaccgat ttctgcaacc aacatcaact tcggtgactt ccaactttat gaacaaaatc 120

aaaggattaa tgttaagtct agtgttagta csttgttcgc ttttcaattg ttggagctat 180

agctagcttc ctttctcagc acttgttgca aagaattttc ctctgccctt gaactatcag 240

ataagtatat gcagaatttt gtgtttaaat cattaaaagt gcttttacca gacacattta 300

tg 302

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

tcttgcgatt ctgttgctga tt 22

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

ttctagctga acctgccatt tg 22

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 20

ccatcaccaa gaatccatca aa 22

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 21

tttgttgatg agaatggagc aga 23

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 22

gccagagctc agtaaatgtc tatca 25

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 23

ctgtttcatt gctttccacc at 22

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 24

catgccaagg caactaaact gt 22

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 25

tgtttttatt gtttttgggg acc 23

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 26

tttgctgaaa ctgaatcccc tt 22

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 27

atcccacccc cacaaataaa g 21

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 28

tccaccgagt atagtcgatc agt 23

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 29

tcagtgatga gggcatgtcc 20

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 30

tgcattggtg actggctatt gt 22

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 31

agaaaagaat gttgtaccac agca 24

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 32

aagggcttag cgtccattcc 20

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 33

tgctccaatt gtattcacct ctg 23

<210> 34

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 34

agtgttactg attgtgctaa gttgc 25

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 35

tcaacatgtg taatgaacca aagc 24

<210> 36

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 36

aggtttggct gcaattgaac tt 22

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 37

tgcagcatct gttgctattc g 21

<210> 38

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 38

acaaaaaaat gcggttgagt tag 23

<210> 39

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 39

ttctccctta attacaaacc aaca 24

<210> 40

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 40

gacaacacca tattcctctc ttcc 24

<210> 41

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 41

gcaaagcaaa tagatctcgt cct 23

<210> 42

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 42

atcctccctt cagtcctgtt tg 22

<210> 43

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 43

gcaaggaatt caatgttcgt tg 22

<210> 44

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 44

gccttgctga gcctagtact ttt 23

<210> 45

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 45

gccagaagaa tgaccactac tga 23

<210> 46

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 46

aggttcctcg gtagtttaga gttg 24

<210> 47

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 47

aaattacggt tgtgccacta cat 23

<210> 48

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 48

aaagacaggc ttccaccaat c 21

<210> 49

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 49

ttgaccaact gattctgctt tct 23

<210> 50

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 50

ctgcaaccaa catcaacttc g 21

<210> 51

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 51

aagggcagag gaaaattctt tg 22

Claims

1.用于构建桃DNA指纹图谱的SNP分子标记组合，其特征在于，由以下SNP分子标记组成：

第六个SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，其中，R为A或G；

2.扩增权利要求1所述SNP分子标记组合的PCR扩增引物对组合，其特征在于，根据SNP分子标记位点上游150bp和下游150bp序列进行设计；其中，

3.一种检测权利要求1所述的SNP分子标记组合的引物对组合在构建桃DNA指纹图谱中的应用，其特征在于，所述引物对组合为权利要求2所述的引物对组合。

4.一种检测权利要求1所述的SNP分子标记组合的引物对组合在鉴定桃种质中的应用，其特征在于，所述引物对组合为权利要求2所述的引物对组合。

5.一种利用权利要求1所述的SNP分子标记组合鉴定桃种质的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）DNA提取：采用CTAB法提取样品DNA；

（2）SNP位点检测：以权利要求2所述引物对组合对样品DNA进行PCR扩增，并采用Sanger法对样品DNA中SNP位点进行检测；

（3）基因分型：根据SNP位点的检测结果进行判定，鉴定桃种质。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（2）的方法为：

①PCR扩增及电泳检测：首先利用PCR扩增引物对进行PCR扩增；配制PCR扩增体系：5×PCR Buffer 4.0 μl、dNTP Mix 1.6 μl、上下游引物的混合物2.0 μl、5 U/μl Taq DNA聚合酶0.15 μl、20ng/μl DNA 2.0μl、ddH₂O 10.25μl；将试剂转移到PCR管或板中，PCR扩增程序为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存；配制2%琼脂糖凝胶，取2μl PCR扩增产物，于100V、15min条件下进行电泳检测；