CN114480704B - 一种用于茄子种资源鉴定的snp组合标记 - Google Patents

一种用于茄子种资源鉴定的snp组合标记 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于茄子种资源鉴定的SNP组合标记，所述茄子SNP组合标记采用如序列表SEQ NO.ID 1‑144所示引物序列进行鉴定。本发明一种茄子SNP组合标记在品种资源分类、品种资源真实性或品种身份鉴定、品种指纹图谱构建、真假杂交种鉴定中均具有应用。

Description

一种用于茄子种资源鉴定的SNP组合标记
技术领域
本发明属于茄子种资源鉴定和育种领域，具体涉及一种用于茄子种资源鉴定的SNP组合标记。
背景技术
茄子(Solanum melongena L)属茄科(Solanaceae)茄属(Solanum L)重要蔬菜。茄子具有较强的杂种优势。因此对已种质资源进行精准鉴定、分类对于杂种优势的利用有着重要的意义。
传统基于表型对种质资源进行遗传多样性分析的方法在茄子上得到了广泛的应用。已有的研究结果表明，茄子具有丰富的表型变异根据表型的的差异能够区分大部分种质资源(邓姗等,2020；李鲁俊等,2019；齐东霞等,2017)。但是由于表型鉴定容易受到环境、人为主观因素的判断，会对研究结果造成一定的影响。而基于DNA序列多样性的分子标记技术由于其不易受环境条件和认为主观因素的影响，在种质资源遗传多样性分析(郭守鹏等,2019；林珲等,2019；王葡萄等,2020)、基因定位与克隆(王彤彤等,2012)、品种真实性和纯度鉴定(吉康娜等,2019)以及分子标记辅助育种(张宝玺等,2020)等方面有着重要的作用。
随着茄子基因组的的解析，茄子的分子标记技术得到了快速发展(Barchi et al,2019；Wei et al,2020)。目前在茄子种质资源遗传多样性分析上利用的分子标记有SRAP(林珲等2019)、SSR(郭守鹏等2019)、EST-SSR(曾美娟等,2020)、Indel(吉康娜等2019)、SNP(Barchi et al,2019；Liu et al,2019；魏庆镇等,2019)等。利用这些分子标记能够有效的将种质资源进行区分，为亲缘关系分析、种子纯度和杂交组配提供了良好的参考(廖秋石等,2020)。
由于单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)是植物基因组中分布最丰富的变异，并且其能实现低成本高通量的检测，因此SNP标记是极具应用前景的分子标记技术(Semagn etal.,2014),已经在多种作物上得到了广泛应用。
现有技术存在的问题：茄子种质资源表型鉴定周期长、工作量大、易受环境条件和人为主观影响。已有的ISSR，SRAP和SSR等分子标记操作复杂，实验周期长，通量低。本发明通过对40份茄子材料进行基因组重测序，开发出能将224份茄子种质完全区分开的135个SNP位点。上述SNP标记组合可用于茄子真实性和身份鉴定，具有适用的品种种类更多、低成本、高效率等优点。
发明内容
本发明要解决的关键技术问题在于通过对40份茄子材料进行基因组重测序，开发出能将224份茄子种质完全区分开的48个SNP位点。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
1.一种茄子SNP组合标记，所述SNP组合标记采用序如列表SEQ NO.ID 1-144(或表1)所示引物序列进行茄子种质资源基因分型。
2.一种茄子SNP组合标记的筛选方法，包括如下步骤：(1)SLAF-seq基因组测序，(2)SNP检测，(3)Perfect SNP过滤，(4)引物设计与合成，(5)引物筛选。
3.一种茄子SNP组合标记在品种资源分类中的应用。利用上述48组SNP引物对224份茄子高代自交系进行区分，统计每个样品两两之间的SNP的相似程度，构建一个距离矩阵，利用R程序包poppr(Kamvar ZN,Tabima JF,GrünwaldNJ.2014.Poppr:an Rpackage forgenetic analysis of populations with clonal,partially clonal,and/or sexualreproduction.PeerJ 2:e281https://doi.org/10.7717/peerj.281)进行群体PCoA分析和进化树构建。两个样品间SNP标记相识度越高，这两个样品间分枝隔得越近，反之越远。在PCA图中，两个样品间SNP标记相识度越高，这两个样品靠的越近，反之越远。
4.一种茄子SNP组合标记在在品种资源真实性或品种身份鉴定中的应用。利用上述48组SNP标记将待鉴定的品种基因型与目标品种的基因型进行比较，两者基因型的相似度达到90％以上，则待鉴定的品种真实的来源于目标品种。
5.一种茄子SNP组合标记在在真假杂交种鉴定的应用。首先在两个亲本中筛选具有上述48个SNP标记中差异的纯合SNP标记，然后在杂交F1单株代中进行分析，如果F1单株均为杂合位点，则该单株为真实杂交种。通过统计F1单株中真实杂交种的百分率，可以对杂交种的纯度进行快速检测。
有益效果：
本发明开发了48组SNP分子标记，利用该SNP分子标记组合，可以避免环境条件和认为主观因素的影响，在茄子种质资源遗传多样性分析、品种真实性、纯度鉴定和真假杂交种的鉴定有着重要的意义。
附图说明
图1为SNP筛选实验流程。
图2为利用48组SNP引物对224份茄子构建遗传进化树，其中，不同的分枝代表不同的茄子材料。
图3为利用48组SNP引物对224份茄子种质资源进行PCA分析，数值表示茄子样品编号。
具体实施方法
本发明专利下述实施例中使用方法和装置，如无特殊说明，均为常规方法和装置；所用器材、试剂均为试剂公司购买的常规器材和试剂。为使本发明专利的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明专利的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在具体实施例中进行了例示。在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明专利的技术方案，在实施例中仅仅示出了与根据本发明专利的方案密切相关的技术方案和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。
实施例1
本实施例提供一种用于茄子种资源鉴定的SNP组合标记，包括如表1所述48组SNP引物。
表1 SNP位点及其引物
Figure GDA0004254080680000021
Figure GDA0004254080680000031
Figure GDA0004254080680000041
实施例2
本实施例提供一种用于茄子种资源鉴定的SNP组合标记的筛选方法，如图1所示，包括如下步骤：
1.SLAF-seq基因组测序
取茄子幼嫩叶片0.1g左右，利用CTAB法提取叶片总DNA，利用琼脂糖电泳检测DNA的完整性，利用RsaI+HaeIII进行双酶切，酶切片段长度在414-464的序列定义为SLAF标签。建库测序的具体的操作步骤参考Sun et al的方法(Sun X,Liu D,Zhang X,et al.SLAF-seq:an efficient method of large-scale De novo SNP discovery and genotypingusing high-throughput sequencing[J].PloS one,2013,8(3):e58700)，最终获得建库测序的reads。
2.SNP检测
简化测序获得的测序reads利用bwa软件比对到茄子参考基因组上(Barchi,L.,Pietrella,M.,Venturini,L.et al.A chromosome-anchored eggplant genome sequencereveals key events in Solanaceae evolution.Sci Rep 9,11769(2019).https://doi.org/10.1038/s41598-019-47985-w)，并使用GATK(McKenna A,Hanna M,Banks E,etal.The Genome Analysis Toolkit:a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data[J].Genome research,2010,20(9):1297-1303.和samtools[(Li H,Handsaker B,Wysoker A,et al.The sequence alignment/map formatand SAMtools[J].Bioinformatics,2009,25(16):2078-2079.两种方法开发SNP，以两种方法得到的SNP标记交集作为最终可靠的SNP标记数据集。最终获得共得到943,784个群体SNP
3.Perfect SNP过滤
根据Liu et al(Liu,Qian,Zhang,Yang,Wu,Barchi,Zhao,Sun,Cui and Wen,2019)的标准，略有修改后进行perfect SNPs筛选，筛选标准如下：(1)最小等位基因频率(MAF)>0.4；(2)错配率<0.25；(3)杂合率<0.5；(4)在SNP位点左右各50bp无其他突变。通过过滤最终得到268个perfect SNPs。
4.引物设计与合成
引物的合成利用primer3进行引物设计，并且在X引物添加用于荧光通引物匹配扩增FAM荧光匹配的接头，序列为GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，在Y引物序列添与HEX荧光匹配的接头序列为荧光匹配的接头，序列为GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。然后将合成的引物送上海生工合成。
5.引物筛选。
使用24个茄子样本进行引物的筛选，SNP分型试剂PARMS购买自武汉景泰生物。反应体系如下：
表2 PCR反应体系
成分 体积
2×PARMS 2.5ul
引物X 0.075ul
引物Y 0.075ul
引物C 0.2ul
DNA模板 1ul
超纯水 1.15ul
利用ABI QuantStudio6 QS6实时荧光定量进行PCR反应，反应程序如表3所示，反应结束后利用仪器自带程序进行基因分析分析。经过筛选，共获得135组可用SNP引物。根据MAF值筛选前48组SNP引物作为核心引物。
表3 PCR热循环程序
步骤 温度 时长
1 94℃ 15min
2 94℃ 20s
3 65℃(每个循环降低0.7℃) 1min
4 回到第2步，10个循环
5 94℃ 20s
6 57℃ 1min
7 回到第6步，35个循环
8 37℃ 1min
7、引物多态性统计。
利用上述48组SNP引物对224份茄子高代自交系进行基因分型，利用Excel计算引物的MAF,PIC和遗传多样性。结果如表4所示。
表4 48组SNP引物对224份茄子遗传多样性分析
Marker MAF GeneDiversity PIC Marker MAF GeneDiversity PIC
SNP1 0.5 0.491031569 0.370476 SNP25 0.486364 0.517020089 0.400577
SNP2 0.5 0.511918048 0.393892 SNP26 0.486239 0.525350765 0.412705
SNP3 0.5 0.643783881 0.567564 SNP27 0.484234 0.508320711 0.387887
SNP4 0.497748 0.508799027 0.38813 SNP28 0.483412 0.552495217 0.451308
SNP5 0.497619 0.55663066 0.456642 SNP29 0.483146 0.630580357 0.556708
SNP6 0.497549 0.577317841 0.484722 SNP30 0.481567 0.529147401 0.418436
SNP7 0.495536 0.49996014 0.37498 SNP31 0.481308 0.541015625 0.435356
SNP8 0.495349 0.537717235 0.430159 SNP32 0.479638 0.512316645 0.394097
SNP9 0.495305 0.545450016 0.441091 SNP33 0.479275 0.609026228 0.526132
SNP10 0.495215 0.560198103 0.461578 SNP34 0.478673 0.552176339 0.451128
SNP11 0.493243 0.508719308 0.38809 SNP35 0.478469 0.559430804 0.461137
SNP12 0.492991 0.541563696 0.435656 SNP36 0.476852 0.532804528 0.424002
SNP13 0.492891 0.552893814 0.451533 SNP37 0.476077 0.55924147 0.461029
SNP14 0.492718 0.570581553 0.475747 SNP38 0.475336 0.503228635 0.381023
SNP15 0.490654 0.541493941 0.435618 SNP39 0.472222 0.532366071 0.423766
SNP16 0.488789 0.504185268 0.381506 SNP40 0.469626 0.539969308 0.434781
SNP17 0.488584 0.462492028 0.374241 SNP41 0.463303 0.523158482 0.411544
SNP18 0.488426 0.533551897 0.424404 SNP42 0.461009 0.52282964 0.41137
SNP19 0.488318 0.541404257 0.435569 SNP43 0.458525 0.526556521 0.417051
SNP20 0.488318 0.541404257 0.435569 SNP44 0.455357 0.496014031 0.372999
SNP21 0.487981 0.563526387 0.466299 SNP45 0.452915 0.50003986 0.379405
SNP22 0.486607 0.499641263 0.374821 SNP46 0.452915 0.50003986 0.379405
SNP23 0.486607 0.499641263 0.374821 SNP47 0.452607 0.548997529 0.449331
SNP24 0.486364 0.517020089 0.400577 SNP48 0.451613 0.525390625 0.416426
实施例3
本实施例提供一种用于茄子种资源鉴定的SNP组合标记的应用，具体如下：
1.SNP标记在品种资源分类中的应用
利用上述48组SNP引物对224份茄子高代自交系进行区分，统计每个样品两两之间的SNP的相似程度，构建一个距离矩阵，利用R程序包poppr(Kamvar ZN,Tabima JF,GrünwaldNJ.2014.Poppr:an R package for genetic analysis of populations withclonal,partially clonal,and/or sexual reproduction.PeerJ 2:e281 https:// doi.org/10.7717/peerj.281)进行群体PCA分析和进化树构建。两个样品间SNP标记相识度越高，这两个样品间分枝隔得越近，反之越远。在Pco图中，两个样品间SNP标记相识度越高，这两个样品靠的越近，反之越远。
2、SNP标记组合在品种资源真实性或品种身份鉴定中的应用
利用上述48组SNP标记将待鉴定的品种基因型与目标品种的基因型进行比较，两者基因型的相似度达到90％以上，则待鉴定的品种真实的来源于目标品种。
3、SNP标记在真假杂交种鉴定的应用
首先在两个亲本中筛选具有上述48个SNP标记中差异的纯合SNP标记，然后在杂交F1单株代中进行分析，如果F1单株均为杂合位点，则该单株为真实杂交种。通过统计F1单株中真实杂交种的百分率，可以对杂交种的纯度进行快速检测。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
序列表
<110> 中国热带农业科学院南亚热带作物研究所
<120> 一种用于茄子种资源鉴定的SNP组合标记
<160> 144
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> Solanum melongena L
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc tgtgatagag gctgaagatg cgg 43
<210> 2
<211> 47
<212> DNA
<213> Solanum melongena L
<400> 2
gaaggtgacc aagttcatgc ttctccaaat tagaggactc aacaaca 47
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> Solanum melongena L
<400> 3
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<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> Solanum melongena L
<400> 4
gaaggtgacc aagttcatgc tttttacttc aagcatcact catacatg 48
<210> 5
<211> 48
<212> DNA
<213> Solanum melongena L
<400> 5
gaaggtgacc aagttcatgc tgccaagata aaccatactt caccttat 48
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> Solanum melongena L
<400> 6
gaaggtgacc aagttcatgc taaaacataa atagcatgca aacaacacga 50
<210> 7
<211> 48
<212> DNA
<213> Solanum melongena L
<400> 7
gaaggtgacc aagttcatgc tgttcactgt attatagcat gtttgaca 48
<210> 8
<211> 43
<212> DNA
<213> Solanum melongena L
<400> 8
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<210> 9
<211> 46
<212> DNA
<213> Solanum melongena L
<400> 9
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<210> 10
<211> 47
<212> DNA
<213> Solanum melongena L
<400> 10
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<210> 11
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<212> DNA
<213> Solanum melongena L
<400> 11
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<210> 12
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<212> DNA
<213> Solanum melongena L
<400> 12
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<210> 13
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<212> DNA
<213> Solanum melongena L
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<212> DNA
<213> Solanum melongena L
<400> 14
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<212> DNA
<213> Solanum melongena L
<400> 15
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<212> DNA
<213> Solanum melongena L
<400> 16
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<210> 17
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<212> DNA
<213> Solanum melongena L
<400> 17
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<210> 18
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<212> DNA
<213> Solanum melongena L
<400> 18
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<210> 19
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<212> DNA
<213> Solanum melongena L
<400> 19
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<210> 20
<211> 46
<212> DNA
<213> Solanum melongena L
<400> 20
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<210> 21
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<210> 22
<211> 46
<212> DNA
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<400> 22
gaaggtgacc aagttcatgc tcataactag tggcgtaagc ctaaat 46
<210> 23
<211> 44
<212> DNA
<213> Solanum melongena L
<400> 23
gaaggtgacc aagttcatgc ttcctaccta gcaaacccaa caga 44
<210> 24
<211> 47
<212> DNA
<213> Solanum melongena L
<400> 24
gaaggtgacc aagttcatgc ttatagagct ctagacctca acgattt 47
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<212> DNA
<213> Solanum melongena L
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<213> Solanum melongena L
<400> 132
ggactgagaa atgtttttaa tagttacata aacata 36
<210> 133
<211> 28
<212> DNA
<213> Solanum melongena L
<400> 133
tcgcatttga cgtttttggg aaacttct 28
<210> 134
<211> 31
<212> DNA
<213> Solanum melongena L
<400> 134
tgccagtcca atagaaaata aatatcctta g 31
<210> 135
<211> 22
<212> DNA
<213> Solanum melongena L
<400> 135
ccgtgtcatg tctaggccct ag 22
<210> 136
<211> 28
<212> DNA
<213> Solanum melongena L
<400> 136
aggaaaagcc gaatacagtt tgcttagt 28
<210> 137
<211> 34
<212> DNA
<213> Solanum melongena L
<400> 137
gagattatat gatatgatat acaatcaaga agtc 34
<210> 138
<211> 36
<212> DNA
<213> Solanum melongena L
<400> 138
ggcaaatttt attcctagaa taaaaataac tagaac 36
<210> 139
<211> 28
<212> DNA
<213> Solanum melongena L
<400> 139
gcaggaatca aactttttcg tgtcattg 28
<210> 140
<211> 26
<212> DNA
<213> Solanum melongena L
<400> 140
ccacggggta tgttgttgtt tgttgt 26
<210> 141
<211> 23
<212> DNA
<213> Solanum melongena L
<400> 141
gtgactaaga aggggacagc cac 23
<210> 142
<211> 33
<212> DNA
<213> Solanum melongena L
<400> 142
ggttagtaca gtagaatgta ctaagtatat aag 33
<210> 143
<211> 34
<212> DNA
<213> Solanum melongena L
<400> 143
gcaaacacag ttataattat agttacgaaa tgta 34
<210> 144
<211> 28
<212> DNA
<213> Solanum melongena L
<400> 144
cacacacaac gtttgtataa atcatgcg 28

Claims (4)

1.一种用于茄子种质资源鉴定的SNP分子标记引物组合，其特征在于，所述SNP分子标记引物组合的核苷酸序列如序列表SEQ NO.ID 1-144所示。
2.如权利要求1所述的SNP分子标记引物组合在茄子品种资源分类中的应用。
3.如权利要求1所述的SNP分子标记引物组合在茄子品种资源真实性或茄子品种身份鉴定中的应用。
4.如权利要求1所述的SNP分子标记引物组合在茄子指纹图谱构建中的应用。
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