CN109234442B

CN109234442B - 一种与绵羊多羔性状相关的snp分子标记及其检测试剂盒和应用

Info

Publication number: CN109234442B
Application number: CN201811353677.8A
Authority: CN
Inventors: 狄冉; 储明星; 李春艳; 刘秋月; 胡文萍; 王翔宇
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2018-11-14
Filing date: 2018-11-14
Publication date: 2022-02-08
Anticipated expiration: 2038-11-14
Also published as: CN109234442A

Abstract

本发明提供了一种与绵羊多羔性状相关的SNP分子标记及其检测试剂盒和应用，属于绵羊SNP分子标记技术领域，所述SNP位点位于绵羊第7号染色体上第69738971bp位点(NM_001174113.1，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v3.1)，所述SNP位点上存在G/T碱基突变，与绵羊多羔性状具有显著的相关性。通过对所述SNP位点进行分型即可预测待测绵羊多羔性状。本发明提供的检测绵羊所述SNP位点基因型的方法，灵敏度，准确性更高，性价比更高，可对所述SNP位点实现自动化检测，在绵羊育种过程中，可将具有多羔性状的TT纯合个体选留下来，对绵羊大规模分子育种具有潜在的应用价值。

Description

一种与绵羊多羔性状相关的SNP分子标记及其检测试剂盒和应用

技术领域

本发明属于绵羊SNP分子标记技术领域，尤其涉及一种与绵羊多羔性状相关的SNP分子标记及其检测试剂盒和应用。

背景技术

大多数绵羊品种具有季节性繁殖特征，加上其本身具有低遗传力的产羔数性状，导致自然状态下羊只出栏数量较低。近年来，随着我国肉羊市场需求量加大，人们逐渐采用各种方法来提升肉羊生产效益，其中分子技术可以有效地提高绵羊遗传进展。因此，筛选与绵羊多羔数有关的主效基因或分子遗传标记已成为现代分子育种的热点。

SIX1基因位于绵羊7号染色体上，包含2个外显子，编码区总长1068bp，编码蛋白含355个氨基酸，该基因在人、牛、小鼠、猪、羊之间具有较高的同源性。组织差异性表达分析表明，SIX1基因在脊椎动物眼部表达并参与调控视网膜发育；此外，该基因表达于耳、肾、骨骼肌等组织中，在促进细胞增殖与分化、抑制凋亡等方面发挥相应作用。

目前关于SIX1基因序列多态性在国内外绵羊繁殖过程中的具体作用未见报道，尚未发现SIX1基因中存在与绵羊多羔形状相关的SNP位点。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种与绵羊多羔性状相关的SNP分子标记及其检测试剂盒和应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一种与绵羊多羔性状相关的SNP分子标记，所述SNP位点位于绵羊第7号染色体上第69738971bp位点(NM_001174113.1)，所述位点位于绵羊SIX1基因内，所述位点上存在G/T碱基突变，与绵羊多羔性状具有显著的相关性，具有TT基因型的个体产羔数显著高于GG基因型的个体；所述SNP位点信息基于的绵羊基因组序列信息版本号为Oar_v3.1。

本发明提供了检测所述SNP位点的引物组，包括上游引物、下游引物和延伸引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；

所述延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明提供了检测所述SNP位点的试剂盒，包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、MgCl₂、标准阳性模板DNA、PCR反应缓冲液和SAP酶，其特征在于，还包括所述的引物组。

优选的，所述引物组中上游引物和下游引物的使用浓度独立为0.45～0.55μmol/L；所述引物组中的延伸引物的浓度为0.6～1.3μmol/L。

本发明还提供了检测与所述绵羊多羔性状相关的SNP分子标记的方法，包括以下步骤：

1)提取待测绵羊的基因组DNA；

2)以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用所述引物组中的上游引物和下游引物进行PCR扩增反应获得PCR扩增产物；

3)用SAP酶对步骤2)中获得的PCR扩增产物进行消化获得消化后的产物；

4)以消化后的产物为模板，利用所述引物组中的延伸引物进行延伸反应获得延伸产物；

5)利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术分析延伸产物，确定所述SNP位点的基因型。

优选的，步骤2)中所述PCR扩增反应使用的反应体系以5μL计包括：

所述PCR扩增反应的程序为：

预变性95℃2min；

变性95℃30s；

退火56℃30s；

延伸72℃60s；

所述变性、退火和延伸步骤进行45个循环后；72℃保持5min。

优选的，步骤3)中所述消化体系以2μL计包括：

SAPBuffer 0.17μL；

1.7U/μL SAP酶 0.3μL；

去离子水 1.53μL；

所述消化的程序为：37℃，40min；85℃，5min。

优选的，步骤4)中所述延伸反应的体系以2μL计包括：

所述延伸反应的程序为：

94℃30s；

[94℃5s，(52℃5s，80℃5s)]；其中所述(52℃5s，80℃5s)进行5个循环，所述[94℃5s，(52℃5s，80℃5s)]进行40个循环；

72℃3min。

本发明还提供了所述的SNP位点在绵羊辅助育种中的应用，在绵羊育种过程中，筛选所述SNP位点为T碱基的绵羊进行后续育种。

本发明还提供了所述试剂盒在绵羊辅助育种中的应用，在绵羊育种过程中，利用所述试剂盒筛选所述SNP位点为T碱基的绵羊进行后续育种。

本发明的有益效果：本发明提供的与绵羊多羔性状相关的SNP分子标记，所述SNP位点位于绵羊第7号染色体上第69738971bp位点(NM_001174113.1)，所述位点上存在G/T碱基突变，与绵羊多羔性状具有显著的相关性，具有TT基因型的个体产羔数显著高于GG基因型的个体。所述SNP位点的G/T碱基突变与绵羊多羔性状紧密相关，通过对所述SNP位点进行分型即可确定待测绵羊多羔性状。另外，本发明提供的SNP位点还与绵羊发情性状相关，所述SNP位点基因型为TT的母羊的发情时间较其他基因型的母羊长。

本发明提供的检测绵羊所述SNP位点基因型的方法，灵敏度，准确性更高，性价比更高，能同时对数百至数千份样本中数十到数百个SNP位点进行检测。

本发明中所述方法可对所述SNP位点实现自动化检测，在绵羊育种过程中，可以将具有多羔性状的TT纯合个体选留下来，从而提高绵羊的产羔性能，同时提高绵羊的发情配种率，对绵羊大规模分子育种具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中利用Sequenom

SNP技术对本实验材料中包含的381只绵羊个体SIX1基因的三种基因型，即GG、GT或TT的检测结果。

具体实施方式

本发明提供了一种与绵羊多羔性状相关的SNP分子标记，所述SNP位点位于绵羊第7号染色体上第69738971bp位点(NM_001174113.1)，所述位点上存在G/T碱基突变，与绵羊多羔性状具有显著的相关性，具有TT基因型的个体产羔数显著高于GG基因型的个体；所述SNP位点信息基于的绵羊基因组序列信息版本号为Oar_v3.1。本发明中所述SNP位点位于SIX1基因中，单羔和季节性发情绵羊中主要以野生型G为主。

本发明还提供了利用Sequenom

SNP技术检测绵羊SIX1基因中所述SNP位点的引物组，包括上游引物、下游引物和延伸引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQID No.1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。具体如下：上游引物5’-ACGTTGGATGGTCCGCAGGGAGTTTGAAAG-3’；下游引物：5’-ACGTTGGATGCTAAATGGAACTGCACGGTC-3’；延伸引物：5’-AGTCCTCAGTGCCTC-3’。

本发明所述的Sequenom

SNP技术结合多重PCR技术、MassARRAYiPLEX单碱基延伸技术和基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析质谱技术对基因进行分型检测。利用此方法可对绵羊SIX1基因的SNP位点实现自动化检测。

本发明还提供了利用Sequenom

SNP技术检测绵羊SIX1基因中所述SNP位点的试剂盒，包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、MgCl₂、标准阳性模板DNA、PCR反应缓冲液和SAP酶，还包括所述的引物组。本发明中，所述引物组中上游引物和下游引物的使用浓度优选的独立为0.45～0.55μmol/L，更优选的独立为0.50μmol/L；所述引物组中的延伸引物的浓度优选为0.6～1.3μmol/L。在本发明中，所述dNTPs的使用浓度优选为20～30μmol/L，更优选为25μmol/L；所述Taq DNA聚合酶的使用浓度优选为4～6U/μL，更优选为5U/μL；所述MgCl₂的使用浓度优选为20～30mmol/L，更优选为25mmol/L；所述PCR反应缓冲液优选为10×PCR反应缓冲液；所述SAP酶的酶活优选为1.7U/μL。本发明中所述试剂盒优选的还包括SAP Buffer。在本发明中，所述标准阳性模板DNA的基因型为TT，所述标准阳性模板DNA作为阳性对照，增加所述SNP位点检测的准确性。

本发明还提供了利用Sequenom

SNP技术检测与绵羊多羔性状相关的绵羊SIX1基因中所述SNP分子标记位点的方法，包括以下步骤：1)提取待测绵羊的基因组DNA；2)以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用所述引物组中的上游引物和下游引物进行PCR扩增反应获得PCR扩增产物；3)用SAP酶对步骤2)中获得的PCR扩增产物进行消化获得消化后的产物；4)以消化后的产物为模板，利用所述引物组中的延伸引物进行延伸反应获得延伸产物；5)利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术分析延伸产物，确定所述SNP位点的基因型。

在本发明中，首先提取待测绵羊的基因组DNA。本发明对所述待测绵羊的种类没有特殊要求，任何种类的绵羊均可，在本发明实施例中采用的是滩羊、苏尼特羊、草地型藏羊、小尾寒羊、湖羊、策勒黑羊；本发明对所述待测绵羊基因组的提取方法没有特殊限定，采用本领域常规的动物细胞基因组提取方法即可，在本发明具体实施过程中，利用红细胞裂解液裂解去除不含DNA的红细胞，细胞核裂解液裂解包细胞释放出基因组DNA，然后蛋白沉

淀液选择性沉淀去除蛋白，最后纯净的基因组DNA通过异丙醇沉淀并重溶解于DNA溶解液。

本发明在获得所述待测绵羊基因组DNA后，以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用所述引物组中的上游引物和下游引物进行PCR扩增反应获得PCR扩增产物。本发明中所述PCR扩增反应使用的反应体系以5μL计包括：

所述PCR扩增反应的程序为：

预变性95℃2min；

变性95℃30s；

退火56℃30s；

延伸72℃60s；

所述变性、退火和延伸步骤进行45个循环后；72℃保持5min。

本发明在所述PCR扩增完成后，优选的将PCR扩增产物保存于4℃。本发明所述PCR扩增反应结束后，所述PCR扩增产物中含有目标SNPs位点所在的DNA片段。

本发明在获得所述PCR扩增产物后，用SAP酶对获得的PCR扩增产物进行消化获得消化后的产物。在本发明中所述消化体系以2μL计包括：

SAP Buffer 0.17μL；

1.7U/μL SAP酶 0.3μL；

去离子水 1.53μL；

所述消化的程序为：37℃，40min；85℃，5min。

本发明中所述消化后的产物优选的保存于25℃。本发明中所述消化的作用为消化掉PCR扩增反应体系中的引物序列和剩余的dNTPs。

本发明在获得所述消化产物后，以消化后的产物为模板，利用所述引物组中的延伸引物进行延伸反应获得延伸产物。本发明中，所述延伸反应的体系以2μL计包括：

所述延伸反应的程序为：

94℃30s；

72℃3min。

本发明中，所述延伸体系中的iplex Buffer、Terminatormix、0.6～1.3μmol/LExtendprimer mix和iplex Enzyme来源于

Gold Reagent Set试剂盒。本发明所述延伸反应过程中，对延伸体系中的待检SNP位点进行单碱基延伸，位点特异性的延伸引物将在突变位点处延伸一个碱基并终止。延伸引物将根据突变类型的差异而连接上不同的ddNTPs，形成分子量差异。本发明子在获得所述延伸产物后，优选的将所述延伸产物经过树脂纯化，本发明对所述树脂纯化的方法没有特殊限定，采用本领域常规的树脂纯化即可。

本发明在获得所述延伸产物后，利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术分析延伸产物，确定所述SNP位点的基因型。本发明将所述延伸产物点样至靶片上，并使用质谱仪对不同延伸产物的分子量差异进行检测，通过数据分析，就可得到各突变位点的具体基因型。本发明中，所述质谱点样有关的使用MassARRAYNanodispenserRS1000进行；所述质谱分析优选的使用MassARRAY Compact System进行；本发明在所述质谱分析后，优选的利用Typer4.0软件检测质谱峰，并根据质谱峰图判读各样本目标位点基因型。

本发明中所述Sequenom

SNP技术的基本原理为：首先使用上游引物和下游引物扩增目标SNPs所在DNA片段，在扩增产物中加入SAP

酶消化掉反应体系中的引物序列和剩余的dNTPs，然后利用延伸引物对待检SNP位点同时进行单碱基延伸，位点特异性的延伸引物将在突变位点处延伸一个碱基并终止。延伸产物将根据突变类型的差异而连接上不同的ddNTPs，形成分子量差异。延伸产物在经过树脂纯化后，将点样至靶片上，并使用质谱仪对不同延伸产物的分子量差异进行检测，通过数据分析，就可得到各突变位点的具体基因型。

本发明还提供了所述的SNP位点在绵羊辅助育种中的应用，在绵羊育种过程中，筛选所述SNP位点为T碱基的绵羊进行后续育种。在本发明中所述SNP位点的筛选优选的采用上述Sequenom

SNP技术；优选的筛选SNP位点为TT基因型的绵羊进行后续育种。本发明所述应用可以将具有多羔性状的基因型TT纯合个体选留下来，提高绵羊产羔性能，同时提高绵羊的发情配种率，对绵羊大规模分子育种具有非常大的应用价值。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1

一种利用Sequenom

SNP技术检测绵羊SIX1基因型并预测其经产母羊平均产羔数的方法

1、实验材料

选取季节性发情的单羔品种(滩羊、苏尼特羊、草地型藏羊共204只)和常年发情的多羔品种(小尾寒羊、湖羊、策勒黑羊共560只，其中包括有产羔数记录的小尾寒羊380只)为检测对象。

2、试剂及仪器

试剂：Complete Genotyping Reagent Kit for

Compact 384；

基因扩增：ABI

9700384Dual；

质谱点样：MassARRAYNanodispenserRS1000；

质谱分析：MassARRAYCompact System；

所有试剂和仪器均购自北京君诺德生物技术有限公司(Beijing GenenodeBiotech Co.,Ltd)。

3、基因组DNA的提取

绵羊颈静脉采血1mL，并用EDTA抗凝处理。首先红细胞裂解液裂解以去除不含DNA的红细胞，细胞核裂解液裂解包细胞以释放基因组DNA，然后蛋白沉淀液选择性沉淀以去除蛋白，最后纯净的基因组DNA通过异丙醇沉淀并重溶解于DNA溶解液。

4、Sequenom

SNP技术进行基因分型

针对绵羊第7号染色体上第69738971bp位点(NM_001174113.1，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v3.1)设计引物组合：

PCR扩增引物的核苷酸序列如下：

上游引物F：5’-ACGTTGGATGGTCCGCAGGGAGTTTGAAAG-3’(SEQ ID No.1)

下游引物R：5’-ACGTTGGATGCTAAATGGAACTGCACGGTC-3’(SEQ ID No.2)

延伸引物序列及延伸产物如表1所示：

表1延伸引物序列及延伸产物

上述引物由君诺德公司合成。

检测流程如下：

1.提取待测绵羊的基因组DNA；

2.以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用所述引物F和R进行PCR扩增反应；

3.用SAP酶对PCR扩增产物进行消化；

4.以消化后的PCR扩增产物为模板，利用所述延伸引物S1进行延伸反应；

5.分析延伸产物，从而对绵羊SIX1基因型进行鉴定。

其中，PCR扩增反应的反应体系为5μL：20-50ng/μL基因组DNA 1μL，10×PCR反应缓冲液0.5μL，25mmol/L MgCl₂0.4μL，25μmol/L dNTPs 0.1μL，PCRPrimermix 1μL，5U/μL TaqDNA聚合酶0.2μL，去离子水补足至5μL；

PCR扩增反应的程序为：95℃2min，95℃30s，56℃30s，72℃60s，45个循环；72℃5min。

对PCR扩增产物进行消化，主要利用SAP酶去除反应产物中的剩余引物和dNTP。SAP酶消化体系为2μL：SAP Buffer 0.17μL，SAP Enzyme 0.3μL，去离子水补足至2μL；

反应条件为：37℃40min，85℃15min，25℃保存。

延伸反应体系为2μL：iplex Buffer 0.2μL，Terminatormix 0.2μL，Extendprimermix 0.94μL，iplex Enzyme 0.041μL，去离子水补足至2μL；

延伸反应条件为：[94℃5s，(52℃5s，80℃5s)]；其中所述(52℃5s，80℃5s)进行5个循环，所述[94℃5s，(52℃5s，80℃5s)]进行40个循环。

将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上，进行MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱)反应，应用Typer4.0软件检测质谱峰，依据质谱峰图判别不同样本目标位点的基因型。

经质谱分析获得PCR扩增产物大小为133bp，延伸产物的质谱检测结果如图1所示。

统计结果：

(1)待测绵羊第7号染色体上第69738971bp位点不同基因型与小尾寒羊产羔数关联分析的统计结果见表2。结果表明，TT型母羊的产羔数显著高于其它2种基因型。

表2待测绵羊第7号染色体上第69738971bp位点不同基因型与小尾寒羊产羔数关联分析

上标不同的小写字母代表差异显著。

(2)待测绵羊第7号染色体上第69738971bp位点各基因型分析统计结果见表3。结果表明，常年发情组与季节性发情组母羊的基因型频率之间差异极显著，且常年发情组TT型频率显著高于季节性发情组。

表3待测绵羊第7号染色体上第69738971bp位点不同基因型分析统计

由此可见，本发明提供的与绵羊多羔性状相关的SNP分子标记，与绵羊多羔性状具有显著的相关性，通过对所述SNP位点进行分型即可确定待测绵羊多羔性状。另外，本发明提供的SNP位点还与绵羊发情性状相关，所述SNP位点基因型为TT的母羊的发情时间较其他基因型的母羊长。本发明中所述方法可对所述SNP位点实现自动化检测，在绵羊育种过程中，可以将具有多羔性状的TT纯合个体选留下来，从而提高绵羊的产羔性能，同时提高绵羊的发情配种率，对绵羊大规模分子育种具有潜在的应用价值。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 一种与绵羊多羔性状相关的SNP 分子标记及其检测试剂盒和应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acgttggatg gtccgcaggg agtttgaaag 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acgttggatg ctaaatggaa ctgcacggtc 30

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agtcctcagt gcctc 15

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agtcctcagt gcctct 16

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agtcctcagt gcctcg 16

Claims

1.检测SNP位点的试剂在制备检测绵羊多羔性状的产品中的应用，其特征在于，所述SNP位点位于绵羊第7号染色体上第69738971bp位点(NM_001174113.1)，所述SNP位点位于绵羊SIX1基因内，所述位点上存在G/T碱基突变，与绵羊多羔性状具有显著的相关性，具有TT基因型的个体产羔数显著高于GG基因型的个体，所述SNP位点信息基于的绵羊基因组序列信息版本号为Oar_v3.1；

筛选所述SNP位点为T碱基的绵羊进行后续育种。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测所述SNP位点的引物组，包括上游引物、下游引物和延伸引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，检测所述SNP位点的试剂盒，包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、MgCl₂、标准阳性模板DNA、PCR反应缓冲液、SAP酶和权利要求2所述的引物组。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述引物组中上游引物和下游引物的使用浓度独立为0.45～0.55μmol/L；所述引物组中的延伸引物的浓度为0.6～1.3μmol/L。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测所述绵羊多羔性状的方法，包括以下步骤：

1)提取待测绵羊的基因组DNA；

2)以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物组中的上游引物和下游引物进行PCR扩增反应获得PCR扩增产物；

4)以消化后的产物为模板，利用权利要求2所述引物组中的延伸引物进行延伸反应获得延伸产物；

5)利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析延伸产物，确定所述SNP位点的基因型。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤2)中所述PCR扩增反应使用的反应体系以5μL计包括：

所述PCR扩增反应的程序为：

预变性95℃2min；

变性95℃30s；

退火56℃30s；

延伸72℃60s；

所述变性、退火和延伸步骤进行45个循环后；72℃保持5min。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤3)中消化的体系以2μL计包括：

SAP Buffer 0.17μL；

1.7U/μL SAP酶 0.3μL；

去离子水 1.53μL；

所述消化的程序为：37℃，40min；85℃，15min。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤4)中所述延伸反应的体系以2μL计包括：

所述延伸反应的程序为：

94℃30s；

72℃3min。