CN107447000B - 一种与绵羊多羔相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents

一种与绵羊多羔相关的snp分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子标记检测技术，具体公开了一种与绵羊多羔相关的SNP分子标记及其应用，通过对绵羊第17号染色体上第71874104bp位点(XM_015101463.1，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v4.0，2015年12月)的核苷酸进行单核苷酸型检测，根据检测结果判定绵羊HIRA基因为纯合或杂合，并预测经产母羊窝平均产羔数。利用此方法可对组蛋白调节(histone regulation,HIRA)基因的SNP位点实现自动化检测。通过对绵羊HIRA基因型进行选择，可以将具有高产羔数性状的AG杂合个体和GG纯合个体选留下来，从而提高绵羊的繁殖力，对绵羊大规模分子育种具有潜在的应用价值。

Description

一种与绵羊多羔相关的SNP分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及分子标记检测技术，具体地说，涉及一种与绵羊多羔相关的SNP分子标记及其应用。
背景技术
产羔数性状是绵羊最重要的经济性状之一，因其受微效多基因控制且遗传力低，难以用常规育种方法来快速改良，而分子技术能有效快速地提高其遗传进展，因此鉴定与产羔数相关的主效基因或分子遗传标记是现代分子育种的关键。
HIRA基因位于绵羊17号染色体上，包含27个外显子，编码区总长3276bp，编码蛋白含1091个氨基酸,该基因在彩鲫、爪蟾、鸡、小鼠、人之间具有非常高的同源性。另外，组织特异性表达分析表明，该基因可能在维持卵巢功能方面发挥一定作用。Nashun等研究发现HIRA对于小鼠卵子发生过程中的转录调节和DNA甲基化作用有着非常关键的作用。
李卫等研究发现，HIRA基因在斑马鱼胚胎发育的不同时期表达水平不同，HIRA基因在斑马鱼成熟的卵中表达量较高，受精后30min 表达量迅速下降，到尾芽期其表达水平又有所恢复。HIRA基因在受精后其表达量低，可能是HIRA基因的mRNA用于胚胎早期发育所需的一些蛋白质的合成。有研究表明，在脊椎动物中，HIRA基因突变会导致胚胎发育不能完成。
郭秋红等和Wang等研究了HIRA基因在鱼类(银鲫和彩鲫)卵子发生和胚胎发育过程中的作用，以探讨其在鱼类卵子发生、胚胎发育和雌核发育中的调控作用。结果发现，HIRA蛋白在银鲫Ⅰ期卵母细胞中没有表达，在Ⅱ期卵母细胞的细胞质中有弱表达，在Ⅲ期早期卵母细胞的周边有强烈表达。而在彩鲫Ⅰ期卵母细胞中就有HIRA蛋白的弱表达，在Ⅱ期时HIRA蛋白在细胞质中大量表达，Ⅲ期早期卵母细胞的细胞质中有弱表达。HIRA mRNA和蛋白质在银鲫和彩鲫早期卵母细胞中有较强表达，且在银鲫和彩鲫卵子发生过程中没有显著差异，说明其可能对于脊椎动物卵子发生和减数分裂没有显著影响，而是在受精或胚胎发育过程中起作用。
然而，目前关于HIRA基因在绵羊繁殖过程中的具体作用研究几乎没有，通过对10个绵羊品种99个绵羊个体进行全基因组重测序并将其分为单羔组和多羔组，并通过Fst值计算获得了大量的有效SNP位点并筛选获得一些基因，其中包括HIRA基因。因此，对其进行研究有助于挖掘出更多与绵羊产羔数相关的分析标记。传统的基因型检测方法，大多采用PCR-RFLP(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism)和PCR-SSCP(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism)检测方法，这些方法通量较低，程序繁多，较难实现高通量自动化测定。
发明内容
本发明的目的是提供一种与绵羊多羔相关的SNP分子标记及其应用，并提供了一种利用Sequenom
Figure DEST_PATH_GDA0001433658370000021
技术检测绵羊 HIRA基因型的方法。
本发明的技术方案如下：
本发明首先提供一种与绵羊多羔相关的SNP分子标记，其含有一个与绵羊多羔相关的SNP位点，该位点位于绵羊第17号染色体上第 71874104bp位点(XM_015101463.1，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v4.0，2015年12月)，该位点的碱基存在A/G突变，与绵羊多羔具有显著的相关性。
基于此，本发明提供一种检测绵羊多羔候选基因HIRA基因型的方法，通过对绵羊第17号染色体上第71874104bp位点(XM_015101463.1，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v4.0，2015 年12月)的核苷酸进行单核苷酸型检测，根据检测结果判定绵羊HIRA 基因为AA、AG或GG。本发明利用Sequenom
Figure DEST_PATH_GDA0001433658370000031
技术实现单核苷酸型检测。
本发明首先提供用于检测绵羊HIRA基因型的引物组合：
PCR扩增引物的核苷酸序列如下：
上游引物F：
5’-ACGTTGGATGAAACGAAACCAGAGCTCTCC-3’；
下游引物R：
5’-ACGTTGGATGTGTGCAGAGGGTCTGATAAC-3’；
延伸引物的核苷酸序列如下：
S1：5’-GGGCCCGGCAACCGAGTTAGTC-3’
本发明提供含有所述引物组合的用于Sequenom
Figure DEST_PATH_GDA0001433658370000032
技术检测绵羊HIRA基因型的试剂盒。
进一步地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、 PCR反应缓冲液和SAP酶。
优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
本发明提供的利用Sequenom
Figure DEST_PATH_GDA0001433658370000033
技术检测绵羊 HIRA基因型的方法，包括以下步骤：
1)提取待测绵羊的基因组DNA；
2)以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用所述引物F和R，进行 PCR扩增反应；
3)用SAP酶对PCR扩增产物进行消化；
4)以消化后的PCR扩增产物为模板，利用所述延伸引物进行延伸反应；
5)分析延伸产物，从而对绵羊HIRA基因型进行判定。
其中，步骤2)中PCR扩增反应使用的反应体系以5μL计为：20-50ng/μL基因组DNA 1μL，10×PCR反应缓冲液0.5μL，25mmol/L MgCl2 0.4μL，25μmol/L dNTPs 0.1μL，PCRPrimer mix 1μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，去离子水补齐至5μL；
PCR扩增反应的扩增程序为：95℃2min；95℃30s，56℃ 30s，72℃60s，45个循环；72℃5min。
步骤3)中对PCR扩增产物进行消化，使用的SAP酶消化体系以 2μL计为：SAPBuffer 0.17μL，SAP Enzyme 0.3μL，去离子水补齐至 2μL。
反应条件为：37℃40min，85℃15min，25℃保存。
步骤4)中延伸反应体系以2μL计为：iplex Buffer 0.2μL， Terminator mix 0.2μL，Extend primer mix 0.94μL，iplex Enzyme 0.041μL，去离子水补齐至2μL；
延伸反应条件为：94℃30s；94℃5s，52℃5s，80℃5s 5个循环，40个循环；72℃3min。
优选地，本发明采用质谱检测法分析延伸产物。
本发明进一步提供前述方法在绵羊分子标记辅助育种中的应用。
Sequenom
Figure DEST_PATH_GDA0001433658370000041
技术的基本原理为：首先使用引物扩增目标SNPs所在片段，在扩增产物中加入SAP酶消化掉反应体系中的引物序列和剩余的dNTPs，然后对待检位点同时进行单碱基延伸，位点特异性的延伸引物将在突变位点处延伸一个碱基并终止。延伸引物将根据突变类型的差异而连接上不同的ddNTPs，形成分子量差异。延伸产物在经过树脂纯化后，将点样至靶片上，并使用质谱仪对不同延伸产物的分子量差异进行检测，通过数据分析，就可得到各突变位点的具体基因型。根据测序结果判定绵羊HIRA基因为AA、AG或GG；其中，单核苷酸型检测是针对绵羊第17号染色体上第71874104bp位点的核苷酸。
本发明提供的利用Sequenom
Figure DEST_PATH_GDA0001433658370000051
技术检测绵羊 HIRA基因型的方法，该技术更灵敏，准确性更高，性价比更高，能同时对数百至数千份样本中数十到数百个SNP位点进行检测。利用本方法可对HIRA基因的SNP位点实现自动化检测，可以将具有高产羔数性状的AG杂合个体和GG纯合个体选留下来，从而提高绵羊的繁殖力，对绵羊大规模分子育种具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1中利用Sequenom
Figure DEST_PATH_GDA0001433658370000052
技术对 HIRA基因的三种基因型，即GG、AG和AA的检测结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1一种利用Sequenom
Figure DEST_PATH_GDA0001433658370000053
技术检测绵羊HIRA 基因型并预测经产母羊窝平均产羔数的方法
1、实验材料
选取375只小尾寒羊绵羊为检测对象。
2、试剂及仪器
试剂：Complete Genotyping Reagent Kit for
Figure DEST_PATH_GDA0001433658370000054
Compact 384；
基因扩增：ABI
Figure DEST_PATH_GDA0001433658370000055
9700 384Dual；
质谱点样：MassARRAY NanodispenserRS1000；
质谱分析：MassARRAY Compact System；
所有试剂和仪器均购自北京君诺德生物技术有限公司(Beijing GenenodeBiotech Co.,Ltd)。
3、基因组DNA的提取
绵羊颈静脉采血1ml，用EDTA抗凝处理。首先红细胞裂解液裂解去除不含DNA的红细胞，细胞核裂解液裂解包细胞释放出基因组 DNA，然后蛋白沉淀液选择性沉淀去除蛋白，最后纯净的基因组DNA 通过异丙醇沉淀并重溶解于DNA溶解液。
4、Sequenom
Figure DEST_PATH_GDA0001433658370000061
技术进行基因分型
针对绵羊第17号染色体上第71874104bp位点 (XM_015101463.1，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v4.0，2015 年12月)设计引物组合。
PCR扩增引物的核苷酸序列如下：
上游引物F：5’-ACGTTGGATGAAACGAAACCAGAGCTCTCC-3’下游引物R：5’-ACGTTGGATGTGTGCAGAGGGTCTGATAAC-3’
延伸引物序列及延伸产物如表1所示。
表1 延伸引物序列及延伸产物
Figure DEST_PATH_GDA0001433658370000062
上述引物由君诺德公司合成。
检测流程如下：
1、提取待测绵羊的基因组DNA；
2、以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用权利要求所述引物F 和R进行PCR扩增反应；
3、用SAP酶对PCR扩增产物进行消化；
4、以消化后的PCR扩增产物为模板，利用所述延伸引物S1进行延伸反应；
5、分析延伸产物，从而对绵羊HIRA基因型进行判定。
其中，PCR扩增反应使用的反应体系以5μL计为：20-50ng/μL基因组DNA 1μL，10×PCR反应缓冲液0.5μL，25mmol/L MgCl2 0.4μL，25μmol/L dNTPs 0.1μL，PCR Primer mix 1μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，去离子水补齐至5μL；
PCR扩增反应的扩增程序为：95℃2min；95℃30s，56℃ 30s，72℃60s，45个循环；72℃5min。
对PCR扩增产物进行消化，主要是用SAP酶去除反应产物中的剩余引物和dNTP。使用的SAP酶消化体系以2μL计为：SAP Buffer 0.17μL，SAP Enzyme 0.3μL，去离子水补齐至2μL。
反应条件为：37℃40min，85℃15min，25℃保存。
延伸反应体系以2μL计为：iplex Buffer 0.2μL，Terminator mix 0.2μL，Extendprimer mix 0.94μL，iplex Enzyme 0.041μL，去离子水补齐至2μL；
延伸反应条件为：94℃30s；94℃5s，52℃5s，80℃5s 5个循环，40个循环；72℃3min。
将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom) 芯片上，进行MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱)反应，利用Typer 4.0软件检测质谱峰，并根据质谱峰图判读各样本目标位点基因型。
经质谱分析得到PCR扩增产物大小为133bp，延伸产物的质谱检测结果如图1所示。
统计结果：
待测绵羊第17号染色体上第71874104bp位点不同基因型分析统计结果见表2。
表2 待测绵羊第17号染色体上第71874104bp位点不同基因型分析统计
Figure DEST_PATH_GDA0001433658370000071
待测绵羊第17号染色体上第71874104bp位点不同基因型与小尾寒羊产羔数关联分析统计结果见表3。
表3 待测绵羊第17号染色体上第71874104bp位点不同基因型与小尾寒羊产羔
数关联分析
Figure DEST_PATH_GDA0001433658370000081
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 内蒙古河套农牧业技术研究院 内蒙古草原宏宝食品股份有限公司
<120> 一种与绵羊多羔相关的SNP分子标记及其应用
<130> KHP171114117.4
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acgttggatg aaacgaaacc agagctctcc 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acgttggatg tgtgcagagg gtctgataac 30
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gggcccggca accgagttag tc 22

Claims (10)

1.一种SNP分子标记在鉴定绵羊多羔性状中的应用，其特征在于，所述SNP分子标记在2015年12月公开的绵羊基因组序列信息版本号Oar_v4.0的绵羊第17号染色体上第71874104bp位点上存在A/G碱基突变，所述SNP分子标记位于XM_015101463.1上，与绵羊多羔具有显著的相关性。
2.用于Sequenom
Figure FDA0002557154140000011
SNP技术检测绵羊HIRA基因型的引物组合，其特征在于，
PCR扩增引物的核苷酸序列如下：
上游引物F：
5’-ACGTTGGATGAAACGAAACCAGAGCTCTCC-3’；
下游引物R：
5’-ACGTTGGATGTGTGCAGAGGGTCTGATAAC-3’；
延伸引物的核苷酸序列如下：
S1：5’-GGGCCCGGCAACCGAGTTAGTC-3’。
3.含有权利要求2所述引物组合用于Sequenom
Figure FDA0002557154140000012
SNP技术检测绵羊HIRA基因型的试剂盒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液和SAP酶。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
6.利用Sequenom
Figure FDA0002557154140000013
SNP技术检测绵羊HIRA基因型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测绵羊的基因组DNA；
2)以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述扩增引物F和R，进行PCR扩增反应；
3)用SAP酶对PCR扩增产物进行消化；
4)以消化后的PCR扩增产物为模板，利用权利要求2所述延伸引物进行延伸反应；
5)分析延伸产物，从而对绵羊HIRA基因型进行判定。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)中PCR扩增反应使用的反应体系以5μL计为：20-50ng/μL基因组DNA 1μL，10×PCR反应缓冲液0.5μL，25mmol/L MgCl2 0.4μL，25μmol/L dNTPs 0.1μL，PCR Primer mix 1μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，去离子水补齐至5μL；
PCR扩增反应的扩增程序为：95℃2min；95℃30s，56℃30s，72℃60s，45个循环；72℃5min。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤3)中对PCR扩增产物进行消化，使用的SAP酶消化体系以2μL计为：SAP Buffer 0.17μL，SAP Enzyme 0.3μL，去离子水补齐至2μL；
反应条件为：37℃40min，85℃15min，25℃保存。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤4)中延伸反应体系以2μL计为：iplexBuffer 0.2μL，Terminator mix 0.2μL，Extend primer mix 0.94μL，iplex Enzyme 0.041μL，去离子水补齐至2μL；
延伸反应条件为：94℃30s；94℃5s，52℃5s，80℃5s 5个循环，40个循环；72℃3min。
10.权利要求6-9任一项所述方法在绵羊分子标记辅助育种中的应用。
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