CN107586857B

CN107586857B - 用于快速鉴定猪的红黑毛色基因的核酸、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN107586857B
Application number: CN201711017139.7A
Authority: CN
Inventors: 蓝静; 赵久刚; 陈磊; 陈四清; 张廷焕; 王可甜; 郭宗义; 谢佳嫦; 曾莉
Original assignee: Chongqing Pig Industry Technology Research Institute Co ltd; Chongqing Academy of Animal Sciences
Current assignee: Chongqing Pig Industry Technology Research Institute Co ltd; Chongqing Academy of Animal Sciences
Priority date: 2017-10-26
Filing date: 2017-10-26
Publication date: 2021-07-27
Anticipated expiration: 2037-10-26
Also published as: CN107586857A

Abstract

本发明提供了一种用于快速鉴定猪的红黑毛色基因的核酸、试剂盒及方法，其核酸包括红毛特异性引物、黑毛特异性引物和下游通用引物，其中，所述红毛特异性引物的序列如SEQ ID No.1所示，所述黑毛特异性引物的序列如SEQ ID No.2所示，所述下游通用引物的序列如SEQ ID No.3所示。本发明提供的方法可用于鉴别杜洛克和以黑为主要被毛颜色的如太湖猪、盆周山地猪、莱芜猪杂交后代的毛色，从分子水平上对杂交后代进行早期筛选，从而快速获得可稳定遗传的黑毛色猪种的检测结果，该方法快速、简单易操作，成本较低，可用于大规模检测及育种实践。

Description

用于快速鉴定猪的红黑毛色基因的核酸、试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于快速鉴定猪的红黑毛色基因的核酸、试剂盒及方法。

背景技术

在猪的杂交育种中，毛色作为一个很重要的表型性状通常将其作为一个品种的标志性特征，毛色性状能否稳定遗传是一个品种是否成功培育的标志。另一方面，毛的颜色会影响消费者对该产品的认可度，直接影响其经济效益。因此，对毛色进行快速鉴定、使培育品种的毛色快速纯合，可加快选育进展，提高选育效率，节约选育成本。被毛黑色的中国地方猪如太湖猪、盆周山地猪等，以高繁殖性能及较好的肉品质闻名，是世界公认的宝贵猪种遗传资源，通常在进行品种培育的时候会被作为母本。而被毛红色的杜洛克猪种因其产肉性能较突出，在品种培育中常作为父本。当以太湖猪、盆周山地猪、莱芜猪为母本、杜洛克为父本培育新品种系的时候，其杂交后代会出现毛色不整齐，可出现黑色、红色、红白条纹、红黑条纹等多种颜色，这种毛色性状分离的现象，严重影响新培育品种的一致性和整齐度。但传统的育种方法是通过一代代剔除红毛色和花纹毛色后代，这需要耗费育种工作者大量时间，浪费许多的经济成本和时间成本。因此，快速对两种毛色进行鉴定，并剔除不需要的毛色在育种实践中尤为重要。

猪的毛色遗传机理较复杂，涉及到一系列色素沉积相关基因和信号通路，任何一个或几个基因位点的突变都会引起毛色的改变。黑素皮质素受体1(melanocortin1-receptor，MC1R)基因是控制动物黑色素合成的重要基因，它的正常表达可使黑色素沉积，呈现真黑色，而该基因的突变会影响真黑色素的生成和沉积，从而引起毛色呈现其他颜色。研究报道杜洛克的红毛色是由于MC1R基因其中一个或几个位点突变引起的。我们的研究发现杜洛克的红毛色对太湖猪、盆周山地猪、莱芜猪的黑毛色为隐性，经统计分析，基本符合经典的孟德尔遗传定律。

因目前针对MC1R的红毛色突变位点的确切的功能证据还没有，文献报道，在杜洛克与梅山猪(太湖猪的一个类群)之间共有7个位点不同(SHI Kerong等2004，Science inChina Ser.C Life Sciences，Vol.47No.3 287-292)，而Dun等(J GenetGenomics.2007Sep；34(9):777-782.)认为668G-->C,1318C-->T,and 1554G-->A可能可以用以区别长白、大白猪与杜洛克猪的毛色。本发明的发明人根据突变氨基酸的功能结构预测认为该基因mRNA序列第727位位点可能是引起红黑毛色表型差异的关键位点，对毛色基因进行检测的方法主要是采用PCR-SSCP或PCR-RFLP的方法进行，但由于该位点没有限制性内切酶位点，且临近的729位还有一个突变位点，会影响该位点的基因分型，导致结果不准确。此外，这些方法还存在步骤复杂、效率低、成本高、对人员要求高等缺点，不适用于大规模检测并应用于育种实践。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于快速鉴定猪的红黑毛色基因的核酸、试剂盒及方法，该方法可用于鉴别杜洛克和以黑毛色为主的太湖猪、盆周山地猪、莱芜猪杂交后代的毛色，从分子水平上对杂交后代进行早期筛选，从而快速获得可稳定遗传的黑色猪种的检测结果，该方法快速、简单易操作，成本较低，可用于大规模检测及育种实践。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

一种用于KASP基因分型快速鉴定猪的红黑毛色基因的核酸，该核酸包括红毛特异性引物、黑毛特异性引物和下游通用引物，其中，所述红毛特异性引物的序列如SEQ IDNo.1所示，所述黑毛特异性引物的序列如SEQ ID No.2所示，所述下游通用引物的序列如SEQ ID No.3所示。

一种用于KASP基因分型快速鉴定猪的红黑毛色基因的试剂盒，其含有如上所述的核酸。

如上所述的试剂盒，优选地，所述试剂盒还包括KASP基因分型检测所用试剂。如2×KASP Master Mix。

如上所述的试剂盒，优选地，所述红毛特异性引物对应检测FAM，所述黑毛特异性引物对应检测HEX。

一种用于KASP基因分型快速鉴定猪的红黑毛色基因方法，该方法包括以下步骤：

(1)从猪耳组织中提取DNA；

(2)对提取的所述DNA，采用KASP基因分型试剂和上述用于快速鉴定猪的红黑毛色基因的核酸进行荧光定量PCR扩增；同时设置含有如SEQ ID No.4所示序列作为红毛基因阳性对照，含有如SEQ ID No.5所示序列作为黑毛基因阳性对照，含有如SEQ ID No.4和SEQID No.5所示序列作为杂合子阳性对照；

(3)利用荧光定量PCR仪上的位点分析功能分析读数；

(4)结果判定：根据两种荧光基团的荧光值在坐标上的位置进行判定；当值偏向代表红毛基因的荧光基团值的X轴，并与已知红毛基因阳性对照聚在一起，则所述待测样品的个体基因型为红毛TT基因型；当荧光值偏向代表黑毛基因的荧光基团值的Y轴，并与已知黑毛基因阳性对照聚在一起，则所述待测样品的个体基因型为黑毛CC基因型；当荧光值分布偏向于坐标45度方向，并与杂合子基因型对照个体聚在一起，则该个体基因型为TC基因型。

如上所述的方法，优选地，在步骤(2)中，所述荧光定量PCR扩增的反应体系中，所述红毛特异性引物、黑毛特异性引物及下游通用引物的引物终浓度为0.2-0.5pmol/μl，所述荧光定量PCR扩增的反应程序为：94℃15min；94℃20s，61-55℃60s，10个循环，其中每个循环降低0.6s；94℃20s，55℃60s，26个循环。

如上所述的方法，优选地，如果所述步骤(3)的读数不理想，则继续进行如下循环：94℃20s，57℃60s，3个循环，重新读数分析；

该步骤重复几次直到不同基因型分别聚得较好为止。

如权上所述的方法，优选地，在步骤(2)中，还设有阴性对照，所述阴性对照为水。

如上所述的方法，还包括验证步骤，所述验证步骤采用方法为：用如SEQ ID No.6、SEQ ID No.7所示的引物对对待测样品的DNA进行PCR扩增，将扩增的阳性产物进行测序，测序结果与如SEQ ID No.8所示红毛基因型序列及如SEQ ID No.9所示黑毛基因型序列进行比对，从而获得待测样品的基因型。

如上所述的方法，优选地，所述PCR扩增程序为：预变性94℃5分钟；随后进入循环：变性94℃30秒，退火60℃30秒，延伸72℃40秒，循环35次；终延伸72℃7分钟后结束反应。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种用于快速鉴定猪的红黑毛色基因的核酸、试剂盒及方法。该核酸、试剂盒及方法通过对杜洛克和中国地方猪太湖猪、盆周山地猪、莱芜猪杂交后代的毛色进行检测，可鉴别出杜洛克与太湖、盆周山地猪、莱芜猪来源的黑红毛色基因，其结果准确。本发明的方法从分子水平上对杂交后代进行早期筛选，从而可快速鉴定出稳定遗传的黑色猪种。该方法便于大规模筛选，降低了成本，操作简便，对实验人员和环境要求较低，准确度高，适合临床检测。

附图说明

图1为采用荧光定量PCR的方法进行检测的结果。

图2为采用直接测序法获得的三种基因型，其中CC型为红毛基因、TT为黑毛基因，CT型为杂合基因。

具体实施方式

本发明涉及到的基因为黑素皮质素受体1(melanocortin1-receptor，MC1R)基因，位于猪6号染色体短臂端，本发明的发明人利用分子克隆结合基因组比对的方法检测到杜洛克和太湖猪中MC1R基因mRNA序列第491位、727位、729位呈现多态性。纯种太湖猪三个位点基因型分别为CC/GG/AA，而纯种杜洛克三个位点基因型分别为TT/AA/GG。其中，第491位C-T的突变导致了编码氨基酸从缬氨酸(Val)到丙氨酸(Ala)的改变，第727位的G-A突变导致了编码氨基酸从酪氨酸(Thr)到丙氨酸(Ala)的突变。经大量实验对目标群体验证，该三个突变位点在检测的群体中呈现完全共分离。因此，本发明采用对第491位多态性位点C/T位点(dbSNP:rs45435032)进行检测的方法对红黑毛色基因型进行鉴定。

具体地说，本发明的技术方案是，从待检猪身上采取耳组织样或血液样，提取DNA，根据该位点的上下游序列设计引物，扩增包含该位点上下游序列50bp左右，同时设计两条针对该突变位点的带不同荧光基团的引物进行扩增，采用LGC公司提供的KASP的方法进行扩增。原理即是采用竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR)原理，基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型，通过一次PCR即可达到分型的目的。扩增完之后在荧光定量PCR仪或可以读取相应荧光的读数仪上对不同荧光基团进行读数，然后计算两种荧光强度的比值，即可获得该个体的基因型。

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1用于快速鉴定猪的红黑毛色基因的引物的设计

1、在ensembl猪基因组数据库

(http://www.ensembl.org/Sμs_scrofa/Info/Index)中获取位于猪6号染色体255611-256573bp(Sscrofa10.2)处的包含MC1R基因序列。设计针对突变位点rs45435032的特异引物序列及反向引物序列，经过大量实验及验证实验，最后确定可用于KASP基因分型快速鉴定红黑毛色基因的特异引物序列设计如表1所示，红毛特异引物、黑毛特异引物和下游通用引物可送到LGC公司合成用于KASP基因分型的红毛特异引物、黑毛特异引物及下游通用引物序列的引物，混合成Primer Mix，其中，红毛特异引物对应检测的是FAM，黑毛特异引物对应检测的是HEX，可由LGC公司提供的通用KASP Master Mix试剂进行检测。具体地，根据KASP基因分型检测原理，LGC公司在合成时，在红毛特异引物和黑毛特异引物的5’端连接不同的检测引物序列，连接红毛特异引物的检测引物序列作为F探针，连接黑毛特异引物的检测引物序列作为H探针，在F探针的5'端标记一个FAM荧光基团；H探针的5'端标记一个HEX荧光基团，相应于F探针和H探针，各设计一个3'端带淬灭基团的淬灭探针，其中，F探针、H探针及对应的淬灭探针均由LGC公司提供，并制备成为试剂2×KASP Master Mix。

表1

上述红毛特异引物和下游通用引物扩增的片段大小为47bp，为红毛阳性基因，其序列如SEQ ID No.4所示，黑毛特异引物和下游通用引物扩增的片段大小为47bp，为黑毛阳性基因，其序列如SEQ ID No.5所示，通过对杜洛克和太湖猪、盆周山地猪、莱芜猪等以黑色为主要颜色的中国地方猪种采用上述引物进行检测，并将检测结果通过育种培育后进行验证，准确率达100％。且本发明方法操作简单、方便，不需要较高技术即可进行操作。

具体地，SEQ ID No.4：CGTGACGCTGCCCCGCGTGGGGCGGGCCATCGCGGCCATCTGGGCGG；

SEQ ID No.5：CGTGACGCTGCCCCGCGCGGGGCGGGCCATCGCGGCCATCTGGGCGG。

实施例2用于快速鉴定红黑毛色基因的检测方法

用于快速鉴定红黑毛色基因的检测方法，包括如下步骤：

1、耳组织DNA的提取

采取猪耳组织样品黄豆粒大小一块或血液样品200μl，用酚氯仿法或者用常规的动物基因组提取试剂盒(天根)提取基因组DNA，提取方法见说明书。测浓度后稀释到20-30ng/μl备用。

2、荧光定量PCR体系的配制

采用LGC公司提供的如实施例1所述的KASP基因分型试剂盒中的2×KASP MasterMix试剂进行PCR反应体系配置，具体体系如下：

(1)当为96孔板时，每孔的反应体系为：2×KASP Master Mix 5μl；72×PrimerMix 0.14μl；样本DNA(20-30ng/μl)5μl。

(2)当为384孔板时，每孔的反应体系为：2×KASP Master Mix 2.5ul；72×PrimerMix 0.07ul；样本DNA(20-30ng/ul)2.5ul。

其中72×Primer Mix含有红毛特异引物的终浓度为21.4pmol/μl，黑毛特异引物终浓度为21.4pmol/μl，下游通用引物终浓度为21.4pmol/μl，即各个反应中特异引物与下游通用引物的终浓度是实际是0.3pmol/μl，其中红毛特异引物对应的荧光标记为FAM，其激发波长为485nm，检测波长为556nm；黑毛特异引物对应的荧光标记为HEX，其激发波长为535nm，检测波长为556nm。

需要注意的是：每个实验孔板上除包含待检测的样品外，还必须包含以下样品：阳性对照：TT基因型阳性样品即含有红毛基因SEQ ID No.4序列的质粒3-5个，CC基因型阳性样品即含有黑毛基因SEQ ID No.5序列的质粒3-5个，阴性对照：阴性样品(用去离子水替换样本DNA)2个。

3、在PCR仪上进行扩增

扩增程序如下：

94℃15min；94℃20s，61-55℃60s，10个循环(每个循环降低0.6s)；94℃20s，55℃60s，26个循环；循环完成后37℃1min读取荧光值。

4、读数及分析

利用荧光定量PCR仪上的位点分析(allelic discrimination，AD)功能进行分析读数。一般来说是扩增完之后在荧光定量PCR仪或可以读取相应荧光的读数仪上对不同荧光基团进行读数，然后计算两种荧光强度的比值，即可获得该个体的基因型。一般认为大于10多倍，就算是有差异的。本发明经过大量实验验证，采用如下方法进行判断结果，结果更直接、可靠。

结果判定：根据两种荧光基团的荧光值在坐标上的位置进行判定，当荧光值偏向代表红毛基因的荧光基团值的X轴，并与已知红毛基因阳性对照聚在一起，则所述待测样品的个体基因型为红毛TT基因型；当荧光值偏向代表黑毛基因的荧光基团值的Y轴，并与已知黑毛基因阳性对照聚在一起，则所述待测样品的个体基因型为黑毛CC基因型；当荧光值分布偏向于坐标45度方向，并与杂合子基因型对照个体聚在一起，则该个体基因型为TC基因型。

5、补充循环分析

当读数不理想，即不能明显看出结果，经大量实验发现，可继续进行如下循环：94℃20s，57℃60s，3个循环，37℃1min并收集荧光信号；重新进行读数分析。该步骤可重复几次直到不同基因型分别聚得较好，能够明显看出结果为止。本发明所建立的鉴定红黑毛色基因方法，其适合高通量、大规模进行筛选，成本较低。其中，在检测过程中设置的阳性对照不仅用于判断结果，还能有效验证所用试剂的有效性，避免假阴性的发生；阴性对照的设计能有效验证所用试剂是否受到污染，避免假阳性发生。

实施例3样品的检测

1、DNA的提取

对于从重庆市各猪场采集的杜洛克、太湖猪、盆周山地猪、莱芜猪来源的猪取猪耳组织样品黄豆粒大小一块，用眼科剪剪碎，或添加了抗凝剂的血液样品200μl于1.5ml离心管中。

当采用酚仿醇方法进行DNA提取时，采用如下步骤：(1)在上述1.5ml离心管中加入1×SET缓冲液至终体积200ul，蛋白酶K(10mg/L)至浓度100μg/ml，再加10％SDS至终浓度0.5％，55℃消化过夜；(2)等组织溶解后，加入等体积饱和酚，盖紧盖子，轻轻上下颠倒混匀约20min，5000g，4℃离心10min；用剪掉尖嘴的大口径吸头，吸上清液入一新的50ml离心管，弃下层苯酚；(3)加入200ul的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混合液，轻轻上下颠倒混匀15min，1000g，4℃，离心15min；再按上述步骤收集上清，弃下层液体；(4)加入200ul的氯仿/异戊醇(24:1)，同上再抽提一次；(5)加入500ul预冷至-20℃的无水乙醇，轻轻摇动离心管，即有DNA呈絮状析出；(6)用吸头吸出絮状的DNA于一1.5ml的离心管中，用70％乙醇洗涤一次，3,000g，离心5min，弃上层乙醇；(7)将离心管于真空干燥泵中37℃抽真空干燥DNA，加入300μl TE溶解DNA，置于4℃保存。

当采用天根基因组DNA试剂盒进行DNA提取时，(1)加GA缓冲液至体积200μl，向离心管中加入20μl蛋白酶K，充分混匀后56℃水浴1-3h，至组织溶解。(2)向离心管中加入200μl GB，充分颠倒混匀后70℃水浴10min。(3)向离心管中加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀15s，简短离心。

(4)将上一步所得离心管中所有产物都加入到放入收集管中的吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，弃废液后将吸附柱CB3放回收集管中。(5)向吸附柱CB3中加入500μl GD(GD使用前先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃废液后将吸附柱CB3放回收集管中。(6)吸取600μl漂洗液PW加入吸附柱CB3中(PW使用前先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃废液后将吸附柱CB3放回收集管中。(7)重复步骤(6)。(8)将吸附柱CB3放回收集管中空转，12000rpm(13,400×g)离心2min，随后将吸附柱CB3放入干净离心管中。室温放置数分钟。(9)吸取50～200μl洗脱缓冲液TE悬空滴加至吸附柱CB3吸附膜的中间部位，室温放置2～5min后，12,000rpm(13,400×g)离心2min，收集DNA样品。

将2μL待检测DNA样品与1μL 6×loading buffer混匀，上样于1.0％琼脂糖凝胶点样孔。150V电压电泳15min后，将凝胶置于凝胶成像仪观察检测，当结果呈现较完整的条带，并且大小在50kb左右时，表示该DNA质量较好，可用于后续检测。

同时取DNA样品1.5ul，采用Nanodrop 2000紫外分光光度计对提取的基因组DNA浓度和纯度进行检测后，将DNA稀释到20-30ng/μl备用。

2、荧光定量PCR体系的配制

(1)当采用96孔板时，每孔的反应体系如下：2×KASP Master Mix 5μl；72×Primer Mix 0.14μl；样本DNA(20-30ng/μl)或去离子水5μl。其中，每板准备1-2个阴性对照，3-5个黑毛阳性对照，3-5个红毛阳性对照。

(2)当采用384孔板时，每孔的反应体系如下：2×KASP Master Mix 2.5μl；72×Primer Mix 0.07μl；样本DNA(20-30ng/μl)或去离子水2.5μl。其中，每板准备1-2个阴性对照，3-5个黑毛阳性对照，3-5个红毛阳性对照。

3、在荧光定量PCR仪上进行扩增

当在ABI 7900荧光定量PCR仪上扩增按如下程序设置：(1)在SDS软件上建一个allelic Discrimination(AD)文件，并设置位点信息和相应的荧光通道信息，其中，“FAM”为allele X reporter，“VIC”为allele Y reporter(在ABI7900机型上VIC比HEX读取荧光值更准确)。(2)在SDS软件上建一个allelic Quantification(AQ)文件，在standard Curve(AQ)中设置扩增程序如下：94℃15min；94℃20s，61-55℃60s，10个循环(每个循环降低0.6℃)；94℃20s，55℃60s，26个循环；37℃1min并收集荧光信号。(3)在AD文件中为每个待检测的孔板位置设置detector为“FAM”和“VIC”。

(4)运行AD文件进行预读板。(5)运行AQ文件进行PCR扩增。(6)AQ完成后，运行AD文件并另存一个文件然后读板。(7)在AD中点击“analyse”分析结果。

当在在BIO-RAD-CFX PCR仪上扩增按如下程序设置：(1)在CFX管理软件中设置一个新程序，并设置扩增程序为：94℃15min；94℃20s，61-55℃60s，10个循环(每个循环降低0.6℃)；94℃20s，55℃60s，26个循环，37℃1min并收集荧光信号。(2)设置好样品、阴性对照和荧光通道1为FAM，通道2为HEX，通道3为ROX(便于在其他软件中分析)，并运行程序。(3)程序完成后在数据分析窗口中选择“Allelic Discrimination”进行结果分析。

4、结果分析

提供一个检测样品的结果，如图1所示。当值偏向代表FAM荧光基团值的X轴，并与已知TT基因型阳性对照个体聚在一起，该个体基因型为红毛TT基因型；当值偏向代表HEX荧光基团值的Y轴，并与已知CC基因型阳性对照个体聚在一起，该个体基因型为黑毛CC基因型；当值偏向于坐标45度方向，并与TC基因型阳性对照个体聚在一起，则该个体基因型为TC基因型。此时，阴性对照应位于坐标接近0的位置。

5、补充循环分析

如果基因型分型不理想，即不能明显看出结果，可参见实施例2的方法重新设置扩增程序进行进一步的补充循环，具体地，扩增循环程序如下：94℃20s，57℃60s，3个循环；37℃1min并收集荧光信号。该补充循环分析步骤可以重复几次直到不同基因型分别聚得较好，能够明显看出结果为止。

检测结果表明，本发明对于杜洛克与太湖、盆周山地猪、莱芜猪来源的黑红毛色基因检测结果准确，准确度为100％。

实施例4设计引物进行扩增后直接测序法

为了验证本发明实施例2中方法的检测准确性，同时为了提供另一种方便的检测方法，本发明还设计了扩增红毛、黑毛基因的通用引物，通过扩增的基因序列，进行测序，测序结果与已知序列进行对比分析，确认样品中的红毛、黑毛基因，该方法相对简便，适合于一次检测样品不多，无检测荧光设备的情况。

1、引物序列如下：

MC1R-1F(SEQ ID No.6)：5’-GTCATGGACGTGCTCATCTG-3’，在MC1R基因mRNA序列的位置：364-383bp。

MC1R-1R(SEQ ID No.7)：5’-CGATGGAGTTGCAGATGACG-3’在MC1R基因mRNA序列的位置：865-884bp。

该扩增序列扩增的片段包含了MC1R基因mRNA序列第491位、727位、729位三个遗传共分离位点，共520bp。

2、扩增条件和体系

扩增退火温度为60℃，普通PCR扩增体系，总体系50μl，具体可采用Takara公司rTaq酶配置如下PCR反应体系配置：10×PCR buffer(不含MgCl₂15mmol)5.0μl；MgCl₂(15mmol)3μl；4×dNTPs(2.5mM)4.0μl；Primers(10pmol/μl each)0.8μl；模板DNA(20-30ng/μl)8.0μl；Taq DNA polymerase(5U/μl)0.5μl；加水至50μl。随后用PCR仪以如下条件进行PCR反应，预变性94℃5分钟；随后进入循环：变性94℃30秒，退火60℃30秒，延伸72℃40秒，循环35次；终延伸72℃7分钟后结束反应。反应结束后取3μl经1.5％琼脂糖凝胶电泳分析确认扩增为单一条带后采用MC1R-1F引物送测序公司进行PCR产物测序。

结果判定：当测序峰图为单一峰，将测序结果与下面的红毛基因序列与黑毛基因序列进行比对，判断是红毛基因还是黑毛基因。当测序峰图在突变位点处为双峰，则为TC杂合基因型。对于直接测序法获得的三种基因型的测序峰图如图2所示。

其中红毛基因型序列(SEQ ID No.7)如下：

SEQ ID No.7：GTCATGGACGTGCTCATCTGCGGCTCCATGGTGTCCAGCCTCTGCTTCCTGGGCGCCATCGCCGTGGACCGCTACGTGTCCATCTTCTACGCGCTGCGCTACCACAGCATCGTGACGCTGCCCCGCGTGGGGCGGGCCATCGCGGCCATCTGGGCGGGCAGCGTGCTCTCCAGCACCCTCTTCATCGCCTACTACCACCACACGGCCGTCCTGCTGGGCCTCGTCAGCTTCTTCGTGGCCATGCTGGCGCTCATGGCGGTACTGTACGTCCACATGCTGGCCCGGGCCTGCCAGCACGGCCGGCACATCGCCCGGCTCCACAAGACGCAGCACCCCACCCGCCAGGGCTGCGGCCTCAAGGGCACGGCCACCCTCACCATCCTGCTGGGCGTCTTCCTCCTCTGCTGGGCACCCTTCTTCCTGCACCTCTCCCTCGTCGTCCTCTGCCCCCAGCACCCCACCTGCGGCTGCGTCTTCAAGAACGTCAACCTCTTTCTGGCCCTCGTCATCTGCAACTCCATCG

黑毛基因型序列(SEQ ID No.8)如下：

SEQ ID No.8：GTCATGGACGTGCTCATCTGCGGCTCCATGGTGTCCAGCCTCTGCTTCCTGGGCGCCATCGCCGTGGACCGCTACGTGTCCATCTTCTACGCGCTGCGCTACCACAGCATCGTGACGCTGCCCCGCGCGGGGCGGGCCATCGCGGCCATCTGGGCGGGCAGCGTGCTCTCCAGCACCCTCTTCATCGCCTACTACCACCACACGGCCGTCCTGCTGGGCCTCGTCAGCTTCTTCGTGGCCATGCTGGCGCTCATGGCGGTACTGTACGTCCACATGCTGGCCCGGGCCTGCCAGCACGGCCGGCACATCGCCCGGCTCCACAAGACGCAGCACCCCACCCGCCAGGGCTGCGGCCTCAAGGGCGCAGCCACCCTCACCATCCTGCTGGGCGTCTTCCTCCTCTGCTGGGCACCCTTCTTCCTGCACCTCTCCCTCGTCGTCCTCTGCCCCCAGCACCCCACCTGCGGCTGCGTCTTCAAGAACGTCAACCTCTTTCTGGCCCTCGTCATCTGCAACTCCATCG

利用本实施例的方法对实施例3中所述样品进行检测，其测序对比后的结果与实施例3的检测结果相同，进一步验证了本发明方法的准确性。

序列表

<110> 重庆市畜牧科学院；重庆市生猪产业技术研究院

<120> 用于快速鉴定猪的红黑毛色基因的核酸、试剂盒及方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgtgacgctg ccccgcgt 18

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgacgctgc cccgcgc 17

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccgcccagat ggccgcgat 19

<210> 4

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgtgacgctg ccccgcgtgg ggcgggccat cgcggccatc tgggcgg 47

<210> 5

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgtgacgctg ccccgcgcgg ggcgggccat cgcggccatc tgggcgg 47

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtcatggacg tgctcatctg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgatggagtt gcagatgacg 20

<210> 8

<211> 523

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtcatggacg tgctcatctg cggctccatg gtgtccagcc tctgcttcct gggcgccatc 60

gccgtggacc gctacgtgtc catcttctac gcgctgcgct accacagcat cgtgacgctg 120

ccccgcgtgg ggcgggccat cgcggccatc tgggcgggca gcgtgctctc cagcaccctc 180

ttcatcgcct actaccacca cacggccgtc ctgctgggcc tcgtcagctt cttcgtggcc 240

atgctggcgc tcatggcggt actgtacgtc cacatgctgg cccgggcctg ccagcacggc 300

cggcacatcg cccggctcca caagacgcag caccccaccc gccagggctg cggcctcaag 360

ggcacggcca ccctcaccat cctgctgggc gtcttcctcc tctgctgggc acccttcttc 420

ctgcacctct ccctcgtcgt cctctgcccc cagcacccca cctgcggctg cgtcttcaag 480

aacgtcaacc tctttctggc cctcgtcatc tgcaactcca tcg 523

<210> 9

<211> 523

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtcatggacg tgctcatctg cggctccatg gtgtccagcc tctgcttcct gggcgccatc 60

gccgtggacc gctacgtgtc catcttctac gcgctgcgct accacagcat cgtgacgctg 120

ccccgcgcgg ggcgggccat cgcggccatc tgggcgggca gcgtgctctc cagcaccctc 180

ttcatcgcct actaccacca cacggccgtc ctgctgggcc tcgtcagctt cttcgtggcc 240

atgctggcgc tcatggcggt actgtacgtc cacatgctgg cccgggcctg ccagcacggc 300

cggcacatcg cccggctcca caagacgcag caccccaccc gccagggctg cggcctcaag 360

ggcgcagcca ccctcaccat cctgctgggc gtcttcctcc tctgctgggc acccttcttc 420

ctgcacctct ccctcgtcgt cctctgcccc cagcacccca cctgcggctg cgtcttcaag 480

aacgtcaacc tctttctggc cctcgtcatc tgcaactcca tcg 523

Claims

1.一种用于KASP基因分型快速鉴定猪的红黑毛色基因的核酸，其特征在于，该核酸包括红毛特异性引物、黑毛特异性引物和下游通用引物，其中，所述红毛特异性引物的序列如SEQ ID No.1所示，所述黑毛特异性引物的序列如SEQ ID No.2所示，所述下游通用引物的序列如SEQ ID No.3所示，红毛特异性引物的5'端标记一个FAM荧光基团，黑毛特异性引物的5'端标记一个HEX荧光基团，两特异性引物的3'端均带淬灭基团。

2.含有如权利要求1所述核酸的试剂盒。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于KASP基因分型检测所用试剂。

4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述红毛特异性引物对应检测FAM，所述黑毛特异性引物对应检测HEX。

5.一种用于KASP基因分型快速鉴定红黑毛色基因方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)从猪组织中提取DNA作为待测样品；

(2)对提取的所述DNA，采用KASP基因分型试剂和如权利要求1所述用于快速鉴定猪的红黑毛色基因的核酸进行荧光定量PCR扩增；同时设置含有如SEQ ID No.4所示序列作为红毛基因阳性对照，含有如SEQ ID No.5所示序列作为黑毛基因阳性对照，含有如SEQ IDNo.4和SEQ ID No.5所示序列作为杂合子阳性对照；

(3)利用荧光定量PCR仪上的位点分析功能分析读数；

(4)结果判定：根据两种荧光基团的荧光值在坐标上的位置进行判定，当荧光值偏向代表红毛基因的荧光基团值的X轴，并与已知红毛基因阳性对照聚在一起，则所述待测样品的个体基因型为红毛TT基因型；当荧光值偏向代表黑毛基因的荧光基团值的Y轴，并与已知黑毛基因阳性对照聚在一起，则所述待测样品的个体基因型为黑毛CC基因型；当荧光值分布偏向于坐标45度方向，并与杂合子基因型对照个体聚在一起，则该个体基因型为TC基因型。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述荧光定量PCR扩增的反应体系中，所述红毛特异性引物、黑毛特异性引物及下游通用引物的引物终浓度为0.2-0.5pmol/μl，所述荧光定量PCR扩增的反应程序为：94℃15min；94℃20s，61-55℃60s，10个循环，其中每个循环降低0.6s；94℃20s，55℃60s，26个循环。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，如果所述步骤(3)的结果不理想，则继续进行如下循环：94℃20s，57℃60s，3个循环，重新分析；

该步骤重复几次直到不同基因型分别聚得明显看出结果为止。

8.如权利要求5-7中任一项所述的方法，其特征在于，还包括验证步骤，所述验证步骤采用方法为：用如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示的引物对对待测样品的DNA进行PCR扩增，将扩增的阳性产物进行测序，测序结果与如SEQ ID No.8所示红毛基因型序列及如SEQID No.9所示黑毛基因型序列进行比对，从而获得待测样品的基因型。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增程序为：预变性94℃5分钟；随后进入循环：变性94℃30秒，退火60℃30秒，延伸72℃40秒，循环35次；终延伸72℃7分钟后结束反应。