CN104962614A - 利用Taqman MGB探针检测绵羊FecB基因多态性的方法 - Google Patents

利用Taqman MGB探针检测绵羊FecB基因多态性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种利用Taqman MGB探针检测绵羊FecB基因多态性的方法，能高通量检测A、G位点，结果容易判读。与传统的PCR-RFLP检测FecB基因等方法相比，每次可以检测384个样品，且不需要进行PCR产物的后续分析，在节省了检测成本的同时，大大缩短了检测周期，提高了检测效率。本发明使用的引物和探针特异性强，不会受到其他基因的干扰，降低了PCR产物污染引起假阳性的风险，并且结果判读更容易。可对FecB基因的SNP位点实现高通量检测，在对绵羊进行大规模分子育种中具有潜在的应用价值。

Description

利用Taqman MGB探针检测绵羊FecB基因多态性的方法
技术领域
本发明涉及分子标记检测技术，具体地说，涉及一种利用TaqmanMGB探针检测绵羊FecB基因多态性的方法。
背景技术
家畜的产仔数是经济价值十分巨大的数量性状。对绵羊产羔数的选择不仅受到性别和年龄的限制，而且绵羊的产羔数是一个遗传力很低的数量性状，因此难以用常规的育种技术来改良产羔数性状。标记辅助选择能够通过影响选择的时间、选择的强度和准确性而极大地提高这类低遗传力性状的选择功效，而找到与这些数量性状基因座相连锁的分子遗传标记，则是实现标记辅助选择的先决条件。
上世纪50年代，Seears兄弟选育出一群可以生多胞胎的澳大利亚美利奴(Booroola Merino,BM)，并报道这种产多胞胎的美利奴绵羊比其他群体的美利奴绵羊产羔数提高了30％。该基因已被绵羊和山羊遗传命名委员会定名为FecB(Fecundity Booroola)。Montgomery等用遗传连锁和微卫星标记定位的方法将FecB基因定位于Booroola羊的第6号常染色体上。最终研究者发现绵羊FecB的影响是由于骨形态发生蛋白受体1B(Bone morphogenetic protein receptor 1B,BMPR1B)基因编码区发生了A746G突变，从而引起第249位氨基酸由谷氨酰胺变为精氨酸(Q249R)。1个FecB拷贝增加排卵数1.3-1.6枚，母羊产羔数增加0.9-1.2只；2个FecB拷贝增加排卵数2.7-3.0枚，母羊产羔数增加1.1-1.7只。
由于FecB基因能提高绵羊繁殖力，可带来巨大的经济利益，因此各地展开了对不同绵羊品种FecB基因检测。目前研究表明FecB突变存在于世界各地各种高繁殖力绵羊品种中。我国的湖羊和小尾寒羊均携带此突变。传统的FecB基因检测方法，大多采用PCR-RFLP(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism)和PCR-SSCP(polymerase chain reaction-single strand conformationpolymorphism)检测方法，这些方法通量较低，程序繁多，较难实现高通量自动化测定。
在PCR反应系统中加入2种不同荧光标记的探针，它们可分别与2个等位基因完全配对。正常情况下，由于探针5′端荧光基团和3′端淬灭基团紧邻在一起，荧光被淬灭。随着PCR的有效进行，与模板完全配对的探针逐步被Taq DNA聚合酶5′→3′外切酶活性切割，致使探针5′端上的荧光基团与3′端的淬灭基团分离，淬灭效应解除，报告荧光基团被激活；而与模板不能完全配对的探针，表明另一对等位基因不能被有效切割，故检测不到荧光信号，通过相应仪器检测荧光值的变化即可实现SNP位点检测。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)主要指在基因组水平上，由单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性。是一种十分理想、有效的分子标记。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用Taqman MGB探针检测绵羊FecB基因多态性的方法。
为了实现本发明目的，本发明的一种检测绵羊多胎主效基因FecB基因型的方法，其是对绵羊第6号染色体上第29382188bp位点(NC_019463.1，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v3.1，2012年12月)的核苷酸进行单核苷酸多态性检测，根据检测结果判定绵羊FecB基因为AA、AG或GG。本发明中单核苷酸多态性检测所采用的方法为Taqman MGB探针法。
本发明首先提供用于检测绵羊FecB基因型的引物和探针：
所述引物的核苷酸序列如下：
正向引物：5’-ACTGCGTGGGCCATCTTGTCTG-3’
反向引物：5’-TTCCTGGCCGCCTATGTGTATTTC-3’
所述探针的核苷酸序列如下：
P-G：5’-F1-AAATATATCGGACGGTGTT-MGB-3’
P-A：5’-F2-AAATATATCAGACGGTGTTG-MGB-3’
其中，F1和F2为不同颜色的荧光报告基团。优选地，F1为FAM，F2为HEX。
本发明还提供含有所述引物和探针的用于检测绵羊FecB基因型的试剂盒。
优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。
更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
本发明的利用Taqman MGB探针检测绵羊FecB基因多态性的方法，包括以下步骤：
1)提取待测绵羊的基因组DNA；
2)以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用前述的引物和探针，进行实时荧光定量PCR反应；
3)根据检测到的荧光信号对绵羊FecB基因型进行判定。
其中，步骤2)中实时荧光定量PCR反应使用的扩增体系以6μl计为：基因组DNA 1μL，2×Master Mix 3μL，10μmol/L正向引物0.3μL，10μmol/L反向引物0.3μL；10μmol/L探针P-G 0.15μL，10μmol/L探针P-A 0.15μL，去离子水补齐至6μL。
实时荧光定量PCR反应的扩增程序为：95℃10min，95℃30sec，60℃1min，40个循环。
本发明进一步提供所述方法在绵羊分子标记辅助育种中的应用。
本发明提供的检测绵羊多胎主效基因FecB基因型的方法，是以绵羊基因组DNA为模板，在体系中同时加入上述引物和探针。引物用于等位基因PCR扩增，上述探针中加入了2种不同荧光标记，可分别与2个等位基因完全配对。正常情况下，由于探针5′端荧光基团和3′端淬灭基团紧邻在一起，荧光被淬灭。随着PCR的有效进行，与模板完全配对的探针逐步被Taq DNA聚合酶5′→3′外切酶活性切割，致使探针5′端上的荧光基团与3′端的淬灭基团分离，淬灭效应解除，报告荧光基团被激活；而与模板不能完全配对的探针，表明另一对等位基因不能被有效切割，故检测不到荧光信号，由此检测荧光值的变化即可进行单核苷酸多态性检测，根据检测结果判定绵羊FecB基因为AA、AG或GG；其中，单核苷酸多态性检测是针对绵羊第6号染色体上位于29382188bp位点的核苷酸。
本发明提供的利用Taqman MGB探针检测绵羊FecB基因多态性的方法，能高通量检测A、G位点，结果容易判读。与传统的PCR-RFLP检测FecB基因等方法相比，每次可以检测384个样品，且不需要进行PCR产物的后续分析，在节省了检测成本的同时，大大缩短了检测周期，提高了检测效率。本发明使用的引物和探针特异性强，不会受到其他基因的干扰，降低了PCR产物污染引起假阳性的风险，并且结果判读更容易。可对FecB基因的SNP位点实现高通量检测，在对羊进行大规模分子育种中具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1中利用Taqman MGB探针法对FecB基因的三种基因型，即GG、AA和AG的检测结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1利用Taqman MGB探针检测绵羊FecB基因多态性的方法
1、实验材料
选取巴美肉羊，以及小尾寒羊为母本、其它品种为父本杂交产生的共5611只母羊和公羊为检测对象。
2、基因组DNA的提取
绵羊颈静脉采血1ml，用EDTA抗凝处理。首先红细胞裂解液裂解去除不含DNA的红细胞，细胞核裂解液裂解包细胞释放出基因组DNA，然后蛋白沉淀液选择性沉淀去除蛋白，最后纯净的基因组DNA通过异丙醇沉淀并重溶解于DNA溶解液。
3、Taqman MGB探针法进行基因分型
针对绵羊第6号染色体上第29382188bp位点(NC_019463.1，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v3.1，2012年12月)设计引物及探针。
所述引物的核苷酸序列如下：
正向引物：5’-ACTGCGTGGGCCATCTTGTCTG-3’
反向引物：5’-TTCCTGGCCGCCTATGTGTATTTC-3’
所述探针的核苷酸序列如下：
P-G：5’-FAM-AAATATATCGGACGGTGTT-MGB-3’
P-A：5’-HEX-AAATATATCAGACGGTGTTG-MGB-3’
引物和探针由英潍捷基公司合成，采用购自ABI公司的universalMaster Mix，PCR仪型号为ViiATM 7实时荧光定量PCR系统。
反应体系：以提取的基因组DNA为模板，以上述合成的探针在荧光定量PCR系统中进行以下扩增(6μL反应体系)：基因组DNA1μL，2×Master Mix 3μL,10μmol/L正向引物0.3μL，10μmol/L反向引物0.3μL；10μmol/L探针P-G 0.15μL，10μmol/L探针P-A 0.15μL，去离子水补齐至6μL。具体步骤如下：
(1)考虑到移液器及吸头的误差，一般每个384孔板按400个反应计算体系。
(2)每个384孔板设置一个空白对照NTC，设置两个已知GG型绵羊基因组对照，一个已知AG型绵羊基因组对照,一个已知AA型绵羊基因组对照。
(3)应用连续电动加样器将反应体系分至384孔板内，每孔5μL。
(4)应用排枪在每孔中加1μL DNA样品。
(5)完成后用封口膜封口，平板离心机离心。
(6)开启ABI ViiATM 7实时荧光定量PCR系统，设置参数，反应条件如下：95℃10min，95℃30sec，60℃1min，40个循环。
4、分析结果
应用ViiA7_v1_1Software进行数据分析。根据对照扩增结果，分型产生三种基因型，见图1。
第一种基因型：GG，与GG型对照在一个轴上；
第二种基因型：AG，与AG型对照在一个轴上；
第三种基因型：AA，与AA型对照在一个轴上。
5、统计结果
待测绵羊第6号染色体29382188位点不同基因型分析统计结果见表1。
表1待测绵羊第6号染色体29382188位点不同基因型分析统计
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.用于检测绵羊FecB基因型的引物和探针，其特征在于，
所述引物的核苷酸序列如下：
正向引物：5’-ACTGCGTGGGCCATCTTGTCTG-3’
反向引物：5’-TTCCTGGCCGCCTATGTGTATTTC-3’
所述探针的核苷酸序列如下：
P-G：5’-F1-AAATATATCGGACGGTGTT-MGB-3’
P-A：5’-F2-AAATATATCAGACGGTGTTG-MGB-3’
其中，F1和F2为不同颜色的荧光报告基团。
2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，F1为FAM，F2为HEX。
3.含有权利要求1或2所述引物和探针的用于检测绵羊FecB基因型的试剂盒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
6.利用Taqman MGB探针检测绵羊FecB基因多态性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测绵羊的基因组DNA；
2)以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用权利要求1或2所述引物和探针，进行实时荧光定量PCR反应；
3)根据检测到的荧光信号对绵羊FecB基因型进行判定。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)中实时荧光定量PCR反应使用的扩增体系以6μl计为：基因组DNA1μL，2×Master Mix 3μL，10μmol/L正向引物0.3μL，10μmol/L反向引物0.3μL；10μmol/L探针P-G 0.15μL，10μmol/L探针P-A0.15μL，去离子水补齐至6μL。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)中实时荧光定量PCR反应的扩增程序为：95℃10min，95℃30sec，60℃1min，40个循环。
9.权利要求6-8任一项所述方法在绵羊分子标记辅助育种中的应用。
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