CN102433376A - 基于荧光淬灭的基因变异检测方法及探针 - Google Patents
基于荧光淬灭的基因变异检测方法及探针 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于荧光淬灭定量的基因变异检测方法，主要步骤包括：1)提取样本DNA；2)扩增待测基因片段；3)与带荧光淬灭分子的探针及带荧光分子的双脱氧核苷三磷酸进行延伸反应；4)检测荧光变化，计算荧光淬灭值；5)根据步骤4)的计算结果，判断待测基因的SNP。本发明还公开了用于上述方法的寡核苷酸探针。该方法利用标记了淬灭分子的探针和标记了荧光分子的双脱氧核苷三磷酸在待测基因的特异位点上进行单碱基延伸，然后通过检测荧光淬灭值，确定探针末端延伸的碱基类型，如此提高了基因SNP检测的特异性、灵敏度、便捷性和检测效率，同时降低了检测成本。
Description
技术领域
本发明涉及核酸检测技术领域，特别是涉及一种基因SNP(单核苷酸多态性)的检测方法及用于该方法的检测探针。
背景技术
基因科学是生物科学的一个重要领域，人的基因密码序列及其变异会影响人体的多种生物功能和功能变异，通过检测人的基因SNP(single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)可以了解和预估人体的功能变异。当前，检测基因SNP已成为分析判断遗传病、个体化药物反应特征的重要手段，也是预测和预防许多疾病的重要手段，例如，糖尿病等内分泌疾病，以及各种肿瘤的易感因素。
目前，基因SNP的检测方法主要有测序法和Taqman探针法。测序法需要使用昂贵的测序仪，检测成本较高，而且测序仪的操作使用和维护都比较复杂，因此大多数城市的医院和科研单位都没有配备测序仪。Taqman探针法的缺点是：1、探针的筛选比较困难，一般一对探针需要经过多次筛选，才能选出较为合适的探针，而且经常遇到多次筛选不成功的情况；2、检测一个基因的SNP需要两个探针，因此成本较高；3、不是定点识别，因此对单碱基突变检测的灵敏性和特异性不高，容易出现假阴性或假阳性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种基于荧光淬灭的基因变异检测方法，该方法简便、高效、成本低，且特异性和灵敏度高。
为解决上述技术问题，本发明的基于荧光淬灭的基因变异检测方法，包括以下步骤：
1)提取样本DNA；
2)以所述DNA为模板，扩增待测基因片段；
3)将步骤2)的产物与带荧光淬灭分子的探针及带荧光分子的双脱氧核苷三磷酸进行延伸反应；
4)检测步骤3)的延伸反应产生的荧光变化，计算荧光淬灭值；
5)根据步骤4)的计算结果，判断所述待测基因的SNP。
步骤3)中，所述荧光淬灭分子与所述探针的序列末端的距离为3～35bp。
步骤4)中，还包括荧光淬灭值的校正步骤。可以应用外标法(即以荧光自然衰减为对照)，对荧光淬灭值进行校正。
本发明要解决的另一技术问题是提供一种用于上述方法的寡核苷酸探针。
为解决上述技术问题，本发明的寡核苷酸探针，是一段标记有荧光淬灭分子的由15～45个核苷酸组成的寡核苷酸序列；所述荧光淬灭分子与所述寡核苷酸序列末端的距离为3～35bp。
本发明的基因变异检测方法利用标记了荧光淬灭分子的特异序列探针和荧光分子标记的双脱氧核苷三磷酸在待测基因的特异位点上进行单碱基延伸，然后通过检测在探针末端延伸的荧光分子标记的碱基的荧光淬灭值，来确定探针末端延伸的碱基类型，亦即待测基因特异位点的碱基类型。与测序法相比，本发明的检测方法不仅大幅节省了检测时间和成本，还能避免过度扩增带来的假阳性；而与Taqman探针法相比，本发明对基因SNP检测的特异性和灵敏性更高。此外，本发明既可以采用实时荧光定量PCR仪作为检测平台，也可以采用普通PCR仪和荧光酶标仪作为检测平台，从而能够在各医院和科研机构普及应用。
附图说明
图1是本发明实施例1的实验组1的实时荧光原始图谱；
图2是本发明实施例1的实验组2的实时荧光原始图谱；
图3是本发明实施例1的实验组3的实时荧光原始图谱；
图4是本发明实施例1的外标对照组的实时荧光原始图谱；
图5是本发明实施例1的空白对照组的实时荧光原始图谱；
图6是本发明实施例2的实验组1的实时荧光原始图谱；
图7是本发明实施例2的实验组2的实时荧光原始图谱；
图8是本发明实施例2的实验组3的实时荧光原始图谱；
图9是本发明实施例2的外标对照组的实时荧光原始图谱；
图10是本发明实施例2的空白对照组的实时荧光原始图谱。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明作进一步详细的说明。
以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例15HT2A基因的SNP检测
1.样本DNA的提取
取适量的人口腔上皮黏膜细胞(由JANPA DNA BASED TESTING Co.Ltd.提供)，提取其基因组DNA。
2.PCR扩增
以所提取的DNA为模板，对该DNA中的5HT2A基因片段进行PCR(polymerase chainreaction，聚合酶链式反应)扩增。
PCR反应的引物序列如下：
正向引物：CAAGGTGAATGGTGAGCAGA (SEQ ID NO：1)
反向引物：AGAGACACGACGGTGAGAGG (SEQ ID NO：2)
上述引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。
PCR反应体系为：10×PCR缓冲液1.5μL，25mM Mg2+1.2μL，10mM dNTP 0.3μL，甜菜碱(Betaine)2μL，DNA模板1μL，5μM正向引物1μL，5μM反向引物1μL，5U/μL rTaq0.1μL，H2O 6.9μL，总体积15μL。
PCR反应条件如表1所示：
表1PCR反应条件
3.PCR产物纯化
收集上述PCR扩增反应的产物，进行纯化。
纯化反应体系为：PCR产物15μL，5U/μL SAP 1μL，5U/μL核酸外切酶I(Exo I)1μL，总体积17μL。
纯化反应条件为：37℃，30分钟；85℃，15分钟。
4.延伸反应和淬灭反应
在实时荧光定量PCR仪(BioRad PTC200)上，以适量的纯化后的PCR产物为模板，与带有淬灭分子的探针，以及荧光分子标记的ddNTP(双脱氧核苷三磷酸)进行延伸反应(平行进行三组实验，并设立外标对照组和空白对照组，外标对照组用于对实验组的荧光淬灭值进行荧光自然衰减的外标校正)，得到带有荧光标记的寡核苷酸，同时产生淬灭反应。
本实施例的探针序列为：
5’-AAAAAAAAACACCAGGCTCTACAGTAAT(BHQ1)GACTTTAACTC-3’(SEQ ID NO：3)
上述探针由硕世生物科技有限公司合成。
延伸反应体系为：10×测序酶缓冲液1μL，2000U/ml测序酶0.15μL，R6G-ddUTP(罗丹明6G-双脱氧尿嘧啶核苷三磷酸)1μL，Fluorescein-12-ddCTP(荧光素-12-双脱氧胞嘧啶核苷三磷酸)1μL，20μM探针2μL，纯化PCR产物5μL，ddH2O 4.85μL，总体积10μL。
延伸反应条件如表2所示：
表2延伸反应条件
5.荧光淬灭值的校正和淬灭比的计算
在实时荧光定量PCR仪上，检测延伸反应产生的荧光变化(原始荧光图谱如图1～5所示)。其中，实时荧光定量PCR仪的A通道(设定λex为494nm，λem为517nm)代表Fluorescein-12标记的碱基C，B通道(设定λex为520nm，λem为548nm)代表R6G标记的碱基T。
对于对照组，分别检测实时荧光定量PCR仪的A、B通道的初始荧光值Ac0、Bc0和经过延伸反应后的荧光衰减(自然衰减)值ΔAc、ΔBc，计算各通道的荧光衰减比Ra、Rb：
A通道的荧光衰减比为：Ra＝ΔAc/Ac0；
B通道的荧光衰减比为：Rb＝ΔBc/Bc0。
对于实验组，分别检测实时荧光定量PCR仪A、B通道的初始荧光值At0、Bt0和延伸反应产生的荧光淬灭值ΔAt、ΔBt，并利用上述计算得到的荧光衰减比Ra、Rb，对荧光淬灭值ΔAt、ΔBt进行校正，获得校正后的荧光淬灭值Qa、Qb：
A通道的经校正的荧光淬灭值为：Qa＝ΔAt×(1-Ra)；
B通道的经校正的荧光淬灭值为：Qb＝ΔBt×(1-Rb)；
根据校正后的荧光淬灭值Qa、Qb，计算A、B通道的荧光淬灭比：
A通道的荧光淬灭比为：ra＝Qa/At0；
B通道的荧光淬灭比为：rb＝Qb/Bt0；
计算结果(以平均值±标准差表示)如表3所示：
表35HT2A基因各实验组A、B通道的荧光淬灭比
| 实验组序号 | A通道的荧光淬灭比 | B通道的荧光淬灭比 |
| 1 | 4.41％±1.65％ | 23.01％±2.36％ |
| 2 | 18.74％±0.88％ | 16.38％±1.21％ |
| 3 | 28.53％±0.35％ | 8.23％±1.09％ |
6.5HT2A基因SNP的判断
分别计算实时荧光定量PCR仪A、B通道(A通道代表Fluorescein-12标记的碱基C，B通道代表R6G标记的碱基T)的淬灭判别系数，然后根据淬灭判别系数判定探针末端所延伸的碱基类型：
A通道淬灭判别系数为：βa＝ra/(ra+rb)；
B通道淬灭判别系数为：βb＝rb/(ra+rb)。
淬灭判别系数β的值越大，表明特定荧光淬灭越显著，即表明待测基因存在相应位点的标志基因(A、T、C、G)。
本实施例设定β≥65％时，为纯合子；35％＜β＜65％为杂合子；各实验组的淬灭判别系数的计算结果及基因型判定结果如表4所示：
表45HT2A基因各实验组的淬灭判别系数及基因型
| 实验组序号 | A通道淬灭判别系数 | B通道淬灭判别系数 | 基因型 |
| 1 | 16.09％ | 83.91％ | TT |
| 2 | 53.35％ | 46.65％ | TC |
| 3 | 77.62％ | 22.38％ | CC |
该基因型判定结果与用测序仪测得的5HT2A的基因型完全一致。
实施例2COMT基因的SNP检测
1.样本DNA的提取
取适量的人口腔上皮黏膜细胞(由JANPA DNA BASED TESTING Co.Ltd.提供)，提取其基因组DNA。
2.PCR扩增
以所提取的DNA为模板，对该DNA中的COMT基因片段进行PCR扩增。
PCR反应的引物序列如下：
正向引物：GGGCCTACTGTGGCTACTCA(SEQ ID NO：4)
反向引物：CCCTTTTTCCAGGTCTGACA(SEQ ID NO：5)
上述引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。
PCR反应体系和反应条件同实施例1。
3.PCR产物纯化
收集上述PCR扩增反应的产物，进行纯化。
纯化反应体系和反应条件同实施例1。
4.延伸反应和淬灭反应
在实时荧光定量PCR仪上，以适量的纯化后的PCR产物为模板，与带有淬灭分子的探针，以及荧光分子标记的ddNTP进行延伸反应(平行进行三组实验，并设立外标对照组和空白对照组)，得到带有荧光标记的寡核苷酸，同时产生淬灭反应。
本实施例的探针序列为：
5’-TCAGGCATGCACACCTTGT(BHQ1)CCTTCA-3’(SEQ ID NO：6)
上述探针由硕世生物科技有限公司合成。
延伸反应体系和反应条件同实施例1。
5.荧光淬灭值的校正和淬灭比的计算
在实时荧光定量PCR检测仪上，检测延伸反应产生的荧光变化(原始荧光图谱如图6～10所示)。其中，实时荧光定量PCR仪的A通道(设定λex为494nm，λem为517nm)代表Fluorescein-12标记的碱基C，B通道(设定λex为520nm，λem为548nm)代表R6G标记的碱基T。
荧光淬灭值的校正和淬灭比的计算方法同实施例1。
计算结果(以平均值±标准差表示)如表5所示：
表5COMT基因各实验组A、B通道的荧光淬灭比
| 实验组序号 | A通道的荧光淬灭比 | B通道的荧光淬灭比 |
| 1 | 110.36％±1.94％ | 15.08％±15.10％ |
| 2 | 71.03％±12.63％ | 56.66％±16.12％ |
| 3 | -1.47％±1.91％ | 51.59％±1.58％ |
6.COMT基因SNP的判断
分别计算实时荧光定量PCR检测仪A、B通道(A通道代表Fluorescein-12标记的碱基C，B通道代表R6G标记的碱基T)的淬灭判别系数，然后根据淬灭判别系数判定探针末端所延伸的碱基类型。淬灭判别系数的计算方法和基因型的判定方法同实施例1。
淬灭判别系数的计算及基因型的判定结果如表6所示：
表6COMT基因各实验组的淬灭判别系数及基因型
| 实验组序号 | A通道淬灭判别系数 | B通道淬灭判别系数 | 基因型 |
| 1 | 87.97％ | 12.03％ | GG |
| 2 | 55.63％ | 44.37％ | GA |
| 3 | -2.92％ | 102.92％ | AA |
该基因型判定结果与用测序仪测出的COMT的基因型完全一致。
Claims (7)
1.一种基于荧光淬灭的基因变异检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取样本DNA；
2)以所述DNA为模板，扩增待测基因片段；
3)将步骤2)的产物与带荧光淬灭分子的探针及带荧光分子的双脱氧核苷三磷酸进行延伸反应；
4)检测步骤3)的延伸反应产生的荧光变化，计算荧光淬灭值；
5)根据步骤4)的计算结果，判断所述待测基因的SNP。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述荧光淬灭分子与所述探针的序列末端的距离为3～35bp。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述荧光淬灭分子为BHQ1，所述荧光分子为荧光素和R6G。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中，还包括应用外标法对所述荧光淬灭值进行校正。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，步骤4)中，还包括计算淬灭比和淬灭判别系数，所述淬灭比为荧光淬灭值与初始荧光值的比值，所述淬灭判别系数为相应通道的淬灭比与所有通道的淬灭比之和的比值。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤5)中，根据淬灭判别系数判断所述待测基因的SNP；所述淬灭判别系数在65％以上时，判定为纯合子；所述淬灭判别系数大于35％，小于65％时，判定为杂合子。
7.一种寡核苷酸探针，其特征在于，该探针是一段标记有荧光淬灭分子的由15～45个核苷酸组成的寡核苷酸序列；所述荧光淬灭分子与所述寡核苷酸序列末端的距离为3～35bp。
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