CN101157953A - 一种荧光标记的寡核苷酸探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种荧光标记的寡核苷酸探针及其应用。本发明的探针一改传统Taqman探针中把荧光报告基团和荧光淬灭基团分别放在探针两端的设计方法，把荧光淬灭基团设计在探针的中部，同时在荧光淬灭基团两端各修饰一个荧光报告基团。这样既缩短了荧光报告基团和荧光淬灭基团之间的距离，提高了淬灭的效果，又保证了探针的长度。同时，由于传统Taqman探针一分子探针被水解只释放一分子荧光，而本发明的探针一分子探针被水解时可以释放两分子荧光，可以增强荧光信号强度，提高检测的灵敏度。本发明可广泛应用于实时荧光PCR反应，也可以用于生物芯片检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种荧光标记的寡核苷酸探针及其应用。
背景技术
核酸检测随着其在基因分型、遗传病诊断、病源微生物检测等领域的广泛应用正变得越来越重要，而基于聚合酶链式反应(PCR)的核酸扩增技术为这些应用提供了强大的工具[Chan YR，Morris A.Curr Opin Infect Dis.2007；20(2)：157-64；Malinowski DP.Expert Rev Mol Diagn.2007；7(3)：269-80.]。而且，随着实时荧光PCR技术的出现，使得核酸检测不再依赖扩增后的凝胶电泳检测，而变得更加方便和实用[Parashar D.et al.Indian J Med Res.2006；124(4)：385-98；Valasek MA，Repa JJ.AdvPhysiol Educ.2005；29(3)：151-9.]。上个世纪90年代美国Perkin Elmer(PE)公司开发出了Taqman荧光探针技术(WO96/15270)，极大地拓展了荧光定量PCR的应用范围。其工作原理是荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)：一对合适的荧光物质可以构成一个能量供体(donor)和能量受体(acceptor)对，其中供体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠，当它们在空间上相互接近到一定距离(1～10nm)时，激发供体而产生的荧光能量正好被附近的受体吸收，使得供体发射的荧光强度衰减，受体荧光分子的荧光强度增强。能量传递的效率与供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等有关系。
TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，淬灭基团在3’末端。当探针完好时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。当探针与靶序列配对时，由于DNA聚合酶具有5’外切酶活性，随着延伸反应的进行探针被聚合酶分解，使得荧光基团与淬灭基团分离，荧光基团发射荧光。体系中有一分子的PCR产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，扩增产物也不断增加，释放出来的荧光基团就不断积累。通过对荧光信号的检测，就可以达到对PCR扩增产物进行实时定量检测的目的。
为了保证检测的灵敏度和特异性，在采用TaqMan探针的PCR体系中一般采用基因序列特异性引物进行目的基因扩增，同时加入序列特异性的TaqMan探针对靶序列进行检测。在反应初始阶段TaqMan探针结构完整，此时系统激发探针上的供体产生的荧光信号被临近的淬灭基团所吸收，因而检测不到荧光信号，随着PCR扩增的进行当有目的基因片段产生时，TaqMan探针就会与模版进行配对杂交，当TaqDNA聚合酶扩增到模版上探针结合的位置时，其5’-3’核酸外切酶的活性(也就是切口平移)切割掉探针5’端的报告基团使其游离到反应体系中去，游离的报告基团由于远离淬灭基团，打破了供体和受体之间能量共振平衡，此时激发报告基团产生的荧光信号就可以被荧光检测系统检测到。这样每扩增一个目的基因分子，就产生一个对应的游离荧光分子，而且荧光分子的累积是与PCR产物的生成等比例的，这样通过对荧光信号的检测就可以达到实时监控PCR产物扩增的过程。当PCR产物的产生进入快速的指数增长阶段时，荧光信号的强度也呈指数增强。由于荧光信号和PCR产物的量保持严格的比例关系，从而就可以通过作标准曲线达到准确定量PCR的起始模版拷贝数的目的。
为了保证在PCR扩增过程中，TaqMan探针与模版的结合效率，一般所设计的探针的Tm值(解链温度)必须比扩增引物的Tm值要高(一般高5～10℃)，而引物的长度一般在18～25个碱基，所以TaqMan探针的长度一般为20～40个碱基，其中多为20～30个碱基。而Perkin-Elmer公司于1995年申请的Taqman探针专利(WO96/15270)中认为探针的长度应该在15～60碱基之间。但在实际使用过程中，当探针较长时使得探针两端的荧光供体和受体基团距离较远，导致荧光淬灭效率降低，而且淬灭基团本身有的也会产生荧光信号，这都会使得反应的本底偏高，降低检测的灵敏度。而如果为了增加淬灭效果缩短探针的长度，则会由于探针的Tm值太低影响与模版的结合，从而降低检测的效率。
因而，需要设计一种探针，在保证探针具有合适长度的前提下，有效缩短荧光基团和淬灭基团之间的距离，以提高淬灭的效果，同时为了获得更好的荧光信号强度，可以考虑增加探针上标记的荧光报告基团的数量。
发明内容
本发明的目的是提供一种淬灭效果较好的荧光标记的寡核苷酸探针。
本发明所提供的荧光标记的寡核苷酸探针，是一段标记了一个或两个荧光报告基团，和一个可以淬灭所述荧光报告基团所发出的荧光的荧光淬灭基团的由15～60个核苷酸组成的寡核苷酸序列；所述荧光淬灭基团位于所述寡核苷酸序列的中部，所述荧光报告基团位于所述寡核苷酸序列的端部。
探针优选为20～30个核苷酸组成的寡核苷酸序列，且所述荧光报告基团与荧光淬灭基团之间的距离在1～20个核苷酸之间为宜。
当所述探针上的荧光报告基团标记为一个时，标记在探针的5’末端，当所述探针上的荧光报告基团标记为两个时，标记在探针的5’末端和3’末端；荧光淬灭基团标记在除了5’末端和3’末端以外的任一个核苷酸上。
探针上的荧光报告基团和荧光淬灭基团的选择范围是非常广泛的，例如荧光报告基团可以为FAM、TET、VIC、JOE或HEX，荧光淬灭基团可以为TAMRA、ECLIPSE、DABCYL、BHQ-1或BHQ-2。
本发明探针的应用领域非常广泛，凡是用到探针的领域均可适用，例如可以应用于实时荧光PCR反应和生物芯片检测。
本发明一改传统Taqman探针中把荧光报告基团和荧光淬灭基团分别放在探针两端的设计方法，把荧光淬灭基团设计在探针的中部，同时在荧光淬灭基团两端各修饰一个荧光报告基团。这样既缩短了荧光报告基团和荧光淬灭基团之间的距离，提高了淬灭的效果，又保证了探针的长度。同时，由于传统Taqman探针一分子探针被水解只释放一分子荧光，而本发明的探针一分子探针被水解时可以释放两分子荧光，可以增强荧光信号强度，提高检测的灵敏度。
附图说明
图1为本发明的探针P2与传统Taqman探针的对比实验结果。
图2为本发明的探针P1与传统Taqman探针的对比实验结果。
具体实施方式
为了验证本发明的可行性，针对临床上非常重要的结核分枝杆菌的检测采用了本发明的探针(P2、P1)与Taqman传统探针的对比实验。
以下实施例不具有限制性。
实施例1、
1、引物、探针的设计及合成
以结核分枝杆菌特有的基因序列IS6110为检测靶标，设计引物和探针。
引物序列：
Forward primer：5’-AAGCCCGCAGGACCACGATC-3’
Reverse primer：5’-ACACATAGGTGAGGTCTGCTACCC-3’
探针序列：5’-CCACAGCCCGTCCCGCCGATCTCG-3’
普通Taqman探针：FAM-5’-CCACAGCCCGTCCCGCCGATCTCG-3’-ECLIPSE
本发明的探针P2：荧光淬灭基团标在距离5’末端第10个碱基上，两端均标记荧光报告基团。
P2：FAM-5’-CCACAGCCCG(ECLIPSE)TCCCGCCGATCTCG-3’-FAM
以上引物和探针由Takara公司合成。
2、反应体系
2x buffer 10μl
Forward primer(10μM) 0.4μl
Reverse primer(10μM) 0.4μl
Probe(10μM) 0.8μl
Taq polymerase 0.3μl
template(1ng/μl) 1μl
Total 20μl
上述反应体系中，除加入的探针(传统探针和本发明的探针)不同外，其余均相同。
3、反应条件
| 95℃ | 3min | |
| 95℃ | 15sec | 40circles |
| 58℃ | 30sec | |
| 50℃ | 30sec |
4、本发明的探针与传统探针的对比实验结果
对本发明的探针与传统探针的检测效果进行对比(表1)。实验结果表明，采用本发明的探针在信号强度上明显优于传统探针，提高了检测的灵敏度。
表1本发明的探针P2与传统探针的对比实验结果
| 探针 | Ct值 |
| P2 | 13.21 |
| 13.21 | |
| 传统探针 | 13.24 |
| 13.29 |
实施例2、
1、引物、探针的设计及合成
以结核分枝杆菌特有的基因序列IS6110为检测靶标，设计引物和探针。
引物序列：
Forward primer：5’-AAGCCCGCAGGACCACGATC-3’
Reverse primer：5’-ACACATAGGTGAGGTCTGCTACCC-3’
探针序列：5’-CCACAGCCCGTCCCGCCGATCTCG-3’
普通Taqman探针：FAM-5’-CCACAGCCCGTCCCGCCGATCTCG-3’-ECLIPSE
本发明的探针P1：荧光淬灭基团标在距离5’末端第10个碱基上，5’端标记荧光报告基团。
P1：FAM-5’-CCACAGCCCG(ECLIPSE)TCCCGCCGATCTCG-3’
2、反应体系
2x buffer 10μl
Forward primer(10μM) 0.4μl
Reverse primer(10μM) 0.4μl
Probe(10μM) 0.8μl
Taq polymerase 0.3μl
template(1ng/μl) 1μl
Total 20μl
上述反应体系中，除加入的探针(传统探针和本发明的探针)不同外，其余均相同。
3、反应条件
| 95℃ | 3min | |
| 95℃ | 15sec | 40circles |
| 58℃ | 30sec | |
| 50℃ | 30sec |
4、本发明的探针与传统探针的对比实验结果
对本发明的探针与传统探针的检测效果进行对比(表2)。实验结果表明，采用本发明的探针在信号强度上明显优于传统探针，提高了检测的灵敏度。
表2本发明的探针P1与传统探针的对比实验结果
| 探针 | Ct值 |
| P1 | 12.87 |
| 12.86 | |
| 传统探针 | 13.24 |
| 13.29 |
序列表
<160>1
<210>1
<211>1165
<212>DNA
<213>结核分枝杆菌(M.tuberculosis)
<220>
<223>
<400>1
ggacagcatc acgcgttggg agctctccca tatggtcgac ctgcaggcgg ccgcgaattc 60
actagtgatt gccagcacgc taattaacgg ttcatcgccg atcatcaggg ccaccgcgag 120
ggccccgatg gtttgcggtg gggtgtcgag tcgatctgca cacagctgac cgagctgggt 180
gtgccgatcg ccccatcgac ctactacgac cacatcaacc gggagcccag ccgccgcgag 240
ctgcgcgatg gcgaactcaa ggagcacatc agccgcgtcc acgccgccaa ctacggtgtt 300
tacggtgccc gcaaagtgtg gctaaccctg aaccgtgagg gcatcgaggt ggccagatgc 360
accgtcgaac ggctgatgac caaactcggc ctgtccggga ccacccgcga caaagcccgc 420
aggaccacga tcgctgatcc ggccacagcc cgtcccgccg atctcgtcca gcgccgcttc 480
ggaccaccag cacctaaccg gctgtgggta gcagacctca cctatgtgtc gacctgggca 540
gggttcgcct acgtggcctt tgtcaccgac gcctacgctc gcaggatcct gggctggcgg 600
gtcgcttcca cgatggccac ctccatggtc caatcgaatt cccgcggccg ccatggcggc 660
cgggagcatg cgacgtcggg cccaattcgc cctatagtga gtcgtattac aattcactgg 720
ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg 780
cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt 840
cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat ggacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc 900
gcgtttgtgt gtttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc 960
ctttcgcttt cttcccttct ttctcgcacg ttcgccggct ttccccgtca gctctaatcg 1020
gggctcccgt taagggtcga ttaatgcttt acggcaccct cgaccaaaac tgaataaggg 1080
tgatggtcac ggtatggcat cgctgatgac ggttacgccc atgactgatc agtcttgaag 1140
tgaactctgt atcgaaactg gcaac 1165
Claims (10)
1.一种寡核苷酸探针，是一段标记了一个或两个荧光报告基团，和一个可以淬灭所述荧光报告基团所发出的荧光的荧光淬灭基团的由15～60个核苷酸组成的寡核苷酸序列；所述荧光淬灭基团位于所述寡核苷酸序列的中部，所述荧光报告基团位于所述寡核苷酸序列的端部。
2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于：所述荧光报告基团为两个，分别位于所述寡核苷酸序列的两端。
3.根据权利要求1所述的探针，其特征在于：所述荧光报告基团为一个，其位于探针的5’末端。
4.根据权利要求1或2或3所述的探针，其特征在于：所述荧光报告基团与荧光淬灭基团之间的距离在1～20个核苷酸之间。
5.根据权利要求1、2或3所述的探针，其特征在于：所述荧光淬灭基团标记在除了5’末端和3’末端以外的任一个核苷酸上。
6.根据权利要求1、2或3所述的探针，其特征在于：所述探针是由15～40个核苷酸组成的寡核苷酸序列。
7.根据权利要求1、2或3所述的探针，其特征在于：所述荧光报告基团为FAM、TET、VIC、JOE或HEX。
8.根据权利要求1、2或3所述的探针，其特征在于：所述荧光淬灭基团为TAMRA、ECLIPSE、DABCYL、BHQ-1或BHQ-2。
9.权利要求1、2或3所述的探针在实时荧光PCR反应中的应用。
10.权利要求1、2或3所述的探针在生物芯片检测中的应用。
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