CN106589005A - 一种荧光信号放大探针中间体、荧光探针及其制备方法 - Google Patents

一种荧光信号放大探针中间体、荧光探针及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种荧光信号放大探针中间体及由该荧光探针中间体制备而成的荧光探针，本发明通过在两个荧光基团之间加入了连接链，可以使两个荧光基团之间的间臂距离达到最佳，使得整个荧光探针中间体制备的荧光探针的信号放大倍数显著提高；并且本发明选择的连接链更有利于信号的传递。

Description

一种荧光信号放大探针中间体、荧光探针及其制备方法
技术领域
本发明属于包含核酸的组合物及该组合物的制备方法领域，特别涉及基因研究、诊断领域，具体是一种荧光信号放大探针中间体、荧光探针及其制备方法，具有信号强度大、检测灵敏度高等优点，可用于各种PCR技术、核酸分子杂交、STR等荧光基团修饰引物。
背景技术
将分子生物学技术应用到临床诊断学，使疾病诊断深入到基因水平，称为基因诊断。用于基因诊断的技术分为两大类，即杂交法和PCR法，具体的基因诊断技术主要有核酸分子杂交技术、聚合酶链式反应技术、基因多态性分析技术、单链构象多态性分析技术、荧光原位杂交染色体分析技术、波谱核型分析技术、DNA测序技术、基因芯片技术以及蛋白质组技术，一些先进的分离和检测技术大大促进了上述技术的完善和发展。其中的检测技术大多数依靠荧光标记手段，而荧光基团的信号强度直接影响检测的灵敏度。目前公认比较好的信号放大系统是美国Chiron公司的研究人员Horn、Urdea和Hendri cks等的“分枝链DNA信号放大探针”，通过探针的梳齿状或树枝状分子结构，实现信号的层层放大，该技术的缺陷在于探针的制备方式难度大而且繁琐。本发明的目的是通过提供一种荧光信号放大探针中间体、荧光探针及其的制备方法，利用该中间体直接使荧光基团自身信号放大，从而简化探针的制备过程，同时提高探针的信号强度。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种荧光信号放大探针中间体、荧光探针及其制备方法，该荧光探针的信号发射强度与现有技术相比显著提高。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供一种荧光信号放大探针中间体，该荧光信号放大探针中间体的结构如下：
其中，
R1为第一荧光基团，R2为第二荧光基团，
Base为
L1为(CH2)n或(CH2)b[O(CH2)c]d，L2为(CH2)h或(CH2)x[O(CH2)y]z
L3为(CH2)m、(CH2)e[O(CH2)f]g、NH(CH2)m、NH(CH2)e[O(CH2)f]g、NHCO(CH2)m、NHCO(CH2)e[O(CH2)f]g、或(CH2)e[O(CH2)f]g，
R’和R”为C1-C4烷基，Q为O或NH，
n＝1-18，h＝1-18，m＝1-10，a＝1-4，b＝1-4，c＝1-4，d＝1-10，x＝1-4，y＝1-4，z＝1-10，e＝1-4，f＝1-4，g＝1-10。
进一步的改进，所述Base为
进一步的改进，L3为
进一步的改进，R1为FAM、HEX、TET、JOE、VIC、CY3、CY5、NED、TAMRA、JOE或ROX等可以发出荧光且带有羧基的荧光基团，优选为FAM。
进一步的改进，R2为TET、VIC、HEX、CY3、NED、TAMRA、JOE、ROX、CY5等带有羧基的荧光基团，优选地，R2为TAMRA或ROX。
进一步的改进，R1为FAM的时候，R2可以是TET、VIC、HEX、CY3、NED、TAMRA、JOE、ROX、CY5；R1为TET的时候，R2可以是VIC、HEX、CY3、NED、TAMRA、JOE、ROX、CY5；R1为VIC、HEX的时候，R2可以是CY3、NED、TAMRA、JOE、ROX、CY5；R1为CY3、NED、TAMRA、JOE的时候，R2可以是ROX、CY5；R1为ROX的时候，R2可以是CY5。
进一步的改进，n＝3-10，优选地，n＝6；优选地，h＝3-10，优选地，h＝6；优选地，a＝2，优选地，b＝2，优选地，c＝2，优选地，d＝2-5，优选地，x＝2，优选地，y＝2，优选地，z＝2-5，优选地，e＝2，优选地，f＝2，优选地，g＝2-5，优选地，m＝5-8，优选地，m＝6，优选地，R’和R”均为异丙基，优选地，Q为NH。
由本发明提供的荧光信号放大探针中间体与核苷酸序列反应制备的荧光探针的信号发射强度显著提高。
本发明提供一种荧光探针，该荧光探针的结构如下：
其中，
R1为第一荧光基团，R2为第二荧光基团，R3为核苷酸，
Base为
L1为(CH2)n或(CH2)b[O(CH2)c]d，L2为(CH2)h或(CH2)x[O(CH2)y]z，
L3为(CH2)m、(CH2)e[O(CH2)f]g、NH(CH2)m、NH(CH2)e[O(CH2)f]g、NHCO(CH2)m、NHCO(CH2)e[O(CH2)f]g、或(CH2)e[O(CH2)f]g，
Q为O或NH，
n＝1-18，h＝1-18，m＝1-10，b＝1-4，c＝1-4，d＝1-10，x＝1-4，y＝1-4，z＝1-10，e＝1-4，f＝1-4，g＝1-10。
进一步的改进，所述Base为优选地，R1为FAM；优选地，R2为TAMRA或ROX；优选地，n＝5-10，优选地，n＝6；优选地，h＝5-10，优选地，h＝6；优选地，b＝2，优选地，c＝2，优选地，d＝2-5，优选地，x＝2，优选地，y＝2，优选地，z＝2-5，优选地，e＝2，优选地，f＝2，优选地，g＝2-5，优选地，m＝5-8，优选地，m＝6，优选地，Q为NH。
进一步的改进，R3为寡聚核苷酸。
进一步的改进，R3为AGCTGCAGGGCATAACATTATC(如SEQ IDNo.1所示)、(GATC)w、Aggctgcagggcataacattatc(如SEQ ID No.2所示)，其中w＝1-5。
本发明提供的荧光信号放大探针中间体优选下列结构的化合物：
本发明另一方面提供一种荧光信号放大探针中间体的制备方法，该方法包括如下步骤：
S1：将式一化合物脱除保护基后，在活化剂催化下与第二荧光基团反应，制得式二化合物；
S2：将式二化合物脱除DMT保护基后，在催化剂作用下，与spacer1反应，氧化，制得式三化合物；
S3：将第一荧光基团在活化剂催化下与spacer2反应制得，制得式四化合物；
S4：将式三化合物脱除DMT保护基，在催化剂作用下与式四化合物反应，氧化，制得式五化合物；
S5：将式五化合物在催化剂的作用下与磷试剂反应，制得荧光信号放大探针中间体；
本发明另一方面还提供一种荧光探针制备方法，该制备方法包括如下步骤：
S6：将荧光信号放大探针中间体加入到含核苷酸序列的合成柱上，反应制得荧光探针；
本发明另一方面还提供一种荧光探针制备方法，该制备方法包括如下步骤：
S11：将式Ⅰ化合物加入到含核苷酸序列的合成柱上，反应制得式Ⅱ化合物；
S12：将式Ⅱ化合物脱除DMT保护基后，在催化剂作用下与spacer1反应，氧化，制得式Ⅲ化合物；
S13：将式Ⅲ化合物脱除DMT保护剂后，在催化剂作用下与式四化合物反应，氧化，制得式Ⅴ化合物；
S14：将式Ⅴ化合物从固相载体上氨解下来，沉淀，干燥，并将干燥的式Ⅴ化合物溶于水中，制得水溶液；
S15：将第二荧光基团溶解于水中，加入活化剂，活化，制得混合物，然后将混合物加入步骤S14制得的水溶解中，超声反应，制得荧光探针；
本发明以上制备方法中提到的保护基优选为三氟乙酰基。
本发明提供的以上制备方法中各步骤反应条件如下：
S1和S3步骤中脱除保护基用的试剂优选为哌啶，反应条件为：活化剂优选为：DSC，50℃，反应两小时。
S2、S4、S12和S13步骤中脱除DMT保护基优选为三氯乙酸；反应条件为：催化剂优选为：四唑催化剂；氧化反应的条件为：加入碘液，氧化60s。
S5步骤中催化剂为四唑催化剂。
S6和S11步骤中是在合成柱上完成的，环境温度20-35℃，湿度35-65％。
S14步骤具体条件为用氨水将式Ⅴ化合物从固相载体上氨解下来，干燥，然后将干燥的DNA序列用水溶解备用。
S15步骤活化剂为EDCI和HOBT，反应条件为50-70℃超声10-20s。
本发明另一方面还提供了核苷酸序列的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
S21：将5’-DMT-核苷酸加入合成柱内，与固相载体连接，向合成柱内加入三氯乙酸，抽干，脱去DMT保护基，获得5’-游离-核苷酸；
S22：将另一5’-DMT-核苷酸与活化剂ACT-1混合后，进入合成柱，反应4-60s，抽干，形成亚磷酰胺四唑活性中间体，将该亚磷酰胺四唑活性中间体与步骤S21制得的5’-游离-核苷酸发生缩合反应；
S23：向合成柱内加入Cap A液以及Cap B，反应后，抽干；
S24：加入碘液，氧化，抽干；
S25：重复步骤S21-S24，制得核苷酸序列。
本发明的有益效果如下：
本发明提供的荧光探针通过在两个荧光基团之间加入了连接链，可以使两个荧光基团之间的间臂距离达到最佳，使得整个荧光信号放大，探针中间体制备的荧光探针的信号放大倍数显著提高。并且本发明选择的连接链更有利于信号的传递。
具体实施方式
实施例
本发明提供的荧光探结构如下所示：
实施例34
以实施例1为例介绍荧光探针的合成方法：该方法包括如下步骤：S1：将式1化合物脱除三氟乙酰基后，在活化剂催化下与第二荧光基团反应，制得式2化合物；
S2：将式2化合物脱除DMT保护基后，在催化剂作用下，与spacer1反应，氧化，制得式3化合物；
S3：将第一荧光基团在活化剂催化下与spacer2反应制得式4化合物；
S4：将式3化合物脱除DMT保护基，在催化剂作用下与式4化合物反应，氧化，制得式5化合物；
S5：将式5化合物在催化剂的作用下与磷试剂反应，制得式6化合物；
S6：将式6化合物加入到含核苷酸序列的合成柱上，反应制得荧光探针；
信号强度增强效果比较
选择本发明实施例1-33的荧光探针作为实验1-33组，选择现有结构ROX-AGCTGCAGGGCATAACATTATC和TAMRA–AGCTGCAGGGCATAACATTATC作为对照1-2组，检测其信号强度，结果见表1。
表1各组的信号强度结果
从上表中可以看出，本发明提供的荧光探针与现有技术相比，信号发射强度显著提高。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京梓熙生物科技有限公司
<120> 一种荧光信号放大探针中间体、荧光探针及其制备方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agctgcaggg cataacatta tc 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aggctgcagg gcataacatt atc 23

Claims (10)

1.一种荧光信号放大探针中间体，其特征在于，所述荧光信号放大探针中间体的结构如下：
其中，
R1为第一荧光基团，R2为第二荧光基团，
Base为
L1为(CH2)n或(CH2)b[O(CH2)c]d，L2为(CH2)h或(CH2)x[O(CH2)y]zL3为(CH2)m、(CH2)e[O(CH2)f]g、NH(CH2)m、NH(CH2)e[O(CH2)f]g、NHCO(CH2)m、NHCO(CH2)e[O(CH2)f]g、
R’和R”为C1-C4烷基，Q为O或NH，
n＝1-18，h＝1-18，m＝1-10，a＝1-4，b＝1-4，c＝1-4，d＝1-10，x＝1-4，y＝1-4，z＝1-10，e＝1-4，f＝1-4，g＝1-10。
2.如权利要求1所述的荧光信号放大探针中间体，其特征在于，所述Base为
3.如权利要求1所述的荧光信号放大探针中间体，其特征在于，L3为
4.如权利要求1所述的荧光信号放大探针中间体，其特征在于，R1为FAM；优选地，R2为TAMRA或ROX。
5.如权利要求1所述的荧光信号放大探针中间体，其特征在于，n＝3-10，优选地，n＝6；优选地，h＝3-10，优选地，h＝6；优选地，a＝2，优选地，b＝2，优选地，c＝2，优选地，d＝2-5，优选地，x＝2，优选地，y＝2，优选地，z＝2-5，优选地，e＝2，优选地，f＝2，优选地，g＝2-5，优选地，m＝5-8，优选地，m＝6，优选地，R’和R”均为异丙基，优选地，Q为NH。
6.一种荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的结构如下：
其中，
R1为第一荧光基团，R2为第二荧光基团，R3为核苷酸，
Base为
L1为(CH2)n或(CH2)b[O(CH2)c]d，L2为(CH2)h或(CH2)x[O(CH2)y]z，L3为(CH2)m、(CH2)e[O(CH2)f]g、NH(CH2)m、NH(CH2)e[O(CH2)f]g、NHCO(CH2)m、NHCO(CH2)e[O(CH2)f]g、
Q为O或NH，
n＝1-18，h＝1-18，m＝1-10，b＝1-4，c＝1-4，d＝1-10，x＝1-4，y＝1-4，z＝1-10，e＝1-4，f＝1-4，g＝1-10。
7.如权利要求6所述的荧光信号放大探针中间体，其特征在于，所述Base为优选地，R1为FAM；优选地，R2为TAMRA或ROX；优选地，n＝5-10，优选地，n＝6；优选地，h＝5-10，优选地，h＝6；优选地，b＝2，优选地，c＝2，优选地，d＝2-5，优选地，x＝2，优选地，y＝2，优选地，z＝2-5，优选地，e＝2，优选地，f＝2，优选地，g＝2-5，优选地，m＝5-8，优选地，m＝6，优选地，Q为NH。
8.如权利要求6所述的荧光探针，其特征在于，所述R3为寡聚核苷酸。
9.一种权利要求1所述荧光信号放大探针中间体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
S1：将式一化合物脱除保护基后，在活化剂催化下与第二荧光基团反应，制得式二化合物；
S2：将式二化合物脱除DMT保护基后，在催化剂作用下，与spacer1反应，氧化，制得式三化合物；
S3：将第一荧光基团在活化剂催化下与spacer2反应制得，制得式四化合物；
S4：将式三化合物脱除DMT保护基，在催化剂作用下与式四化合物反应，氧化，制得式五化合物；
S5：将式五化合物在催化剂的作用下与磷试剂反应，制得荧光信号放大探针中间体；
10.一种权利要求6所述荧光探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
S6：将荧光信号放大探针中间体加入到含核苷酸序列的合成柱上，反应制得荧光探针；
或所述制备方法包括如下步骤：
S11：将式Ⅰ化合物加入到含核苷酸序列的合成柱上，反应制得式Ⅱ化合物；
S12：将式Ⅱ化合物脱除DMT保护基后，在催化剂作用下与spacer1反应，氧化，制得式Ⅲ化合物；
S13：将式Ⅲ化合物脱除DMT保护剂后，在催化剂作用下与式四化合物反应，氧化，制得式Ⅴ化合物；
S14：将式Ⅴ化合物从固相载体上氨解下来，沉淀，干燥，并将干燥的式Ⅴ化合物溶于水中，制得水溶液；
S15：将第二荧光基团溶解于水中，加入活化剂，活化，制得混合物，然后将混合物加入步骤S14制得的水溶解中，超声反应，制得荧光探针；
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