CN101487046A - 一种dna荧光探针及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种DNA荧光探针及其制备方法。该探针的特征在于它采用半导体发光纳米粒子CdTe/CdS/ZnS做发射荧光的能量给体，金纳米粒子做吸收荧光的能量受体，所述CdTe/CdS/ZnS纳米粒子与单链NH2－DNA相连接，构成CdTe/CdS/ZnS－DNA；所述金纳米粒子与单链SH－DNA相连接，构成Au－DNA；所述单链SH－DNA与NH2－DNA互补，使所述CdTe/CdS/ZnS－DNA与Au－DNA杂交制成。该制备方法首先制备半导体发光纳米粒子CdTe/CdS/ZnS及CdTe/CdS/ZnS－DNA；其次制备金纳米粒子及Au－DNA纳米粒子；最后连接所述CdTe/CdS/ZnS－DNA(能量给体)和Au－DNA(能量受体)，制得DNA荧光探针。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术，具体为一种基于荧光共振能量转移原理的DNA荧光探针及其制备方法，该DNA探针可用于液体环境中检测某些具有特征DNA序列的小分子生命物质。
背景技术
近些年分子生物学迅猛发展，新技术不断出现，应用也日益广泛，特别是快速简便准确地检测基因序列在医学临床检验学、免疫学、生物学等研究领域中的潜在应用前景已引起国际科学界的广泛关注。对于具有特定DNA序列的生命物质的检测，传统的方法主要是采用放射性标记和聚合酶链式反应(PCR)。由于其技术复杂，设备昂贵，使DNA检测技术的广泛应用受到极大的限制。除了PCR技术在不断改进外，一些新的检测方法和技术也不断地被开发，例如生物传感技术。目前DNA生物传感器是依据DNA杂交原理，利用每种生物所具有的保守DNA链段的特点，通过人工设计并合成一段与其互补的DNA探针进行检测。根据其检测方法不同DNA生物传感器可分为光学DNA生物传感器，压电晶体DNA生物传感器和电化学DNA生物传感器等类型。其中光学DNA生物传感器具有非破坏性的操作优势、较高的信号产生与读取速度，使其应用领域得到了极大地扩展，成为应用最为普遍的生物传感器，具有广阔的应用和发展前景。
光学DNA(生物)传感器主要有荧光光纤DNA传感器、荧光探针DNA传感器、表面增强拉曼DNA传感器和表面等离子共振DNA传感器等。
基于荧光标记的检测体系近年来在DNA芯片的应用已经获得认可。许多检测方法都可以采用荧光进行，而这些检测方法主要依赖于DNA有机荧光分子标记的供—受体对之间的能量转移。
荧光共振能量转移(FRET)分析法由于其采用的仪器简单、灵敏度高，所需样品量少，分析速度快等优点，与色谱分离手段相结合，己成为一种有效的痕量及超痕量分析技术。由于FRET对距离具有敏感性，能量转移荧光分析非常适合于对环境、生物医学科学和临床化学等方面复杂、低含量组分的分析，而且可以对无标记的目标DNA序列进行检测。因此，基于这种原理的分析方法已被广泛地用于生物大分子结构、性质、反应机理以及定量分析等方面的研究，是基因工程中的一种新手段。
目前荧光共振能量转移方法中大多采用有机染料作为能量的供-受体对，因为有机荧光分子对生物有很好的相容性，例如帕克，布劳德和尤瑟卡斯等研究者先后对有机染料为能量供-受体对进行了研究，其研究结果分别发表在《临床微生物学》(Park et al.Clin.Microbio.，2000，2829-2836)，《生物技术动向》(Brude et al.Trends in Biotechnol.，2002，20，249-256)，《分析化学》(Ysourkas et al.Anal.Chem.，2003，75，3697-3703)等权威刊物上。但采用这种供—受体对仍存在以下不足：1.它们的激发光谱都较窄，很难同时激发多种组分；2.有机染料的有机荧光分子光谱较宽，分布不对称，给区分不同探针分子的有机荧光分子来源带来困难，无法同时检测多种组分；3.需要特定的波长激发才能发出荧光，若同时检测多种疾病，就需要用不同波长的光激发。这样就会造成检测体系中的能量过多，不利于检测；同时不同波长激发之间的重叠也会使各个能量给体和受体之间的能量转移变得不明显，增加数据分析的复杂性；4.有机染料最严重的缺陷是光化学稳定性差，光漂白与光解作用会使每个染料探针能够发出的荧光光子平均数量较少，光解产物又往往会对生物体产生杀伤作用。
无机纳米粒子由于其独特的物理化学性能，已经成为在生物分子的检测和标记方面的研究热点。量子点发射光谱呈对称分布且宽度窄，颜色可调(不同大小的纳米晶体能被单一波长的光激发而发出不同颜色的光)，并具有较高的量子效率(quantum yields；又称量子产率)和良好的化学、光学稳定性，其荧光寿命是普通有机染料分子的100倍以上，作为能量给体已广泛应用于荧光共振能量转移研究中。
纳米级别的金粒子可与氨基发生非共价的静电吸附而牢固结合，与巯基之间形成很强的Au-S共价键，这使得胶态金可与生物活性分子结合，形成的探针可用于生物体系的检测中，且其高的消光系数、宽的吸收光谱，对染料分子有有效的荧光淬灭，使其在分子生物学领域的应用成为研究热点。
目前，国内外已有关于使用量子点作为荧光检测和荧光标记以及微生物传感器研究方面的报道，例如瓦格尼尔等研究者分别对其进行了研究，表征，其研究结果发表在《纳米通讯》杂志上(Wargnier et al，Nano Lett.，2004，78，451-457)。但是，采用有机荧光分子作为探针的能量供-受体对也会使探针存在上述的诸多缺点。金等研究者发现使用单层巯基乙酸包覆的核壳型CdSe/ZnS半导体发光纳米粒子(即核-壳型量子点)为能量给体，使用有机物DABCYL作为能量受体(即淬灭剂)时，其体系的发射光谱和吸收光谱有近90％的重叠，并成功地构建了共振能量体系，这个结果发表在《传感器与传动器》杂志上(Kim et al，Sensors and Actuators B，2004，102，315-319)。和有机染料相比，其荧光寿命有了较大提高。不足之处在于使用CdSe/ZnS为能量给体，DABCYL作为淬灭剂，所得到的有效信号较低，和背景信号(噪声信号)相比，其能量转移效率有待进一步提高。凯迪等研究者在《分子和细胞探测器》在纸上发表了其研究成果(Cady et al，Mol.Cell.Probe.，2007，21，116-124)，其采用Iowa Black为能量受体(淬灭剂)，以单层巯基乙酸包覆的核壳型CdSe/ZnS半导体纳米粒子为发光粒子，对能量给体和受体的连接以及淬灭机制进行了优化和讨论。在对比实验中发现，不同的能量供—受体体系与目标DNA杂交后，荧光强度是不同的，顺序为量子点-Iowa Black>量子点-Au>量子点-DABCYL，这表明量子点-Au体系中量子点的发光效率有待于进一步改善。另外，由于实验所采用的量子点最大激发波长在490nm附近，金纳米粒子最大吸收波长在525nm附近，导致其吸收和发射光谱的重叠率很低，造成淬灭效率低，使背景信号过高等缺陷。这些能量给体基于量子点的报道，由于能量供-受体本身问题以及供-受体对设计存在缺陷，造成其量子效率普遍较低，传感体系灵敏度不高。所以，上述能量供—受体体系及探针还有待改进。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷，本发明要解决的技术问题是，设计一种DNA荧光探针及其制备方法，该探针具有检测限低、测量灵敏度高和对被检测DNA特异性好等特点，可以简便、快速地检测某一特定序列的DNA。该制备方法省略了CdTe晶体的形成过程，使制备工艺简化；利用该方法制备得到的CdTe/CdS/ZnS能够发出特定(如红色)荧光，并且该特定(如红色)荧光的CdTe/CdS/ZnS的量子效率较高。
本发明解决所述探针技术问题的技术方案是：设计一种DNA荧光探针，其特征在于该探针采用半导体发光纳米粒子CdTe/CdS/ZnS做发射荧光的能量给体，金纳米粒子做吸收荧光的能量受体，所述CdTe/CdS/ZnS纳米粒子与单链NH2-DNA相连接，构成CdTe/CdS/ZnS-DNA；所述金纳米粒子与单链SH-DNA相连接，构成Au-DNA；并且所述单链SH-DNA与NH2-DNA互补，使所述CdTe/CdS/ZnS-DNA与Au-DNA杂交制成。
本发明解决所述制备方法技术问题的技术方案是：设计一种本发明所述DNA荧光探针的制备方法，该制备方法采用以下工艺：
首先，制备CdTe/CdS/ZnS-DNA溶液；具体方法为：
(1)制备半导体发光纳米粒子CdTe/CdS/ZnS原液，其包括：制备NaHTe，将Te粉和NaBH4置于比色管中，并在20-100℃下反应，得备用溶液A；制备pH5-12并且含有巯基的有机酸和氯化镉混合溶液，剧烈搅拌下迅速加入Na2S溶液，用N2气脱氧，得备用溶液B；制备pH6.0-9.0巯基有机酸和硫酸锌混合溶液，用N2气脱氧，得备用溶液C；制备pH6.0-9.0并且含有巯基的有机酸和氯化镉混合溶液，用N2气脱氧，得备用溶液D；在所述D溶液中迅速加入A溶液和极少量Na2S溶液并搅拌，在未形成CdTe晶之前，加入所述B溶液并搅拌，得到CdTe/CdS前驱体溶液；在前驱体溶液中加入所述C溶液，回流1-24h，得到发射红色荧光的半导体发光纳米粒子CdTe/CdS/ZnS原液；其中，所述的巯基有机酸为巯基乙酸或者巯基丙酸，所述氯化镉和硫酸锌的摩尔浓度均为：(0.25-10.0)×10-3M；所述A溶液中的NaHTe、B溶液中的Na2S、C溶液中的硫酸锌、D溶液中的氯化镉的摩尔浓度比例为(0.1-1.5):(0.01-0.5):(1.0-3.0):(0.01-0.2)；
(2)制备CdTe/CdS/ZnS-DNA溶液：将1-10ml的CdTe/CdS/ZnS原液和1OD的5’-NH2-DNA混合，加入5’-NH2-DNA量1-40倍的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚氨盐酸盐，在Tris-HCl溶液中反应0.1-72h，即得到能够发出红色荧光的CdTe/CdS/ZnS-DNA溶液；
其次，按常规方法制备Au-DNA溶液；
最后，制备DNA荧光探针；将所述CdTe/CdS/ZnS-DNA溶液与Au-DNA溶液按1:(0.1-20)的体积比混合，加入1-200ml杂交缓冲液磷酸盐溶液，在10-90℃下杂交0.5-24小时，即得到DNA荧光探针。
本发明通过DNA杂交技术，将金纳米粒子Au-DNA和半导体发光纳米粒子CdTe/CdS/ZnS-DNA连接起来，构建了荧光探针。与现有技术相比，本发明荧光探针采用半导体发光纳米粒子CdTe/CdS/ZnS作为能量给体，具有量子点所具备的较宽的光谱激发范围等优良性能，可自由地选择激发波长，有利于保证给体发射波长与受体吸收波长的良好重叠，增加共振能量的转移效率；采用金纳米粒子作为能量受体，可对CdTe/CdS/ZnS所发出的能量进行有效淬灭，并且性质稳定，不需底物反应，检测速度快，可保证生命大分子被标记而其活性基本不变，并可实现多重标记。本发明荧光探针能够得到高达80％的量子效率、nM级的灵敏度和可检测一个错配碱基特异性的精度。本发明制备方法不需要CdTe晶体的形成过程，工艺简化，效率提高，而且所得到的CdTe/CdS/ZnS性能稳定。
具体实施方式
以下结合实施例进一步详细描述本发明：
本发明设计的DNA荧光探针(简称探针)，采用半导体发光纳米粒子CdTe/CdS/ZnS做发射荧光的能量给体，金纳米粒子做吸收荧光的能量受体，所述的CdTe/CdS/ZnS纳米粒子与单链NH2-DNA相连接，构成CdTe/CdS/ZnS-DNA；所述的金纳米粒子与单链SH-DNA相连接，构成Au-DNA，并且单链SH-DNA与NH2-DNA互补，使所述CdTe/CdS/ZnS-DNA与Au-DNA杂交制成。
本发明探针所述互补的单链DNA序列根据A-T，G-C对应的原则得出。所述的DNA链段包括下述DNA编码序列：
具有沙门氏杆菌特征的DNA编码序列，例如：
5’-CTGATGCCTCCCTGCCCCACCAGTATTCGCTGATGGCCGGCAGGGAGTG CCAG-3’等
具有志贺氏杆菌特征的DNA编码序列，例如：
5’-ATGAAGAAAGGTGATGCGGCTGAACATGCAGAGCACCATATGAAAGACAACGCTGGGTTCCAGGCTGGATGTGTGCTCCACATCCACAGCAGATGC CACTGAACGCACCGATAACCTGGCTGATGCCG CCTGA-3’等；
具有鼠疫杆菌特征的DNA编码序列，例如：
5’-GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAD-3’；
5’-AGTAAGCAAGAGAGAGCCGGGGGG-3’等；
具有弓形虫特征的DNA编码序列，例如：
5’-ATGGCGGGTATCTTTCGCACGATCTATGACTGGCTCCTGAGATGTTCTG-3’；
5’-GCAGGGCGACAGAGATGGATGTCACCATGATTGGTCTCCAGAATGCAG GA AAGTCTTCGT TGTTGCGCGTGCTTGCGGTA-3’；
5’-CAGAACTCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAAAAGAGTCTCTTCTTGGAT ATCTGGAGGAACTGGCAAAAGG-3’等；
具有肝炎病毒特征的DNA编码序列，例如：
5’-ATTAGAATGAAGAATCCCTCCATTGTTGGAGTCCTGTGCAAGATTCACA AGGACTTAATCTGGGTTGTA-3’；
5’-ATAATGCATCCTCAAGTGGTCATCTTAAGCCTCATCCTACATCTGGCAG-3’等；
具有冠状病毒特征的DNA编码序列，例如：
5’-AGGTGATGACGAATTTATTGAGTAA-3’；
5’-ATGATTCAAACTCCAACATCTTTTCTAATAGTGTTAATTCTTCTTTGGTTTAAACTTGTGTTAAGTTGTTTTAAAGAGTGTGTTTTAGCGCTTCTTCAATTAATACAAGTTTTACTCCAAATTATTAATAGTAACTTACAGGCTAGACTT CTGCTTTGGC ACAGTCTAGA CTAA-3’等；
具有肺炎球菌特征的DNA编码序列，例如：
5’-ATGTGTCCTCAGAAGCTAACCATCTCCTGGTTTGCCATCGTTTTGCTGGT GTCTCCACTCATGGCCATGT GGGAGCTGGA GAAAGACG-3’；
5’-AATACTTGTACCAGTGTTTACACAAAAGATAGAACTGCTAGTGTAAAAT TCCAGCCTTAGACCTTCTGATTAAG-3’；
5’-ATTGAGATGA AGCGATATGC TGTGCCCTTA G-3’等；
具有流感病毒特征的DNA编码序列，例如：
5’-ATGAAGAAAATGAATCACAAGTCAACTGACAGTCCAAAGGCTCCACAGCTCAGAGGAGGG-3’；
5’-ATGAAACGCATTAGCACCACCATTACCACCACCATCACCATACCACAGG TAACGGTGCGGGCTGA-3’等；
或者是具有特征DNA编码序列的病毒，细菌或微生物等。
本发明同时设计了所述探针的制备方法，该制备方法采用以下工艺步骤：
首先，制备半导体发光纳米粒子CdTe/CdS/ZnS溶液；具体方法为：制备NaHTe，将Te粉和NaBH4置于比色管中，并在20—100℃下反应，得备用溶液A；制备pH5-12并且含有巯基的有机酸和氯化镉混合溶液，剧烈搅拌下迅速加入Na2S溶液，用N2气脱氧，得备用溶液B；制备pH6.0-9.0并且含有巯基的有机酸和硫酸锌混合溶液，用N2气脱氧，得备用溶液C；制备pH6.0-9.0并且含有巯基有机酸和氯化镉的混合溶液，用N2气脱氧，得备用溶液D；在所述D溶液中迅速加入A溶液和极少量Na2S溶液并搅拌，在未形成CdTe晶之前，加入所述B溶液并搅拌，得到CdTe/CdS前驱体溶液；在前驱体溶液中加入所述C溶液，回流1-24h，得到尺寸为5-40nm的发射红色荧光的半导体发光纳米粒子CdTe/CdS/ZnS；其中，所述的巯基有机酸为巯基乙酸或者巯基丙酸；所述的氯化镉和硫酸锌的摩尔浓度均为：(0.25-10.0)×10-3M；所述A溶液中的NaHTe、B溶液中的Na2S、C溶液中的硫酸锌、D溶液中的氯化镉摩尔浓度比例为(0.1-1.5):(0.01-0.5):(1.0-3.0):(0.01-0.2)。
其次，制备CdTe/CdS/ZnS-DNA溶液；将1-10ml的CdTe/CdS/ZnS原液和1OD的5’-NH2-DNA混合，加入5’-NH2-DNA量1-40倍的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚氨盐酸盐(EDC)，在Tris-HCl溶液中反应0.1-72h，即可得到能够发出红色荧光的CdTe/CdS/ZnS-DNA溶液。
再次，制备Au-DNA溶液：该制备方法本身为现有技术，不赘述(参见郭文旬等2002年发表的“两段互补DNA在金纳米粒子表面修饰实现自组装”论文；Kuo etal.Self-assembly of Gold Nanoparticles by Hybridization of TwoComplementary DNAs，Journal of Medical and Biological Engineering，22(3)：113-116)。
最后，制备DNA荧光探针；将所述CdTe/CdS/ZnS-DNA溶液与Au-DNA溶液按1:0.1-1:20的体积比进行混合，加入1-200ml杂交缓冲液磷酸盐溶液(PBS)，在10-90℃下杂交0.5-24小时，即得到所述的DNA荧光探针。
本发明制备方法通过改变所述CdTe/CdS/ZnS-DNA上所连接的单链DNA序列的长度，例如在DNA序列与CdTe/CdS/ZnS相连的一端加入1-10个碱基，即可以调节所述CdTe/CdS/ZnS纳米粒子和金纳米粒子之间的距离，从而得到不同强度的荧光；所述的碱基可以是A、T、G和C中的任意一个，或者是它们之中一个以上的任意组合。
本发明探针采用如下方法检测：用荧光分光光度计分别测试探针以及加入目标DNA后体系的荧光强度，计算量子效率及淬灭效率(计算方法为现有技术，可参考刘长松等，荧光法研究司帕沙星与白蛋白的作用，《光谱学与光谱分析》，2001，6，829-832；或者李戎等，含荧光染料织物的真实反射率及荧光量子效率，《印染》，2000，26(9)，11-15)，激发波长为300-400nm，扫描范围：480-650nm，扫描速率：0.1-10nm/s。
本发明所述氯金酸溶液的制备方法为现有技术。实施例制备氯金酸溶液的具体方法是：将10-100mg HAuCl4·4H2O溶于1-100ml的双蒸水中即得。使用时，可取0.1-10ml制备好的氯金酸溶液到水中稀释。
本发明所述PBS缓冲液的制备方法为现有技术。实施例制备PBS缓冲液的具体方法是：(1)将1-100mg的Na2HPO4·12H2O溶于100ml双蒸水中；(2)将1-100mg的NaH2PO4·12H2O溶于100ml双蒸水中；(3)取(1)溶液61ml和(2)溶液39ml混匀即得。
本发明所述Tris-HCl以及杂交缓冲溶液的制备方法为现有技术。实施例的具体方法是：将0.9—90g的Tris碱溶于750ml水中，并使用磷酸或者盐酸将其pH调节到6—9之间即得。
本发明探针的工作原理是：当CdTe/CdS/ZnS纳米粒子和金纳米粒子相互靠近，满足荧光共振能量转移条件时，CdTe/CdS/ZnS纳米粒子(能量给体)和金纳米粒子(能量受体)相接触，CdTe/CdS/ZnS纳米粒子发出的荧光被转移到金纳米粒子上，并以热能的形式散发出去，导致金纳米粒子将CdTe/CdS/ZnS纳米粒子的荧光能量吸收(或称作淬灭)，因而检测不到荧光信号。当体系中存在大量与探针上DNA序列互补的DNA序列时，探针上的两条DNA链就会分离，转而与体系中与之互补的DNA链杂交，使所述能量给体和能量受体的距离增大，能量给体发出的荧光就不能被淬灭，此时可以检测到荧光信号。依据此理，本发明探针可以根据荧光的强弱，来检测目标DNA，从而应用于基因组的突变检测以及微生物病原体基因的检测和分析。
本发明FRET体系的能量供—受体对满足了以下几个必要条件：(1)供—受体要相互比较接近(1-10nm)；(2)给体的发射光谱与受体的吸收光谱要重叠；(3)供—受体的跃迁偶极距近乎平行。
本发明探针可用来检测目标DNA，即利用本发明的探针中已知的特征DNA序列来检测目标DNA。如果目标DNA与探针中的单链DNA完全互补，则体系的荧光会增强，从而达到检测未知DNA序列的目的。具体检测方法为向探针溶液中加入目标DNA，10—90℃下反应0.5—24小时，用荧光分光光度计检测其荧光强度的变化，如果荧光强度增强，证明有目标DNA存在。
本发明未述及之处适用于现有技术。
以下是本发明的具体实施例。所述的实施例仅是用于进一步具体描述本发明，而不是限制本发明的权利要求。
实施例1
1.DNA序列
检测鼠疫特征DNA序列之一：
序列1：5′端用氨基标记的单链DNA(记作S1)，
5’-AGTAAGCAAGAGAGAGCCGGGGGG-(CH2)6-NH2-3’；
序列2：3′端用巯基修饰的单链DNA(与S1互补，记作S2)，
5’-SH-(CH2)6-CCCCGGCTCTCTCTTGCTTACT-3’；
序列3：目标DNA(与S1互补，记作S3)，
5’-CCCCCCGGCTCTCTCTTGCTTACT-3’。
2.制备方法
(1)CdTe/CdS/ZnS-S1的制备 制备CdTe/CdS/ZnS：将14mg Te粉和40mg NaBH4置于比色管中，加入双蒸水，在25℃反应，生成NaHTe(A溶液)。制备pH7.5并且含有巯基丙酸和氯化镉的双蒸水溶液，剧烈搅拌下迅速加入Na2S溶液，通入N2气20分钟(B溶液)。制备pH7.5并且含有35μl巯基丙酸和硫酸锌的混合溶液，N2气脱氧(C溶液)；制备pH7.5、并且含有50μl巯基丙酸和氯化镉的混合溶液，N2脱氧(D溶液)；在D溶液(氯化镉的摩尔浓度为0.05×10-3mol/l)中迅速加入A溶液(NaHTe的摩尔浓度为0.8×10-3mol/l)和0.1ml Na2S溶液并搅拌，在未形成CdTe晶体之前加入B溶液(Na2S的摩尔浓度为0.02×10-3mol/l)并搅拌，直接得到CdTe/CdS前驱体溶液。在前驱体溶液中加入C溶液(硫酸锌的摩尔浓度为1.50×10-3mol/l)，回流2h，得到尺寸为10nm的发红色荧光的CdTe/CdS/ZnS。
连接CdTe/CdS/ZnS与S1。将10ml CdTe/CdS/ZnS原液和1OD的S1混合，加入10ml的EDC[1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚氨盐酸盐)](EDC的使用量是S1用量的5倍)，在Tris-HCl溶液中25℃下反应24小时，即得到CdTe/CdS/ZnS-S1。
(2)Au-S2的制备 采用所述现有技术制备Au-S2。
(3)DNA荧光探针的制备 将合成的CdTe/CdS/ZnS-S1与Au-S2溶液按照r＝1:1的体积比混合，并加入20ml杂交缓冲液PBS，10℃下反应1.5小时，使DNA充分杂交，得到DNA荧光探针。
3.目标DNA检测 把1OD的目标DNA(S3)加入到10ml、T＝45℃、pH＝7.5的探针溶液中，反应1h，测得荧光强度增强，计算得量子效率为60％。
实施例2
1.DNA序列
检测肺炎球菌特征DNA序列之一：
序列1：5′端用氨基标记的单链DNA(记作S1)，
5’-ATTGAGATGAAGCGATATGCTGTGCCCTTAG-(CH2)6-NH2-3’；
序列2：3′端用巯基修饰的单链DNA(与S1互补，记作S2)，
5’-SH-(CH2)6-TTCACAGCATATCGCTTCATCTCTCAAT-3’；
序列3：目标DNA(与S1互补，记作S3)，
5’-CTAAGGGCACAGCATATCGCTTCATCTCTCAAT-3’。
2.制备方法
(1)CdTe/CdS/ZnS-S1的制备 制备CdTe/CdS/ZnS：将14mg Te粉和40mg NaBH4置于比色管中，加入双蒸水，在25℃反应，生成NaHTe(A溶液)。制备pH7.5并且含有巯基丙酸和氯化镉的双蒸水溶液，剧烈搅拌下迅速加入Na2S溶液，通入N2气20分钟(B溶液)。制备pH7.5并且含有35μl巯基丙酸和硫酸锌的混合溶液，N2气脱氧(C溶液)；制备pH7.5并且含有50μl巯基丙酸和氯化镉的混合溶液，N2脱氧(D溶液)；在D溶液(氯化镉的摩尔浓度为0.1×10-3mol/l)中迅速加入A溶液(NaHTe的摩尔浓度为1.0×10-3mol/l)和0.1ml Na2S溶液并搅拌，在未形成CdTe晶体之前加入B溶液(Na2S的摩尔浓度为0.1×10-3mol/l)并搅拌，直接得到CdTe/CdS前驱体溶液。在前驱体溶液中加入C溶液(硫酸锌的摩尔浓度为0.75×10-3mol/l)，回流2h，得到尺寸为10nm的发红色荧光的CdTe/CdS/ZnS。
连接CdTe/CdS/ZnS与S1。将10ml CdTe/CdS/ZnS原液和1OD的S1混合，加入10ml的EDC(用量是S1用量的10倍)，在Tris-HCl溶液中25℃下反应24小时，即得到CdTe/CdS/ZnS-S1。
(2)采用所述现有技术制备Au-S2。
(3)DNA荧光探针的制备 将合成的CdTe/CdS/ZnS-S1与Au-S2溶液按照r＝1:0.1的体积比混合，并加入20ml杂交缓冲液PBS，10℃下反应1.5小时，使DNA充分杂交，得到DNA荧光探针。
3.目标DNA检测 把1OD的S3加入到10ml、T＝45℃、pH＝7.5的探针溶液中反应0.5h，测得荧光强度增强，计算得量子效率为68％。
实施例3
1.DNA序列
检测冠状病毒特征DNA序列之一：
序列1：5′端用氨基标记的单链DNA(记作S1)。
5’-AGGTGATGACGAATTTATTGAGTAA-(CH2)6-NH2-3’；
序列2：3′端用巯基修饰的单链DNA(与S1互补，记作S2)，
5’-SH-(CH2)6-AATAAATTCGTCATCACCT-3’；
序列3：目标DNA(与S1互补，记作S3)，
5’-TTACTCAATAAATTCGTCATCACCT-3’。
2.制备方法
(1)CdTe/CdS/ZnS-S1的制备 制备CdTe/CdS/ZnS：将14mg Te粉和40mg NaBH4置于比色管中，加入双蒸水，在25℃反应，生成NaHTe(A溶液)。制备pH7.5并且含有巯基丙酸和氯化镉的双蒸水溶液，剧烈搅拌下迅速加入Na2S溶液，通入N2气20分钟(B溶液)。制备pH7.5、并且含有35μl巯基丙酸和硫酸锌的混合溶液，N2气脱氧(C溶液)；制备pH7.5并且含有50μl巯基丙酸和氯化镉的混合溶液，N2脱氧(D溶液)；在D溶液(氯化镉的摩尔浓度为0.2×10-3mol/l)中迅速加入A溶液(NaHTe的摩尔浓度为1.5×10-3mol/l)和0.1ml Na2S溶液并搅拌，在未形成CdTe晶体之前加入B溶液(Na2S的摩尔浓度为0.05×10-3mol/l)并搅拌，直接得到CdTe/CdS前驱体溶液。在前驱体溶液中加入C溶液(硫酸锌的摩尔浓度为2.0×10-3mol/l)，回流6h，得到尺寸为15nm的发红色荧光的CdTe/CdS/ZnS。
连接CdTe/CdS/ZnS与S1。将10ml CdTe/CdS/ZnS原液和1OD的S1混合，加入10ml的EDC(EDC的使用量是S1用量的5倍)，在Tris-HCl溶液中25℃下反应12小时，即得到CdTe/CdS/ZnS-S1。
(2)Au-S2的制备同实施例1。
(3)DNA荧光探针的制备 将合成的CdTe/CdS/ZnS-S1与Au-S2溶液按照r＝1:5的体积比混合，并加入20ml杂交缓冲液PBS，30℃下反应16小时，使DNA充分杂交，得到DNA荧光探针。
3.目标DNA检测 把1OD的S3加入到10ml T＝45℃、pH＝8.0的探针溶液中反应6h，测得荧光强度增强，计算得量子效率为80％。
实施例4
1.DNA序列
检测肝炎毒特征DNA序列之一：
序列1：5′端用氨基标记的单链DNA(记作S1)，
5’-ATAATGCATCCTCAAGTGGTCATCTTAAGCCTCATCCTACATCTGGCA G-(CH2)6-NH2-3’；
序列2：3′端用巯基修饰的单链DNA(与S1互补，记作S2)，
5’-SH-(CH2)6-TGTAGGATGAGGCTTAAGATGACCACTTGAGGATGCATTAT-3’；
序列3：目标DNA(与S1互补，记作S3)，
5’-CTGCCAGATGTAGGATGAGGCTTAAGATGACCACTTGAGGATGCATTAT-3’。
2.制备方法
(1)CdTe/CdS/ZnS-S1的制备 制备CdTe/CdS/ZnS：将14mg Te粉和40mg NaBH4置于比色管中，加入双蒸水，在25℃反应，生成NaHTe(A溶液)。制备pH7.5并且含有巯基丙酸和氯化镉的双蒸水溶液，剧烈搅拌下迅速加入Na2S溶液，通入N2气20分钟(B溶液)。制备pH7.5并且含有35μl巯基丙酸和硫酸锌的混合溶液，N2气脱氧(C溶液)；制备pH7.5并且含有50μl巯基丙酸和氯化镉的混合溶液，N2脱氧(D溶液)；在D溶液(氯化镉的摩尔浓度为0.06×10-3mol/l)中迅速加入A溶液(NaHTe的摩尔浓度为0.9×10-3mol/l)和0.1ml Na2S溶液并搅拌，在未形成CdTe晶体之前加入B溶液(Na2S的摩尔浓度为0.4×10-3mol/l)并搅拌，直接得到CdTe/CdS前驱体溶液。在前驱体溶液中加入C溶液(硫酸锌的摩尔浓度为2.0×10-3mol/l)，回流6h，得到尺寸为18nm的发红色荧光的CdTe/CdS/ZnS。
连接CdTe/CdS/ZnS与S1。将10ml CdTe/CdS/ZnS原液和1OD的S1混合，加入10ml的EDC(用量是S1用量的15倍)，在Tris-HCl溶液中25℃下反应72小时，即得到CdTe/CdS/ZnS-S1。
(2)Au-S2的制备同实施例1。
(3)DNA荧光探针的制备 将合成的CdTe/CdS/ZnS-S1与Au-S2溶液按照r＝1:0.1的体积比混合，并加入20ml杂交缓冲液PBS，85℃下反应24小时，使DNA充分杂交，得到DNA荧光探针。
3.目标DNA检测 把1OD的S3加入到10ml、T＝80℃、pH＝8.0的探针溶液中反应12h，测得荧光强度增强，计算得量子效率为40％。
实施例5
1.DNA序列
检测弓形虫特征DNA序列之一：
序列1：5′端用氨基标记的单链DNA(记作S1)，
5’-ATGGCGGGTATCTTTCGCACGATCTATGACTGGCTCCTGAGATGTTCTG-(CH2)6-NH2-3’；
序列2：3′端用巯基修饰的单链DNA(与S1互补，记作S2)，
5’-SH-(CH2)6-CAGGAGCCAGTCATAGATCGTGCGAAAGATACCCGCCAT-3’；
序列3：目标DNA(与S1互补，记作S3)，
5’-CAGAACATCTCAGGAGCCAGTCATAGATCGTGCGAAAGATACCCGCCAT-3’。
2.制备方法 (1)CdTe/CdS/ZnS-S1的制备制备CdTe/CdS/ZnS：将14mg Te粉和40mg NaBH4置于比色管中，加入双蒸水，在25℃反应，生成NaHTe(A溶液)。制备pH7.5并且含有巯基丙酸和氯化镉的双蒸水溶液，剧烈搅拌下迅速加入Na2S溶液，通入N2气20分钟(B溶液)。制备pH7.5并且含有35μl巯基丙酸和硫酸锌的混合溶液，N2气脱氧(C溶液)；制备pH7.5并且含有50μl巯基丙酸和氯化镉的混合溶液，N2脱氧(D溶液)；在D溶液(氯化镉的摩尔浓度为0.06×10-3mol/l)中迅速加入A溶液(NaHTe的摩尔浓度为0.9×10-3mol/l)和0.1ml Na2S溶液并搅拌，在未形成CdTe晶体之前加入B溶液(Na2S的摩尔浓度为0.4×10-3mol/l)并搅拌，直接得到CdTe/CdS前驱体溶液。在前驱体溶液中加入C溶液(硫酸锌的摩尔浓度为2.0×10-3mol/l)，回流18h，得到尺寸为20nm的发红色荧光的CdTe/CdS/ZnS。
连接CdTe/CdS/ZnS与S1。将10ml CdTe/CdS/ZnS原液和1OD的S1混合，加入10ml的EDC(用量是S1用量的25倍)，在Tris-HCl溶液中25℃下反应12小时，即得到CdTe/CdS/ZnS-S1。
(2)Au-S2的制备同实施例1。
(3)DNA荧光探针的制备 将合成的CdTe/CdS/ZnS-S1与Au-S2溶液按照r＝1:15的体积比混合，并加入20ml杂交缓冲液PBS，10℃下反应16小时，使DNA充分杂交，得到DNA荧光探针。
3.目标DNA检测 把1OD的S3加入到10ml、T＝90℃、pH＝9.0的探针溶液中，反应1h，测得荧光强度增强，计算得量子效率为35％、
实施例6
监测生物是否发生变异。
1.DNA序列
检测鼠疫特征DNA序列之一：
序列1：5′端用氨基标记的单链DNA(记作S1)，
5’-AGTAAGCAAGAGAGAGCCGGGGGG-(CH2)6-NH2-3’；
序列2：3′端用巯基修饰的单链DNA(与S1互补，记作S2)，
5’-SH-(CH2)6-CCCCGGCTCTCTCTTGCTTACT-3’；
序列3：目标DNA(与S1互补，记作S3)，
5’-CCCCCCGGCTCTCTCTTGCTTACT-3’。
序列4：与S3有一个错配碱基的目标单链DNA(S4)，
5’-CCCCCCGGCTCTCTCATGCTTACT-3’。
2.制备方法 (1)CdTe/CdS/ZnS-S1的制备制备CdTe/CdS/ZnS：将14mg Te粉和40mg NaBH4置于比色管中，加入双蒸水，在25℃反应，生成NaHTe(A溶液)。制备pH9.0并且含有巯基丙酸和氯化镉的双蒸水溶液，剧烈搅拌下迅速加入Na2S溶液，通入N2气20分钟(B溶液)。制备pH9.0并且含有35μl巯基丙酸和硫酸锌的混合溶液，N2气脱氧(C溶液)；制备pH9.0并且含有50μl巯基丙酸和氯化镉的混合溶液，N2脱氧(D溶液)；在D溶液(氯化镉的摩尔浓度为0.05×10-3mol/l)中迅速加入A溶液(NaHTe的摩尔浓度为0.8×10-3mol/l)和0.1ml Na2S溶液并搅拌，在未形成CdTe晶体之前加入B溶液(Na2S的摩尔浓度为0.02×10-3mol/l)并搅拌，直接得到CdTe/CdS前驱体溶液。在前驱体溶液中加入C溶液(硫酸锌的摩尔浓度为1.50×10-3mol/l)，回流2h，得到尺寸为10nm的发红色荧光的CdTe/CdS/ZnS。
连接CdTe/CdS/ZnS与S1。将10ml CdTe/CdS/ZnS原液和1OD的S1混合，加入10ml的EDC(用量是S1用量的5倍)，在Tris-HCl溶液中25℃下反应24小时，即得到CdTe/CdS/ZnS-S1。
(2)Au-S2的制备同实施例1。
(3)DNA荧光探针的制备 将合成的CdTe/CdS/ZnS-S1与Au-S2溶液按照r＝1:6的体积比混合，并加入20ml杂交缓冲液PBS，10℃下反应1.5小时，使DNA充分杂交，得到DNA荧光探针。
3.目标DNA检测把1OD的S3和S4分别加入到10ml、25℃、pH＝9.0的探针溶液中，分别测得：加入S3的体系荧光强度增强，计算量子效率为70％；而加入S4的体系荧光强度仅稍有增强，荧光强度变化幅度远小于加入S3体系的幅度，只有S3体系的58％。S3和S4所获得的荧光强度差表明，本发明的探针具有良好的特异性；同时，利用本发明探针可以监测生物是否发生变异(特征DNA编码序列发生变化)。
Claims (4)
1.一种DNA荧光探针，其特征在于该探针采用半导体发光纳米粒子CdTe/CdS/ZnS做发射荧光的能量给体，金纳米粒子做吸收荧光的能量受体，所述CdTe/CdS/ZnS纳米粒子与单链NH2-DNA相连接，构成CdTe/CdS/ZnS-DNA；所述金纳米粒子与单链SH-DNA相连接，构成Au-DNA；并且所述单链SH-DNA与NH2-DNA互补，使所述CdTe/CdS/ZnS-DNA与Au-DNA杂交制成。
2.根据权利要求1所述的DNA荧光探针，其特征在于所述互补的单链DNA序列根据A-T，G-C对应的原则得出；所述DNA链段包括下述DNA编码序列：具有沙门氏杆菌特征的DNA编码序列、具有志贺氏杆菌特征的DNA编码序列、具有鼠疫杆菌特征的DNA编码序列、具有弓形虫特征的DNA编码序列、具有肝炎病毒特征的DNA编码序列、具有冠状病毒特征的DNA编码序列、具有肺炎球菌特征的DNA编码序列、具有流感病毒特征的DNA编码序列，或者是具有特征DNA编码序列的病毒，细菌或微生物。
3.一种权利要求1或2所述DNA荧光探针的制备方法，该制备方法采用以下工艺：
首先，制备CdTe/CdS/ZnS-DNA溶液；具体方法为：
(1)制备半导体发光纳米粒子CdTe/CdS/ZnS原液，其包括：制备NaHTe，将Te粉和NaBH4置于比色管中，并在20-100℃下反应，得备用溶液A；制备pH5-12并且含有巯基的有机酸和氯化镉混合溶液，剧烈搅拌下迅速加入Na2S溶液，用N2气脱氧，得备用溶液B；制备pH6.0-9.0巯基有机酸和硫酸锌混合溶液，用N2气脱氧，得备用溶液C；制备pH6.0-9.0并且含有巯基的有机酸和氯化镉混合溶液，用N2气脱氧，得备用溶液D；在所述D溶液中迅速加入A溶液和极少量Na2S溶液并搅拌，在未形成CdTe晶之前，加入所述B溶液并搅拌，得到CdTe/CdS前驱体溶液；在前驱体溶液中加入所述C溶液，回流1-24h，得到发射红色荧光的半导体发光纳米粒子CdTe/CdS/ZnS原液；其中，所述的巯基有机酸为巯基乙酸或者巯基丙酸，所述氯化镉和硫酸锌的摩尔浓度均为：(0.25-10.0)×10-3M；所述A溶液中的NaHTe、B溶液中的Na2S、C溶液中的硫酸锌、D溶液中的氯化镉的摩尔浓度比例为(0.1-1.5):(0.01-0.5)：(1.0-3.0):(0.01-0.2)；
(2)制备CdTe/CdS/ZnS-DNA溶液：将1-10ml的CdTe/CdS/ZnS原液和1OD的5’-NH2-DNA混合，加入5’-NH2-DNA量1-40倍的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚氨盐酸盐，在Tris-HCl溶液中反应0.1-72h，即得到能够发出红色荧光的CdTe/CdS/ZnS-DNA溶液；
其次，按常规方法制备Au-DNA溶液；
最后，制备DNA荧光探针；将所述CdTe/CdS/ZnS-DNA溶液与Au-DNA溶液按1:(0.1-20)的体积比混合，加入1-200ml杂交缓冲液磷酸盐溶液，在10-90℃下杂交0.5-24小时，即得到DNA荧光探针。
4.根据权利要求3所述DNA荧光探针的制备方法，其特征在于通过在DNA序列与CdTe/CdS/ZnS相连的一端加入1-10个碱基，改变所述CdTe/CdS/ZnS-DNA上所连接的单链DNA序列的长度，调节所述CdTe/CdS/ZnS纳米粒子和金纳米粒子之间的距离，得到不同强度的荧光；所述的碱基可以是A、T、G和C中的任意一个或者一个以上的任意组合。
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