CN105154085A - 一种比率型双荧光探针的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种比率型双荧光探针的制备方法及应用，采用CdTe量子点与Au纳米簇作为荧光信号源，硅基质材料作为载体，量子点作为参比信号源，被包埋于硅核内，具有荧光响应性能的Au？NCs(Au？纳米簇)共价键合到硅层的表面，制备得到核-卫星式结构的杂化微球。本发明的优点：量子点作为参比信号源，其被包埋于硅核内，从而有效地避免了泄漏，提供了一个稳定的参比信号，而具有荧光响应性能的Au？NCs共价键合到硅球的表面，实现Cu²⁺的选择性识别与响应。

Description

一种比率型双荧光探针的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种比率型双荧光探针的制备方法及其应用，具体涉及具有核-卫星式结构的CdTeSiO₂AuNCs杂化荧光探针的制备方法及其在Cu²⁺定量测定中的应用。

背景技术

与单荧光猝灭型荧光探针相比，比率型荧光探针的信号变化更容易被裸眼观察到其变化(WangHH,XueL,QianYY,etal,Orglett,2010,12:292～295)。比率型荧光法是采用两个良好分辨率的波长下荧光强度的比值作为信号，这样就可以为环境中除待测物外的其他因素所造成的影响提供内校正，消除激发光源的强度漂移造成的信号变化，与传感器本身的浓度也无关，所以，大大的提高了定量测定的精确性(LvX,LiuJ,LiuYL,etal,ChemCommun,2011,47:12843～12845)。

设计具有双荧光发射的纳米粒子，并将其发展为可实现选择性测定金属离子的比率型荧光探针，已经成为未来探针设计的发展趋势。比如说，在zhang的工作中(ZhangK,ZhouHB,MeiQS,etal,JAmChemSoc,2011,133:8424～8427)，两种不同尺寸的CdTe量子点（分别发射红色和绿色荧光）通过硅烷化试剂而结合起来，红色荧光的量子点包埋在硅核中，而绿色荧光的量子点连接在硅球的表面，这样就形成了一个双发射的荧光杂化微球。该杂化微球可被发展为环境样品中爆炸物TNT含量检测的比率型荧光传感探针。在Zhu的工作中(ZhuAW,QuQ,ShaoXL,etal,AngewChemIntEd,2012,51:7185～7189)，他们制备了一种基于量子点和碳点的双荧光发射杂化微球（CdSeCQDs），并且在该杂化球的表面连接了TPEA来实现对铜离子的选择性结合，该比率型杂化微球最终被发展为细胞中铜离子浓度高灵敏度，高选择性传感探针。

量子点（quantumdots，QDs）是由Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族元素组成的半导体纳米晶粒。由于量子点具有激发光谱宽且连续、发射光谱窄且对称、发射波长可调、荧光量子产率高等优越的荧光特性，近年来，并广泛应用于荧光探针的设计领域；金纳米簇(AuNCs)，是一种新兴的荧光材料，由于超小的尺寸，无生物毒性，近红外发射，良好的生物相容性等特点(XieJP,ZhengYG,YingJY,J.Am.Chem.Soc.2009,131,888–889)，它也可以作为荧光探针设计的光学信号源。

铜离子是人体健康的必需元素，并且在调节各种生命过程中具有重要的作用(ZhangM,YeBC,Analyst,2011,136:5139～5142)。然而，过量的铜离子会导致细胞环境的失调，并且会对生物器官带来严重的毒害作用。因此，发展铜离子含量高灵敏度，高选择性的探针具有重要的意义。

发明内容

本发明旨在提供一种比率型双荧光探针的制备方法，将CdTe量子点作为参比信号源而包埋于硅核内，提供稳定的参比信号，将具有Cu²⁺选择性响应性能的AuNCs共价键合到硅球的表面，制备得到CdTeSiO₂AuNCs杂化荧光微球，并将其发展为可实现Cu²⁺定量测定的比率型荧光探针。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种比率型双荧光探针，以CdTe量子点与Au纳米簇(AuBSANCs)作为荧光信号源，硅基质材料作为载体，量子点作为参比信号源，被包埋于硅核内，具有荧光响应性能的Au纳米簇共价键合到硅球的表面，制备得到核-卫星式结构的杂化微球。

本发明提供了上述比率型双荧光探针的制备方法，具体包括如下步骤：

1）将巯基丙酸加入到CdCl₂中，得到含巯基丙酸的CdCl₂溶液；

2）将碲粉、NaBH₄与蒸馏水混合，在氮气保护并搅拌的条件下进行还原反应得到NaHTe溶液；

3）碲化镉量子点(CdTeQDs)溶液的制备：将NaHTe溶液快速加入到上述含巯基丙酸的CdCl₂溶液中，用NaOH水溶液调节溶液的pH为8.5-11，然后沸水浴加热1-5h，得到碲化镉量子点溶液；

4）CdTeSiO₂的制备

乙醇中加入新鲜的CdTeQDs溶液，在搅拌下加入氨水，随后迅速加入四乙氧基硅烷，反应在20-30℃下进行1-4小时，得到CdTeSiO₂微球，所得产物在乙醇中离心洗涤三次去除过量的反应物；

5）氨基修饰的CdTeSiO₂微球的制备

将步骤4）中所得的CdTeSiO₂微球加入乙醇中，再加入氨水，再加入四乙氧基硅烷(TEOS)和3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，并在20-30℃下搅拌，反应进行2-5小时得到CdTeSiO₂-NH₂；所得产物在乙醇中三次离心洗涤，去除过量的反应物；

6）金纳米簇(AuNCs)的制备

先往反应容器加入牛血清白蛋白溶液，再加入氯金酸溶液并搅拌，温度在30-40℃，1-8分钟后加入少量的氢氧化钠水溶液，反应进行8-16h后得到以牛血清白蛋白作为稳定剂的金纳米簇(AuBSANCs)溶液，所得产物透析48h；

7）CdTeSiO₂AuNCs的制备

取AuNCs原液溶于水中，再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，随后用稀HCl溶液调节溶液的pH值到4.0-6.5，室温下搅拌反应10-40分钟，使金纳米簇表面的牛血清白蛋白的羧基活化后，再取步骤3）中合成的CdTeSiO₂-NH₂溶液加入上述活化后的金纳米簇溶液中，随后用NaOH溶液调节溶液pH值为8-11，该混合物在暗处慢速搅拌反应5-20小时；最后，所得产物用去离子水洗涤三次，去除未反应的过量AuNCs和EDC·HCl，制得CdTeSiO₂AuNCs杂化微球。

上述制备方法中，所述步骤1）中含巯基丙酸的CdCl₂溶液中，巯基丙酸与CdCl₂的摩尔比为2:1-6:1。

上述制备方法中，所述步骤2）中NaHTe溶液中NaBH₄与蒸馏水的用量比为20-50mg/mL，Te与NaBH₄的摩尔比为1:10-1:30。

上述制备方法中，调节溶液pH的NaOH水溶液的浓度为0.2-2.0mol/L。

上述制备方法中，所述步骤4）中氨水的质量百分比浓度为28%，氨水、乙醇、四乙氧基硅烷、碲化镉量子点的用量比为（50~500）μL：(20~100)mL：(50~400)μL：(5~20)mL。

上述制备方法中，所述步骤5）中，所用氨水的质量百分比浓度为28%，氨水、乙醇、四乙氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷、CdTeSiO₂微球的用量比为(0.1~1)mL：(20~80)mL：(0.05~0.5)mL：(0.05~0.5)mL：1mL。

上述制备方法中，：所述步骤6）中氯金酸溶液的浓度为5-20mmol/L，牛血清白蛋白溶液浓度为10-50mg/mL，氢氧化钠水溶液浓度为0.5-1.0mol/L，氯金酸溶液、牛血清白蛋白溶液与氢氧化钠水溶液的体积比为（1~10）mL：（1~10）mL：（0.1~1.0）mL。

上述制备方法中，所述步骤7）中，在AuNCs的活化阶段，所用AuNCs与EDC·HCl的质量比为(0.4~1.0))mg∶(50~100)mg；CdTeSiO₂-NH₂微球与活化后的AuNCs的用量体积比为1∶(1~20)，调节溶液pH至8-11时所用NaOH的浓度为0.005—0.01mol/L。

本发明提供了上述比率型双荧光探针的应用，将CdTeSiO₂AuNCs杂化微球用于Cu²⁺的测定，按以下步骤进行：

将CdTeSiO₂AuNCs杂化微球溶液加入磷酸盐缓冲液(PBS)中，调节溶液的pH为7-10；随后再加入Cu²⁺溶液，最终混合物用去离子水稀释到相同体积并彻底混合，放置5-15分钟后，开始测定；

所述CdTeSiO₂AuNCs杂化微球的浓度为0.1-1mgml^-1，待测定Cu²⁺的浓度范围为0-150.0×10^-7mol/L。

上述比率型双荧光探针在实现Cu²⁺定量测定时的响应机理为：核内的CdTe量子点信号保持不变，而外层的AuNCs会通过形成Au-Cu²⁺复合物的方式选择性地与Cu²⁺键合，从而导致AuNCs的红色荧光猝灭，这样就可以实现Cu²⁺定量测定。

本发明提供的制备方法，将具有优良荧光性能的量子点与金纳米簇结合为一体，制备所得的核-卫星式结构杂化微球，发展为Cu²⁺定量测定的比率型荧光探针。该荧光探针在实现Cu²⁺定量测定中具有稳定性好、灵敏度高、选择性好、检出限低等优势。

本发明的有益效果：

1）量子点作为参比信号源，其被包埋于硅基质微球内，可以有效地避免其发生泄漏，提供了一个稳定的参比信号；

2）金纳米簇的荧光量子产率高，并可与Cu²⁺特异性结合，将其共价键合到硅载体的表面，可实现Cu²⁺的选择性识别与响应。

3）通过调节两种荧光材料之间的硅层的厚度，可控制内核的QDs与外层AuNCs间的距离，使得该距离大于荧光共振能量转移所需距离，从而消除两者间的能量转移，如此便可以使QDs成为一个稳定的荧光参比信号来源，制备所得合成的CdTeSiO₂AuNCs杂化微球用于Cu²⁺的测定中，具有稳定性好、灵敏度高、选择性好、检出限低等优势。

附图说明

图1是CdTeSiO₂AuNCs杂化微球的高分辨透射电镜图。

图2是图1的放大图。

图3是(Ⅰ)CdTeSiO₂，(Ⅱ)AuNCs，(Ⅲ)CdTeSiO₂AuNCs杂化微球溶液的归一化荧光光谱图。

图4是CdTeSiO₂AuNCs杂化微球的荧光发射光谱。

图5是CdTeSiO₂AuNCs杂化微球溶液的两波长处荧光强度比值(F_545nm/F_655nm)与Cu²⁺浓度的关系图(PBS缓冲溶液，pH=7.4)。

具体实施方式

下面通过实施例来进一步说明本发明，但不局限于以下实施例。

实施例1：

一种制备双荧光比率型铜离子定量测定荧光探针的方法，通过共价键连接牛血清白蛋白稳定的金纳米簇(AuBSANCs)于氨基修饰的CdTeSiO₂微球表面，制得CdTeSiO₂AuNCs杂化微球，并将其发展为可实现Cu²⁺定量测定的比率型荧光探针，包括如下步骤：

1）CdTe量子点的制备

将硼氢化钠与碲粉按摩尔比为5:1混合，在氮气氛围下，反应制备碲氢化钠（NaHTe）前躯体；将该新鲜的前躯体溶液取2ml在磁力搅拌的作用下，加入到氮气饱和的氯化镉与巯基丙酸混合溶液（巯基丙酸与CdCl₂的摩尔比为2.4:1）中，并在pH=9.0的条件下，100℃加热反应4h生成发射波长为550nm的CdTeQDs。注意：在该反应体系中，各反应物的摩尔比[CdCl₂]:[MPA]:[NaHTe]=2:4.8:1。

2）CdTeSiO₂的制备

50mL乙醇中加入6mL新鲜的CdTeQDs溶液，在搅拌下加入0.4mL氨水(28wt%)，随后迅速加入200μLTEOS，反应在25℃下进行4小时。所得的产物在乙醇中离心洗涤三次去除过量的反应物；

将所合成的CdTeSiO₂微球在真空干燥箱中烘干，得到粉末状固体，并配成浓度为0.2—3.0mg/mL的水溶液待用。

3）氨基修饰的CdTeSiO₂微球(CdTeSiO₂-NH₂)的制备

上述所得的CdTeSiO₂微球作为进一步修饰氨基硅层的种子，将步骤2）中所得的CdTeSiO₂微球1mL加入50mL乙醇中，再加入0.1ml氨水(28wt%)，300μLTEOS和300μLAPTES，并在25℃下搅拌，反应进行2小时。所得产物在乙醇中三次离心洗涤，去除过量的反应物。

4）金纳米簇（AuNCs）的制备

实验中所用的所有玻璃容器在使用前均用王水洗涤并用乙醇和超纯水洗涤干净待用。5mL的HAuCl₄溶液(5mmol/L,37℃)加入到5mL的BSA溶液(25mg/mL,37℃)中，搅拌2分钟后，加入0.25mL的NaOH溶液（1mol/L），混合物在37℃下反应10小时。溶液在二次水中透析48小时，去除未反应的HAuCl₄和NaOH。最终溶液在4℃储存待用。

5）CdTeSiO₂AuNCs的制备

取1mLAuNCs原液溶于35mL水中(0.5mg/mL)，再加入60mg的EDC·HCl，随后用稀HCl溶液约0.2mL调节溶液的pH值到6.2。室温下搅拌反应30分钟，使金纳米簇表面的牛血清白蛋白的羧基活化后，再取步骤3）中合成的CdTeSiO₂-NH₂溶液1mL加入上述活化后的金纳米簇溶液中，随后用0.01M的NaOH溶液调节溶液pH值到8.5，该混合物在暗处慢速搅拌反应10小时。最后，所得产物用去离子水洗涤三次，去除未反应的过量金纳米簇和EDC。所得杂化微球在接下来的实验中定义为CdTeSiO₂AuNCs杂化微球。

将上述制得的CdTeSiO₂AuNCs微球用于Cu²⁺的测定：

将步骤5）中所得CdTeSiO₂AuNCs杂化微球取1mL（0.2mgmL^-1）加入1.0mL的PBS缓冲溶液（pH=7.0）。随后再加入不同量的已知浓度（0，6.0×10^-7，10.0×10^-7，15.0×10^-7，20.0×10^-7，25.0×10^-7，30.0×10^-7，40.0×10^-7，50.0×10^-7，60.0×10^-7，70.0×10^-7，100.0×10^-7mol/L）的Cu²⁺溶液，最终混合物用去离子水稀释到5mL并彻底混合，放置10分钟后，开始测定。采用荧光激发波长为380nm，激发电压为900kV。测量结果见图3所示。

本实施例得到的CdTeSiO₂AuNCs杂化微球进行电镜扫描，见图1。图1是CdTeSiO₂AuNCs杂化微球的高分辨透射电镜图。图2为放大显示图，图中显示：所合成的杂化微球尺寸约为180nm左右。

图3是(Ⅰ)CdTeSiO₂，(Ⅱ)AuNCs，(Ⅲ)CdTeSiO₂AuNCs杂化微球溶液的归一化荧光光谱图。图中可以看出：在单一波长激发时（380nm），CdTeSiO₂溶液的最大发射波长位于550nm处，AuNCs溶液的最大发射波长位于686nm处，而最终合成的CdTeSiO₂AuNCs杂化微球溶液出现了545nm及655nm处的两个荧光发射峰。

图4是CdTeSiO₂AuNCs杂化微球的荧光发射光谱。图中Cu²⁺浓度从上到下依次为：0，6.0×10^-7，10.0×10^-7，15.0×10^-7，20.0×10^-7，25.0×10^-7，30.0×10^-7，40.0×10^-7，50.0×10^-7，60.0×10^-7，70.0×10^-7，100.0×10^-7mol/L。图中可以看出：随着Cu²⁺的浓度增加，655nm处的荧光发射强度会逐渐下降，而545nm处的发射波长保持不变，由此，我们可以将CdTeQDs在545nm处的信号作为内校正信号。该新型荧光传感器可以实现6.0×10^-7mol/L到100.0×10^-7mol/L范围内的Cu²⁺浓度传感。

图5是CdTeSiO₂AuNCs杂化微球溶液的两波长处荧光强度比值(F_545nm/F_655nm)与Cu²⁺浓度的关系图(PBS缓冲溶液，pH=7.4)。图中可以看出：该杂化微球溶液的两波长处荧光强度比值F_545nm/F_655nm与Cu²⁺浓度呈良好的线性关系，因此可发展为Cu²⁺浓度定量测定的比率型荧光探针。

实施例2：

一种制备双荧光比率型铜离子定量测定荧光探针的方法，通过共价键连接牛血清白蛋白稳定的金纳米簇(AuBSANCs)于氨基修饰的CdTeSiO₂微球表面，制得CdTeSiO₂AuNCs杂化微球，包括如下步骤：

1）CdTe量子点的制备

将硼氢化钠与碲粉按摩尔比为6:1混合，在氮气氛围下，反应制备碲氢化钠（NaHTe）前躯体；将该新鲜的前躯体溶液取2ml在磁力搅拌的作用下，加入到氮气饱和的氯化镉与巯基丙酸混合溶液（巯基丙酸与CdCl₂的摩尔比为2:1）中，并在pH=9.0的条件下，100℃加热反应3h生成发射波长为540nm的CdTeQDs。

2）CdTeSiO₂的制备

40mL乙醇中加入6mL新鲜的CdTeQDs溶液，在搅拌下加入0.3mL氨水(28wt%)，随后迅速加入120μLTEOS，反应在25℃下进行4小时；所得的产物在乙醇中离心洗涤三次去除过量的反应物；

将所合成的CdTeSiO₂微球在真空干燥箱中烘干，得到粉末状固体，并配成浓度为0.2—3.0mg/mL的水溶液待用。3）氨基修饰的CdTeSiO₂微球(CdTeSiO₂-NH₂)的制备

上述所得的CdTeSiO₂微球作为进一步修饰氨基硅层的种子，将步骤2）中所得的CdTeSiO₂微球1mL加入60mL乙醇中，再加入0.1ml氨水(28wt%)，150μLTEOS和150μLAPTES，并在25℃下搅拌，反应进行2小时。所得产物在乙醇中三次离心洗涤，去除过量的反应物。

4）金纳米簇（AuNCs）的制备

实验中所用的所有玻璃容器在使用前均用王水洗涤并用乙醇和超纯水洗涤干净待用。4mL的HAuCl₄溶液(5mmol/L,37℃)加入到4mL的BSA溶液(25mg/mL,37℃)中，搅拌2分钟后，加入0.2mL的NaOH溶液（1mol/L），混合物在30℃下反应10小时。溶液在二次水中透析48小时，去除未反应的HAuCl₄和NaOH。最终溶液在4℃储存待用。

5）CdTeSiO₂AuNCs的制备

取1mLAuNCs原液溶于20mL水中(0.8mg/mL)，再加入100mg的EDC·HCl，随后用稀HCl溶液约0.2mL调节溶液的pH值到5.8。室温下搅拌反应30分钟，使金纳米簇表面的牛血清白蛋白的羧基活化后，再取步骤3）中合成的CdTeSiO₂-NH₂溶液1mL加入上述活化后的金纳米簇溶液中，随后用0.01mol/L的NaOH溶液调节溶液pH值到9.5，该混合物在暗处慢速搅拌反应10小时。最后，所得产物用去离子水洗涤三次，去除未反应的过量金纳米簇和EDC，得到CdTeSiO₂AuNCs杂化微球。

实施例3：

一种制备双荧光比率型铜离子定量测定荧光探针的方法，通过共价键连接牛血清白蛋白稳定的金纳米簇(AuBSANCs)于氨基修饰的CdTeSiO₂微球表面，制得CdTeSiO₂AuNCs杂化微球，包括如下步骤：

1）CdTe量子点的制备

将硼氢化钠与碲粉按摩尔比为4:1混合，在氮气氛围下，反应制备碲氢化钠（NaHTe）前躯体；将该新鲜的前躯体溶液取2ml在磁力搅拌的作用下，加入到氮气饱和的氯化镉与巯基丙酸混合溶液（巯基丙酸与CdCl₂的摩尔比为6:1）中，并在pH=10.0的条件下，100℃加热反应5h生成发射波长为560nm的CdTeQDs。

2）CdTeSiO₂的制备

35mL乙醇中加入5mL新鲜的CdTeQDs溶液，在搅拌下加入0.35mL氨水(28wt%)，随后迅速加入100μLTEOS，反应在30℃下进行3小时。所得的产物在乙醇中离心洗涤三次去除过量的反应物；

将所合成的CdTeSiO₂微球在真空干燥箱中烘干，得到粉末状固体，并配成浓度为0.2—3.0mg/mL的水溶液待用。

3）氨基修饰的CdTeSiO₂微球(CdTeSiO₂-NH₂)的制备

上述所得的CdTeSiO₂微球作为进一步修饰氨基硅层的种子，将步骤3）中所得的CdTeSiO₂微球1mL加入40mL乙醇中，再加入1ml氨水(28wt%)，150μLTEOS和150μLAPTES，并在30℃下搅拌，反应进行4小时。所得产物在乙醇中三次离心洗涤，去除过量的反应物。

4）金纳米簇（AuNCs）的制备

实验中所用的所有玻璃容器在使用前均用王水洗涤并用乙醇和超纯水洗涤干净待用。10mL的HAuCl₄溶液(10mmol/L，37℃)加入到10mL的BSA溶液(40mg/mL，37℃)中，搅拌2分钟后，加入0.5mL的NaOH溶液（1mol/L），混合物在35℃下反应8小时。溶液在二次水中透析48小时，去除未反应的HAuCl₄和NaOH。最终溶液在4℃储存待用。

5）CdTeSiO₂AuNCs的制备

取1mLAuNCs原液溶于40mL水中(0.4mg/mL)，再加入50mg的EDC·HCl，随后用稀HCl溶液调节溶液的pH值到5.0。室温下搅拌反应25分钟，使金纳米簇表面的牛血清白蛋白的羧基活化后，再取步骤3）中合成的CdTeSiO₂-NH₂溶液1mL加入上述活化后的金纳米簇溶液中，随后用0.01mol/L的NaOH溶液调节溶液pH值到9.5，该混合物在暗处慢速搅拌反应15小时。最后，所得产物用去离子水洗涤三次，去除未反应的过量金纳米簇和EDC，得到CdTeSiO₂AuNCs杂化微球。

Claims (10)

1.一种比率型双荧光探针，其特征在于：采用CdTe量子点与Au纳米簇作为荧光信号源，硅基质材料作为载体，量子点作为参比信号源，被包埋于硅核内，具有荧光响应性能的Au纳米簇共价键合到硅球的表面，制备得到核-卫星式结构的杂化微球。

2.一种权利要求1所述的比率型双荧光探针的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）将巯基丙酸加入到CdCl₂中，得到含巯基丙酸的CdCl₂溶液；

2）将碲粉、NaBH₄与蒸馏水混合，在氮气保护并搅拌的条件下进行还原反应得到NaHTe溶液；

3）碲化镉量子点溶液的制备：将NaHTe溶液快速加入到上述含巯基丙酸的CdCl₂溶液中，用NaOH水溶液调节溶液的pH为8.5-11，然后沸水浴加热1-5h，得到碲化镉量子点溶液；

4）CdTeSiO₂微球的制备

乙醇中加入新鲜的碲化镉量子点溶液，在搅拌下加入氨水，随后迅速加入四乙氧基硅烷，反应在20-30℃下进行1-4小时，得到CdTeSiO₂微球，所得产物在乙醇中离心洗涤三次去除过量的反应物；

5）氨基修饰的CdTeSiO₂微球的制备

将步骤4）中所得的CdTeSiO₂微球加入乙醇中，再加入氨水，再加入四乙氧基硅烷和3-氨丙基三乙氧基硅烷，并在20-30℃下搅拌，反应进行2-5小时得到CdTeSiO₂-NH₂；所得产物在乙醇中经三次离心洗涤，去除过量的反应物；

6）Au纳米簇的制备

先往反应容器加入牛血清白蛋白溶液，再加入氯金酸溶液并搅拌，温度在30-40℃，1-8分钟后加入氢氧化钠水溶液，反应进行8-16h后得到以牛血清白蛋白作为稳定剂的金纳米簇溶液，所得产物透析48h；

7）CdTeSiO₂Au纳米簇的制备

取Au纳米簇原液溶于水中，再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，随后用稀HCl溶液调节溶液的pH值到4.0-6.5，室温下搅拌反应10-40分钟，使金纳米簇表面的牛血清白蛋白的羧基活化后，再取步骤3）中合成的CdTeSiO₂-NH₂溶液加入上述活化后的金纳米簇溶液中，随后用NaOH溶液调节溶液pH值为8-11，该混合物在暗处慢速搅拌反应5-20小时；最后，所得产物用去离子水洗涤三次，去除未反应的过量金纳米簇和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，制得CdTeSiO₂AuNCs杂化微球。

3.根据权利要求2所述的比率型双荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤1）中含巯基丙酸的CdCl₂溶液中，巯基丙酸与CdCl₂的摩尔比为2:1-6:1。

4.根据权利要求2所述的比率型双荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤2）中NaHTe溶液中NaBH₄与蒸馏水的用量比为20-50mg/mL，Te与NaBH₄的摩尔比为1:10-1:30。

5.根据权利要求2所述的比率型双荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤3）中Te^2-与巯基丙酸的摩尔比为1:3-1:6，调节溶液pH的NaOH水溶液的浓度为0.2-2.0mol/L。

6.根据权利要求2所述的比率型双荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤4）中氨水的质量百分比浓度为28%，氨水、乙醇、四乙氧基硅烷、碲化镉量子点的用量比为（50~500）μL：(20~100)mL：(50~400)μL：(5~20)mL。

7.根据权利要求2所述的比率型双荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤5）中，所用氨水的质量百分比浓度为28%，氨水、乙醇、四乙氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷、CdTeSiO₂微球的用量比为(0.1~1)mL：(20~80)mL：(0.05~0.5)mL：(0.05~0.5)mL：1mL。

8.根据权利要求2所述的比率型双荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤6）中氯金酸溶液的浓度为5-20mmol/L，牛血清白蛋白溶液浓度为10-50mg/mL，氢氧化钠水溶液浓度为0.5-1.0mol/L，氯金酸溶液、牛血清白蛋白溶液与氢氧化钠水溶液的体积比为（1~10）mL：（1~10）mL：（0.1~1.0）mL。

9.根据权利要求2所述的比率型双荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤7）中，在Au纳米簇的活化阶段，所用Au纳米簇与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的质量比为(0.4~1.0))mg∶(50~100)mg；CdTeSiO₂-NH₂微球与活化后的Au纳米簇的用量体积比为1∶(1~20)，调节溶液pH至8-11时所用NaOH的浓度为0.005—0.01mol/L。

10.一种权利要求1所述的比率型双荧光探针的使用方法，其特征在于：将CdTeSiO₂Au纳米簇杂化微球用于Cu²⁺的测定，按以下步骤进行：

将CdTeSiO₂Au纳米簇杂化微球溶液加入磷酸盐缓冲液中，调节溶液的pH为7-10；随后再加入Cu²⁺溶液，最终混合物用去离子水稀释到相同体积并彻底混合，放置5-15分钟后，开始测定；

所述CdTeSiO₂AuNCs杂化微球的浓度为0.1-1mgml^-1，待测定Cu²⁺的浓度范围为0-150.0×10^-7mol/L。