CN104020147B

CN104020147B - 一种荧光型分子印迹探针的制备方法

Info

Publication number: CN104020147B
Application number: CN201410265576.0A
Authority: CN
Inventors: 李文友; 李董艳; 何锡文; 张玉奎
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2014-06-16
Filing date: 2014-06-16
Publication date: 2016-04-20
Anticipated expiration: 2034-06-16
Also published as: CN104020147A

Abstract

一种荧光型分子印迹探针的制备方法，以碲化镉量子点为荧光元素，对碲化镉量子点进行包硅处理后作为载体，苯基膦酸为替代模板分子，采用表面印迹和抗原决定基法合成分子印迹探针，步骤如下：制备碲化镉量子点溶液；制备量子点包硅微球；制备以量子点包硅微球为核、分子印迹层为壳的复合材料；制备荧光型分子印迹探针。本发明的优点是：该荧光型分子印迹聚合物结合了量子点的高灵敏性和分子印迹的高选择性，在载体表面修饰分子印迹层，识别位点接近表面，易于选择性识别目标分子；采用抗原决定基法所合成的荧光探针可以识别目标分子酪氨酸磷酸化多肽并表现为荧光增强型效果。

Description

一种荧光型分子印迹探针的制备方法

技术领域

本发明涉及量子点荧光探针的制备技术，特别是一种荧光型分子印迹探针的制备方法。

背景技术

分子印迹技术是制备在形状、大小、空间结构和结合位点上与目标分子完全匹配的分子印迹聚合物的技术，参见：G.Valtakis,L.Andersson,R.Muller,K.Mosbach,Nature,1993,361(6413):645-647;L.X.Chen,S.F.Xu,J.H.Li,Chem.Soc.Rev.,2011,40(5),2922-2942。分子印迹技术作为一种分离技术，具有预定性、识别性、实用性三大特点。目前分子印迹聚合物已被成功地应用于小分子的识别分析，但是分子印迹聚合物对生物大分子比如多肽或者蛋白的识别依然是一种严峻的挑战，这是因为生物大分子往往具有较大的分子量、一定的溶解性以及复杂的构象变化。尽管存在种种困难，通过金属螯合印迹、表面印迹和抗原决定基印迹等方法已经成功地合成了大分子印迹聚合物，参见：L.Qin,X.W.He,W.Zhang,W.Y.Li,Y.K.Zhang,Anal.Chem.,2009,81(17):7206-7216;J.X.Liu,K.G.Yang,Q.L.Deng,Q.R.Li,L.H.Zhang,Z.Liang,Y.K.Zhang,ChemCommun.,2011,47(13):3969-3971；M.Kempe,M.Glad,K.Mosbach,J.Mol.Recognit.1995,8(1-2):35-39;A.Nematollahzadeh,W.Sun,C.S.A.Aureliano,D.Lutkemeyer,J.Stute,M.J.Abdekhodaie,A.Shojaei,B.Sellergren,Angew.Chem.Int.Ed.,2011,50(2):495-498；A.Rachkov,N.Minoura,J.Chromatogr.A,2000,889(1-2):111-118;A.Rachkov,N.Minoura,BiochimBiophysActa2001,1544(1-2):255-266;H.Nishino,C.S.Huang,K.J.Shea,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2006,45(15):2392-2396。

量子点（quantumdots,QDs）是由Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族元素组成的半导体纳米晶粒。由于量子点具有激发光谱宽且连续、发射光谱窄且对称、发射波长可调、荧光量子产率高等良好的荧光特性，它成为在生物、医学领域最有生命力的发展方向之一，参见：M.BruchezJr.,M.Moronne,P.Gin,S.Weiss,A.P.Alivisatos,Science,1998,281(5385):2013-2016;W.C.W.Chan,S.Nie,Science,1998,281(5385):2016-2018。理想的荧光探针具有较高的灵敏性而且必须能够与相应的目标分析物发生特异性的结合，由于合适的天然抗体价格昂贵、提取过程繁琐，而且稳定性差，因此将量子点的优点与分子印迹技术的特点相结合具有非常的意义。

基于分子印迹技术的量子点荧光探针的制备技术，将分子印迹技术的高选择性与量子点的高灵敏性性相结合，已成功地被用于小分子和蛋白质的识别分析，参见：C.I.Lin,A.K.Joseph,C.K.Chang,Y.D.Lee,J.Chromatogr.A,2004,1027(1-2):259-262;H.F.Wang.Y.He,T.R.Ji,X.P.Yan,Anal.Chem.2009,81(4):1615-1621;W.Zhang,X.W.He,Y.Chen,W.Y.Li,Y.K.Zhang,Biosens.Bioelectron.,2011,26(5):2553-2558;W.Zhang,X.W.He,W.Y.Li,Y.K.Zhang,2012,48(12):1757-1759。本发明采用表面印迹和抗原决定基印迹方法制备荧光探针，利用优良荧光性能的量子点作为荧光元素，先合成量子点包硅的微球并使其作为荧光载体，然后加入替代模板、功能单体和交联剂制备荧光分子印迹聚合物探针用于选择性地识别目标物并表现为荧光增强型效果。

发明内容

本发明的目的在于针对上述技术分析和存在问题，提供一种荧光型分子印迹探针的制备方法，该方法采用表面印迹和抗原决定基法，对目标分子的识别具有较高的选择性和灵敏性；且制备方法简单，不同批次间重现性较好，在实际样品中对目标物的选择性识别和检测有着良好的应用前景。

本发明的技术方案：

一种荧光型分子印迹探针的制备方法，以碲化镉量子点为荧光元素，对碲化镉量子点进行包硅处理后作为载体，苯基膦酸为替代模板分子，采用表面印迹和抗原决定基法合成分子印迹探针，包括如下步骤：

1）将碲粉（Te）、NaBH₄与超纯水混合，在氮气保护并搅拌的条件下还原碲粉得到NaHTe溶液，将NaHTe溶液快速加入到含巯基丙酸（MPA）的CdCl₂溶液中，用浓度为1.0mol/L的NaOH水溶液调节溶液的pH为10.0，先在室温下搅拌30分钟，然后沸水浴加热2h，制得到碲化镉量子点溶液；

2）将上述碲化镉量子点溶液加入无水乙醇中，再加入氨水，搅拌条件下加入四乙氧基硅烷，25℃下反应2h，离心后弃去上清液，将沉淀物在无水乙醇中洗涤三次，真空干燥后得到量子点包硅微球；

3）将模板苯基膦酸加入无水乙醇中，加入3-脲丙基三甲氧基硅烷，预组装30分钟，然后将其加入到量子点包硅微球-乙醇溶液中，再加入正辛基三甲氧基硅烷，室温下搅拌12h，通过溶胶凝胶水解聚合反应在量子点包硅微球的表面形成分子印迹层，得到以量子点包硅微球为核、分子印迹层为壳的复合材料；

4）将洗脱剂甲醇-氢氧化钠的混合溶液加入到复合材料中，混合均匀，震荡30分钟，离心除去上清液，重新用上述洗脱剂甲醇-氢氧化钠的混合溶液洗涤，重复此过程直到用紫外分光光度计检测模板分子洗净为止，即可制得荧光型分子印迹探针。

所述巯基丙酸的CdCl₂溶液中巯基丙酸与CdCl₂的摩尔比为2.4:1；NaHTe溶液中NaBH₄与超纯水的用量比为45.5mg/mL，Te与NaBH₄的摩尔比为1:19；碲化镉量子点溶液中Te^2-与巯基丙酸的摩尔比为1:4.8。

所述量子点包硅微球中氨水的质量百分比浓度为25%，氨水、乙醇、四乙氧基硅烷（TEOS）、碲化镉量子点的用量比为200μL：40mL：100μL：8mL。

所述复合材料中量子点包硅微球-乙醇溶液的浓度为1.0mg/mL，量子点包硅微球-乙醇溶液、苯基膦酸、乙醇、3-脲丙基三甲氧基硅烷与正辛基三甲氧基硅烷的用量比为20mL：40mg：5mL：200μL：1.076mL。

所述洗脱剂中氢氧化钠的浓度为0.1mol/L，甲醇与氢氧化钠溶液的体积比为4：1；洗脱剂与复合材料的用量比为2mL/mg。

本发明的优点和积极效果是：

1）量子点作为荧光元素，合成荧光型分子印迹聚合物结合了量子点的高灵敏性和分子印迹的高选择性；

2）以量子点包硅微球为载体，采用表面印迹的方式，在载体表面修饰分子印迹层，识别位点接近表面，易于选择性识别目标分子；

3）采用抗原决定基法所合成的荧光探针可以识别目标分子酪氨酸磷酸化多肽并表现为荧光增强型效果。

附图说明

图1是该荧光型分子印迹探针的透射电镜图。

图2是该荧光型分子印迹探针对目标分子酪氨酸磷酸化多肽的识别性能的荧光表征。

图3是非印迹聚合物（参比）对目标分子酪氨酸磷酸化多肽的识别性能的荧光表征。

具体实施方式

实施例：

1）将0.0636g碲粉（Te）、0.363gNaBH₄与8mL超纯水混合，在氮气保护并搅拌的条件下还原碲粉得到NaHTe溶液，当反应液由紫色完全变为白色后，将NaHTe溶液快速加入到含巯基丙酸（MPA）的CdCl₂溶液中，含巯基丙酸（MPA）的CdCl₂溶液的用量比为12.5mLCdCl₂、53μL巯基丙酸和180mL超纯水，然后用浓度为1.0mol/L的NaOH水溶液调节溶液的pH为10.0，先在室温下搅拌30分钟，然后沸水浴加热2h，制得到碲化镉量子点溶液；

2）将8mL上述碲化镉量子点溶液加入40mL无水乙醇中，再加入200μL、质量百分比浓度为25%的氨水，搅拌条件下加入100μL四乙氧基硅烷，25℃下反应2h，离心后弃去上清液，将沉淀物在无水乙醇中洗涤三次，真空干燥后得到量子点包硅微球；

3）将40mg模板苯基膦酸加入5mL无水乙醇中，再加入200μL3-脲丙基三甲氧基硅烷，预组装30分钟，然后将其加入到20mL、浓度为1.0mg/mL的量子点包硅微球-乙醇溶液中，再加入1.076mL正辛基三甲氧基硅烷，室温下搅拌12h，通过溶胶凝胶水解聚合反应在量子点包硅微球的表面形成分子印迹层，得到以量子点包硅微球为核、分子印迹层为壳的复合材料；

4）将体积比为4：1的洗脱剂甲醇-氢氧化钠的混合溶液加入到上述复合材料中，洗脱剂与复合材料的用量比为2mL/mg，混合均匀并震荡30分钟，离心除去上清液，重新用上述洗脱剂甲醇-氢氧化钠的混合溶液洗涤，重复此过程直到用紫外分光光度计检测模板分子洗净为止，即可制得荧光型分子印迹探针。

制得的荧光型分子印迹探针对目标分子酪氨酸磷酸化多肽的识别性能检测：

将荧光型分子印迹探针和参照物分别加入到缓冲溶液中，超声分散，使两种物质的浓度均为100mg/mL,然后分别加入0-35μM不同浓度等体积酪氨酸磷酸化多肽，用荧光分光光度计来测定探针及参照物与目标分子酪氨酸磷酸化多肽的响应。荧光分光光度计：日立，日本，F-4500型；激发和发射狭缝均为10nm，激发波长设定在450nm，在490-700nm范围内记录实验数据，光电管的电压为700V。

图1是该荧光型分子印迹探针的透射电镜图，图中显示：该方法制备的分子探针粒子的尺寸约256nm，具有良好的分散性。

图2是该荧光型分子印迹探针对目标分子酪氨酸磷酸化多肽的识别性能的荧光表征，通过比较直线的斜率（探针的斜率与参比的斜率之比），可以说明探针的识别行为。

图3是非印迹聚合物（参比）对目标分子酪氨酸磷酸化多肽的识别性能的荧光表征。通过参比的对照，可以看出对相同浓度的目标分子，印迹聚合物的荧光响应增强，也说明了探针具有良好的识别行为。

Claims

1.一种荧光型分子印迹探针的制备方法，以碲化镉量子点为荧光元素，对碲化镉量子点进行包硅处理后作为载体，苯基膦酸为替代模板分子，采用表面印迹和抗原决定基法合成分子印迹探针，首先将碲粉(Te)、NaBH₄与超纯水混合，在氮气保护并搅拌的条件下还原碲粉得到NaHTe溶液，将NaHTe溶液快速加入到含巯基丙酸(MPA)的CdCl₂溶液中，用浓度为1.0mol/L的NaOH水溶液调节溶液的pH为10.0，先在室温下搅拌30分钟，然后沸水浴加热2h，制得到碲化镉量子点溶液，其特征在于包括如下步骤：

1)将上述碲化镉量子点溶液加入无水乙醇中，再加入氨水，搅拌条件下加入四乙氧基硅烷，25℃下反应2h，离心后弃去上清液，将沉淀物在无水乙醇中洗涤三次，真空干燥后得到量子点包硅微球；

2)将模板苯基膦酸加入无水乙醇中，加入3-脲丙基三甲氧基硅烷，预组装30分钟，然后将其加入到量子点包硅微球-乙醇溶液中，再加入正辛基三甲氧基硅烷，室温下搅拌12h，通过溶胶凝胶水解聚合反应在量子点包硅微球的表面形成分子印迹层，得到以量子点包硅微球为核、分子印迹层为壳的复合材料；

3)将洗脱剂甲醇-氢氧化钠的混合溶液加入到复合材料中，混合均匀，震荡30分钟，离心除去上清液，重新用上述洗脱剂甲醇-氢氧化钠的混合溶液洗涤，重复此过程直到用紫外分光光度计检测模板分子洗净为止，即可制得荧光型分子印迹探针。

2.根据权利要求1所述荧光型分子印迹探针的制备方法，其特征在于：所述巯基丙酸的CdCl₂溶液中巯基丙酸与CdCl₂的摩尔比为2.4:1；NaHTe溶液中NaBH₄与超纯水的用量比为45.5mg/mL，Te与NaBH₄的摩尔比为1:19；碲化镉量子点溶液中Te与巯基丙酸的摩尔比为1:4.8。

3.根据权利要求1所述荧光型分子印迹探针的制备方法，其特征在于：所述量子点包硅微球中氨水的质量百分比浓度为25％，氨水、乙醇、四乙氧基硅烷(TEOS)、碲化镉量子点的用量比为200μL：40mL：100μL：8mL。

4.根据权利要求1所述荧光型分子印迹探针的制备方法，其特征在于：所述复合材料中量子点包硅微球-乙醇溶液的浓度为1.0mg/mL，量子点包硅微球-乙醇溶液、苯基膦酸、乙醇、3-脲丙基三甲氧基硅烷与正辛基三甲氧基硅烷的用量比为20mL：40mg：5mL：200μL：1.076mL。

5.根据权利要求1所述荧光型分子印迹探针的制备方法，其特征在于：所述洗脱剂中氢氧化钠的浓度为0.1mol/L，甲醇与氢氧化钠溶液的体积比为4：1；洗脱剂与分子印迹探针的用量比为2mL/mg。