CN113292749B - 一种用于根系分泌物原位可视化检测的荧光印迹膜及其制备与应用 - Google Patents

一种用于根系分泌物原位可视化检测的荧光印迹膜及其制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于根系分泌物原位可视化检测的荧光印迹膜及其制备与应用。本发明以碲化镉量子点为荧光检测源，将其包合于以单一植物根系分泌物为模板、氨丙基硅氧烷、苯基硅氧烷、交联剂的分子印迹聚合物中，最后负载于凝胶膜上，制得成原位可视化特异性检测绿原酸的荧光印迹膜。所得荧光印迹膜可原位可视化检测分泌物植物根系分泌物，能够在复杂的体系中只对特定分泌物进行特异性响应，且特异性响应值高，安全无毒，可重复利用。

Description

一种用于根系分泌物原位可视化检测的荧光印迹膜及其制备 与应用
技术领域
本发明属于能源化工领域(包括化学、材料科学、能源科学与技术、化学工程、纺织科学技术、食品科学技术、环境科学技术、安全科学技术等)领域，具体涉及一种用于根系分泌物原位可视化检测的荧光印迹膜及其制备与应用。
背景技术
根系分泌物是根系高效活化土壤养分的主要成分，对提高根际土壤养分的有效性意义重大，并且强烈影响着土壤微生物的种类、数量及其在植物根际的分布，研究根系分泌物以及其和土壤微生物关系一直是科学界的重点和难点。但是，土壤中根系分泌物的分解、根系分泌物本身含量低、成分复杂以及土壤环境带来的干扰，给研究带来了很大的困难。
目前，研究根系分泌物的方法大多是先收集提纯后检测，通常是通过构建采集系统收集根系分泌物，由于收集时是从根系部位用溶剂洗脱下来，损失严重、准确性差，对微量分泌物而言，先洗脱、再从洗脱液中分离纯化困难重重，此外容易对根系造成扰动，而且难以知道特定分泌物的具体分泌部位和分泌数量。因此，急切地需要发明一种在根系原位进行特异性检测根系分泌物的方法来检测根系分泌物的具体分泌部位和分泌量。
现有的检测方法均为原位收集根系分泌物，再对分泌物进行分离检测，虽然实现了原位收集植物分泌物，能够减少对植物的伤害，较传统的分泌物收集方式而言，对植物分泌物的鉴定更加准确、快速，但是仍然没有达到原位检测的功能，还是存在使用传统柱色谱等检测繁琐性的缺点，收集后的多种根系分泌物混杂在一起，仍然需要通过柱色谱等操作才能进行分离检测，步骤繁琐，不能节省时间。同时，原位收集装置部件较多，组装不方便，并且仪器装置成本较高，需要一定的实验空间安置收集与检测的仪器设备，不能实现对根系分泌物的检测实现快速、便捷。
综上，目前实现原位可视化是根系分泌物检测领域的一个重点难点，没有较为简便敏锐的检测手段，根系分泌物将在提取纯化过程中造成损失并对根系造成不可逆的伤害。
发明内容
为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种用于根系分泌物原位可视化检测的荧光印迹膜的制备方法。
本发明以植物根系分泌物绿原酸为模板分子为例，以碲化镉量子点为荧光检测源，将其包合于以绿原酸为模板、以3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)作为功能单体、以正硅酸乙酯(TEOS)作为交联剂的分子印迹聚合物中，最后负载于凝胶膜上，设计成原位可视化特异性检测绿原酸的荧光印迹膜。
本发明的另一目的在于提供上述方法制得的一种用于根系分泌物原位可视化检测的荧光印迹膜。
本发明的再一目的在于提供一种用于根系分泌物原位可视化检测的荧光印迹膜的应用。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种用于根系分泌物原位可视化检测的荧光印迹膜的制备方法，包括以下步骤：
(1)CdTe量子点的制备：
将硼氢化钠(NaBH4)和碲粉混合均匀并分散于水中，常温下避光反应，得到前驱体NaHTe溶液；将氯化镉(CdCl2)和巯基乙酸(TGA)溶于水中，调节pH至碱性，通氮除氧，加入前驱体NaHTe溶液，加热反应，得到CdTe QDs溶液，洗涤，离心，冻干，得到量子点粉末；
(2)采用反相微乳法制备CdTe@SiO2@MIPs：
将连续相、表面活性剂和水混合均匀形成微乳液，加入CdTe量子点溶液并混匀，然后依次加入催化剂NH3·H2O和交联剂并混合均匀，持续搅拌进行包硅反应，再加入氨丙基硅氧烷、苯基硅氧烷或十六烷基三甲氧基硅烷、植物根系分泌物溶液、交联剂并充分混匀，持续搅拌进行印迹反应，反应后加入丙酮超声破乳，纯化，干燥得到CdTe@SiO2@MIPs分子印迹聚合物粉末；
(3)负载CdTe@SiO2@MIPs凝胶印迹膜的制备：
将琼脂和水溶性天然或合成高分子化合物溶解于水中，加入羧甲基纤维素钠(CMC-Na)并搅拌均匀，得到高分子化合物混合溶液，冷却至室温，加入CdTe@SiO2@MIPs分子印迹聚合物粉末并混合均匀，自然晾干脱水成膜，即得负载CdTe@SiO2@MIPs凝胶印迹膜。
优选地，步骤(1)所述硼氢化钠(NaBH4)和碲粉的质量比为1：(1～2)。
优选地，步骤(1)所述硼氢化钠和碲粉混合均匀并分散于水中，所得溶液中硼氢化钠的浓度为1.6～3.0wt％。
优选地，步骤(1)所述常温下避光反应的时间为6～12h。
优选地，步骤(1)所述氯化镉和巯基乙酸溶于水中，巯基乙酸与水的体积比为(1～3)：100；所得水溶液中氯化镉的浓度为0.8～1wt％。
优选地，步骤(1)所述巯基乙酸(TGA)与前驱体NaHTe溶液的体积比为(1～1.5)：50。
优选地，步骤(1)中调节pH指将体系的pH值调至8～11。
优选地，步骤(1)所述加热反应的温度为90～120℃，时间为3～9h。
优选地，步骤(2)所述连续相为环己烷、二甲基亚砜、石油醚和丙烯酸中的至少一种。
优选地，步骤(2)所述表面活性剂为壬基酚聚氧乙烯醚(NP-10)、曲拉通X-100、吐温20和三乙醇胺中的至少一种。
优选地，步骤(2)所述连续相、表面活性剂、水和CdTe量子点溶液的体积比为100：(10～14)：1：4。
优选地，步骤(2)所述CdTe量子点溶液的浓度为0.5～1.5‰。
优选地，步骤(2)所述交联剂为正硅酸乙酯(TEOS)、正硅酸甲酯、正硅酸丙酯和三乙氧基硅烷中的至少一种。
优选地，步骤(2)所述CdTe量子点溶液、催化剂NH3·H2O和第一次加入交联剂的体积比为4：1：(0.5～1.5)。
优选地，步骤(2)所述CdTe量子点溶液、氨丙基硅氧烷、苯基硅氧烷或十六烷基三甲氧基硅烷、植物根系分泌物溶液和第二次加入交联剂的体积比为40：(1～2)：1：2：5。
优选地，步骤(2)所述氨丙基硅氧烷为3-氨丙基三乙氧基硅烷、3-氨丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基三羟基基硅烷和γ-氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷中的至少一种。
优选地，步骤(2)所述苯基硅氧烷为苯基三乙氧基硅烷、苯基三甲氧基硅烷和二苯基二甲氧基硅烷中的至少一种。
优选地，步骤(2)所述植物根系分泌物溶液的浓度为30～40wt％。
优选地，步骤(2)所述植物根系分泌物溶剂中的植物根系分泌物是根据植物所需检测的分泌物而加入，为绿原酸、苯甲酸、香草醛、阿魏酸和叶绿醇等根系分泌物中的一种，根据检测的分泌物更改模板。
优选地，步骤(2)所述包硅反应的时间为4～8h；所述印迹反应的时间为16～24h。
优选地，步骤(2)所述丙酮的体积与产物混合液体积比为4：(1～2)。
优选地，步骤(2)所述纯化的方法为：将加入丙酮超声破乳后的溶液进行离心，取沉淀物，分别用环己烷、乙醇、蒸馏水离心洗涤沉淀物，所得产物用体积比为(1～2)：9的酸与醇或酸与乙腈组成的混合液洗脱掉植物根系分泌物，得到纯化产物。
更优选地，所述酸为甲酸、醋酸、盐酸和硝酸中的至少一种；所述醇为乙醇和甲醇中的至少一种。
优选地，步骤(2)所述干燥方法为冷冻真空干燥。
优选地，步骤(3)所述水溶性天然或合成高分子化合物为聚乙烯醇、海藻酸钠、乙基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、α-环糊精和羟乙基纤维素其中一种。
优选地，步骤(3)所述琼脂、水溶性天然高分子或合成高分子化合物、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)的质量比为1：(1～2)：2。
优选地，步骤(3)所述高分子化合物混合溶液中天然高分子或合成高分子化合物的质量分数为2～10％。
优选地，步骤(3)所述CdTe@SiO2@MIPs分子印迹聚合物在高分子化合物混合液中的浓度为2～3wt％。
上述方法制得的一种用于根系分泌物原位可视化检测的荧光印迹膜。
本发明设计了一种利用荧光分析手段，结合分子印迹技术，合成一种对单一根系分泌物特异性识别的荧光探针，然后将其负载在凝胶膜上。所得膜材料可以让根系铺展于上面生长一段时间，通过凝胶成像系统并结合激光共聚焦显微镜可精准分析根系分泌物的具体的分泌部位和分泌量。
本发明通过将单一特定的植物根系分泌物作为上述制备方法步骤(2)中的模板材料，通过洗脱纯化、负载等步骤制得的荧光印迹膜可相应原位可视化检测出对应的根系分泌物的分泌情况。
上述一种用于根系分泌物原位可视化检测的荧光印迹膜在根系分泌物原位可视化检测中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
1、本发明提供的荧光印迹膜具有原位可视化检测分泌物的特点，通过将荧光印迹膜包裹在待测植物的根系一段时间后取下，根系的不同分泌物与荧光印迹膜特异性识别，使荧光发生响应变化，分析检测的过程中不需要分离纯化目标产物，只需要借助凝胶成像系统和激光扫描共聚焦显微镜即可实现原位可视化检测根系分泌物的情况，得到荧光响应强度，再根据荧光响应曲线得到对应的分泌物浓度，相比传统的色谱检测，省时高效。
2、本发明利用CdCl2和TeO2制备CdTe量子点，再通过反相微乳法构建分子印迹硅壳，能与常见的植物分泌物绿原酸发生特异性结合，再利用PVA、琼脂和CMC-Na制备凝胶膜作为载体，采用分子印迹技术制备成的荧光探针，能够在复杂的体系中只对特定分泌物进行特异性响应，且特异性响应值非常高。
3、本发明制备的根系分泌物原位可视化检测的荧光印迹膜，安全无毒性作用，可重复利用，不需要多种机器设备收集和检测，操作简便。
4、本实验设计思路具有启发性，可根据不同的模板构建不同的膜，设计出能够特异性检测该种物质的材料，为根系分泌物的相关研究提供了指导方向，具有广泛的应用。
附图说明
图1为实施例3步骤(1)加入前驱体NaHTe溶液后，反应体系(CdTe QDs)溶液随反应时间变化的荧光图，从加热反应开始，每间隔1h取样检测，所得样品按图中顺序从左至右排序。
图2为实施例1所得的CdTe@SiO2@MIPs的SEM图。
图3为实施例9中CdTe@SiO2@MIPs分子印迹聚合物加入不同量绿原酸的荧光发射谱图。
图4为实施例10中绿原酸特异性识别CdTe@SiO2@MIPs分子印迹聚合物的效果图，图片从左往右表明分子印迹聚合物溶液的荧光随着绿原酸溶液的逐渐滴加呈现出由局部淬灭至完全淬灭的现象。
图5为实施例1所得CdTe@SiO2@MIPs荧光印迹膜(左)以及实施例11中绿原酸特异性识别CdTe@SiO2@MIPs荧光印迹膜(右)的效果图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用未注明生产厂商者的原料、试剂等，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
(1)CdTe量子点的制备
将1.6g硼氢化钠和1.6g碲粉混合均匀，随后分散于100mL蒸馏水中，常温条件下避光反应6h得到CdTe量子点中Te的前驱体NaHTe溶液。将0.4g氯化镉和0.5mL巯基乙酸(TGA)溶于50mL蒸馏水中，加入质量分数为5％NaOH溶液调节pH至10，通氮气除氧0.5h后，将25mL前驱体NaHTe溶液加入到该混合溶液中，将混合溶液水浴加热至90℃进行回流反应3h，得到CdTe QDs溶液，用无水乙醇洗涤3次，离心后进行冷冻干燥12h，得到CdTe QDs粉末。
(2)CdTe@SiO2@MIPs分子印迹聚合物的制备
采用反相微乳法制备CdTe@SiO2@MIPs：在圆底烧瓶中加入100mL环己烷、10mL NP-10、1mL蒸馏水，超声20min形成微乳液。称量0.002g CdTe QDs粉末，溶于4mL蒸馏水中，配制CdTe QDs溶液，称量60mg绿原酸粉末，溶于200μL蒸馏水配制成绿原酸溶液。往微乳液中加入4mL上述CdTe QDs溶液，搅拌15min使其分散均匀。加入1mL催化剂NH3·H2O搅拌混合均匀，再加入0.5mL正硅酸乙酯(TEOS)充分搅拌混合4h。先后加入100μL功能单体3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、100μL苯基三乙氧基硅烷(PTEOS)、200μL模板绿原酸溶液、500μL交联剂正硅酸乙酯(TEOS)并充分进行印迹反应16h。反应结束后，将产物溶液转移至多个离心管中洗涤，每个离心管中转移10mL产物溶液，再分别加入40mL丙酮进行超声破乳。6000rpm高速离心5min，除去上清液，保留沉淀物。沉淀物依次用环己烷、乙醇、蒸馏水洗涤2、2、3次，每次6000rpm高速离心5min。洗涤后保留产物，加入2mL甲酸和18mL乙醇混合溶液洗脱分子印迹聚合物中的模板分子，离心后对产物进行冷冻干燥12h，得到CdTe@SiO2@MIPs分子印迹聚合物粉末。
(3)负载CdTe@SiO2@MIPs凝胶印迹膜的制备
取2g琼脂和2g明胶，加入100mL蒸馏水加热至95℃溶解，随后加入4g羧甲基纤维素钠(CMC-Na)并搅拌均匀，得到明胶混合溶液。冷却至室温，加入2g上述CdTe@SiO2@MIPs，搅拌混合均匀后倒入培养皿。将培养皿置于室温条件下自然烘干使之脱水形成膜。
实施例2
(1)CdTe量子点的制备
将1.6g硼氢化钠(NaBH4)和3.2g碲粉混合均匀，随后分散于100mL蒸馏水中，常温条件下避光反应6h得到CdTe量子点中Te的前驱体NaHTe溶液。将0.5g氯化镉和0.5mL巯基乙酸(TGA)溶于50mL蒸馏水中，加入质量分数为5％的NaOH溶液调节pH至10，通氮气除氧0.5h后，将17mL前驱体NaHTe溶液加入到该混合溶液中，将混合溶液水浴加热至120℃进行回流反应3h，得到CdTe QDs溶液，用无水乙醇洗涤3次，离心后进行冷冻干燥12h，得到CdTe QDs粉末。
(2)CdTe@SiO2@MIPs分子印迹聚合物的制备
采用反相微乳法制备CdTe@SiO2@MIPs：在圆底烧瓶中加入100mL环己烷、14mL NP-10、1mL蒸馏水，超声20min形成微乳液。称量0.006g CdTe QDs粉末，溶于4mL蒸馏水中，配制CdTe QDs溶液，称量80mg绿原酸粉末，溶于200μL蒸馏水配制成绿原酸溶液。往微乳液中加入4mL上述CdTe QDs溶液，搅拌15min使其分散均匀。加入1mL催化剂NH3·H2O搅拌混合均匀，再加入1.5mL三乙氧基硅烷充分搅拌混合8h。先后加入200μL功能单体3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、100μL苯基三乙氧基硅烷(PTEOS)、200μL模板绿原酸溶液、500μL交联剂三乙氧基硅烷并充分反应24h。反应结束后，将产物溶液转移至多个离心管中洗涤，每个离心管中转移10mL产物溶液，再分别20mL丙酮进行超声破乳。6000rpm高速离心5min，除去上清液，保留沉淀物。沉淀物分别用环己烷、乙醇、蒸馏水洗涤2、2、3次，每次6000rpm高速离心5min。洗涤后保留产物，加入4mL甲酸和18mL乙醇混合溶液洗脱分子印迹聚合物中的模板分子，离心后对产物进行冷冻干燥12h，得到CdTe@SiO2@MIPs分子印迹聚合物粉末。
(3)负载CdTe@SiO2@MIPs凝胶印迹膜的制备
取5g琼脂和10g聚乙烯醇(PVA)，加入100mL蒸馏水加热至95℃溶解，随后加入10g羧甲基纤维素钠(CMC-Na)并搅拌均匀，得到聚乙烯醇混合溶液。冷却至室温，加入3g上述CdTe@SiO2@MIPs，搅拌混合均匀后倒入培养皿。将培养皿置于室温条件下自然烘干使之脱水形成膜。
实施例3
(1)CdTe量子点的制备
将3g硼氢化钠(NaBH4)和3g碲粉混合均匀，随后分散于100mL蒸馏水中，常温条件下避光反应12h得到CdTe量子点中Te的前驱体NaHTe溶液。将0.5g氯化镉(CdCl2)和1.5mL巯基乙酸(TGA)溶于50mL蒸馏水中，加入质量分数为5％的NaOH溶液调节pH至10，通氮气除氧0.5h后，将75mL前驱体NaHTe溶液加入到该混合溶液中，将混合溶液水浴加热至90℃进行回流反应9h，得到CdTe QDs溶液，用无水乙醇洗涤3次，离心后进行冷冻干燥12h，得到CdTe量子点粉末。
(2)CdTe@SiO2@MIPs分子印迹聚合物的制备
采用反相微乳法制备CdTe@SiO2@MIPs：在圆底烧瓶中加入100mL环己烷、10mL NP-10、1mL蒸馏水，超声20min形成微乳液。称量0.004g CdTe QDs粉末，溶于4mL蒸馏水中，配制CdTe QDs溶液，称量70mg绿原酸粉末，溶于200μL蒸馏水配制成绿原酸溶液。往微乳液中加入4mL上述CdTe QDs溶液，搅拌15min使其分散均匀。加入1mL催化剂NH3·H2O搅拌混合均匀，再加入500μL正硅酸乙酯(TEOS)并充分搅拌混合4h。先后加入100μL功能单体3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、100μL苯基三乙氧基硅烷(PTEOS)、200μL模板绿原酸溶液、500μL交联剂正硅酸乙酯(TEOS)并充分反应16h。反应结束后，将产物溶液转移至多个离心管中洗涤，每个离心管中转移10mL产物溶液，再分别向混合溶液加入40mL丙酮进行超声破乳。6000rpm高速离心5min，除去上清液，保留沉淀物。沉淀物分别用环己烷、乙醇、蒸馏水洗涤2、2、3次，每次6000rpm高速离心5min。洗涤后保留产物，加入2mL醋酸和18mL乙醇混合溶液洗脱分子印迹聚合物中的模板分子，离心后对产物进行冷冻干燥12h，得到CdTe@SiO2@MIPs分子印迹聚合物粉末。
(3)负载CdTe@SiO2@MIPs凝胶印迹膜的制备
取10g琼脂和10g羟丙基纤维素，加入100mL蒸馏水加热至95℃溶解，随后加入20g羧甲基纤维素钠(CMC-Na)并搅拌均匀，得到羟丙基纤维素混合溶液。冷却至室温，加入3g上述CdTe@SiO2@MIPs，搅拌混合均匀后倒入培养皿。将培养皿置于室温条件下自然烘干使之脱水形成膜。
实施例4
(1)CdTe量子点的制备
将2g硼氢化钠(NaBH4)和2g碲粉混合均匀，随后分散于100mL蒸馏水中，常温条件下避光反应12h得到CdTe量子点中Te的前驱体NaHTe溶液。将0.45g氯化镉(CdCl2)和1.0mL巯基乙酸(TGA)溶于50mL蒸馏水中，加入质量分数为5％的NaOH溶液调节pH至8，通氮气除氧0.5h后，将50mL前驱体NaHTe溶液加入到该混合溶液中，将混合溶液水浴加热至100℃进行回流反应3h，得到CdTe QDs溶液，用无水乙醇洗涤3次，离心后进行冷冻干燥12h，得到CdTeQDs粉末。
(2)CdTe@SiO2@MIPs分子印迹聚合物的制备
采用反相微乳法制备CdTe@SiO2@MIPs：在圆底烧瓶中加入100mL环己烷、12mL NP-10、1mL蒸馏水，超声20min形成微乳液。称量0.004g CdTe QDs粉末，溶于4mL蒸馏水中，配制CdTe QDs溶液，称量80mg苯甲酸粉末，溶于200μL蒸馏水配制成苯甲酸溶液。往微乳液中加入4mL上述CdTe QDs溶液，搅拌15min使其分散均匀。加入1mL催化剂NH3·H2O搅拌混合均匀，再加入1.5mL正硅酸乙酯(TEOS)并充分搅拌混合8h。先后加入150μL功能单体3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、100μL苯基三乙氧基硅烷(PTEOS)、200μL模板苯甲酸溶液、500μL交联剂正硅酸乙酯(TEOS)并充分反应24h。反应结束后，将产物溶液转移至多个离心管中洗涤，每个离心管中转移10mL产物溶液，再分别向混合溶液加入20mL丙酮超声破乳。6000rpm高速离心5min，除去上清液，保留沉淀物。沉淀物分别用环己烷、乙醇、蒸馏水洗涤2、2、3次，每次6000rpm高速离心5min。洗涤后保留产物，加入4mL醋酸和18mL甲醇混合溶液洗脱分子印迹聚合物中的模板分子，离心后对产物进行冷冻干燥12h，得到CdTe@SiO2@MIPs分子印迹聚合物粉末。
(3)负载CdTe@SiO2@MIPs凝胶印迹膜的制备
取5g琼脂和10g聚乙烯醇(PVA)，加入100mL蒸馏水加热至95℃溶解，随后加入10g羧甲基纤维素钠(CMC-Na)并搅拌均匀，得到聚乙烯醇混合溶液。冷却至室温，加入2.5g上述CdTe@SiO2@MIPs，搅拌混合均匀后倒入培养皿。将培养皿置于室温条件下自然烘干使之脱水形成膜。
实施例5
(1)CdTe量子点的制备
将1.6g硼氢化钠和1.6g碲粉混合均匀，随后分散于100mL蒸馏水中，常温条件下避光反应6h得到CdTe量子点中Te的前驱体NaHTe溶液。将0.4g氯化镉和0.5mL巯基乙酸(TGA)溶于50mL蒸馏水中，加入质量分数为5％NaOH溶液调节pH至10，通氮气除氧0.5h后，将25mL前驱体NaHTe溶液加入到该混合溶液中，将混合溶液水浴加热至90℃进行回流反应3h，得到CdTe QDs溶液，用无水乙醇洗涤3次，离心后进行冷冻干燥12h，得到CdTe QDs粉末。
(2)CdTe@SiO2@MIPs分子印迹聚合物的制备
采用反相微乳法制备CdTe@SiO2@MIPs：在圆底烧瓶中加入100mL二甲基亚砜、10mL曲拉通X-100、1mL蒸馏水，超声20min形成微乳液。称量0.002g CdTe QDs粉末，溶于4mL蒸馏水中，配制CdTe QDs溶液，称量60mg香草醛粉末，溶于200μL蒸馏水配制成香草醛溶液。往微乳液中加入4mL上述CdTe QDs溶液，搅拌15min使其分散均匀。加入1mL催化剂NH3·H2O搅拌混合均匀，再加入0.5mL正硅酸甲酯充分搅拌混合4h。先后加入100μL功能单体3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)、100μL苯基三甲氧基硅烷、200μL模板香草醛溶液、500μL交联剂正硅酸甲酯并充分进行印迹反应16h。反应结束后，将产物溶液转移至多个离心管中洗涤，每个离心管中转移10mL产物溶液，再分别加入40mL丙酮进行超声破乳。6000rpm高速离心5min，除去上清液，保留沉淀物。沉淀物依次用环己烷、乙醇、蒸馏水洗涤2、2、3次，每次6000rpm高速离心5min。洗涤后保留产物，加入2mL醋酸和18mL乙腈混合溶液洗脱分子印迹聚合物中的模板分子，离心后对产物进行冷冻干燥12h，得到CdTe@SiO2@MIPs分子印迹聚合物粉末。
(3)负载CdTe@SiO2@MIPs凝胶印迹膜的制备
取2g琼脂和2g海藻酸钠，加入100mL蒸馏水加热至95℃溶解，随后加入4g羧甲基纤维素钠(CMC-Na)并搅拌均匀，得到海藻酸钠混合溶液。冷却至室温，加入2g上述CdTe@SiO2@MIPs，搅拌混合均匀后倒入培养皿。将培养皿置于室温条件下自然烘干使之脱水形成膜。
实施例6
(1)CdTe量子点的制备
将1.6g硼氢化钠(NaBH4)和3.2g碲粉混合均匀，随后分散于100mL蒸馏水中，常温条件下避光反应6h得到CdTe量子点中Te的前驱体NaHTe溶液。将0.5g氯化镉和0.5mL巯基乙酸(TGA)溶于50mL蒸馏水中，加入质量分数为5％的NaOH溶液调节pH至10，通氮气除氧0.5h后，将17mL前驱体NaHTe溶液加入到该混合溶液中，将混合溶液水浴加热至120℃进行回流反应3h，得到CdTe QDs溶液，用无水乙醇洗涤3次，离心后进行冷冻干燥12h，得到CdTe QDs粉末。
(2)CdTe@SiO2@MIPs分子印迹聚合物的制备
采用反相微乳法制备CdTe@SiO2@MIPs：在圆底烧瓶中加入100mL石油醚、14mL吐温20、1mL蒸馏水，超声20min形成微乳液。称量0.006g CdTe QDs粉末，溶于4mL蒸馏水中，配制CdTe QDs溶液，称量80mg阿魏酸粉末，溶于200μL蒸馏水配制成阿魏酸溶液。往微乳液中加入4mL上述CdTe QDs溶液，搅拌15min使其分散均匀。加入1mL催化剂NH3·H2O搅拌混合均匀，再加入1.5mL正硅酸丙酯(TEOS)充分搅拌混合8h。先后加入200μL功能单体3-氨丙基三羟基硅烷、100μL十六烷基三甲氧基硅烷、200μL模板绿原酸溶液、500μL交联剂正硅酸丙酯并充分反应24h。反应结束后，将产物溶液转移至多个离心管中洗涤，每个离心管中转移10mL产物溶液，再分别20mL丙酮进行超声破乳。6000rpm高速离心5min，除去上清液，保留沉淀物。沉淀物分别用环己烷、乙醇、蒸馏水洗涤2、2、3次，每次6000rpm高速离心5min。洗涤后保留产物，加入4mL盐酸和18mL乙醇混合溶液洗脱分子印迹聚合物中的模板分子，离心后对产物进行冷冻干燥12h，得到CdTe@SiO2@MIPs分子印迹聚合物粉末。
(3)负载CdTe@SiO2@MIPs凝胶印迹膜的制备
取5g琼脂和10g羟乙基纤维素，加入100mL蒸馏水加热至95℃溶解，随后加入10g羧甲基纤维素钠(CMC-Na)并搅拌均匀，得到羟乙基纤维素混合溶液。冷却至室温，加入3g上述CdTe@SiO2@MIPs，搅拌混合均匀后倒入培养皿。将培养皿置于室温条件下自然烘干使之脱水形成膜。
实施例7
(1)CdTe量子点的制备
将3g硼氢化钠(NaBH4)和3g碲粉混合均匀，随后分散于100mL蒸馏水中，常温条件下避光反应12h得到CdTe量子点中Te的前驱体NaHTe溶液。将0.5g氯化镉(CdCl2)和1.5mL巯基乙酸(TGA)溶于50mL蒸馏水中，加入质量分数为5％的NaOH溶液调节pH至10，通氮气除氧0.5h后，将75mL前驱体NaHTe溶液加入到该混合溶液中，将混合溶液水浴加热至90℃进行回流反应9h，得到CdTe QDs溶液，用无水乙醇洗涤3次，离心后进行冷冻干燥12h，得到CdTe量子点粉末。
(2)CdTe@SiO2@MIPs分子印迹聚合物的制备
采用反相微乳法制备CdTe@SiO2@MIPs：在圆底烧瓶中加入100mL丙烯酸、10mL三乙醇胺、1mL蒸馏水，超声20min形成微乳液。称量0.004g CdTe QDs粉末，溶于4mL蒸馏水中，配制CdTe QDs溶液，称量70mg叶绿醇粉末，溶于200μL蒸馏水配制成叶绿醇溶液。往微乳液中加入4mL上述CdTe QDs溶液，搅拌15min使其分散均匀。加入1mL催化剂NH3·H2O搅拌混合均匀，再加入500μL正硅酸乙酯(TEOS)并充分搅拌混合4h。先后加入100μL功能单体γ-氨乙基氨丙基三甲基硅烷、100μL二苯基二甲氧基硅烷、200μL模板叶绿醇溶液、500μL交联剂正硅酸乙酯(TEOS)并充分反应16h。反应结束后，将产物溶液转移至多个离心管中洗涤，每个离心管中转移10mL产物溶液，再分别向混合溶液加入40mL丙酮进行超声破乳。6000rpm高速离心5min，除去上清液，保留沉淀物。沉淀物分别用环己烷、乙醇、蒸馏水洗涤2、2、3次，每次6000rpm高速离心5min。洗涤后保留产物，加入2mL硝酸酸和18mL甲醇混合溶液洗脱分子印迹聚合物中的模板分子，离心后对产物进行冷冻干燥12h，得到CdTe@SiO2@MIPs分子印迹聚合物粉末。
(3)负载CdTe@SiO2@MIPs凝胶印迹膜的制备
取10g琼脂和10gα-环糊精，加入100mL蒸馏水加热至95℃溶解，随后加入20g羧甲基纤维素钠(CMC-Na)并搅拌均匀，得到α-环糊精混合溶液。冷却至室温，加入3g上述CdTe@SiO2@MIPs，搅拌混合均匀后倒入培养皿。将培养皿置于室温条件下自然烘干使之脱水形成膜。
实施例8
(1)CdTe量子点的制备
将2g硼氢化钠(NaBH4)和2g碲粉混合均匀，随后分散于100mL蒸馏水中，常温条件下避光反应12h得到CdTe量子点中Te的前驱体NaHTe溶液。将0.45g氯化镉(CdCl2)和1.0mL巯基乙酸(TGA)溶于50mL蒸馏水中，加入质量分数为5％的NaOH溶液调节pH至8，通氮气除氧0.5h后，将50mL前驱体NaHTe溶液加入到该混合溶液中，将混合溶液水浴加热至100℃进行回流反应3h，得到CdTe QDs溶液，用无水乙醇洗涤3次，离心后进行冷冻干燥12h，得到CdTeQDs粉末。
(2)CdTe@SiO2@MIPs分子印迹聚合物的制备
采用反相微乳法制备CdTe@SiO2@MIPs：在圆底烧瓶中加入100mL环己烷、12mL吐温20、1mL蒸馏水，超声20min形成微乳液。称量0.004g CdTe QDs粉末，溶于4mL蒸馏水中，配制CdTe QDs溶液，称量80mg苯甲酸粉末，溶于200μL蒸馏水配制成苯甲酸溶液。往微乳液中加入4mL上述CdTe QDs溶液，搅拌15min使其分散均匀。加入1mL催化剂NH3·H2O搅拌混合均匀，再加入1.5mL正硅酸乙酯(TEOS)并充分搅拌混合8h。先后加入150μL功能单体3-氨丙基三乙甲氧基硅烷(APTMS)、100μL苯基三乙氧基硅烷(PTEOS)、200μL模板苯甲酸溶液、500μL交联剂正硅酸乙酯(TEOS)并充分反应24h。反应结束后，将产物溶液转移至多个离心管中洗涤，每个离心管中转移10mL产物溶液，再分别向混合溶液加入20mL丙酮超声破乳。6000rpm高速离心5min，除去上清液，保留沉淀物。沉淀物分别用环己烷、乙醇、蒸馏水洗涤2、2、3次，每次6000rpm高速离心5min。洗涤后保留产物，加入4mL甲酸和18mL甲醇混合溶液洗脱分子印迹聚合物中的模板分子，离心后对产物进行冷冻干燥12h，得到CdTe@SiO2@MIPs分子印迹聚合物粉末。
(3)负载CdTe@SiO2@MIPs凝胶印迹膜的制备
取5g琼脂和10g聚乙烯醇(PVA)，加入100mL蒸馏水加热至95℃溶解，随后加入10g羧甲基纤维素钠(CMC-Na)并搅拌均匀，得到聚乙烯醇混合溶液。冷却至室温，加入2.5g上述CdTe@SiO2@MIPs，搅拌混合均匀后倒入培养皿。将培养皿置于室温条件下自然烘干使之脱水形成膜。
实施例9不同量的绿原酸对CdTe@SiO2@MIPs分子印迹聚合物荧光强度的影响
按照实施例1步骤2的制备方法得到CdTe@SiO2@MIPs分子印迹聚合物粉末，称量0.5g分子印迹聚合物粉末，加入100mL水，制备浓度为0.5g/mL的溶液，称量10mg的绿原酸，加入100ml水中，制备浓度为0.1mg/mL的绿原酸溶液，将体积为0μL、100μL、200μL、300μL、400μL的绿原酸溶液加入到上述制备的含有CdTe@SiO2@MIPs分子印迹聚合物的测试溶液中，随后利用分子荧光分光光度计对测试液进行测定，并记录相应数值。
实施例10CdTe@SiO2@MIPs的特异性识别实验
按实施例3方法制备得到CdTe@SiO2@MIPs分子印迹聚合物粉末，将粉末溶于水中，配制CdTe@SiO2@MIPs浓度为2％的溶液，溶液在紫外分析仪365nm紫外光下呈现黄色。将浓度为0.01％的绿原酸溶液逐滴滴加到上述溶液中，绿原酸与分子印迹聚合物发生特异性识别，使后者发生荧光淬灭，溶液的荧光随着绿原酸溶液的逐渐滴加呈现出由局部淬灭至完全淬灭的现象。
实施例11CdTe@SiO2@MIPs荧光印迹膜的特异性识别实验
按实施例1方法制备负载CdTe@SiO2@MIPs凝胶印迹膜，烘干后的薄膜在紫外分析仪365nm紫外光下呈现黄色，将浓度为0.01％的绿原酸溶液滴加到印迹膜上，绿原酸与印迹膜发生特异性识别，使后者发生荧光淬灭。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于根系分泌物原位可视化检测的荧光印迹膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将硼氢化钠和碲粉混合均匀并分散于水中，常温下避光反应6～12 h，得到前驱体NaHTe溶液；将氯化镉和巯基乙酸溶于水中，调节pH至碱性，通氮除氧，加入前驱体NaHTe溶液，90～120℃加热反应3～9h，得到CdTe QDs溶液，洗涤，离心，冻干，得到量子点粉末；
（2）将连续相、表面活性剂和水混合均匀形成微乳液，加入CdTe量子点溶液并混匀，然后依次加入催化剂NH3•H2O和交联剂并混合均匀，持续搅拌进行包硅反应4～8 h，再加入氨丙基硅氧烷、苯基硅氧烷或十六烷基三甲氧基硅烷、植物根系分泌物溶液、交联剂并充分混匀，持续搅拌进行印迹反应16～24h，反应后加入丙酮超声破乳，纯化，干燥得到CdTe@SiO2@MIPs分子印迹聚合物粉末；
（3）将琼脂和水溶性天然或合成高分子化合物溶解于水中，加入羧甲基纤维素钠并搅拌均匀，得到高分子化合物混合溶液，冷却至室温，加入CdTe@SiO2@MIPs分子印迹聚合物粉末并混合均匀，自然晾干脱水成膜，即得负载CdTe@SiO2@MIPs凝胶印迹膜；
步骤（2）所述纯化的方法为：将加入丙酮超声破乳后的溶液进行离心，取沉淀物，分别用环己烷、乙醇、蒸馏水离心洗涤沉淀物，所得产物用体积比为（1～2）：9的酸与醇或酸与乙腈组成的混合液洗脱掉植物根系分泌物，得到纯化产物；
步骤（3）所述琼脂、水溶性天然高分子或合成高分子化合物和羧甲基纤维素钠的摩尔比为1：（1～2）：2。
2.根据权利要求1所述一种用于根系分泌物原位可视化检测的荧光印迹膜的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述连续相、表面活性剂、水和CdTe量子点溶液的体积比为100 ：（10～14）：1 ：4；所述CdTe量子点溶液的浓度为0.5～1.5‰；所述CdTe量子点溶液、催化剂NH3•H2O和第一次加入交联剂的体积比为4：1：（0.5～1.5）；所述CdTe量子点溶液、氨丙基硅氧烷、苯基硅氧烷或十六烷基三甲氧基硅烷、植物根系分泌物溶液和第二次加入交联剂的体积比为40：（1～2）：1：2：5；所述植物根系分泌物溶液的浓度为30～40wt%。
3.根据权利要求1所述一种用于根系分泌物原位可视化检测的荧光印迹膜的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述高分子化合物混合溶液中高分子化合物的质量分数为2～10%；所述CdTe@SiO2@MIPs分子印迹聚合物在高分子化合物混合液中的浓度为2～3 wt%。
4.根据权利要求1所述一种用于根系分泌物原位可视化检测的荧光印迹膜的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述硼氢化钠和碲粉的质量比为1：(1～2)；所述硼氢化钠和碲粉混合均匀并分散于水中，所得溶液中硼氢化钠的浓度为1.6～3.0wt%；所述氯化镉和巯基乙酸溶于水中，巯基乙酸与水的体积比为（1～3）：100；所得水溶液中氯化镉的浓度为0.8～1wt%；所述巯基乙酸与前驱体NaHTe溶液的体积比为（1～1.5）：50。
5.根据权利要求1所述一种用于根系分泌物原位可视化检测的荧光印迹膜的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述植物根系分泌物溶剂中的植物根系分泌物为绿原酸、苯甲酸、香草醛、阿魏酸和叶绿醇中的一种；所述连续相为环己烷、二甲基亚砜、石油醚和丙烯酸中的至少一种；所述表面活性剂为壬基酚聚氧乙烯醚、曲拉通X-100、吐温20和三乙醇胺中的至少一种；所述交联剂为正硅酸乙酯、正硅酸甲酯、正硅酸丙酯和三乙氧基硅烷中的至少一种；所述氨丙基硅氧烷为3-氨丙基三乙氧基硅烷、3-氨丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基三羟基硅烷和γ-氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷中的至少一种；所述苯基硅氧烷为苯基三乙氧基硅烷、苯基三甲氧基硅烷和二苯基二甲氧基硅烷中的至少一种。
6.根据权利要求1所述一种用于根系分泌物原位可视化检测的荧光印迹膜的制备方法，其特征在于，步骤（1）中调节pH指将体系的pH值调至8～11；步骤（3）所述水溶性天然或合成高分子化合物为聚乙烯醇、海藻酸钠、乙基纤维素、α-环糊精和羟乙基纤维素中的至少一种。
7.根据权利要求1所述一种用于根系分泌物原位可视化检测的荧光印迹膜的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述丙酮的体积与产物混合液体积比为4：（1～2）；所述酸为甲酸、醋酸、盐酸和硝酸中的至少一种；所述醇为乙醇和甲醇中的至少一种。
8.权利要求1～7任一项所述方法制得的一种用于根系分泌物原位可视化检测的荧光印迹膜。
9.权利要求8所述一种用于根系分泌物原位可视化检测的荧光印迹膜在根系分泌物原位可视化检测中的应用。
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