CN101241140A - 基于量子点标记的免疫印迹检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于量子点标记的免疫印迹检测方法，首先将带有羧基或者氨基的量子点通过化学反应与二抗相连接，形成量子点标记的复合物；采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，探针是抗体，显色用量子点标记的二抗。经PAGE分离的蛋白质样品转移到固相载体上，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与量子点标记的第二抗体起反应，在紫外灯下，量子点发射荧光以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。用简单紫外成像系统配备滤光片得到免疫印迹图像。本发明以连接有二抗的量子点作为免疫印迹的优良的荧光成像剂，可以大大加速并且提高灵敏度和准确度。

Description

基于量子点标记的免疫印迹检测方法

技术领域

本发明涉及一种纳米技术领域的蛋白质检测方法，具体说是一种基于量子点标记的免疫印迹检测方法。

背景技术

常规免疫印迹(Western Blots)是采用化学发光和辐射技术。应用传统的有机荧光发色团的免疫印迹分析技术有其固有的局限性。低的荧光稳定性使其很难在长时间段成像，从而使检测灵敏度低。因为不同的发色团需要不同波长激发光源，而且需要很复杂的设计平台，因此多通道技术也是不可能的。另外，染料宽的发射光谱使得多通路互相重叠而产生干扰。

量子点(QDs)特指半径小于或接近激子波尔半径的半导体纳米颗粒，大小均匀的半导体量子点发射光谱窄且具有尺寸“调谐”特性，用单个波长即可激发不同的量子点，荧光量子产率高，稳定性好，具有很好的生物相容性等优点。而且近年来量子点丰富的光学特性及其在生物学标识方面巨大的研究和应用价值逐步被看好。量子点独特的光学性能使得连接有蛋白或者二抗的量子点可以作为免疫印迹的优良的荧光成像剂。量子点光稳定性的增强有利于信号稳定性以及高质量的分析。另外，宽的吸收峰和窄的发射峰使得在一个简单的系统中多色多通道成为可能。单一、便宜的紫外激发光源激发就可以得到490nm到680nm范围的发射波长。

量子点基础上的免疫印迹不但可以多色检测，而且价钱便宜，并具有以下优点：光稳定性增加，高灵敏度，与现有化学发光方法比较灵敏度高或者相当；多通道，大容量；线性强，提高蛋白表达量；比增强型化学发光试剂(ECL)便宜；与现有的成像系统相容，不用专用设备；不用暗室，胶片，不用冲洗，节约时间和成本；不用脱模；多色检测，可以在同一个检测窗口观察到多个抗体的存在并决定他们的浓度，比单色检测降低成本。用量子点标记的免疫印迹检测方法，分析转换信号可以大大加速并且提高灵敏度和准确度。

经对现有技术的文献检索发现，Richard L Ornberg等在《Nature Methods》(自然方法)2，79-81(2005)上发表，Western blot analysis with quantumdot fluorescence technology：a sensitive and quantitative method formultiplexed proteomics(用量子点的一光技术进行免疫印迹分析：灵敏、定量的多元检测方法)。该文是在同一个检测点用多种量子点标记进行多元蛋白质和蛋白质状态定量检测，要求不同波长的量子点同时应用，且定量分析。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于量子点标记的免疫印迹检测方法，使其利用量子点的荧光特性，将其与抗体偶联，直接进行蛋白免疫印迹检测，可以大大加速并且提高灵敏度和准确度。本发明是简单直接的定性分析方法，更简单易行，适用于非定量蛋白质及其功能检测。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用量子点标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与量子点标记的第二抗体起反应，在紫外灯下，量子点发射荧光以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。用简单紫外成像系统配备不同的滤光片可以得到免疫印迹图像。

本发明方法具体包括以下步骤：

第一步.量子点与抗体的连接

将表面带有羧基的量子点分散在硼酸盐缓冲溶液(pH＝9.18)中，加入硫化二亚胺(EDC)和二抗，漩涡混合振荡均匀，在室温下反应。反应溶液离心，用磷酸缓冲溶液多次洗涤，得到量子点和二抗连接物(量子点标记的二抗)。

第一步中，在室温下反应时间为3小时。

第一步中，所述硼酸盐缓冲溶液，其pH＝9.18；所述磷酸缓冲溶液，其浓度为0.1M，pH＝7.8。

第一步中，所述恒流转膜，是指60mA恒流转膜2小时。

第二步.免疫印迹过程

电转移：将电泳后的胶平铺在经甲醇浸泡后的PVDF(聚偏二氟乙烯)膜上，夹在六层滤纸中间，放到半干式电转仪上，恒流转膜；

免疫反应：将转好的膜放到TBST溶液中清洗，加入含5％脱脂奶粉的TBST溶液中，摇床封闭，之后加入1∶1000稀释的单抗，摇床孵育，TBST溶液清洗两次，加入1∶500稀释的量子点标记的二抗，在避光条件下孵育，TBST清洗三次；

拍照：直接将反应后的膜在凝胶成像系统中成像，利用量子点在紫外光照射下发射荧光的性能，得到免疫印迹图像。

第二步中，将转好的膜放到TBST溶液中清洗，其时间为10min。

第二步中，摇床封闭是指37℃摇床封闭1小时。

第二步中，TBST溶液清洗两次，每次5分钟。

第二步中，在避光条件下37℃孵育60分钟，TBST清洗3次，每次5分钟。

本发明所选用的量子点根据其尺寸大小，发射波长可以是520nm(绿色)，560(橙黄色)，600nm(橙色)，和620nm(红橙色)。

与现有技术相比，本发明是基于标准的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和免疫印迹过程进行的，利用纳米量子点的荧光性能，不用传统的显色、显影、定影、凉干等照片洗印过程，直接成像，不但价钱便宜，而且光稳定性增加，与现有化学发光方法比较灵敏度高或者相当；与现有的成像系统相容，不用专用设备；不用暗室，胶片，不用冲洗，节约时间和成本，且检测的灵敏度有所提高。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

用量子点标记的免疫印迹检测方法检测BRCAA1蛋白表达情况。

将表面带有羧基的量子点(发射波长为520nm(绿色)，600nm(橙色)，620nm(红橙色)和680nm(红色))分散在硼酸盐缓冲溶液(ph＝9.18)中，加入硫化二亚胺(EDC)和羊抗兔二抗，漩涡混合振荡均匀，在室温下反应3小时。反应溶液高速离心，用磷酸缓冲溶液(PBS，0.1M，pH＝7.8)多次洗涤，得到量子点标记的二抗复合物。

将含有目标蛋白(BRCAA1)的质粒进行细胞转染。细胞总蛋白提取：在细胞培养皿中加入200ul RIPA裂解液，用细胞刮刀收集细胞，将所有液体转入一个灭菌的离心管中。用枪头来回抽打10次，12000RPM 4℃离心5min，将上清移至另一灭菌的离心管中，备用。

丙烯酰胺蛋白电泳：配制10％分离胶与4％浓缩胶，安装好垂直电泳胶板后灌胶，先灌分离胶，等分离胶完全凝固后灌浓缩胶，并插上梳子。浓缩胶完全凝固后拔出梳子，安装好电泳装置，取提取好的蛋白上清与2×SDS蛋白上样缓冲液混合均匀，于沸水中水浴3分钟以使蛋白完全变性。用微量上样器进行上样每孔上样20ul。先60V恒压进行电泳，直到蛋白完全跑出浓缩胶后将电压设为80V，直至溴酚蓝跑出分离胶时停止电泳。

电转移：将电泳后的胶平铺在经甲醇浸泡后的PVDF膜上，夹在六层滤纸中间，放到半干式电转仪上，60mA恒流转膜2小时。

免疫反应：将转好的膜放到TBST溶液(25mM Tris-Cl，150mM NaCl，0.05％Tween20，pH7.2)中清洗10min；加入含5％脱脂奶粉的TBST溶液中，37℃摇床封闭1小时；之后加入1∶1000稀释的兔抗人BRCAA1抗体，37℃摇床孵育1小时；TBST溶液清洗两次，每次5分钟；加入1∶500稀释的量子点标记的羊抗兔二抗复合物，在避光条件下于37℃孵育60分钟；TBST清洗3次，每次5分钟。

拍照：直接将反应后的膜在凝胶成像系统中成像，可以明显看到在140KDa处，BRCAA1的亮的条带。

本发明以连接有二抗的量子点作为免疫印迹的优良的荧光成像剂，可以大大加速并且提高灵敏度和准确度。

Claims (10)

1、一种基于量子点标记的免疫印迹检测方法，其特征在于，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，探针是抗体，显色用量子点标记的二抗，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与量子点标记的第二抗体起反应，在紫外灯下，量子点发射荧光以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分，用简单紫外成像系统配备滤光片得到免疫印迹图像。

2、根据权利要求1所述的基于量子点标记的免疫印迹检测方法，其特征是，包括以下步骤：

第一步.量子点与抗体的连接

将表面带有羧基的量子点分散在硼酸盐缓冲溶液中，加入硫化二亚胺和二抗，漩涡混合振荡均匀，在室温下反应，反应溶液离心，用磷酸缓冲溶液多次洗涤，得到量子点和二抗连接物，即量子点标记的二抗；

第二步.免疫印迹过程

电转移：将电泳后的胶平铺在经甲醇浸泡后的聚偏二氟乙烯膜上，夹在六层滤纸中间，放到半干式电转仪上，恒流转膜；

免疫反应：将转好的膜放到TBST溶液中清洗，加入含5％脱脂奶粉的TBST溶液中，摇床封闭，之后加入1∶1000稀释的单抗，摇床孵育，TBST溶液清洗两次，加入1∶500稀释的量子点标记的二抗，在避光条件下孵育，TBST清洗三次；

拍照：直接将反应后的膜在凝胶成像系统中成像，利用量子点在紫外光照射下发射荧光的性能，得到免疫印迹图像。

3、根据权利要求1或者2所述的基于量子点标记的免疫印迹检测方法，其特征是，所选用的量子点，其发射波长是520nm、560nm、600nm和620nm中的一种。

4、根据权利要求2所述的基于量子点标记的免疫印迹检测方法，其特征是，第一步中，在室温下反应时间为3小时。

5、根据权利要求2或4所述的基于量子点标记的免疫印迹检测方法，其特征是，第一步中，所述硼酸盐缓冲溶液，其pH＝9.18；所述磷酸缓冲溶液，其浓度为0.1M，pH＝7.8。

6、根据权利要求2或4所述的基于量子点标记的免疫印迹检测方法，其特征是，第一步中，所述恒流转膜，是指60mA恒流转膜2小时。

7、根据权利要求2所述的基于量子点标记的免疫印迹检测方法，其特征是，第二步中，将转好的膜放到TBST溶液中清洗，其时间为10min。

8、根据权利要求2或7所述的基于量子点标记的免疫印迹检测方法，其特征是，第二步中，摇床封闭是指37℃摇床封闭1小时。

9、根据权利要求2或7所述的基于量子点标记的免疫印迹检测方法，其特征是，第二步中，TBST溶液清洗两次，每次5分钟。

10、根据权利要求2或7所述的基于量子点标记的免疫印迹检测方法，其特征是，第二步中，在避光条件下37℃孵育60分钟，TBST清洗3次，每次5分钟。