CN104749149A - 一种同时检测多种指标的多色荧光免疫层析试剂条 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时检测多种指标的多色荧光免疫层析试剂条，属于医学检验领域。该试纸条包括底板、样品垫、结合垫、分析膜和吸水垫，样品垫、结合垫、分析膜、吸水垫顺次以适当重叠关系搭接在底板上，试剂条结合垫上包被具有相同激发波长不同发射波长荧光物质标记的不同检测指标的探测分子和一种或多种质控分子，分析膜检测线上包被多种待测指标捕获分子，通过特异性结合反应完成同时检测多种指标。本发明试剂条成本降低，结构简化且达到了能够同时、快捷检测多种指标的目的。

Description

一种同时检测多种指标的多色荧光免疫层析试剂条

技术领域

本发明涉及一种以具有相同同激发不同发射波长的荧光物质为基础，可以同时进行多种指标检测的多色荧光免疫层析试剂条，属于医学检验领域。

背景技术

免疫层析技术是近年来兴起的一种快速诊断技术，具有精确、快速和操作简单等特点。其原理是包括样品垫、结合垫、分析膜和吸水垫，将特异的抗体先固定在分析膜上特定的检测线上，当样品垫上添加样品后，随着毛细作用开始做层析运动。当移动至检测线时，样品中抗原和抗体特异性结合，若是胶体金、免疫酶染色或荧光可使这一区域产生一定颜色，从而实现特异性诊断过程。

就现有技术来说，免疫层析技术特别是胶体金免疫层析技术已经是一种较成熟、工艺稳定的快捷，简便现场诊断技术，但其通常只能对一种指标检测，同时通常应用在半自动的检测仪器上，实现多种指标同时全自动检测的技术暂时还不成熟。

同时荧光免疫层析技术近年来也得到大力的发展，其较胶体金、酶染色等免疫层析方法测量结果更加迅速准确，能够将多指标同荧光免疫层析结合形成多指标同时检测的荧光免疫层析产品十分必要。

中国专利CN201110451642X公开了一种定量检测肌钙蛋白I/肌酸激酶同工酶/肌红蛋白的荧光免疫层析方法及其试剂盒，该专利利用量子点优良的荧光特性，结合荧光多色标记技术和免疫层析技术，实现多种指标的多色荧光同时检测。中国专利CN201410501474.4公开了一种同步定量多种肿瘤标志物的量子点免疫层析试条及其方法，该专利同样利用量子点材料结合免疫层析技术实现多种指标同时多色荧光检测。中国专利CN201410151364X公开了一种多色荧光免疫层析蛋白芯片，该专利描述了一种结合荧光免疫层析和蛋白芯片技术的芯片结构，其中包括混合多种指标于一起的检测质控线，具有多种检测标志物的结合垫等结构。上述专利均描述了同时检测多种指标的技术，但是前两个专利主要是运用量子点材料作为荧光物质，工艺复杂，成本很高，且其分析膜中的检测区域与传统试剂条相同，检测项目还是偏少；后一个专利虽然公开了多色荧光的检测原理，但其中的结构和材料等部分均没有描述清楚，内容需要补充较多。

综合现有的技术和发展前景，研发一种同时检测多种指标的多色荧光免疫层析产品十分必要。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，公开了一种同时检测多种指标的多色荧光免疫层析试剂条。

为实现上述目标，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种同时检测多种指标的多色荧光免疫层析试剂条，包括底板、样品垫、结合垫、分析膜和吸水垫，样品垫、结合垫、分析膜、吸水垫顺次以适当重叠关系搭接在底板上，其特征在于该试剂条结合垫上包被具有相同激发不同发射波长荧光物质标记的不同检测指标的探测分子和一种或多种质控分子，分析膜上有检测线和质控线，检测线上包被多种待测分子捕获分子，质控线上包被质控分子捕获分子；免疫层析开始时，待测分子和探测分子-荧光物质在结合垫结合，后在分析膜上被检测线中的捕获分子捕获，形成捕获分子-待测分子-探测分子-荧光物质复合物，置于多色荧光仪器下进行检测，对检测线照射相同波长的激发光，不同指标的不同荧光物质激发后发射出不同波长的发射光，被光电材料捕捉后计算得出检测数值，完成对多种检测指标的同时检测。

所述的分析膜上的检测线有X条，X≥1，所述的相同激发波长不同发射波长荧光物质有Y种，Y≥1，每条检测线上能够同时检测Y种指标，试剂条同时能够检测X*Y种指标。

所述的分析膜上的质控线可以选择多种形式进行质控，一种是质控线单独存在，，则可以选择任意一种荧光物质进行质控，检测指标为X*Y种；另一种是质控线和检测线融合在一起，则质控指标和检测指标共计X*Y种，检测和质控指标任意组合。

一种优选的检测试剂条具有4条检测线，3种不同发射波长荧光物质，质控线和一条检测线融合，质控荧光物质为上述3种中的1种发射波长，故每条检测线可以检测3种指标，去掉一个质控，共检测11种指标。

所述的荧光物质具有同样的激发波长和不同的发射波长，荧光物质之间发射峰明显不重叠或重叠很少；优选的荧光物质在360nm激发波长时均有较强的吸收，发射波长在450-615nm范围内且具有明显的区别分布，优选的荧光物质包括激发波长360nm发射波长450nm的6～甲基香豆素，激发波长350nm发射波长525nm的丹磺酰肼，激发波长360nm发射波长615nm的三(二苯甲酰基甲烷)单(菲罗啉)铕(III)或包含上述3种荧光物质的其他材料。

所述的结合垫为聚酯膜或玻璃纤维膜，分析膜为硝酸纤维素膜、尼龙膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜，底板为聚酯或塑料板。

所述的结合垫可以舍去，荧光物质标记抗体可以包被在分析膜上，包被位置位于分析膜靠近样品垫一端的前端。

一种如权利要求1所述的多色荧光免疫层析试剂条的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)荧光物质标记抗体：合成不同发射波长相同激发波长的荧光物质，并分别将不同的检测指标的特异性抗体以及质控分子和上述荧光物质相连后得到抗体/质控分子修饰的荧光物质，再将上述材料固定在结合垫上；

2)抗体包被：在分析膜上分别设有检测线，质控线和检测线重合，固定能与质控分子特异性结合的捕获分子，检测线固定上述待测分子不同抗原决定簇的特异性捕获分子；

3)试剂条组装：以样品垫、结合垫、分析膜、吸水垫和底板构建成荧光免疫层析试剂条，用斩切机切成一定宽度得所需的试剂条。

有益效果

本发明将多色荧光表及技术，免疫层析技术和具有相同激发波长不同发射波长的荧光物质结合应用，完成了同时检测多种指标的免疫层析试剂条的开发过程，该试剂条具有以下优点：

首先，本发明所述试剂条采用360nm激发波长，450-615nm的多种区别发射波长的荧光物质进行抗体标记，较现有的量子点等荧光物质制作简单，成本较低，且标记和检测性能均表现良好；

其次，本发明将多种检测指标的捕获分子混合在一起固定在多条检测线上，在试剂条结合垫上包被标记了多色荧光物质的多种检测指标的探测分子，免疫层析开始后，在每条检测线上都能检测出几种不同的指标，最终实现了多种指标的同时检测，同时该试剂条的结构发生改变，传统的质控线和检测线融为一条线，同样利用荧光物质进行质控，试剂条结构简化，制作难度降低。

最后，本发明试剂条可以应用在全自动、半自动等多种仪器上，特别是可以应用在全自动荧光免疫定量分析装置中，多指标和全自动结合，检测效率更是大大提高。

附图说明

图1本发明多色荧光免疫层析试剂条结构示意图。

其中，1、2、3为三种荧光物质，，4为样品垫，5为结合垫，6为分析膜，7为吸水垫，8为检测线，9为捕获分子。

具体实施方式

本发明公开了一种同时检测多种指标的多色荧光免疫层析试剂条，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明之内。本发明的试剂条已经通过较佳的实施例进行描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对文本所述的方法和应用进行改动或是当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明的技术方案为：

如图1所示，一种同时检测多种指标的多色荧光免疫层析试剂条，包括底板、样品垫(4)、结合垫(5)、分析膜(6)和吸水垫(7)，样品垫(4)、结合垫(5)、分析膜(6)、吸水垫(7)顺次以适当重叠关系搭接在底板上，其特征在于该试剂条结合垫上包被具有相同激发不同发射波长荧光物质(1，2，3)标记的不同检测指标的探测分子和一种或多种质控分子，分析膜上有检测线(8)和质控线，检测线上包被多种待测指标捕获分子(9)，质控线上包被质控分子捕获分子；免疫层析开始时，待测指标分子和探测分子～荧光物质在结合垫结合，后在分析膜上被检测线中的捕获分子捕获，形成捕获分子～待测分子～探测分子～荧光物质复合物，置于多色荧光仪器下进行检测，对检测线照射相同波长的激发光，不同指标的不同荧光物质激发后发射出不同波长的发射光，被光电材料捕捉后计算得出检测数值，完成对多种检测指标的同时检测。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：多色荧光免疫层析试剂条的制备

1)多色荧光物质偶联不同探测分子：溶解于20～100Mmol的PBS缓冲液中，活化的360nm荧光物质溶解于二甲基亚砜(DMF)中，然后将探测分子与360nm荧光物质以1∶1～1∶3混合，充分搅拌反应1h，然后将溶液置于透析袋中梯度换液透析3次，每次6～8h，得到的溶液即为探测分子～荧光物质复合物；

2)试剂条组装：

a.结合垫的制备：结合垫选用玻璃纤维或者聚酯材质，然后将结合垫用50mM PBS溶液(pH＝7.5)缓冲液浸泡，取出后干燥，将制得的探测分子～荧光物质复合物均匀喷洒在结合垫上；

b.分析膜的制备：本发明优选检测线和质控线融合为一条线的方法，将待测指标和质控分子的捕获分子用50mM PBS溶液(pH＝7.5)缓冲液稀释至4mg/ml的浓度，0.8μL/cm在硝酸纤维素膜右端划线得到检测线，，在检测线相隔5mm处在划第二条检测线，每条检测线中的检测项目只能和荧光物质种类一样多。

c.组装：在底板上顺次相互搭接的粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，按要求切割成适当宽度的试纸条。

实施例二：优选的同时检测12指标的试剂条的结构

本发明优选一种同时检测12种指标的多色荧光免疫层析试剂条，荧光物质为激发波长360nm发射波长450nm的6～甲基香豆素，激发波长360nm发射波长525nm的丹磺酰肼，激发波长360nm发射波长615nm的三(二苯甲酰基甲烷)单(菲罗啉)铕(III)，如图1所示，12种指标同时检测的试剂条共有3种荧光物质，4条检测线，12种指标的探测分子分成4份和3种荧光物质形成标记的混合物后包被在结合垫上，每条检测线上具有3种待测指标的捕获分子，可以检测12种待测指标，质控线和检测线融合。

结合垫中12种探测分子分别和3种荧光物质形成如下复合物：探测分子a～丹磺酰肼，探测分子b～6～甲基香豆素，探测分子c～三(二苯甲酰基甲烷)单(菲罗啉)铕(III)，探测分子d～丹磺酰肼，探测分子e～6～甲基香豆素，探测分子f～三(二苯甲酰基甲烷)单(菲罗啉)铕(III)，探测分子g～丹磺酰肼，探测分子h～6～甲基香豆素，探测分子i～三(二苯甲酰基甲炕)单(菲罗啉)铕(III)，探测分子j～丹磺酰肼，探测分子k～6～甲基香豆素，探测分子I～三(二苯甲酰基甲烷)单(菲罗啉)铕(III)；四条检测线上的捕获分子分别是，检测线1：捕获分子a，捕获分子b，捕获分子c，检测线2：捕获分子d，捕获分子e，捕获分子f，检测线3：，捕获分子g，捕获分子h，捕获分子i，检测线4：捕获分子j，捕获分子k，捕获分子I(上述的排列组合可以任意进行，不局限于文中所述)。当层析反应开始时，每条检测线分别固定相应的荧光物质～探测分子复合物，再通过全自动荧光免疫层析分析仪的检测，同时实现对多种指标的检测分析。

Claims (7)

1.一种同时检测多种指标的多色荧光免疫层析试剂条，包括底板、样品垫、结合垫、分析膜和吸水垫，样品垫、结合垫、分析膜、吸水垫顺次以适当重叠关系搭接在底板上，其特征在于该试剂条结合垫上包被具有相同激发不同发射波长的荧光物质标记的不同检测指标的探测分子和一种或多种质控分子，分析膜上有检测线和质控线，检测线上包被多种待测分子捕获分子，质控线上包被质控分子捕获分子；免疫层析开始时，待测分子和探测分子-荧光物质在结合垫结合，后在分析膜上被检测线中的捕获分子捕获，形成捕获分子-待测分子-探测分子-荧光物质复合物，置于多色荧光仪器下进行检测，对检测线照射相同波长的激发光，不同指标的不同荧光物质激发后发射出不同波长的发射光，被光电材料捕捉后计算得出检测数值，完成对多种检测指标的同时检测。

2.根据权利要求1所述的多色荧光免疫层析试剂条，其特征在于所述的分析膜上的检测线有X条，X≥1，所述的相同激发波长不同发射波长荧光物质有Y种，Y≥1，每条检测线上能够同时检测Y种指标，试剂条同时能够检测X*Y种指标。

3.根据权利要求1所述的多色荧光免疫层析试剂条，其特征在于所述的分析膜上的质控线可以选择多种方式进行质控，一种是质控线单独存在，可以选择任意一种荧光物质进行质控，检测指标为X*Y种；另一种是质控线和一条或多条检测线融合在一起，质控指标和检测指标共X*Y种，检测和质控指标任意组合。

4.根据权利要求1所述的多色荧光免疫层析试剂条，其特征在于所述的荧光物质具有同样的激发和不同的发射波长，荧光物质之间发射峰明显不重叠或重叠很少；优选的荧光物质在360nm激发时均有较强的吸收，发射波长在450-615nm范围内且具有明显的区别分布，优选的荧光物质包括激发波长360nm发射波长450nm的6～甲基香豆素，激发波长350nm发射波长525nm的丹磺酰肼，激发波长360nm发射波长615nm的三(二苯甲酰基甲烷)单(菲罗啉)铕(III)或包含上述3种荧光物质的其他材料。

5.根据权利要求1所述的多色荧光免疫层析试剂条，其特征在于所述的结合垫为聚酯膜或玻璃纤维膜，分析膜为硝酸纤维素膜、尼龙膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜，底板为聚酯或塑料板。

6.根据权利要求1所述的多色荧光免疫层析试剂条，其特征在于所述的结合垫可以舍去，荧光物质标记抗体可以包被在分析膜上，包被位置位于分析膜靠近样品垫一端的前端。

7.一种权利要求1所述的多色荧光免疫层析试剂条的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)荧光物质标记抗体：合成不同发射波长相同激发波长的荧光物质，并分别将不同的检测指标的特异性抗体以及质控分子和上述荧光物质相连后得到抗体/质控分子修饰的荧光物质，再将上述材料固定在结合垫上；

2)抗体包被：在分析膜上分别设有检测线，质控线和检测线重合，固定能与质控分子特异性结合的捕获分子，检测线固定上述待测分子不同抗原决定簇的特异性捕获分子；

3)试剂条组装：以样品垫、结合垫、分析膜、吸水垫和底板构建成荧光免疫层析试剂条，用斩切机切成一定宽度得所需的试剂条。