CN101120253B - 用于免疫色谱的试验器具以及使用该器具的半定量方法 - Google Patents

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Abstract

作为使用免疫色谱法可容易地对检样中所含的测定对象物质进行半定量的新型试验器具，本发明提供具有检样通过毛细管现象可移动的多孔体的免疫色谱用试验器具，上述用于免疫色谱的试验器具具有：(1)以可移动的状态配置可与上述检样中的测定对象物质特异性结合的被标记的抗体或抗原的区域；(2)以固定在上述多孔体上的状态配置可与上述测定对象物质特异性结合的抗体或抗原的区域；以及(3)以固定在上述多孔体上的状态配置与上述测定对象物质特定浓度下的显色相对应的标准显色的区域；通过上述区域(2)发生的显色与上述标准显色进行比较，可以对检样中的测定对象物质进行半定量。本发明还提供使用该试验器具的半定量方法。

Description

用于免疫色谱的试验器具以及使用该器具的半定量方法
技术领域
本发明涉及使用免疫学色谱(免疫色谱法)，对检样中的测定对象物质进行半定量的试验器具，以及使用该试验器具进行的半定量方法。
背景技术
免疫色谱用试验器具是以含有血清或血浆的血液、尿等体液等作为检样，用于检测血清检样中的抗HBs抗原、检测血清或血浆检样中的抗梅毒密螺旋体抗体、判定血型、检测尿检样中的人绒毛膜促性腺激素(hCG)等。
图5是以往的免疫色谱用试验器具的一个例子的示意图，图5(a)是免疫色谱用试验器具的平面图，图5(b)是其侧面图。图5(c)是与图5(a)同样的图，但表示使用后的免疫色谱用试验器具。
图5(a)和(b)所示的免疫色谱用试验器具11中，在片状的基体12上设置样品垫13。使用试验器具11时，将该样品垫13浸渍在作为测定对象的检样中。被样品垫13吸收的检样由于毛细管现象而向与该样品垫13相邻接设置的试剂垫14移动。试剂垫14中担载有标记抗体或抗原。
被样品垫13吸收的检样到达试剂垫14，则担载于试剂垫14的标记抗体或抗原溶出。检样中的测定对象物质与标记抗体或抗原形成复合物。含有这些物质的检样通过毛细管现象向与试剂垫14相邻接设置的多孔体15移动。到达多孔体15的复合物通过毛细管现象向下游方向移动(图中，以样品垫13一侧为上游一侧)。
多孔体15上设置有固定了抗体或抗原的反应区域16。通过毛细管现象而移动至多孔体15中的抗原、抗体或上述复合物被反应区域16捕获。如图5(c)所示，该捕获可通过在该区域16的显色16’确认。这样，通过目视即可确认检样中是否有测定对象物质。
在试验器具11的更下游一侧，设置有吸收检样中其它成分和未被捕获的测定对象物质等的吸收垫17。
使用图示的免疫色谱用试验器具，还可以对检样中的测定对象物质进行半定量。例如，设置多个对各种测定对象物质的检测灵敏度不同的反应区域16，根据产生显色16’的区域16的数目，可以对检样中测定对象物质进行半定量。
上述免疫色谱用试验器具、以及使用该试验器具检测检样中的测定对象物质的方法、或对该测定对象物质进行半定量的方法记载于专利文献1-6中。
专利文献1中，记载的是使用以免疫色谱法为原理的片状试验器具，对液体中的抗原或抗体进行测定的方法。但是，该文献中并没有公开、暗示对抗原或抗体进行半定量，也未公开、暗示在多孔体上具有显示标准显色的区域的试验器具。
专利文献2中记载的是使用色素标记的抗原或抗体测定液体中是否存在抗原或抗体的试验器具。但是，该文献中并未公开、暗示对抗原或抗体进行半定量，也未公开、暗示在多孔体上具有显示标准显色区域的试验器具。
专利文献3记载的是用于对检样溶液中的抗原或抗体进行定量的试验器具。该试验器具的特征在于：由上游至下游具有多个固定有逐渐增加的量的捕获试剂的反应区域，根据显色的反应区域数目对分析对象进行定量。其必须要件是反应区域为多个，但设置多个反应区域使得制备步骤繁杂，不优选。另外，对于该试验器具，并未公开、暗示在多孔体上具有显示标准显色的区域。
专利文献4记载的是用于对检样溶液中的抗原或抗体进行半定量的试验器具。该试验器具沿颗粒标记的抗原或抗体、检样溶液的展开方向具有排成一列的多个反应区域，通过夹层法的原理，半定量地推测抗原或抗体的量。其必须要件是反应区域为多个，但设置多个反应区域使得制备步骤繁杂，不优选。另外，对于该试验器具，并未公开、暗示在多孔体上具有显示标准显色的区域。
专利文献5记载的是：使用在同一个膜上具备呈现一定色调的部分和呈现检样浓度依存性的色调的部分的免疫学色谱分析片，向该免疫学色谱分析片上注入未知浓度的检样，进行色谱展开，然后对呈现一定色调的部分的色调和呈现检样浓度依存性色调的部分的色调进行光学浓度测定或者目视读取，以测定未知检样的浓度的方法。该方法的特征在于：在同一个膜上具有对照显色区域和检样浓度依存性显色区域，但该对照显色区域是使用与检样不同的固定化抗体和标记抗体进行显色，步骤繁杂，同时调节成相当于特定检样浓度的显色并不容易。
专利文献6记载的是在检样通过毛细管现象在其上移动的多孔体上直接印刷判定线的种类标识的免疫色谱用试验器具。如专利文献6所述，在检样通过毛细管现象在其上移动的多孔体上进行印刷的想法是专利文献6以前所没有的，在该多孔体上设置对测定对象物质浓度的测定有用的标识，该想法是以前完全没有的。
专利文献1：日本特开平7-55808号公报
专利文献2：日本特开平10-73592号公报
专利文献3：日本特开平5-5743号公报
专利文献4：日本特开平8-278305号公报
专利文献5：日本特开2001-83153号公报
专利文献6：日本特开2001-13143号公报
发明内容
因此，本发明的目的在于提供使用免疫色谱法、制备容易、且容易对检样中所含的测定对象物质浓度进行半定量的新型试验器具，以及使用该试验器具的半定量方法。
为实现上述目的，本发明提供具有检样通过毛细管现象可移动的多孔体的免疫色谱用试验器具(以下称为“本发明的试验器具”)，
上述免疫色谱用试验器具具有：
(1)以可移动的状态配置可与上述检样中的测定对象物质特异性结合的被标记的抗体或抗原的区域；
(2)以固定在上述多孔体上的状态配置可与上述测定对象物质特异性结合的抗体或抗原的区域；以及
(3)以固定在上述多孔体上的状态配置与上述测定对象物质特定浓度下的显色相对应的标准显色的区域；
通过将上述区域(2)中产生的显色与上述标准显色进行比较，对上述检样中的上述测定对象物质进行半定量。
作为本发明的试验器具的优选方案，可列举：上述(2)的以固定在上述多孔体上的状态配置可与上述测定对象物质特异性结合的抗体或抗原的区域、和上述(3)的以固定在上述多孔体上的状态配置与上述测定对象物质特定浓度下的显色相对应的标准显色的区域，相对于展开溶剂的展开方向横排(列)或竖排(並列)配置。
作为本发明的试验器具的另一优选方案，可列举上述试验器具，其中，上述(1)的以可移动的状态配置可与上述检样中的测定对象物质特异性结合的被标记的抗体或抗原的区域中所使用的标记用色素、和上述(3)的以固定在上述多孔体上的状态配置与上述测定对象物质的特定浓度下的显色相对应的标准显色的区域中所使用的标准显色用色素为同一色素。
本发明还提供使用本发明的试验器具对检样中的测定对象物质进行半定量的方法。
本发明的试验器具通过对固定在免疫色谱用试验器具多孔体上的标准显色和测定对象物质通过被固定在多孔体上的抗体或抗原捕获而产生的显色进行比较，可容易地对检样中所含的测定对象物质进行半定量。
本发明的试验器具中，由于具有以固定在多孔体上的状态配置可与测定对象物质特异性结合的抗体或抗原的区域(反应区域)、以及以固定在上述多孔体上的状态配置与测定对象物质特定浓度下的显色相对应的标准显色的区域，因此，可以在相同条件下对反应区域的显色和标准显色进行比较，可得到高的精度。
本发明的试验器具只要具有至少一个反应区域和显示标准显色的区域即可进行半定量，因此，与为了进行半定量而必须有多个反应区域的试验器具相比，可以简便地制造。另外，对于显示标准显色的区域，无需经过抗体、抗原等即可将色素等直接固定在多孔体上，因此与必须经过抗体、抗原等进行固定的试验器具相比，可简便地制造。另外，并不间接地经过抗原抗体反应等反应，因此在使用本试验器具时，上述标准显色的色调完全不受各种使用条件不同的影响。
附图说明
图1是本发明试验器具的一个实施方案的示意图。
图2是图1的试验器具的侧面图。
图3是将本发明的试验器具浸渍在调节成各种浓度的hCG中后，观察标准显色8和显色6’的显色度程度随时间变化的图。
图4中，图4(a)-(e)是实施例中使用的试验器具的平面图，图4(a)是浸渍到尿检样中之前的未使用的试验器具，图4(b)是使用hCG浓度为25IU/L的检样实施半定量后的试验器具，图4(c)是使用hCG浓度为1000IU/L的检样实施半定量后的试验器具，图4(d)是使用hCG浓度为10000IU/L的检样实施半定量后的试验器具，图4(e)是使用hCG浓度为0IU/L(阴性)的检样实施半定量后的试验器具。
图5中，图5(a)是以往的免疫色谱用试验器具的示意图，通过平面图表示试验器具。图5(b)是图5(a)所示试验器具的侧面图。图5(c)是与图5(a)同样的图，但表示使用后的试验器具。
符号说明
1：　试验器具
2：　基体
3：  样品垫
4：  试剂垫
5：  多孔体
6：  反应区域
6’：显色
7：  吸收垫
8：  标准显色
9：  区域
9’：显色
11： 试验器具
12： 基体
13： 样品垫
14： 试剂垫
15： 多孔体
16： 反应区域
16’：显色
17：吸收垫
20：保护膜
21：透明部分
22：窗口
23、23’、23”：不透明部分
具体实施方式
以下参照附图，对本发明的试验器具进行说明。
图1是本发明试验器具的一个实施方案的示意图，图2是图1所示试验器具的侧面图。
图1和图2所示的试验器具1在片状的基体2上形成样品垫3、试剂垫4、多孔体5和吸收垫7。试验器具1中，试剂垫4、多孔体5和吸收垫7被保护膜20覆盖。
以下，对本发明的试验器具1的各构成要素进行说明。
图1所示的试验器具1中，各构成要素在片状的基体2上形成。基体2采用在免疫色谱法中不会吸收或透过通过各构成要素中的检样、并且检样接触时不会使检样改性的材料制作。所述材料有医疗用具中使用的塑料材料，具体来说例如有氯乙烯、聚乙烯、乙烯乙酸乙烯酯树脂、聚丙烯、聚碳酸酯、聚氨酯、聚苯乙烯、有机硅树脂、氟树脂、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚酰胺、ABS树脂等。基体2可以是由表面实施了疏水疏油加工的纸制的。
样品垫3是滴加检样或浸渍到检样中的部位，检样中存在不溶性物质时，也用作除去该不溶性物质的滤器。从该角度考虑，样品垫3可例举孔径为20μm-100μm、优选30μm-40μm的非织造布或多孔质膜，但并不限于此。作为样品垫3可使用的材料只要是可以采集一定量的检样、为亲水性的、具有滤器功能即可，没有特别限定，例如有再生纤维素、乙酸纤维素、硝酸纤维素、聚丙烯腈、乙烯乙酸乙烯酯、聚氨酯、聚甲基丙烯酸甲酯、尼龙树脂、玻璃纤维、纸浆(pulp)、棉、人造丝、丙烯酸类(アクリル)、聚酯等，但并不限于此。
滴加到样品垫3中的检样由于毛细管现象而向下游方向、即试剂垫4方向移动。以下，在本说明书中，将试验器具1的样品垫3一侧称为上游一侧，将其相对的一侧称为下游一侧。另外，滴加到样品垫3中的检样也指将样品垫3浸渍在检样中，从而样品垫3中含有的检样。
试剂垫4的材质与样品垫3同样，可以列举非织造布或多孔质膜，但没有特别限定。可与检样中测定对象物质特异性结合的抗体或抗原以用色素等标记物质标记的状态担载于试剂垫4。
可与测定对象物质特异性结合的抗体或抗原可根据测定对象物质适当选择。测定对象物质为尿检样中的人绒毛膜促性腺激素(hCG)时，可以使用抗hCG抗体，更具体地说，可以使用抗hCG小鼠多克隆抗体、抗hCG小鼠单克隆抗体等。测定对象物质为甲胎蛋白(AFP)时，可以使用抗AFP抗体，测定对象物质为抗HIV抗体时，可以使用HIV抗原肽等。测定对象物质为半定量所必需的癌症标志(癌マ—カ—)—前列腺特异性抗原(PSA)时，例如可以使用抗人PSA兔抗体等。
标记物质只要是可视性地发色的物质即可，没有特别限定，例如可以是以胶体金为代表的胶体金属(金属コロイド)、胶体非金属(非金属コロイド)、染料溶胶或分散染料等染料颗粒、胶乳颗粒或着色微粒等。其中，从发色性优异、色调和粒径丰富、对抗体或抗原的标记方法有多种等角度考虑，优选用染料或颜料着色的胶乳微粒或聚苯乙烯微粒。另外，该标记方法是本领域技术人员所周知的，有吸附的方法或化学键合的方法等。特别优选用染料或颜料着色的粒径为0.5μm以下、优选粒径为0.05-0.5μm的球状或大致呈球状的胶乳微粒或聚苯乙烯微粒。最优选蓝色胶乳(ブル—ラテツクス)。
被标记的抗体或抗原以可移动的状态担载于试剂垫4。这里，以可移动的状态担载是指在未使用时、即试剂垫4为干燥的状态下，被标记的抗体或抗原保持在试剂垫4中，使用时，即由于检样的到达使试剂垫4湿润时，被标记的抗体或抗原变得可移动。为此，试剂垫4必须是不吸附被标记的抗体或抗原的材料，如果是吸附材料，则可以预先用另外的BSA等惰性蛋白质进行封闭处理而使用。这样，被标记的抗体或抗原例如在含浸在试剂垫4中后，通过冷冻干燥，可保持在试剂垫4中。
因此，试验器具1中，试剂垫4形成了以可移动的状态配置可与检样中的测定对象物质特异性结合的被标记的抗体或抗原的区域。
滴加到样品垫3中的检样由于毛细管现象向试剂垫4移动。因此，优选试剂垫4的孔径与样品垫3的孔径相同或比样品垫3的孔径小。试剂垫4的孔径可以是1μm-50μm，优选5μm-30μm。
图1和图2所示的试验器具1中，为了使检样利用毛细管现象的移动容易，形成样品垫3和试剂垫4部分层叠的状态。不过，只要是检样可通过毛细管现象适当地移动，样品垫3与试剂垫4可以只是相邻接地配置，也可以制成同一个垫。
检样到达试剂垫4，则检样中的测定对象物质与垫4中的被标记的抗体或抗原通过毛细管现象而向下游方向、即向多孔体5移动。测定对象物质与被标记的抗原或抗体存在抗原和抗体关系时，两者的一部分或全部形成抗原-抗体复合物，它们也向下游方向、即多孔体5移动。图1和图2所示的试验器具1中，为了使该移动容易进行，试剂垫4与多孔体5形成部分层叠的状态。不过，只要检样可通过毛细管现象适当移动，试剂垫4和多孔体5可以只是相邻接配置，也可以是试剂垫4兼作多孔体5使用，也可以相反兼用。
多孔体5是结构具有海绵状的微孔、或者具有网眼状，检样可通过毛细管现象移动的介质。图1和图2所示的试验器具1中，是以片状的多孔质膜表示。多孔体5的材料只要是可实施免疫色谱法即可，没有特别限定，具体来说，例如可以列举以纤维素、纤维素衍生物、硝酸纤维素、乙烯乙酸乙烯酯、聚氨酯、聚甲基丙烯酸甲酯、尼龙树脂、聚偏二氟乙烯(PVDF)等多孔性合成聚合物等作为原料的织造布、非织造布或膜、玻璃纤维滤器、各种滤纸等，优选使用纤维素、纤维素衍生物、多孔性合成聚合物，特别优选使用硝酸纤维素。多孔体5的孔径可以例举1μm-30μm，优选1μm-20μm。
多孔体5具有固定了可与测定对象物质特异性结合的抗体或抗原的区域6(反应区域)。固定于区域6的抗体或抗原可根据测定对象物质适当选择。具体来说，当测定对象物质为hCG时，可以使用抗hCG抗体，更具体地说，可以使用抗hCG小鼠多克隆抗体、抗hCG小鼠单克隆抗体等。测定对象物质为AFP时，可以使用抗AFP抗体。测定对象物质为抗HIV抗体时，可以使用HIV抗原肽等。测定对象物质为PSA时，可以使用抗PSA小鼠单克隆抗体、抗PSA兔抗体等。另外，对于这些的固定方法，例如多孔体5为硝酸纤维素或尼龙等时，可以直接涂布上述抗体或抗原的溶液，干燥，即可容易地固定。如果是通过直接涂布、干燥无法固定的玻璃纤维滤器或滤纸等多孔体，则通过实施多孔体的活化、或固定的抗体或抗原的活化等前处理可容易地进行固定，这些固定方法是本领域技术人员所熟知的技术。
由于毛细管现象而移动至多孔体5中的抗原、抗体和/或复合物被固定在区域6中的抗体或抗原捕获。捕获了含有标记物质的抗原、抗体和/或复合物，则能够以在区域6产生的显色进行确认。这里，在区域6产生的显色的色调依存于所使用的免疫色谱法(试剂的组合)和检样中测定对象物质的浓度。例如，由检样中的抗原与保持在试剂垫4中的标记抗体形成的复合物被反应区域中的固定化抗体捕获时，检样中的测定对象物质浓度高，则在区域6中捕获的复合物增加，因此产生强色调的显色，如果检样中的测定对象物质的浓度低，则在区域6中被捕获的复合物减少，呈现弱色调的显色。另一方面，例如检样中的抗原与保持在试剂垫4中的标记抗原形成竞争反应，如果在反应区域中，标记抗原被固定化抗体捕获，则如果检样中的测定对象物质浓度高，区域6中捕获的标记抗原减少，因此呈现弱色调的显色，检样中的测定对象物质的浓度低，区域6中捕获的标记抗原增加，因此呈现强色调的显色。
多孔体5具有固定了与测定对象物质特定浓度下的显色相对应的标准显色8的区域。即，试验器具1中，使用含有特定浓度(以下称为“基准浓度”)的测定对象物质的检样时，具有与在区域6中发生的显色相等色调的区域在多孔体5上形成。另外，标准显色8的固定方法也可以利用与上述反应区域同样的固定化方法。
本发明的试验器具中，通过对存在于各试验器具1多孔体5上的、在区域6中发生的显色的色调和标准显色8的色调进行比较，可以容易地对检样中的测定对象物质进行半定量。即，由检样中的抗原与保持在试剂垫4中的标记抗体形成的复合物被反应区域的固定化抗体捕获时，区域6发生的显色的色调如果比标准显色8的色调弱，则检样中测定对象物质的浓度比基准浓度低。如果在区域6中发生的显色的色调比标准显色8的色调强，则检样中测定对象物质的浓度比基准浓度高。在区域6中发生的显色的色调与标准显色8的色调相同程度时，则检样中测定对象物质的浓度与基准浓度程度相同。另外，如果在区域6中不发生显色，则表示检样中不存在测定对象物质，或者在检出灵敏度以下。因此，本发明的试验器具1通过区域6中是否显色，即可以对测定对象物质进行特定灵敏度下的定性评价。
通过使用光学浓度计等对在区域6中发生的显色的色调与标准显色8的色调进行比较，可以准确地测定检样中测定对象物质的浓度。
在多孔体5中，检样通过毛细管现象在其内部移动，因此，优选标准显色8固定在多孔体5的表面。这里，标准显色8优选为标记担载于试剂垫4的抗体或抗原所使用的标记物质。因此，优选例举以胶体金为代表的胶体金属、胶体非金属、染料溶胶或分散染料等染料颗粒、胶乳颗粒或着色微粒等。其中，从发色性优异、色调和粒径丰富、对抗体或抗原的标记方法有多种等角度考虑，优选用染料或颜料着色的胶乳微粒或聚苯乙烯微粒。另外，该标记方法是本领域技术人员所周知的，有吸附的方法或化学键合的方法等。特别优选用染料或颜料着色的、粒径为0.5μm以下、优选粒径为0.05-0.5μm的球状或大致呈球状的胶乳微粒或聚苯乙烯微粒。最优选蓝色胶乳。
标准显色8只要是与测定对象物质特定浓度下的显色为同一色调，可以使用色素、染料、颜料等，也可以用其它物质形成。
优选以固定于上述多孔体上的状态配置可以与测定对象物质特异性结合的抗体或抗原的区域(反应区域6)、和以固定在上述多孔体上的状态配置与测定对象物质特定浓度下的显色相对应的标准显色的区域(标准显色8)相对于展开溶剂的展开横排或竖排配置，最优选横排。另外，优选两者位于相邻近的位置。具体来说，优选两者的距离在20mm以内，更优选在10mm以内。
展开溶剂只要是通常可在检样中含有的溶剂即可，没有特别限定。例如有水(包括检样中所含的水分)；生理食盐水；丙酮等有机溶剂等。
展开溶剂的展开方向在图1中是由样品垫3向吸收垫7的方向。
另外，以可移动的状态配置可以与检样中的测定对象物质特异性结合的被标记的抗体或抗原的区域(试剂垫4)所使用的标记用色素、和以固定在上述多孔体上的状态配置与测定对象物质特定浓度下的显色相对应的标准显色的区域(标准显色8)所使用的标准显色用色素优选为同一色素，进一步优选为胶乳颗粒。
标准显色8所显示的基准浓度或检测灵敏度可根据测定对象物质的种类、试验器具的用途适当选择。例如，试验器具1用于测定尿检样中的hCG量时，优选检测灵敏度为25IU/L、基准浓度为1000IU/L。hCG的检测灵敏度为25IU/L时，可通过区域6有无显色来进行妊娠诊断。基准浓度设定为1000IU/L时，可以进行宫外孕、流产早产、绒毛膜瘤的预后判定等评价。结果，以hCG浓度25IU/L和1000IU/L为标准，通过一次测定，即可以对检样中的测定对象物质进行半定量。例如，测定血液中的PSA量时，优选检测灵敏度为1ng/ml，基准浓度为4ng/ml。PSA的检测灵敏度为1ng/ml时，可通过区域6有无显色来诊断前列腺肥大，基准浓度设定为4ng/ml时，可以诊断前列腺癌。结果，通过一次操作，以PSA浓度1ng/ml和4ng/ml作为基准，即可以对检样中的PSA浓度进行半定量。
如上所述，在多孔体5中移动的检样中的测定对象物质的部分或全部被固定在区域6中的抗体或抗原捕获。而检样中的其它成分和未被捕获的测定对象物质等则由多孔体5中向下游方向移动。图1和图2所示的试验器具中，设置了用于吸收这些物质的吸收垫7。吸收垫7只要是可以吸收由多孔体5中移动来的检样并保持，即没有特别限定。因此，吸收垫7可广泛使用滤纸、非织造布、多孔质膜等以往以吸收液体并保持在其内部为目的所使用的物质。吸收垫7可以含有硅胶等具有吸水性、吸湿性的物质。
如上所述，检样中不含有测定对象物质时、或者即使含有也在检测灵敏度以下时，区域6不发生显色，试验器具1在外观上与未使用时相比没有变化。因此，本发明的试验器具1优选具有用于确认试验结束的结构。图1和图2所示的试验器具1中，在多孔体5的固定标准显色8的区域的更下游一侧设置了在检样到达时发色的区域9。在覆盖多孔体5的保护膜20中，覆盖该区域9的部分设置成透明的窗口22。图1中，保护膜20中，部分21和22为透明的，23、23’、23”为不透明的。
图1和图2所示的试验器具1中，该区域9和窗口22形成确认试验结束的结构。即，由多孔体5中移动来的检样到达区域9，则发色，通过窗口22可确认该发色。由此可以确认试验结束。
出于上述目的，区域9中含浸或固定有各种发色剂。区域9中含浸或固定的发色剂可以是通过与规定pH的液态试样接触而发色的发色剂，具体来说，可列举例如曙红B、焰红染料B、苯红紫4B、刚果红、溴酚蓝、溴甲酚绿、2，5-二硝基苯酚或它们的相关物质。另外，发色剂可以是在检样到达区域9时由于其水分而发色的物质。
还可以是在多孔体5的窗口22上游侧的区域、例如被不透明部分23’覆盖的区域含浸水溶性的色素，在检样到达时溶解，溶解在检样中并移动的色素通过窗口22进行确认。
与被标记的抗原或抗体特异性反应的成分，例如使用标记抗hCG小鼠单克隆抗体时，将抗小鼠羊抗体等固定在区域9，也可以达到该目的。
将与测定不相关的标记抗体或标记生物素或匙孔血蓝蛋白等保持在试剂垫4中，将与上述标记抗体特异性反应的抗体或抗原或者抗生物素蛋白或者抗匙孔血蓝蛋白抗体固定在区域9中，也可以达到上述目的。
以上，利用附图对本发明的试验器具进行了详细说明，但本发明的试验器具并不限于图示的方案。本发明的试验器具是具有检样通过毛细管现象可移动的多孔体的免疫色谱用试验器具，可广泛使用具有下述(1)-(3)的区域的：
(1)以可移动的状态配置可与上述检样中的测定对象物质特异性结合的被标记的抗体或抗原的区域；
(2)以固定在上述多孔体上的状态配置可与上述测定对象物质特异性结合的抗体或抗原的区域；以及
(3)以固定在上述多孔体上的状态配置与上述测定对象物质特定浓度下的显色相对应的标准显色的区域。
因此，本发明的试验器具可以象日本特表平1-503174号公报、日本特开平6-180320号公报、日本特开平6-160388号公报所述的免疫色谱用试验装置那样，具有收容多孔体等构成要素的外壳。本发明的图中所例举的保护膜20在本发明的试验器具中并不是必须的。
固定在多孔体上的反应区域和/或标准显色的形状并不限于图示的线状，可以是其它形状。另外，多孔体上也可以固定与各测定对象物质的不同浓度下的显色相对应的多个反应区域和/或标准显色。
本发明的试验器具可适用于来自生物的各种液体试样。所述液体试样具体可列举血液、血浆、血清、唾液、尿、粪便提取液、组织提取液等。这些液体试样中所含有的测定对象物质可以是发挥抗原或抗体功能的各种蛋白质或肽、复合蛋白质、脂质、复合脂质、核酸、凝集素、糖链或具有这些的化合物、生物素、抗生物素蛋白、激素、酶、酶底物、酶抑制剂、受体、配体、药物、药物代谢产物、分析对象物质的衍生物等，更具体地说，可以例举人绒毛膜促性腺激素(hCG)、促黄体生成素(LH)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、人胎盘催乳素(hPL)、β2微球蛋白(β2m)、铁蛋白、HBs抗原、雌激素、PSA等以及它们的抗体。本发明中，优选利用抗体、抗原、核酸、抗生物素蛋白、生物素，特别优选抗体或抗原。
本发明的试验器具也适用于将上述列举的测定对象物质的标准品溶解于生理食盐水等中制备的溶液。
实施例
以下，通过实施例进一步说明本发明的试验器具。
本实施例中，使用图1和图2所示的试验器具1。
试验器具1的各构成如下所示。
基体2：聚酯制，长125mm×宽8mm×厚0.25mm
样品垫3：粘接长30mm×宽8mm×厚0.3mm的非织造布(ベンリ—ゼ，旭化成社制)。
试剂垫4：在长15mm×宽8mm×厚0.3mm的非织造布(玻璃纤维，ミリポア社制)上填充被标记的抗体(结合有用蓝色染料着色的胶乳颗粒(粒径0.3μm的球状颗粒)作为标记物质的抗hCG小鼠单克隆抗体)并冷冻干燥所得。将其粘接在基体2上。
样品垫3和试剂垫4的端部层叠(层叠长约4mm)。
多孔体5：将硝酸纤维素膜(长25mm×宽8mm×厚235μm，孔径约8μm)粘接在基体2上。
多孔体5和试剂垫4的端部层叠(层叠长2mm)。
在多孔体5上涂布1.5mg/ml的抗hCG小鼠单克隆抗体，干燥，从而使该单克隆抗体固定在区域6中。
标准显色8：将与作为标记物使用的物质相同的胶乳颗粒(用蓝色染料着色)固定在多孔体5的表面，以此作为标准显色8，使其与浓度为1000IU/L(基准浓度)的hCG在区域6被抗体捕获时的显色为同一色调。
作为表示试验结束的指标，在比多孔体5的标准显色8下游侧的区域9含浸曙红B作为发色剂，并干燥。
吸收垫7：将长20mm×宽8mm×厚0，4mm的非织造布(玻璃纤维，ワツトマン社制)粘接在基体2上。
保护膜：除了样品垫3，将试验器具1的上部用具有透明部分21、22和不透明部分23、23’、23”的保护膜(聚对苯二甲酸乙二醇酯制)覆盖。
使用该试验器具1，以人绒毛膜促性腺激素(hCG)作为测定对象物质，实施半定量。
将hCG(国立医药品食品卫生研究所制)用含有0.1％BSA的生理食盐水稀释，使hCG浓度为以下各种浓度，将试验器具1的样品垫3部分在该溶液中浸渍约3秒钟。接着，将试验器具1在水平方向静置约3分钟，保护膜20位于上面。在窗口22明确地产生表示反应结束的显色9’时，用光密度计测定标准显色8与区域6的显色6’。
这里，使用hCG浓度为0IU/L(阴性)、25IU/L、100IU/L、250IU/L、500IU/L、1000IU/L和10000IU/L的检样。
以下，以由光密度计得到的数值表示各浓度的检样在区域6的显色6’的显色度程度。
[表1]
 
浓度(IU/L) 显色度
0 10
25 240
100 1160
250 3400
500 5900
1000 10000
10000 17000
通过光密度计测定的标准显色8的显色度程度值为9800。
阴性检样几乎不发色，在25IU/L时发色，随着浓度的升高，发色也增强，在1000IU/L下显示与标准显色同等的发色，在更高浓度下显示比标准显色更强的发色，可用作半定量的试验器具。
再使用该试验器具1，确认显色度是否随时间变化。即，将试验器具1以样品垫3浸没的方式在经浓度调节的检样中浸渍约3秒钟。接着，将试验器具1水平静置约3-30分钟，使保护膜位于上面，用光密度计测定各时间下的标准显色8和区域6的显色6’。
这里，使用hCG浓度为0IU/L(阴性)、25IU/L、500IU/L、1000IU/L和106IU/L的检样。
图3和下表中表示了由光密度计得到的显色度程度的数值随时间变化的情况。
[表2]
Figure S06803344120070731D000151
显色度是将各浓度测定三次所得的平均值。标准显色的数值是各浓度测定三次(共15次)的平均值。
观察30分钟之内随时间的变化，标准显色8或各浓度下的区域6的显色6’中的发色是在试验开始后5-10分钟后显示峰，然后伴随着对多孔体5的检样供应量减少，多孔体5干燥，从而显色度降低。由测定开始，随着时间的推移，阴性检样几乎不发色，在25IU/L下开始发色，在1000IU/L下呈现几乎与标准显色同等的发色，在更高浓度下显示比标准显色更强的发色，这种倾向没有变化，可用作半定量的试验器具。
表1、表2和图3所示的本试验结果是以光密度计测定的结果的数值表示，在目视判定中，通过有无显色以及与标准显色的强弱，也得到了同样的结果。
图4是表示实施半定量前后试验器具1的平面图。图4(a)是浸渍到检样中之前的未使用的试验器具，(b)是使用hCG浓度为25IU/L的尿检样实施半定量后的试验器具，(c)是使用hCG浓度为1000IU/L的检样实施半定量后的试验器具，(d)是使用hCG浓度为10000IU/L的检样实施半定量后的试验器具，(d)是使用hCG浓度为0IU/L(阴性)的检样实施半定量后的试验器具。
由图4可知，实施了半定量之后的试验器具1可通过在窗口22发生的显色9’确认(图4(b)-(e))。使用阴性检样的例子中，在区域6未发生显色，由透明部分21只确认了标准显色8。而含有hCG的检样中，可以观察到表示hCG与被标记的抗体的复合物在区域6被抗体捕获的显色6’。该显色6’因检样中hCG浓度不同而出现色调差异。具体来说，在使用hCG浓度比基准浓度低的25IU/L的检样的例子中，显色6’比标准显色8的色调弱很多(图4(b))。在使用hCG浓度与基准浓度相等的1000IU/L的检样的例子中，显色6’的色调与标准显色8大至相同(图4(c))。使用hCG浓度比基准浓度高的10000IU/L的检样的例子中，显色6’的色调比标准显色8强(图4(d))。
产业实用性
本发明涉及使用免疫学色谱(免疫色谱法)对检样中的测定对象物质进行半定量的试验器具；以及使用该试验器具的半定量方法。

Claims (4)

1.用于对人绒毛膜促性腺激素(hCG)进行半定量的试验器具，该试验器具是具有检样通过毛细管现象可移动的多孔体的免疫色谱用试验器具，
上述用于免疫色谱的试验器具有：
(1)以可移动的状态配置可与上述检样中的人绒毛膜促性腺激素(hCG)特异性结合的、被用蓝色染料着色的胶乳颗粒标记的抗体的区域；
(2)以固定在上述多孔体上的状态配置可与人绒毛膜促性腺激素(hCG)特异性结合的抗体的反应区域；以及
(3)以在上述多孔体上固定用蓝色染料着色的胶乳颗粒的状态配置与人绒毛膜促性腺激素(hCG)1000IU/L下的显色相对应的标准显色的标准显色区域；
将上述反应区域(2)发生的显色与上述标准显色在20mm以内的距离进行比较，从而以检测灵敏度25IU/L对上述检样中的人绒毛膜促性腺激素(hCG)进行半定量。
2.权利要求1所述的试验器具，其中，上述(2)的以固定在上述多孔体上的状态配置可与人绒毛膜促性腺激素(hCG)特异性结合的抗体的反应区域、和上述(3)的以固定在上述多孔体上的状态配置与人绒毛膜促性腺激素(hCG)1000IU/L下的显色相对应的标准显色的标准显色区域相对于展开溶剂的展开方向横排配置。
3.权利要求1或2所述的试验器具，其用于妊娠诊断。
4.使用权利要求1或2所述的试验器具对检样中的人绒毛膜促性腺激素(hCG)进行半定量的方法。
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