WO2006080438A1 - イムノクロマト用試験具およびこれを用いた半定量方法 - Google Patents

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WO2006080438A1
WO2006080438A1 PCT/JP2006/301315 JP2006301315W WO2006080438A1 WO 2006080438 A1 WO2006080438 A1 WO 2006080438A1 JP 2006301315 W JP2006301315 W JP 2006301315W WO 2006080438 A1 WO2006080438 A1 WO 2006080438A1
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test device
region
specimen
antibody
target substance
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PCT/JP2006/301315
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Inventor
Naofumi Satou
Jyunichi Makino
Original Assignee
Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • the present invention relates to a test device for semi-quantifying a substance to be measured in a specimen using immunological chromatography (Immunochromatography), and a semi-quantitative method using the test device.
  • immunological chromatography Immunochromatography
  • An immunochromatographic test device uses blood or blood containing serum or plasma, body fluid such as urine as a sample, detects anti-HBs antigen in the serum sample, detects anti-treponemaparidum antibody in the serum or plasma sample, blood Used for type determination and detection of human chorionic gonadotropin (hCG) in urine samples.
  • body fluid such as urine as a sample
  • detects anti-HBs antigen in the serum sample detects anti-treponemaparidum antibody in the serum or plasma sample
  • blood Used for type determination and detection of human chorionic gonadotropin (hCG) in urine samples.
  • hCG human chorionic gonadotropin
  • FIG. 5 is a conceptual diagram showing an example of a conventional immunochromatographic test device
  • FIG. 5 (a) is a plan view of the immunochromatographic test device
  • FIG. 5 (b) is a side view thereof
  • FIG. Fig. 5 (c) shows an immunochromatographic test device after use of force, which is the same diagram as Fig. 5 (a).
  • a sample pad 13 is provided on a sheet-like substrate 12.
  • FIG. When the test device 11 is used, the sample pad 13 is immersed in a specimen to be measured. The specimen absorbed in the sample pad 13 moves to the reagent pad 14 provided adjacent to the sample pad 13 by capillary action.
  • the reagent pad 14 carries a labeled antibody or antigen.
  • the labeled antibody or antigen carried on the reagent pad 14 is eluted.
  • a substance to be measured in a sample and a labeled antibody or antigen may form a complex.
  • the specimen containing these moves to the porous body 15 provided adjacent to the reagent pad 14 by capillary action.
  • the composite that has reached the porous body 15 moves in the downstream direction (when the sample pad 13 side is the upstream side in the figure) by capillary action.
  • a reaction region 16 to which an antibody or an antigen is immobilized is provided on the porous body 15.
  • an absorption pad 17 is provided for absorbing other components in the specimen and a substance to be measured that has not been captured.
  • the substance to be measured in the sample can be semi-quantified.
  • a plurality of reaction regions 16 each having different detection sensitivities for the measurement target substance can be provided, and the measurement target substance in the sample can be semi-quantified by the number of regions 16 in which coloration 1 occurs.
  • Patent Documents 1 to 6 describe such an immunochromatographic test device and a method for detecting a measurement target substance in a specimen using the same, or a method for semi-quantifying the measurement target substance.
  • Patent Document 1 describes a method for measuring an antigen or antibody in a liquid using a sheet-like test device based on the immunochromatography method.
  • a test device having a region exhibiting a standard color on a porous body.
  • Patent Document 2 describes a test device for measuring the presence or absence of an antigen or antibody in a liquid using a dye-labeled antigen or antibody.
  • a test device for measuring the presence or absence of an antigen or antibody in a liquid using a dye-labeled antigen or antibody.
  • Patent Document 3 describes a test device for quantifying an antigen or antibody in a sample solution.
  • the test device is characterized by having a plurality of reaction regions in which an amount of capture reagent that increases in upstream force toward the downstream is immobilized, and quantifies the analysis target based on the number of colored reaction regions. It is. Although it is an essential requirement to have a plurality of reaction regions, it is not preferable to provide a plurality of reaction regions because the manufacturing process becomes complicated. Further, there is no disclosure or suggestion regarding the test device having a region exhibiting a standard color on the porous body.
  • Patent Document 4 describes a test device for semi-quantifying an antigen or antibody in a sample solution.
  • the test device is a particle-labeled antigen or antibody, the direction of development of the sample solution.
  • the amount of the antigen or antibody can be estimated semi-quantitatively by the principle of the sandwich method, having a plurality of reaction regions arranged in series.
  • a plurality of reaction regions is an essential requirement, but providing a plurality of reaction regions is not preferable because the manufacturing process becomes complicated. Further, there is no disclosure or suggestion regarding a test device having a region exhibiting a standard color on a porous body.
  • Patent Document 5 discloses an immunochromatographic analysis using an immunochromatographic analysis piece having a portion where a constant color tone appears on the same film and a portion where a concentration-dependent color tone of a specimen appears. After injecting a sample with an unknown concentration into a strip and performing chromatographic development, the color tone of the portion where a certain color tone appears and the color tone of the portion where the concentration-dependent color tone of the sample appears are visually measured using an optical density measuring device A method for measuring the concentration of a read unknown analyte is described. This method is characterized in that the control color region and the concentration-dependent color region of the sample are on the same film, but the control color region is immobilized differently from the sample. The coloration is performed using an antibody and a labeled antibody, which is complicated and is not easy to adjust to a color corresponding to the concentration of a specific specimen.
  • Patent Document 6 describes an immunochromatographic test device in which a classification line type indication is directly printed on a porous body to which a specimen moves due to capillary action. As described in Patent Document 6, when printing is performed on a porous body on which a specimen moves due to capillary action, the idea is that a measurement target substance is not formed on the porous body before Patent Document 6. The idea of providing a display useful for measuring concentration has been quite powerful.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-55808
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 10-73592
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 5-5743
  • Patent Document 4 JP-A-8-278305
  • Patent Document 5 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-83153
  • Patent Document 6 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-13143
  • the present invention uses the immunochromatography method and is easy to manufacture and is contained in the specimen. It is an object of the present invention to provide a novel test device for easily semi-quantifying the concentration of a measurement target substance and a semi-quantitative method using this test device.
  • the present invention is an immunochromatographic test device having a porous body in which a specimen can move by capillary action
  • the immunochromatographic test tool is:
  • the standard coloration corresponding to the coloration at a specific concentration of the measurement target substance has a region arranged in a fixed state on the porous body
  • test device of the present invention A test device for semi-quantifying the measurement target substance in the specimen by comparing the coloration generated in the region (2) with the standard coloration (hereinafter referred to as “test device of the present invention”). . )I will provide a.
  • the standard coloring used for the region where the labeling dye used in the above and the standard coloring corresponding to the coloring at a specific concentration of the measurement target substance in (3) are fixed on the porous body are used.
  • Examples of the test device include the same colorant as the colorant.
  • the present invention also provides a method for semi-quantifying a substance to be measured in a specimen using the test device of the present invention.
  • the test device of the present invention is generated by capturing the standard color fixed on the porous body of the immunochromatographic test device and the antibody or antigen immobilized on the porous body of the measurement target substance. By comparing with the coloration, it is possible to easily semi-quantify the measurement target substance contained in the sample.
  • the test device of the present invention includes a region (reaction region) in which an antibody or an antigen that can specifically bind to a measurement target substance is fixed on a porous body, and a specific substance of the measurement target substance. Since the standard coloration corresponding to the coloration at the concentration has a region arranged in a fixed state on the porous body, the coloration of the reaction region and the standard coloration should be compared under the same conditions. It is possible to obtain high accuracy.
  • the test device of the present invention can perform semi-quantification if there is at least one reaction region and a region exhibiting standard coloration, a plurality of reaction regions are essential for semi-quantification. Compared to a test device, it can be easily manufactured. In addition, for areas showing standard coloration, it is an essential requirement to fix dyes etc. directly on the porous body without using antibodies, antigens, etc. Compared to test equipment, it can be easily manufactured. In addition, since the reaction such as an antigen-antibody reaction is not indirectly performed, the color tone of the standard coloring is not affected at all by the difference in various use conditions when using this test device.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram of an embodiment of a test device of the present invention.
  • FIG. 2 is a side view of the test device of FIG.
  • Fig. 3 is a graph showing the time course of standard coloration 8 and the degree of coloration! / ⁇ after the test device of the present invention is immersed in hCG adjusted to various concentrations. .
  • FIGS. 4 (a) to 4 (e) are plan views of the test device used in the examples, and FIG. 4 (a) is an unused test device before immersion in the urine specimen.
  • Fig. 4 (b) shows a test device after semi-quantification using a sample with hCG concentration of 25 IUZL
  • Fig. 4 (c) shows a test device after semi-quantification using a sample with hCG concentration of 1000 IUZL
  • Fig. 4 ( d) shows a test device after semi-quantification using a sample with hCG concentration of 10000 IUZL
  • Fig. 4 (e) shows a test device after semi-quantification using a sample with hCG concentration OIUZL (negative).
  • RU [FIG. 4]
  • FIG. 5 (a) is a conceptual diagram showing a conventional immunochromatographic test device, and the test device is shown in a plan view.
  • FIG. 5 (b) is a side view of the test device shown in FIG. 5 (a).
  • FIG. 5 (c) shows the same test force as in FIG. 5 (a) and the test device after use.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram of an embodiment of the test device of the present invention
  • FIG. 2 is a side view of the test device shown in FIG.
  • a sample pad 3, a reagent pad 4, a porous body 5 and an absorption pad 7 are formed on a sheet-like substrate 2.
  • the reagent pad 4, the porous body 5 and the absorption pad 7 are covered with a protective film 20.
  • each component is formed on a sheet-like substrate 2.
  • the substrate 2 is made of a material that does not absorb or permeate the specimen passing through each component during the immunochromatography and does not denature the specimen when the specimen comes into contact.
  • plastic materials used in medical devices such as vinyl chloride, polyethylene, ethylene acetate butyl resin, polypropylene, polycarbonate, polyurethane, polystyrene, silicone resin, and fluorine resin. , Polyethylene terephthalate, polyamide, ABS resin and the like.
  • the substrate 2 may be made of paper having a water and oil repellent finish on the surface.
  • the sample pad 3 is a part where the specimen is dropped or immersed in the specimen. When an insoluble substance is present in the specimen, the sample pad 3 also acts as a filter for removing the insoluble substance. To do. From this point of view, the sample pad 3 is not particularly limited to a force exemplified by a nonwoven fabric or a porous membrane having a pore diameter of 20 ⁇ m to 100 ⁇ m, preferably 30 ⁇ m to 40 ⁇ m.
  • the material that can be used for the sample pad 3 is not particularly limited as long as a certain amount of specimen can be collected, is hydrophilic, and has a filter function.
  • regenerated cellulose, cellulose acetate, nitrocellulose, and poly Forces exemplified by acrylonitrile, ethylene butyl acetate, polyurethane, polymethyl methacrylate, nylon resin, glass fiber, pulp, cotton, rayon, acrylic, polyester and the like are not particularly limited thereto.
  • the specimen dropped onto the sample pad 3 moves in the downstream direction, that is, toward the reagent node 4 by capillary action.
  • the sample pad 3 side of the test device 1 is the upstream side, and the opposite side is the downstream side.
  • the sample pad 3 is included in the sample pad 3 as a result of being immersed in the sample. It also means a specimen that has been removed.
  • the material of the reagent pad 4 is exemplified by a nonwoven fabric or a porous membrane as in the case of the sample pad 3, but is not particularly limited thereto.
  • the reagent pad 4 carries an antibody or an antigen that can specifically bind to the measurement target substance in the sample in a state labeled with a labeling substance such as a dye.
  • the antibody or antigen that can specifically bind to the measurement target substance is appropriately selected according to the measurement target substance.
  • the substance to be measured is human chorionic gonadotropin (hCG) in a urine sample
  • an anti-hCG antibody more specifically, an anti-hCG mouse polyclonal antibody, an anti-hCG mouse monoclonal antibody, or the like
  • AFP alphafetoprotein
  • an anti-AFP antibody is used.
  • an anti-HIV antibody an HIV antigen peptide or the like is used.
  • PSA prostate specific antigen
  • PSA prostate specific antigen
  • the labeling substance is not particularly limited as long as visible color development is observed.
  • metal colloids represented by gold colloids, non-metal colloids, dye sols such as dye sols or disperse dyes, latex particles or Examples thereof include colored fine particles.
  • latex fine particles or polystyrene fine particles colored with dyes or pigments are preferred from the viewpoints of excellent color developability, abundant color tone and particle diameter, and the presence of a plurality of methods for labeling antibodies or antigens.
  • This labeling method is well known by those skilled in the art, and there are a method by adsorption and a method by chemical binding.
  • latex particles or polystyrene particles having a particle size of 0.5 ⁇ m or less, preferably 0.05 to 0.5 ⁇ m, which are colored with a dye or a pigment, are preferably spherical or substantially spherical. . Most preferred is a blue latex.
  • the labeled antibody or antigen is carried on the reagent pad 4 in a movable state.
  • “supported in a movable state” means that the labeled antibody or antigen is retained in the reagent pad 4 when not in use, that is, when the reagent pad 4 is dry. This means that when the reagent pad 4 is wetted during use, that is, due to the arrival of the specimen, the labeled antibody or antigen becomes movable.
  • reagent pad 4 is labeled
  • the adsorbed antibody or antigen must be a material, but if it is a material that adsorbs, it can be used by masking with an inactive protein such as BSA in advance.
  • the labeled antibody or antigen is retained on the reagent pad 4 by, for example, impregnating the reagent pad 4 and then lyophilizing it.
  • the reagent pad 4 forms a region where the labeled antibody or antigen that can specifically bind to the substance to be measured in the specimen can be moved.
  • the specimen dropped on the sample pad 3 moves to the reagent pad 4 by capillary action.
  • the hole diameter of the reagent pad 4 is preferably the same as or smaller than that of the sample pad 3.
  • the pore size of the reagent pad 4 is exemplified by 1 ⁇ m to 50 ⁇ m, preferably 5 ⁇ m to 30 ⁇ m.
  • the sample pad 3 and the reagent pad 4 are partially stacked in order to facilitate the movement of the specimen due to capillary action.
  • the sample pad 3 and the reagent pad 4 may be simply arranged adjacent to each other or may be the same pad as long as the specimen can be appropriately moved by the capillary phenomenon.
  • the substance to be measured in the specimen and the labeled antibody or antigen in the pad 4 move downstream, that is, toward the porous body 5 by capillary action.
  • the measurement target substance and the labeled antigen or antibody are in an antigen-antibody relationship, a part or all of both forms an antigen-antibody complex, which is also downstream, that is, porous. Move to body 5.
  • the reagent pad 4 and the porous body 5 are partially laminated.
  • the reagent pad 4 and the porous body 5 may be simply disposed adjacent to each other, or the reagent pad 4 may serve as the porous body 5. The reverse is also possible.
  • the porous body 5 has a structure having sponge-like pores or a network, and is a medium in which the specimen can move by capillary action.
  • the test device 1 shown in FIGS. 1 and 2 is shown as a sheet-like porous membrane.
  • the material of the porous body 5 is not particularly limited as long as the immunochromatography method can be performed. Woven fabrics and nonwoven fabrics made from porous synthetic polymers such as cellulose, cellulose derivatives, nitrocellulose, ethylene acetate butyl, polyurethane, polymethyl methacrylate, nylon resin, polyvinylidene difluoride (PVDF), etc.
  • Examples thereof include membranes, glass fiber filters, various filter papers, and the like, and those using nitrocellulose, which are preferable using cellulose, cellulose derivatives, and porous synthetic polymers, are particularly preferable.
  • Examples of the pore diameter of the porous body 5 include 1 ⁇ m to 30 ⁇ m, preferably 1 ⁇ m to 20 ⁇ m.
  • the porous body 5 has a region 6 (reaction region) in which an antibody or an antigen capable of specifically binding to the measurement target substance is immobilized.
  • the antibody or antigen immobilized on region 6 can be appropriately selected according to the substance to be measured. Specifically, when the substance to be measured is hCG, an anti-hCG antibody, more specifically, an anti-hCG mouse polyclonal antibody, an anti-hCG mouse monoclonal antibody, or the like can be used. When the substance to be measured is AFP, an anti-AFP antibody can be used. When the substance to be measured is an anti-HIV antibody, an HIV antigen peptide or the like can be used.
  • an anti-PSA mouse monoclonal antibody, an anti-PSA rabbit antibody, or the like can be used.
  • These immobilization methods can be easily fixed by directly applying and drying the above-mentioned antibody or antigen solution when the porous body 5 is, for example, -trocellulose or nylon.
  • the porous material In the case of porous materials such as glass fiber filters and filter paper that cannot be fixed by direct application and drying, the porous material must be activated or pre-treated with the activity of the immobilized antibody or antigen.
  • the antigen, antibody, and Z or complex that have migrated through the porous body 5 by capillarity are captured by the antibody or antigen immobilized on the region 6.
  • the antigen, antibody, and Z or complex containing the labeling substance are captured, it can be confirmed as a color developed in region 6.
  • the color tone generated in region 6 depends on the immunochromatography method (reagent combination) used and the concentration of the substance to be measured in the sample. For example, when the complex formed by the labeled antibody held on the reagent pad 4 and the antigen in the sample is captured by the immobilized antibody in the reaction region, the concentration of the measurement target substance in the sample is high.
  • the porous body 5 has a region in which a standard color 8 corresponding to a color at a specific concentration of the measurement target substance is fixed. That is, in the test device 1, a region having a color tone equal to the coloration generated in the region 6 is formed on the porous body 5 when a specimen containing a specific concentration of the measurement target substance (hereinafter referred to as “reference concentration”) is used. Has been. Note that the fixing method similar to that in the reaction region can also be used for the method of fixing the standard color 8.
  • the color tone generated in the region 6 present on the porous body 5 of the test device 1 is compared with the color tone of the standard color 8, thereby measuring in the specimen.
  • the target substance can be easily semi-quantified. That is, for example, when the complex formed by the antigen in the specimen and the labeled antibody held in the reagent pad 4 is captured by the immobilized antibody in the reaction region, the color tone generated in the region 6 is changed. If it is weaker than the standard color tone 8, the concentration of the analyte in the sample will be lower than the reference concentration. If the color tone generated in region 6 is stronger than the standard color tone 8, the concentration of the substance to be measured in the sample is higher than the reference concentration.
  • the concentration of the substance to be measured in the sample is comparable to the reference concentration.
  • the test device 1 of the present invention can also perform a qualitative evaluation at a specific sensitivity of the measurement target substance based on the presence or absence of coloration in the region 6.
  • the concentration of the measurement target substance in the sample can be accurately measured. wear.
  • the standard color 8 Since the specimen moves inside the porous body 5 due to capillary action, the standard color 8 has many It is preferably fixed to the surface of the hole 5.
  • the standard color 8 is preferably a labeling substance used to label the antibody or antigen carried on the reagent pad 4.
  • preferred examples include metal colloids represented by gold colloids, non-metallic colloids, dye particles such as dye sols or disperse dyes, latex particles, and colored fine particles.
  • latex fine particles or polystyrene fine particles colored with dyes or pigments are preferred from the viewpoints of excellent color developability, abundant color tone and particle diameter, and the existence of a plurality of methods for labeling antibodies or antigens.
  • This labeling method is known by those skilled in the art, and there are a method by adsorption and a method by chemical binding.
  • latex or polystyrene particles that are colored with dyes or pigments and have a particle size of 0.5 ⁇ m or less, preferably 0.05 to 0.5 ⁇ m, and are spherical or substantially spherical.
  • a particle size 0.5 ⁇ m or less, preferably 0.05 to 0.5 ⁇ m, and are spherical or substantially spherical.
  • spherical or substantially spherical spherical or substantially spherical.
  • the standard coloration 8 may be formed using other substances such as pigments, dyes, and pigments as long as the color tone is the same as the coloration at a specific concentration of the substance to be measured.
  • an antibody or an antigen that can specifically bind to the measurement target substance is disposed on the porous body in a fixed state (reaction area 6), and is displayed at a specific concentration of the measurement target substance.
  • the area where the standard color corresponding to the color is fixed on the porous body (standard color 8) is arranged in series or in parallel with the development direction of the developing solvent. Most preferably, they are arranged in series. Moreover, it is preferable that both are located in the vicinity. Specifically, the distance between the two is preferably within 20 mm, more preferably within 10 mm.
  • the developing solvent is not particularly limited as long as it can be normally contained in a specimen.
  • examples include water (including water contained in the specimen); physiological saline; organic solvents such as acetone.
  • the development direction of the developing solvent is the direction from the sample pad 3 to the absorption pad 7 in FIG.
  • the labeling dye used in the region (reagent pad 4) in which the labeled antibody or antigen that can specifically bind to the analyte in the sample can be moved, and the identification of the analyte Standard coloration corresponding to coloration at different concentrations is fixed on the porous body
  • the standard coloring dye used in the region (standard coloring 8) arranged in the state of being formed is latex particles, preferably the same color.
  • the reference concentration and detection sensitivity indicated as the standard coloration 8 can be appropriately selected according to the type of the substance to be measured and the use of the test device.
  • the detection sensitivity is preferably 25 IUZL and the reference concentration is preferably lOOOOIUZL.
  • the reference concentration is lOOOIUZL, evaluations such as ectopic pregnancy, premature labor, and prognosis of choriocarcinoma can be performed.
  • the target substance in the sample can be semi-quantified in one measurement.
  • the detection sensitivity is lng ZmL and the reference concentration is 4 ngZmL.
  • PSA detection sensitivity is IngZmL
  • prostate hypertrophy can be diagnosed based on the presence or absence of color development in region 6, and prostate cancer can be diagnosed when the reference concentration is 4 ngZmL.
  • semi-quantitative determination of the PSA concentration in the sample is possible based on the PSA concentrations of IngZmL and 4ngZmL in a single operation.
  • the test device 1 shown in FIGS. 1 and 2 is provided with an absorbent pad 7 for absorbing them.
  • the absorbent pad 7 is not particularly limited as long as it can absorb and hold the specimen that has moved through the porous body 5. Therefore, the absorbent pad 7 can be widely used, such as filter paper, non-woven fabric, and porous membrane, that have been conventionally used for the purpose of absorbing liquid and retaining it inside.
  • the absorbent pad 7 may contain a water-absorbing / hygroscopic substance such as silica gel.
  • test device 1 of the present invention has a mechanism for confirming the completion of the test.
  • test device 1 shown in Fig. 1 and Fig. 2 the standard color of porous body 5
  • a region 9 that generates color when the sample arrives is provided.
  • a transparent window 22 is provided in a portion of the protective film 20 covering the porous body 5 that covers the region 9.
  • portions 21 and 22 of the protective film 20 are transparent, and portions 23, 23 ′ and 23 ⁇ are opaque.
  • the region 9 and the window 22 form a mechanism for confirming the completion of the test. That is, when the specimen that has moved through the porous body 5 reaches the region 9, color development occurs, and this color development can be confirmed through the window 22. Thereby, it can be confirmed that the test is completed.
  • the area 9 is impregnated or fixed with various color formers.
  • color formers that are impregnated or immobilized in the region 9 are those that develop color when contacted with a liquid sample having a predetermined pH, such as eosin B, phloxine B, benzoperpurine 4B, Congo red, Examples include bromphenol levenore, bromcrezo monore green, 2,5-dinitrophenol, or related substances.
  • the color former may be one that develops color due to its moisture when the specimen reaches region 9! /.
  • a water-soluble dye is impregnated in a region upstream of the window 22 of the porous body 5, for example, in a region covered with the opaque portion 23 'so that the sample dissolves when it reaches the sample.
  • the dye that dissolves and moves in the specimen may be confirmed through the window 22.
  • a component that specifically reacts with a labeled antigen or antibody for example, a labeled anti-hCG mouse monoclonal antibody is used, an anti-mouse mouse antibody or the like is immobilized in region 9 to achieve the object. obtain.
  • labeled antibody, labeled piotin, keyhole mossian, etc. are retained in the reagent pad 4 without being involved in the measurement, and the antibody that reacts specifically with the labeled antibody or antigen, avidin, or anti-keyhole. This purpose can be achieved even if the antibody is immobilized in region 9.
  • test device of the present invention has been described in detail with reference to the drawings, the test device of the present invention is not limited to the illustrated form.
  • the test device of the present invention is an immunochromatographic test device having a porous body in which the specimen can move by capillary action, and can be widely used those having the following areas (1) to (3). .
  • the test device of the present invention is a test apparatus for immunochromatography described in JP-T-1-503174, JP-A-6-180320, JP-A-6-160388. You may have a casing which accommodates components, such as a porous body. Further, the protective film 20 illustrated in the drawings of the present invention is not essential for the test device of the present invention.
  • the reaction region fixed on the porous body and the shape of Z or standard color are not limited to a linear shape as shown in the figure, and may be other shapes.
  • a plurality of reaction regions and Z or standard coloring corresponding to coloring at different concentrations of the substance to be measured may be fixed on the porous body.
  • the test device of the present invention can be applied to various biological liquid samples.
  • a liquid sample include blood, plasma, serum, saliva, urine, fecal extract, tissue extract and the like.
  • the measurement target substances contained in these liquid samples include various proteins and peptides that function as antigens or antibodies, complex proteins, lipids, complex lipids, nucleic acids, lectins, sugar chains or compounds having these, piotin, avidin , Hormones, enzymes, enzyme substrates, enzyme inhibitors, receptors, ligands, drugs, drug metabolites, analyte derivatives, etc.
  • human chorionic gonadotropin hCG
  • luteinization Hormone LH
  • Alphafetoprotein AFP
  • CEA Carcinoembryonic antigen
  • hPL Human placental lactogen
  • Beta 2 microglobulin
  • Ferritin HBs antigen
  • Estrogen PSA, etc.
  • An antibody against is exemplified.
  • antibodies, antigens, nucleic acids, avidin and piotin are preferably used, and antibodies or antigens are particularly preferred.
  • test device of the present invention can also be applied to a solution prepared by dissolving a standard sample of a measurement target substance as exemplified above in physiological saline or the like.
  • test device of the present invention will be further described by way of examples.
  • test device 1 shown in FIGS. 1 and 2 was used.
  • test device 1 Each configuration of test device 1 was as follows.
  • Base 2 Polyester, length 125mm x width 8mm x thickness 0.25mm
  • Sample pad 3 Non-woven fabric (Benlyse, manufactured by Asahi Kasei Co., Ltd.) 30 mm long x 8 mm wide x 0.3 mm thick was adhered.
  • Reagent Pad 4 Latex particles colored with blue dye as labeling substance (particle size 0.3) on non-woven fabric (glass fiber, manufactured by Millipore) 15mm long x 8mm wide x 0.3mm thick m anti-hCG mouse monoclonal antibody) bound with spherical particles) and lyophilized were used. This was adhered on the substrate 2.
  • Porous material 5 A nitrocellulose film (length 25 mm ⁇ width 8 mm ⁇ thickness 235 ⁇ m, pore diameter about 8 m) was adhered onto the substrate 2.
  • the ends of the porous body 5 and the reagent pad 4 are laminated (2 mm in length).
  • Standard color 8 Same as the color used as the labeling substance as standard color 8, so that hCG with a density of 1000 IUZL (reference concentration) has the same color tone as that of the antibody when captured by the antibody in region 6.
  • the particles colored with a blue dye) were fixed on the surface of the porous body 5.
  • the region 9 downstream of the standard color 8 of the porous body 5 was impregnated with eosin B as a color former and dried.
  • Absorbent pad 7 Nonwoven fabric (glass fiber, manufactured by Whatman) having a length of 20 mm, a width of 8 mm, and a thickness of 0.4 mm was bonded onto the substrate 2.
  • Protective film Except for the sample pad 3, the upper part of the test device 1 was covered with a protective film (made of polyethylene terephthalate) having transparent portions 21, 22 and opaque portions 23, 2, 23 ".
  • the substance to be measured is human chorionic gonadotropin (hCG). Semi-quantitative was performed.
  • sample pad 1 of test device 1 Add 3 parts of sample pad 1 of test device 1 to a solution diluted with physiological saline containing 0.1% BS A so that hCG (manufactured by National Institute of Health Sciences) is included at various concentrations as follows. It was immersed for a while. Next, the test device 1 was left in the horizontal direction for about 3 minutes so that the protective film 20 was on top. When a coloration indicating that the reaction was completed in window 22 was clearly generated, the coloration of standard color 8 and region 6 was measured with a densitometer.
  • hCG manufactured by National Institute of Health Sciences
  • samples having hCG concentrations of OIUZL (negative), 25IUZL, lOOIU / L, 250IU / L, 500IU / L, lOOOIUZL and lOOOOIUZL were used.
  • the value of the coloration degree of standard coloration 8 measured with a densitometer was 9800.
  • Negative specimen shows almost no color, color develops with 25IUZL, color develops with increasing concentration, color develops almost equivalent to standard color with 1000IUZL, and color develops stronger than standard color at higher concentrations, semi-quantitative It was useful as a test tool.
  • test device 1 the presence or absence of a change in coloration with time was confirmed.
  • the test device 1 was immersed for about 3 seconds in the specimen whose concentration was adjusted so that the sample pad 3 was immersed.
  • the test device 1 was left to stand for about 3 to 30 minutes in the horizontal direction so that the protective film 20 was on top, and the standard coloration 8 and the coloration of the region 6 at each time were measured with a densitometer.
  • samples with hCG concentrations of 0 IUZL (negative), 25 IUZL, 500 IU / L, 1000 IU / L and 10 6 IUZL were used.
  • Figure 3 and the table below show the degree of color change with time. As shown.
  • the coloration degree is an average value measured three times for each density.
  • the standard color value is the average of 3 times for each density (15 times in total).
  • FIG. 4 is a plan view showing the test device 1 before and after the semi-quantitative measurement.
  • Figure 4 (a) is an unused test device before immersion in the sample, (b) is a test device after semi-quantification using a urine sample with an hCG concentration of 25 IUZL, and (c) is a sample with an hCG concentration of 1000 IUZL.
  • D is a test device after semi-quantitative analysis using a sample with hCG concentration lOOOOIUZL, (e) is a sample with hCG concentration OIUZL (negative) Each test piece after semi-quantitative analysis is shown.
  • the present invention relates to a test device for semi-quantifying a substance to be measured in a specimen using immunological chromatography (Immunochromatography), and a semi-quantitative method using the test device.
  • immunological chromatography Immunochromatography

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Abstract

　イムノクロマト法を用いて検体中に含まれる測定対象物質を容易に半定量するための新規な試験具として、検体が毛管現象により移動可能な多孔体を有するイムノクロマト用試験具であって、前記イムノクロマト用試験具は、（１）検体中の測定対象物質と特異的に結合し得る、標識された抗体または抗原が、移動可能な状態で配置された領域、（２）前記測定対象物質と特異的に結合し得る抗体または抗原が、前記多孔体上に固定された状態で配置された領域、および（３）前記測定対象物質の特定の濃度における呈色に対応する標準呈色が、前記多孔体上に固定された状態で配置された領域を有し、前記領域（２）に生じる呈色と、前記標準呈色とを比較することにより、検体中の測定対象物質を半定量するための試験具、および、この試験具を用いた半定量方法を提供する。

Description

明 細 書
ィムノクロマト用試験具およびこれを用いた半定量方法
技術分野
[0001] 本発明は、免疫学的クロマトグラフィー (ィムノクロマト法)を用いて、検体中の測定 対象物質を半定量するための試験具、および該試験具を用いた半定量方法に関す る。
背景技術
[0002] ィムノクロマト用試験具は、血清または血漿を含む血液、尿などの体液等を検体とし 、血清検体中の抗 HBs抗原の検出、血清または血漿検体中の抗トレポネーマパリダ ム抗体の検出、血液型の判定、尿検体中のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン (hCG)の 検出等に使用されている。
[0003] 図 5は、従来のィムノクロマト用試験具の一例を示す概念図であり、図 5 (a)は、ィム ノクロマト用試験具の平面図であり、図 5 (b)は、その側面図である。図 5 (c)は、図 5 ( a)と同様の図である力 使用後のィムノクロマト用試験具を示している。
[0004] 図 5 (a)および (b)に示すィムノクロマト用試験具 11では、シート状の基体 12上にサ ンプルパッド 13が設けられている。試験具 11を使用する場合、該サンプルパッド 13 を測定対象となる検体に浸漬する。サンプルパッド 13に吸収された検体は毛管現象 によって、該サンプルパッド 13に隣接して設けられた試薬パッド 14へと移動する。試 薬パッド 14には、標識された抗体または抗原が担持されている。
[0005] サンプルパッド 13に吸収された検体が試薬パッド 14に到達すると、試薬パッド 14 に担持されている標識された抗体または抗原が溶出する。検体中の測定対象物質と 標識された抗体または抗原とは、複合体を形成することもある。これらを含んだ検体 は、毛管現象によって試薬パッド 14に隣接して設けられた多孔体 15へと移動する。 多孔体 15に到達した複合体は、毛管現象によって下流方向（図中、サンプルパッド 1 3の側を上流側とした場合)へと移動する。
[0006] 多孔体 15上には、抗体または抗原を固定した反応領域 16が設けられている。毛管 現象によって多孔体 15中を移動してきた抗原、抗体、あるいは前記複合体は、反応 領域 16で捕捉される。図 5 (c)に示すように、この捕捉は、該領域 16での呈色 1 により確認することができる。このようにして、検体中の測定対象物質の有無を、目視 により確認することができる。
試験具 11のさらに下流側には、検体中の他の成分および捕捉されな力つた測定対 象物質等を吸収するための吸収パッド 17が設けられている。
[0007] また、図示したィムノクロマト用試験具を用いて、検体中の測定対象物質を半定量 することもできる。例えば、各々測定対象物質に対する検出感度が異なる反応領域 1 6を複数設けて、呈色 1 が生じた領域 16の数により、検体中の測定対象物質を半 定量することができる。
[0008] このようなィムノクロマト用試験具、およびこれを用いて検体中の測定対象物質を検 出する方法または該測定対象物質を半定量する方法が、特許文献 1〜6に記載され ている。
特許文献 1には、液体中の抗原または抗体をィムノクロマト法を原理とするシート状 の試験具を用いて測定する方法に関する記載がある。し力しながら、当該文献には、 抗原または抗体を半定量することに関する開示、示唆はなぐまた、多孔体上に標準 呈色を示す領域を有する試験具に関する開示、示唆もない。
特許文献 2には、色素標識した抗原または抗体を用いて、液体中の抗原または抗 体の存否を測定するための試験具に関する記載がある。し力しながら、当該文献にも 、抗原または抗体を半定量することに関する開示、示唆はなぐまた、多孔体上に標 準呈色を示す領域を有する試験具に関する開示、示唆もない。
特許文献 3には、検体溶液中の抗原または抗体を定量するための試験具に関する 記載がある。該試験具は、上流力も下流に向けて増加する量の捕捉試薬が固定化さ れて 、る複数の反応領域を有することを特徴とし、発色した反応領域の数によって分 析対象を定量するものである。反応領域が複数であることが必須要件であるが、反応 領域を複数設けることは、製造工程が煩雑となり好ましくない。また、該試験具には、 多孔体上に標準呈色を示す領域を有する試験具に関する開示、示唆はない。
特許文献 4には、検体溶液中の抗原または抗体を半定量するための試験具に関す る記載がある。該試験具は、粒子標識された抗原または抗体、検体溶液の展開方向 に対して直列に並んでいる複数の反応領域を有し、サンドイッチ法の原理により、抗 原または抗体の量を半定量的に推測することができる旨の開示がある。反応領域が 複数であることが必須要件であるが、反応領域を複数設けることは、製造工程が煩雑 となり好ましくない。また、該試験具には、多孔体上に標準呈色を示す領域を有する 試験具に関する開示、示唆はない。
[0009] 特許文献 5には、同一膜上に一定の色調が現れる部分と検体の濃度依存性の色 調が現れる部分を備えた免疫学的クロマト分析片を用いて、該免疫学的クロマト分析 片に未知濃度の検体を注入しクロマト展開させた後、一定の色調の現れる部分の色 調と、検体の濃度依存性の色調が現れる部分の色調とを光学的濃度測定装置また は目視的に読み取り未知検体の濃度を測定する方法が記載されている。当該方法 は、対照の呈色領域と、検体の濃度依存性の呈色領域が同一膜上にある点が特徴 的であるが、該対照の呈色領域は、検体とは別異の固定化抗体および標識抗体を 用いて呈色させるものであり、煩雑であるとともに、特定の検体の濃度に相当する呈 色に調整することは容易ではない。
特許文献 6には、毛管現象により検体が移動する多孔体上に判定ラインの種別表 示が直接印刷されたィムノクロマト用試験具が記載されて 、る。特許文献 6に記載さ れて 、るように、毛管現象により検体が移動する多孔体上に印刷を行うと!、う発想は 、特許文献 6以前にはなぐ該多孔体上に測定対象物質の濃度を測定するのに有用 な表示を設けるという思想は従来全くな力つた。
[0010] 特許文献 1 :特開平 7— 55808号公報
特許文献 2：特開平 10— 73592号公報
特許文献 3：特開平 5— 5743号公報
特許文献 4：特開平 8— 278305号公報
特許文献 5：特開 2001— 83153号公報
特許文献 6 :特開 2001—13143号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0011] したがって、本発明は、ィムノクロマト法を用いて、製造が容易で、かつ検体中に含 まれる測定対象物質の濃度を容易に半定量するための新規な試験具、およびこの 試験具を用いた半定量方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
本発明は、上記目的を達成するため、検体が毛管現象により移動可能な多孔体を 有するィムノクロマト用試験具であって、
前記ィムノクロマト用試験具は、
(1)前記検体中の測定対象物質と特異的に結合し得る、標識された抗体または抗原 力 移動可能な状態で配置された領域、
(2)前記測定対象物質と特異的に結合し得る抗体または抗原が、前記多孔体上に 固定された状態で配置された領域、および
(3)前記測定対象物質の特定の濃度における呈色に対応する標準呈色が、前記多 孔体上に固定された状態で配置された領域を有し、
前記領域 (2)に生じる呈色と、前記標準呈色とを比較することにより、前記検体中 の前記測定対象物質を半定量するための試験具 (以下、「本発明の試験具」とする。 )を提供する。
本発明の試験具の好ましい態様として、前記 (2)の前記測定対象物質と特異的に 結合し得る抗体または抗原が、前記多孔体上に固定された状態で配置された領域と 、前記 (3)の前記測定対象物質の特定の濃度における呈色に対応する標準呈色が 、前記多孔体上に固定された状態で配置された領域とが、展開溶媒の展開方向に 対して、直列または並列に配置された前記試験具が挙げられる。
本発明の試験具の、別の好ましい態様として、前記（1)の前記検体中の測定対象 物質と特異的に結合し得る、標識された抗体または抗原が、移動可能な状態で配置 された領域に用いる標識用色素と、前記 (3)の前記測定対象物質の特定の濃度に おける呈色に対応する標準呈色が、前記多孔体上に固定された状態で配置された 領域に用いる標準呈色用色素とが同一の色素である前記試験具が挙げられる。 また、本発明は、本発明の試験具を用いて検体中の測定対象物質を半定量する方 法を提供する。
発明の効果 [0013] 本発明の試験具は、ィムノクロマト用試験具の多孔体上に固定された標準呈色と、 測定対象物質が多孔体上に固定された抗体または抗原に捕捉されることによって生 じる呈色とを比較することで、検体中に含まれる測定対象物質を容易に半定量するこ とがでさる。
また、本発明の試験具は、測定対象物質と特異的に結合し得る抗体または抗原が 、多孔体上に固定された状態で配置された領域 (反応領域)、および、測定対象物質 の特定の濃度における呈色に対応する標準呈色が、前記多孔体上に固定された状 態で配置された領域を有することから、同一条件下で反応領域の呈色と標準呈色と を比較することが可能であり、高い精度が得られる。
また、本発明の試験具は、少なくとも 1つの反応領域と、標準呈色を示す領域があ れば、半定量が可能であることから、半定量するために複数の反応領域を必須要件 とする試験具に比べて、簡便に製造することができる。また、標準呈色を示す領域に ついては、色素等を、抗体、抗原等を介さず、直接多孔体上に固定していることから 、抗体、抗原等を介して固定することを必須要件とする試験具に比べて、簡便に製造 することができる。また間接的に抗原抗体反応などの反応を介さないので本試験具 を使用するにあたって、前記標準呈色の色調が様々な使用条件の違いに全く影響さ れない。
図面の簡単な説明
[0014] [図 1]図 1は、本発明の試験具の一実施形態の概念図である。
[図 2]図 2は、図 1の試験具の側面図である。
[図 3]図 3は、各種濃度に調整した hCGに本発明の試験具を浸漬した後の標準呈色 8および呈色 の呈色度の度合!/ヽの経時変化を見たグラフである。
[図 4]図 4 (a)〜（e)は、実施例で使用された試験具の平面図であり、図 4 (a)は尿検 体に浸漬する前の未使用の試験具、図 4 (b)は hCG濃度 25IUZLの検体を用いて 半定量を実施した後の試験具、図 4 (c)は hCG濃度 1000IUZLの検体を用いて半 定量を実施した後の試験具、図 4 (d)は hCG濃度 10000IUZLの検体を用いて半 定量を実施した後の試験具、図 4 (e)は hCG濃度 OIUZL (陰性)の検体を用いて半 定量を実施した後の試験具を示して 、る。 [図 5]図 5 (a)は従来のィムノクロマト法用試験具を示す概念図であり、試験具を平面 図により示している。図 5(b)は図 5 (a)に示す試験具の側面図である。図 5(c)は、図 5 (a)と同様の図である力、使用後の試験具を示している。
符号の説明
1:試験具
2:基体
3:サンプノレパッド
4:試薬パッド
5:多孔体
6:反応領域
6' ：呈色
7:吸収パッド
8:標準呈色
9:領域
9' ：呈色
11:試験具
12:基体
13:サンプルパッド
14:試薬パッド
15:多孔体
16:反応領域
16' ：呈色
17:吸収パッド
20:保護フィルム
21:透明部分
22:窓
23, 23 , 23〃 ：不透明部分
発明を実施するための最良の形態 [0016] 以下、図面を参照して、本発明の試験具について説明する。
図 1は、本発明の試験具の一実施形態の概念図であり、図 2は図 1に示す試験具 の側面図である。
図 1および図 2に示す試験具 1は、シート状の基体 2上にサンプルパッド 3、試薬パ ッド 4、多孔体 5および吸収パッド 7が形成されている。試験具 1のうち、試薬パッド 4、 多孔体 5および吸収パッド 7は、保護フィルム 20により被覆されている。
[0017] 以下、本発明の試験具 1の各構成要素について説明する。
図 1に示す試験具 1にお 、て、各構成要素はシート状の基体 2上に形成されて 、る 。基体 2は、ィムノクロマト法の際に各構成要素中を通過する検体を吸収または透過 することがなぐかつ検体が接触した際に、検体を変性させることのない材料で作製さ れる。このような材料としては、医療用具に使用されるプラスチック材料、具体的には 例えば、塩化ビニル、ポリエチレン、エチレン酢酸ビュル榭脂、ポリプロピレン、ポリ力 ーボネート、ポリウレタン、ポリスチレン、シリコーン榭脂、フッ素榭脂、ポリエチレンテ レフタレート、ポリアミド、 ABS榭脂等が挙げられる。また、基体 2は、表面に撥水撥油 加工が施された紙製であってもよ ヽ。
[0018] サンプルパッド 3は、検体が滴下される、または検体中に浸漬される部位であり、検 体中に不溶性物質が存在して ヽる場合、該不溶性物質を除去するフィルタ一として も作用する。この観点から、サンプルパッド 3は、孔径 20 μ m〜100 μ m、好ましくは 30 μ m〜40 μ mの不織布または多孔質膜が例示される力 特にこれらに限定され ない。サンプルパッド 3に使用可能な材料としては、一定量の検体を採取でき、親水 性であり、フィルター機能を有するものであれば特に限定されず、例えば、再生セル ロース、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ポリアクリロニトリル、エチレン酢酸ビュル 、ポリウレタン、ポリメチルメタタリレート、ナイロン榭脂、ガラス繊維、パルプ、綿、レー ヨン、アクリル、ポリエステルなどが例示される力 特にこれらに限定されない。
[0019] サンプルパッド 3に滴下された検体は、毛管現象によって下流方向、すなわち試薬 ノッド 4へと移動する。以下、本明細書において、試験具 1のサンプルパッド 3の側を 上流側とし、その反対側を下流側とする。また、サンプルパッド 3に滴下された検体と 言った場合、サンプルパッド 3を検体に浸漬された結果、該サンプルパッド 3中に含ま れた検体をも意味する。
[0020] 試薬パッド 4の材質としては、サンプルパッド 3と同様に、不織布または多孔質膜が 例示されるが、特にこれらに限定されない。試薬パッド 4には、検体中の測定対象物 質と特異的に結合可能な抗体または抗原が色素等の標識物質で標識された状態で 担持されている。
測定対象物質と特異的に結合可能な抗体または抗原は、測定対象物質に応じて 適宜選択される。測定対象物質が尿検体中のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン (hCG) である場合、抗 hCG抗体、より詳細には、抗 hCGマウスポリクローナル抗体、抗 hCG マウスモノクローナル抗体等が使用される。測定対象物質がアルファフエトプロテイン (AFP)である場合、抗 AFP抗体が使用される。測定対象物質が抗 HIV抗体である 場合、 HIV抗原ペプチド等が使用される。測定対象物質が、半定量が必要な癌マー カーである前立腺特異抗原 (PSA)である場合、例えば、抗ヒト PSAゥサギ抗体等が 使用される。
標識物質としては、可視的に発色が認められるものであれば特に限定されないが、 例えば、金コロイドに代表される金属コロイド、非金属コロイド、染料ゾルもしくは分散 染料のような染料粒子、ラテックス粒子または着色微粒子等が挙げられる。中でも、 発色性に優れ、色調及び粒子径が豊富であり、抗体もしくは抗原への標識化方法が 複数存在する等の観点から、染料若しくは顔料で着色されたラテックス微粒子または ポリスチレン微粒子が好ましい。尚、この標識ィ匕方法は当業者により周知されており、 吸着による方法やィ匕学結合による方法などがある。とりわけ、染料若しくは顔料で着 色された、粒径 0. 5 μ m以下、好ましくは粒径 0. 05-0. 5 μ mの、球状または略球 状をしたラテックス微粒子またはポリスチレン微粒子が好ま ヽ。最も好ましくはブル 一ラテックスである。
[0021] 標識された抗体または抗原は、移動可能な状態で試薬パッド 4に担持されて ヽる。
ここで、移動可能な状態で担持されているとは、未使用時、すなわち試薬パッド 4が 乾燥して ヽる状態では、標識された抗体または抗原が試薬パッド 4中に保持されて ヽ るが、使用時、すなわち検体の到達によって試薬パッド 4が湿潤すると、標識された 抗体または抗原は移動可能となることを意味する。このためには、試薬パッド 4が標識 された抗体または抗原を吸着しな 、材料でなければならな 、が、吸着してしまう材料 であれば、あらかじめ別の BS Aなどの不活性な蛋白質でマスキング処理することで 使用できる。そうして標識された抗体または抗原は、例えば試薬パッド 4に含浸させた 後、凍結乾燥することで、試薬パッド 4に保持されている。
したがって、試験具 1では、試薬パッド 4が、検体中の測定対象物質と特異的に結 合し得る、標識された抗体または抗原が移動可能な状態で配置された領域をなして いる。
[0022] サンプルパッド 3に滴下された検体は、毛管現象により試薬パッド 4へと移動する。
このため、試薬パッド 4の孔径は、サンプルパッド 3よりも孔径が同じか小さいことが好 ましい。試薬パッド 4の孔径は、 1 μ m〜50 μ mが例示され、好ましくは 5 μ m〜30 μ mである。
[0023] 図 1および図 2に示す試験具 1では、毛管現象による検体の移動を容易にするため 、サンプルパッド 3と試薬パッド 4とが一部積層した状態になっている。但し、毛管現 象によって検体が適切に移動できるのであれば、サンプルパッド 3と試薬パッド 4とは 、単に隣接して配置されていてもよぐ更には同一パッドとしてもよい。
[0024] 試薬パッド 4に検体が到達すると、検体中の測定対象物質と、パッド 4中の標識され た抗体または抗原とは、毛管現象によって下流方向へ、すなわち多孔体 5へと移動 する。なお、測定対象物質と標識された抗原または抗体とが、抗原と抗体の関係にあ る場合には、両者の一部または全部は抗原 抗体複合体を形成し、これも下流方向 へ、すなわち多孔体 5へと移動する。図 1および図 2に示す試験具 1では、この移動を 容易にするため、試薬パッド 4と多孔体 5とが一部積層した状態になっている。但し、 毛管現象によって、検体が適切に移動できるのであれば、試薬パッド 4と多孔体 5と は、単に隣接して配置されていてもよぐ更には試薬パッド 4が多孔体 5をかねてもよ ぐその逆でもよい。
[0025] 多孔体 5は、その構造がスポンジ状の細孔を有したもの、又は、網目状を有したも のであって、毛管現象によって検体が移動可能な媒体である。図 1および図 2に示す 試験具 1では、シート状の多孔質膜として示されている。多孔体 5の材料としては、ィ ムノクロマト法が実施可能であれば特に限定されないが、具体的には例えば、セル口 ース、セルロース誘導体、ニトロセルロース、エチレン酢酸ビュル、ポリウレタン、ポリメ チルメタタリレート、ナイロン榭脂、ポリビ-リデンジフルオリド (PVDF)等の多孔性合 成ポリマー等を原料とする織布、不織布ゃメンブラン、グラスファイバーフィルター、 各種の濾紙等が挙げられ、セルロース、セルロース誘導体、多孔性合成ポリマーを 用いたものが好ましぐニトロセルロースを用いたものが特に好ましい。多孔体 5の孔 径は、 1 μ m〜30 μ mが例示され、好ましくは 1 μ m〜20 μ mである。
[0026] 多孔体 5は、測定対象物質と特異的に結合し得る抗体または抗原が固定された領 域 6 (反応領域)を有する。領域 6に固定される抗体または抗原は、測定対象物質に 応じて適宜選択することができる。具体的には、測定対象物質が hCGである場合、 抗 hCG抗体、より詳細には、抗 hCGマウスポリクローナル抗体、抗 hCGマウスモノク ローナル抗体等を使用することができる。測定対象物質が AFPである場合、抗 AFP 抗体を使用することができる。測定対象物質が抗 HIV抗体である場合、 HIV抗原べ プチド等を使用することができる。測定対象物質が PSAである場合、抗 PSAマウスモ ノクローナル抗体、抗 PSAゥサギ抗体等を使用することができる。尚、これらの固定 化の方法は、たとえば多孔体 5が-トロセルロースやナイロンなどの場合、上述の抗 体または抗原の溶液を直接に塗布し乾燥することによって容易に固定ィ匕することが できる。また直接塗布、乾燥することで固定ィ匕できないグラスファイバーフィルターや 濾紙などの多孔体の場合には、多孔体の活性化や、固定化する抗体または抗原の 活性ィ匕などによる前処理を施すことによって容易に固定ィ匕でき、これらの固定ィ匕の方 法は当業者によく知られた技術である。
[0027] 毛管現象によって、多孔体 5中を移動してきた抗原、抗体および Zまたは複合体は 、領域 6に固定された抗体または抗原により捕捉される。標識物質を含んだ抗原、抗 体および Zまたは複合体が捕捉されると、領域 6に生じる呈色として確認することが できる。ここで領域 6に生じる呈色の色調は、用いるィムノクロマト法 (試薬の組合せ） と検体中の測定対象物質の濃度に依存する。例えば、検体中の抗原と試薬パッド 4 に保持されていた標識抗体により形成された複合体を、反応領域における固定化抗 体で捕捉する場合においては、検体中の測定対象物質の濃度が高いと、領域 6で捕 捉される複合体が増加するため、強い色調の呈色を生じ、検体中の測定対象物質の 濃度が低いと、領域 6で捕捉される複合体が減少するため、弱い色調の呈色を生じる 。一方、例えば、検体中の抗原と、試薬パッド 4に保持されていた標識抗原との競合 反応において、反応領域で標識抗原を固定ィ匕抗体により捕捉する場合においては、 検体中の測定対象物質の濃度が高いと、領域 6で捕捉される標識抗原が減少するた め、弱い色調の呈色を生じ、検体中の測定対象物質の濃度が低いと、領域 6で捕捉 される標識抗原が増加するため、強い色調の呈色を生じる。
[0028] 多孔体 5は、測定対象物質の特定濃度における呈色に対応する標準呈色 8が固定 された領域を有している。すなわち、試験具 1では、測定対象物質を特定濃度 (以下 、「基準濃度」という。）含む検体を使用した場合に、領域 6に生じる呈色と等しい色調 を有する領域が多孔体 5上に形成されている。尚、標準呈色 8の固定化の方法にあ つても前記反応領域と同様の固定ィ匕方法を利用することができる。
[0029] 本発明の試験具では、各々試験具 1の多孔体 5上に存在する、領域 6に生じる呈色 の色調と、標準呈色 8の色調とを比較することで、検体中の測定対象物質を容易に 半定量することができる。すなわち、例えば、検体中の抗原と試薬パッド 4に保持され ていた標識抗体により形成された複合体を、反応領域における固定化抗体で捕捉す る場合においては、領域 6に生じる呈色の色調が標準呈色 8の色調よりも弱い場合、 検体中の測定対象物質の濃度が基準濃度よりも低いことになる。領域 6に生じる呈色 の色調が、標準呈色 8の色調よりも強い場合、検体中の測定対象物質の濃度が基準 濃度よりも高いことになる。領域 6に生じる呈色の色調が、標準呈色 8の色調と同程度 の場合、検体中の測定対象物質の濃度が基準濃度と同程度ということになる。また、 領域 6に呈色が生じな力 た場合、検体中に測定対象物質が存在しないか、あるい は検出感度以下であることを意味する。したがって、本発明の試験具 1は、領域 6に おける呈色の有無により、測定対象物質の特定の感度における定性評価を行うことも できる。
さらにまた、領域 6に生じる呈色の色調と、標準呈色 8の色調とを光学的濃度計等 を用いて比較することで、検体中の測定対象物質の濃度を正確に測定することがで きる。
[0030] 多孔体 5は、毛管現象によってその内部を検体が移動するため、標準呈色 8は多 孔体 5の表面に固定されていることが好ましい。ここで、標準呈色 8は、試薬パッド 4に 担持される抗体または抗原を標識するのに使用した標識物質であることが好ましい。 したがって、金コロイドに代表される金属コロイド、非金属コロイド、染料ゾルもしくは 分散染料のような染料粒子、ラテックス粒子または着色微粒子等が好ましく例示され る。中でも、発色性に優れ、色調及び粒子径が豊富であり、抗体もしくは抗原への標 識化方法が複数存在する等の観点から、染料若しくは顔料で着色されたラテックス 微粒子またはポリスチレン微粒子が好ましい。尚、この標識ィ匕方法は当業者により周 知されており、吸着による方法やィ匕学結合による方法などがある。とりわけ、染料若し くは顔料で着色された、粒径 0. 5 μ m以下、好ましくは粒径 0. 05-0. 5 μ mの、球 状または略球状をしたラテックス微粒子またはポリスチレン微粒子が好ま 、。最も好 ましくはブルーラテックスである。
但し、標準呈色 8は、測定対象物質の特定濃度における呈色と同一の色調である 限り、色素、染料、顔料等、他の物質を用いて形成してもよい。
また、測定対象物質と特異的に結合し得る抗体または抗原が、前記多孔体上に固 定された状態で配置された領域 (反応領域 6)と、測定対象物質の特定の濃度にお ける呈色に対応する標準呈色が、前記多孔体上に固定された状態で配置された領 域 (標準呈色 8)とは、展開溶媒の展開方向に対して、直列または並列に配置されて いることが好ましぐ直列に配置されていることが最も好ましい。また、両者が近傍に 位置することが好ましい。具体的には、両者の距離は 20mm以内であることが好まし ぐ 10mm以内であることがより好ましい。
なお、展開溶媒は、通常検体に含有されうるものであれば特に限定されない。例え ば、水 (検体中に含まれる水分を含む）；生理食塩水;アセトン等の有機溶媒等が挙 げられる。
展開溶媒の展開方向は、図 1においては、サンプルパッド 3から吸収パッド 7への方 向である。
また、検体中の測定対象物質と特異的に結合し得る、標識された抗体または抗原 が、移動可能な状態で配置された領域 (試薬パッド 4)に用いる標識用色素と、測定 対象物質の特定の濃度における呈色に対応する標準呈色が、前記多孔体上に固定 された状態で配置された領域 (標準呈色 8)に用いる標準呈色用色素は、同一の色 素であるのが好ましぐラテックス粒子であるものがさらに好ましい。
[0031] 標準呈色 8として示される基準濃度や検出感度は、測定対象物質の種類や、試験 具の用途に応じて適宜選択することができる。例えば、試験具 1が尿検体中の hCG の量を測定するものである場合、検出感度は 25IUZL、基準濃度は lOOOIUZLで あることが好ましい。 hCGの検出感度を 25IUZLとした場合、領域 6の発色の有無に より妊娠診断が可能となる。基準濃度を lOOOIUZLとした場合、子宮外妊娠、流早 産、絨毛性腫瘍の予後判定などの評価が可能となる。結果として、 hCG濃度 25IU ZLと lOOOIUZLを基準として、検体中の測定対象物質が一回の測定で半定量可 能となる。例えば、血液中の PSAの量を測定するものである場合、検出感度は lng ZmL、基準濃度は 4ngZmLであることが好ましい。 PSAの検出感度を IngZmLと した場合、領域 6の発色の有無により前立腺肥大の診断が可能となり、基準濃度を 4 ngZmLとした場合、前立腺癌の診断が可能となる。結果として、一回の操作で PSA 濃度 IngZmLと 4ngZmLを基準として、検体中の PSA濃度の半定量が可能となる
[0032] 上記したように、多孔体 5中を移動する検体中の測定対象物質の部分あるいは全 部は、領域 6に固定された抗体または抗原により捕捉される。一方、検体中の他の成 分および捕捉されな力 た測定対象物質等は、多孔体 5中を下流方向へと移動する 。図 1および 2に示す試験具 1には、これらを吸収するための吸収パッド 7が設けられ ている。吸収パッド 7は、多孔体 5中を移動してきた検体を吸収して、保持できるもの である限り特に限定されない。したがって、吸収パッド 7は、ろ紙、不織布、多孔質膜 等、液体を吸収してその内部に保持する目的で従来使用されているものを広く使用 することができる。吸収パッド 7は、シリカゲルのような吸水性 ·吸湿性を有する物質を 含んでいてもよい。
[0033] 上記したように、検体中に測定対象物質が含まれて!/、な 、場合または含まれて!/ヽ ても検出感度以下である場合、領域 6に呈色は生じず、試験具 1は、外見上未使用 時と変化がない。このため、本発明の試験具 1は、試験終了を確認するための機構を 有していることが好ましい。図 1および図 2に示す試験具 1では、多孔体 5の標準呈色 8が固定された領域よりも下流側に、検体が到達した際に発色を生じる領域 9が設け られている。多孔体 5を被覆する保護フィルム 20のうち、該領域 9を被覆する部分に は、透明な窓 22が設けられている。図 1において、保護フィルム 20のうち、部分 21お よび 22は透明であり、部分 23、 23' 、 23〃 は不透明である。
図 1および図 2に示す試験具 1では、該領域 9および窓 22が試験終了を確認する 機構をなす。すなわち、多孔体 5中を移動してきた検体が領域 9に到達すると発色を 生じ、この発色は窓 22により確認することができる。これにより、試験が終了したことを ½認することができる。
[0034] この目的のため、領域 9には種々の発色剤が含浸または固定ィ匕される。領域 9に含 浸または固定化される発色剤としては、所定の pHの液状試料との接触により発色す る発色剤、具体的には例えば、ェォシン B、フロキシン B、ベンゾパープリン 4B、コン ゴーレッド、ブロムフエノーノレブノレ一、ブロムクレゾ一ノレグリーン、 2, 5—ジニトロフエノ ール、またはこれらの関連物質が挙げられる。また、発色剤は、検体が領域 9に到達 した際に、その水分によって発色するものであってもよ!/、。
さらにまた、多孔体 5の窓 22よりも上流側の領域に、例えば不透明部分 23' で被 覆された領域に、検体が到達した際に溶解するように、水溶性の色素を含浸させて おき、検体中に溶解されて移動する色素を窓 22で確認するものであってもよい。 また、標識された抗原もしくは抗体と特異的に反応する成分、例えば標識抗 hCGマ ウスモノクローナル抗体を用いた場合は抗マウスヒッジ抗体などを領域 9に固定ィ匕し ておいても、当該目的を達し得る。
また、測定に関与しな 、標識抗体や標識ピオチンやキーホールへモシアン等を試 薬パッド 4に保持させておき、上記標識抗体と特異的に反応する抗体または抗原や アビジンもしくは抗キーホールへモシァニン抗体を領域 9に固定ィ匕しておいても当該 目的を達成できる。
[0035] 以上、図を用いて本発明の試験具について詳細に説明したが、本発明の試験具は 図示した形態に限定されない。本発明の試験具は、検体が毛管現象によって移動可 能な多孔体を有するィムノクロマト用試験具であって、下記（1)〜（3)の領域を有す るものを広く使用することができる。 (1)前記検体中の測定対象物質と特異的に結合し得る、標識された抗体または抗原 力 移動可能な状態で配置された領域、
(2)前記測定対象物質と特異的に結合し得る抗体または抗原が、前記多孔体上に 固定された状態で配置された領域、および
(3)前記測定対象物質の特定の濃度における呈色に対応する標準呈色が、前記多 孔体上に固定された状態で配置された領域。
[0036] したがって、本発明の試験具は、特表平 1— 503174号公報、特開平 6— 180320 号公報、特開平 6— 160388号公報に記載されているィムノクロマト用の試験装置の ように、多孔体等の構成要素を収容するケーシングを有していてもよい。また、本発 明の図に例示した保護フィルム 20は、本発明の試験具に必須ではない。
多孔体上に固定される反応領域および Zまたは標準呈色の形状も、図示したよう に線状に限定されず、他の形状であってもよい。また、多孔体上には、各々測定対 象物質の異なる濃度における呈色に対応する複数の反応領域および Zまたは標準 呈色が固定されて 、てもよ 、。
[0037] 本発明の試験具は、生物由来の種々の液体試料に対して適用することができる。こ のような液体試料としては、具体的にはたとえば、血液、血漿、血清、唾液、尿、ふん 便抽出液、組織抽出液等が挙げられる。これらの液体試料に含有される測定対象物 質としては、抗原あるいは抗体として機能する各種蛋白質やペプチド、複合蛋白質、 脂質、複合脂質、核酸、レクチン、糖鎖あるいはこれを有する化合物、ピオチン、アビ ジン、ホルモン、酵素、酵素基質、酵素インヒビター、レセプター、リガンド、薬物、薬 物代謝産物、分析対象物の誘導体などであり、さらに具体的には、ヒト絨毛性性腺刺 激ホルモン（hCG)、黄体形成ホルモン（LH)、アルファフエトプロテイン (AFP)、癌 胎児性抗原 (CEA)、ヒト胎盤ラクトゲン (hPL)、ベータ 2ミクログロブリン（ |8 2m)、フ エリチン、 HBs抗原、エストロゲン、 PSA等およびこれらに対する抗体が例示される。 本発明においては、抗体、抗原、核酸、アビジン、ピオチンが好ましく利用され、抗体 あるいは抗原が特に好まし 、。
なお、本発明の試験具は、上に例示したような測定対象物質の標準品を生理食塩 水等に溶解して調製した溶液に対しても適用することができる。 実施例
[0038] 以下、実施例により本発明の試験具をさらに説明する。
本実施例では、図 1および図 2に示す試験具 1を使用した。
試験具 1の各構成は以下の通りであった。
基体 2 :ポリエステル製、縦 125mm X横 8mm X厚さ 0. 25mm
サンプルパッド 3：縦 30mm X横 8mm X厚さ 0. 3mmの不織布（ベンリーゼ、旭化成 社製)を接着した。
試薬パッド 4 :縦 15mm X横 8mm X厚さ 0. 3mmの不織布（ガラス繊維、ミリポア社 製)に、標識された抗体 (標識物質として、青色染料で着色されたラテックス粒子 (粒 径 0. 3 mの球状粒子）を結合させた抗 hCGマウスモノクローナル抗体）を充填して 凍結乾燥させたものを使用した。これを基体 2上に接着させた。
サンプルパッド 3と試薬パッド 4とは、端部同士が積層されている（縦約 4mm分)。 多孔体 5：ニトロセルロース膜（縦 25mm X横 8mm X厚さ 235 μ m、孔径約 8 m)を 基体 2上に接着させた。
多孔体 5と試薬パッド 4とは、端部同士が積層されている (縦 2mm分)。
多孔体 5上に、 1. 5mgZmLの抗 hCGマウスモノクローナル抗体を塗布し、乾燥さ せることで、該モノクローナル抗体を領域 6に固定させた。
標準呈色 8：濃度 1000IUZL (基準濃度)の hCGが領域 6で抗体に捕捉された際の 呈色と同一の色調になるように、標準呈色 8として、標識物質として使用したのと同じ ラテックス粒子 (青色染料で着色)を多孔体 5の表面に固定した。
試験終了を表す指標として、多孔体 5の標準呈色 8よりも下流側の領域 9に、発色剤 としてェォシン Bを含侵させて乾燥させた。
吸収パッド 7 :縦 20mm X横 8mm X厚さ 0. 4mmの不織布（ガラス繊維、ワットマン社 製)を基体 2上に接着した。
保護フィルム：サンプルパッド 3を除いて、試験具 1の上部を透明部分 21、 22および 不透明部分 23、 2 , 23"を有する保護フィルム (ポリエチレンテレフタレート製)を 用いて被覆した。
[0039] この試験具 1を用いて、測定対象物質をヒト絨毛性性腺刺激ホルモン (hCG)として 、半定量を実施した。
hCG (国立医薬品食品衛生研究所製)を以下の各種濃度で含むように、 0. 1%BS Aを含む生理食塩水で希釈した溶液に、試験具 1のサンプルパッド 3部分を、約 3秒 間浸漬させた。次に、保護フィルム 20が上になるように試験具 1を水平方向に約 3分 間静置した。窓 22に反応が終了したことを示す呈色^ が明確に生じた時点で、標 準呈色 8と領域 6の呈色 をデンシトメータで測定した。
ここで、検体は、 hCG濃度が OIUZL (陰性）、 25IUZL、 lOOIU/L, 250IU/L 、 500IU/L, lOOOIUZLおよび lOOOOIUZLのものを使用した。
以下に、各濃度の検体の領域 6の呈色 の呈色度の度合をデンシトメ一タカ 得 られた数値で示す。
[0040] [表 1]
Figure imgf000019_0001
[0041] いっぽう、標準呈色 8の呈色度の度合をデンシトメータで測定した値は 9800であつ た。
陰性検体では殆ど発色せず、 25IUZLで発色、濃度が上がるにつれて発色も増 強し、 1000IUZLでほぼ標準呈色と同等の発色を示し、それ以上の濃度では標準 呈色より強い発色を示し、半定量の試験具として有用であった。
[0042] さらに、この試験具 1を用いて、経時的な呈色度の変化の有無を確認した。すなわ ち、サンプルパッド 3が浸力るように、試験具 1を濃度調整した検体中に約 3秒間浸漬 させた。次に、保護フィルム 20が上になるように試験具 1を水平方向に約 3〜30分間 静置し、各時間の標準呈色 8と領域 6の呈色 をデンシトメータで測定した。
ここで、検体は、 hCG濃度が 0IUZL (陰性）、 25IUZL、 500IU/L, 1000IU/ Lおよび 106IUZLのものを使用した。
図 3および下記表に、呈色度の度合をデンシトメ一タカ 得られた数値の経時変化 として示した。
[0043] [表 2]
Figure imgf000020_0001
[0044] なお、呈色度は、各濃度 3回測定した平均値である。標準呈色の数値は、各濃度 3 回 (合計 15回）の平均値である。
30分までの経時変化を見ると、標準呈色 8や各濃度での領域 6の呈色 におけ る発色が試験開始後 5 10分でピークを示し、その後は多孔体 5に対する検体の供 給量減少に伴う多孔体 5の乾燥により発色度が低下した。測定開始力 時間が経過 しても、陰性検体では殆ど発色せず、 25IUZLで発色、 1000IUZLでほぼ標準呈 色と同等の発色、それ以上の濃度では標準呈色より強い発色を示す傾向は変わら ず、半定量の試験具として有用であった。
なお、表 1、表 2および図 3に示した本試験結果は、デンシトメータで測定した結果と して数値で示したが、目視による判定においても、呈色の有無および標準呈色との 強弱の観点では、同じ結果が得られた。
[0045] 図 4は、半定量を実施した前後の試験具 1を示した平面図である。図 4 (a)は検体に 浸漬する前の未使用の試験具、 (b)は hCG濃度 25IUZLの尿検体を用いて半定量 を実施した後の試験具、（c)は hCG濃度 1000IUZLの検体を用いて半定量を実施 した後の試験具、 (d)は hCG濃度 lOOOOIUZLの検体を用いて半定量を実施した 後の試験具、 (e)は hCG濃度 OIUZL (陰性)の検体を用いて半定量を実施した後の 試験具を各々示している。
図 4から明らかなように、半定量を実施した後の試験具 1であることは、窓 22に生じ る呈色^ により確認できる（図 4 (b)〜( ）。陰性検体を使用した例では、領域 6に 呈色は生じず、透明部分 21からは標準呈色 8のみが確認された。一方、 hCGを含ん だ検体では、 hCGと標識された抗体との複合体が領域 6で抗体に捕捉されたことを 示す呈色 が確認された。この呈色 は検体中の hCG濃度により色調が異なつ ていた。具体的には、 hCG濃度が基準濃度よりも低い 25IUZLの検体を使用した例 では、呈色 は標準呈色 8に比べてはるかに色調が弱力つた（図 4 (b) )。 hCG濃 度が基準濃度と等しい 1000IUZLの検体を使用した例では、呈色 の色調は標 準呈色 8とほぼ同一であった（図 4 (c) )。 hCG濃度が基準濃度よりも高い 10000IU ZLの検体を使用した例では、呈色 の色調は標準呈色 8よりも強力つた（図 4 (d)
) o
産業上の利用可能性
本発明は、免疫学的クロマトグラフィー (ィムノクロマト法)を用いて、検体中の測定 対象物質を半定量するための試験具、および該試験具を用いた半定量方法に関す るものである。

Claims

請求の範囲 [1] 検体が毛管現象により移動可能な多孔体を有するィムノクロマト用試験具であって 前記ィムノクロマト用試験具は、
(1)前記検体中の測定対象物質と特異的に結合し得る、標識された抗体または抗 原が、移動可能な状態で配置された領域、
(2)前記測定対象物質と特異的に結合し得る抗体または抗原が、前記多孔体上に 固定された状態で配置された領域、および
(3)前記測定対象物質の特定の濃度における呈色に対応する標準呈色が、前記 多孔体上に固定された状態で配置された領域を有し、
前記領域 (2)に生じる呈色と、前記標準呈色とを比較することにより、前記検体中 の前記測定対象物質を半定量するための試験具。
[2] 前記 (2)の前記測定対象物質と特異的に結合し得る抗体または抗原が、前記多孔 体上に固定された状態で配置された領域と、前記 (3)の前記測定対象物質の特定 の濃度における呈色に対応する標準呈色が、前記多孔体上に固定された状態で配 置された領域とが、展開溶媒の展開方向に対して、直列または並列に配置された請 求項 1記載の試験具。
[3] 前記（1)の前記検体中の測定対象物質と特異的に結合し得る、標識された抗体ま たは抗原が、移動可能な状態で配置された領域に用いる標識用色素と、前記 (3)の 前記測定対象物質の特定の濃度における呈色に対応する標準呈色が、前記多孔体 上に固定された状態で配置された領域に用いる標準呈色用色素とが同一の色素で ある請求項 1または 2記載の試験具。
[4] 請求項 1ないし 3のいずれかに記載の試験具を用いて検体中の測定対象物質を半 定量する方法。
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