JP6939106B2 - イムノクロマト試験片およびキットおよび測定方法 - Google Patents
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Description
本発明は、イムノクロマト法による生体試料中に含まれる分析対象物質（ヘモグロビン、ヘモグロビンＡ１ｃなど）の測定方法、当該測定方法に用いるイムノクロマト試験片、イムノクロマト試験片を含むキットに関する。
世界糖尿病連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ）によると、世界の糖尿病患者数はアメリカ、ヨーロッパなどの先進国に加え、中国、インド、ブラジルなどの新興国を含めて急増しており、２０１５年で約４．２億人存在し、２０４０年には約６．４億人に及ぶと予測され、糖尿病診断の重要性は増している。
糖尿病診断項目の一つであるヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃと称することがある）とは、血液中の酸素を運搬する役割を担うヘモグロビン（以下、Ｈｂと称することがある）に糖（グルコース）が結合した糖化ヘモグロビンの内、ヘモグロビンβ鎖のＮ末端側に位置するバリン残基が糖化された物質を指し、総Ｈｂ量に対するＨｂＡ１ｃ濃度が過去１〜２ヶ月間の平均血糖値を反映することから、糖尿病の長期的な経過を観察するのに利用されている。
従来、ＨｂＡ１ｃの測定には、ＨＰＬＣ法、キャピラリー電気泳動法、酵素法、免疫法などの測定技術が利用されていたが、これらの測定方法は専門知識を有することや分析装置が大型かつ高額であるなどの理由から、主に大規模病院や多数の検査を行う検査センターで利用されており、小規模病院ではＨｂＡ１ｃを簡単に測定できない点が問題となっていた。
近年、医療現場ではＰＯＣＴという言葉が注目を集めている。ＰＯＣＴとはＰｏｉｎｔ Ｏｆ Ｃａｒｅ Ｔｅｓｔｉｎｇの略であり、医療従事者が被験者の傍らで行う臨床検査のことをいう。ＰＯＣＴは大規模病院の中央検査室等で行う臨床検査とは異なり、その場で瞬時に検査結果が得られることから、糖尿病診断においてもＰＯＣＴが広まりつつある。
ＨｂＡ１ｃ濃度の測定を目的としたＰＯＣＴの中に、イムノクロマト法を利用した技術が提案されている。イムノクロマト法とは毛細管現象を利用した免疫測定法であり、妊娠検査やインフルエンザ検査などにおいて世界的に普及している。従来のイムノクロマト法は目視判定（定性評価）が一般的であったが、近年、クロマトリーダー等の分析装置を利用して生体試料中に含まれる分析対象物質の濃度を定量化する技術が開発されつつある。
イムノクロマト法を用いた分析対象物質の濃度を定量化する手法の一つとしては、抗原抗体反応を利用したサンドイッチ法が挙げられる。サンドイッチ法では分析対象物質に対してエピトープの異なる２種類の抗体を利用する。一方の抗体は、金コロイド、着色ラテックス、蛍光粒子等の検出粒子と感作した検出抗体として使用する。他方の抗体は、メンブレンの特定位置に線状に固定化した捕捉抗体としてテストラインを形成する。加えて、前記検出抗体を特異的に認識する抗体をメンブレンの他の位置に線状に固定化しコントロールラインを形成する。生体試料中に含まれる分析対象物質は、メンブレンの一端（上流側）から展開し、検出抗体と免疫複合体を形成しながら移動し、テストライン上で捕捉抗体と接触して捕捉され発色する。分析対象物質と免疫複合体を形成しなかった遊離の検出試薬はテストラインを通過し、コントロールラインの抗体に捕捉され発色する。これらの発色強度をクロマトリーダー等の装置を利用することで分析対象物質の濃度を定量することができる。
特許文献１および２には、イムノクロマト法を用いたＨｂＡ１ｃ濃度を測定する技術が開示されている。当該方法は血液と環状多糖類を含む試薬を接触させることでＨｂβ鎖のＮ末端（エピトープ）を露出させ、その後、検出粒子（金コロイドあるいはラテックス粒子）で標識されたＨｂ抗体と免疫反応を行い、抗体固定化メンブレン上に展開し、抗ＨｂＡ１ｃ抗体固定化部および抗ＨｂＡ０固定化部に到達した免疫複合体をそれぞれ検出することで、血液中のＨｂＡ１ｃ（％）を簡便に求めることができる。
しかしながら、本手法では検出粒子に感作した抗Ｈｂ抗体がＨｂＡ１ｃやＨｂＡ０だけでなく、他のＨｂとも免疫反応を行うので、生体試料の種類によっては感度が低下することが問題となる。また、同一メンブレン部で２種類の免疫複合体を検出する場合、上流の免疫反応が下流の免疫反応に影響することがあるので測定精度が低下する点が問題となっていた。
一方、特許文献３には、イムノクロマト法において、サンプルパッドに保持されたＨｂを光学的に検出して、生体試料中のヘマトクリット値を測定する技術が開示されている。かかる発明は、上流の免疫反応が下流の免疫反応に影響することがないため、測定精度の向上が期待される。しかし、前記文献に記載の発明において、コンジュゲーションパッドに着色粒子等の検出粒子が含まれる場合には、検出粒子の拡散によりサンプルパッドの色が変化するなどして測定値にばらつきを生ずる問題があった。
本発明は、上記の問題点に鑑みて、従来よりも測定精度の高い生体試料に含まれる分析対象物質の測定方法、当該測定方法に用いるイムノクロマト試験片、イムノクロマト試験片を含むキットを提供することを課題とするものである。
本発明者は、前記課題を解決するために鋭意研究した結果、イムノクロマト試験片において、第１の分析対象物質をサンプルパッド部で測定し、第２の分析対象物質をメンブレン部で測定することにより、生体試料の種類や生体試料中の分析対象物質の濃度の影響を受けずに第１の分析対象物質と第２の分析対象物質をそれぞれ精度よく測定できること見出した。
しかし、同一生体試料を用いても測定値に違い（ばらつき）が生じる新たな課題に直面した。この原因を調査したところ、イムノクロマト試験片（サンプルパッド）に滴下した生体試料溶液が下流側に展開すると、コンジュゲーションパッドに含浸された着色粒子等の検出粒子が拡散してサンプルパッドまで広がることにより、サンプルパッドにおける第１の分析対象物質由来の色味が変化し測定値がばらつくことを突き止めた。そこで、発明者は、前記試験片に拡散防止手段を設けることで、サンプルパッドにおける第１の分析対象物質由来の色味の変化を抑制することに成功した。加えて、本発明者はこの知見を基に、従来よりも測定精度の高い生体試料中に含まれる分析対象物質の測定方法、当該測定に用いるイムノクロマト試験片、イムノクロマト試験片を含むキットの発明を完成させた。
すなわち、代表的な本願発明は以下の通りである。
（１） サンプルパッド、コンジュゲーションパッド、メンブレン、吸収パッドが順に連接配置され、前記サンプルパッドの下面の一部と前記コンジュゲーションパッドの上面の少なくとも一部が接触可能なように配置されており、前記接触可能部に拡散防止手段が設けられたイムノクロマト試験片を用い、少なくとも下記工程（ｉ）から（ｉｉｉ）をこの順に経て、生体試料中の第１の分析対象物質および第２の分析対象物質を定量する方法。
工程（ｉ）：生体試料と生体試料希釈液とを体積比１：１００〜１：１０００で混合して生体試料溶液を調製する工程
工程（ｉｉ）：工程（ｉ）で得られた生体試料溶液を、イムノクロマト試験片に滴下し、展開させる工程
工程（ｉｉｉ）：サンプルパッドにおいて第１の分析対象物質を比色定量する工程、およびメンブレンにおいて第２の分析対象物質を比色定量する工程
（２） 前記接触可能部の長さは、４ｍｍ以上である（１）に記載の方法。
（３） 前記拡散防止手段は、着色粒子の拡散を防止するものである（１）または（２）に記載の方法。
（４） 前記拡散防止手段は、フィルムまたはシートである（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５） 前記拡散防止手段は、前記コンジュゲーションパッドの上流側上面の一部が前記サンプルパッドと接触するように配置されている（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６） 前記コンジュゲーションパッドは、着色粒子を含有する（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７） 前記第１の分析対象物質がヘモグロビンである（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８） 前記第２の分析対象物質がヘモグロビンＡ１ｃである（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（１） サンプルパッド、コンジュゲーションパッド、メンブレン、吸収パッドが順に連接配置され、前記サンプルパッドの下面の一部と前記コンジュゲーションパッドの上面の少なくとも一部が接触可能なように配置されており、前記接触可能部に拡散防止手段が設けられたイムノクロマト試験片を用い、少なくとも下記工程（ｉ）から（ｉｉｉ）をこの順に経て、生体試料中の第１の分析対象物質および第２の分析対象物質を定量する方法。
工程（ｉ）：生体試料と生体試料希釈液とを体積比１：１００〜１：１０００で混合して生体試料溶液を調製する工程
工程（ｉｉ）：工程（ｉ）で得られた生体試料溶液を、イムノクロマト試験片に滴下し、展開させる工程
工程（ｉｉｉ）：サンプルパッドにおいて第１の分析対象物質を比色定量する工程、およびメンブレンにおいて第２の分析対象物質を比色定量する工程
（２） 前記接触可能部の長さは、４ｍｍ以上である（１）に記載の方法。
（３） 前記拡散防止手段は、着色粒子の拡散を防止するものである（１）または（２）に記載の方法。
（４） 前記拡散防止手段は、フィルムまたはシートである（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５） 前記拡散防止手段は、前記コンジュゲーションパッドの上流側上面の一部が前記サンプルパッドと接触するように配置されている（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６） 前記コンジュゲーションパッドは、着色粒子を含有する（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７） 前記第１の分析対象物質がヘモグロビンである（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８） 前記第２の分析対象物質がヘモグロビンＡ１ｃである（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
本発明のイムノクロマト試験片は、特定の構成を有する拡散防止手段を設けているので、生体試料中の第１の分析対象物質をサンプルパッド部で、また第２の分析対象物質をメンブレン部でそれぞれ高精度かつ定量的に測定することができる。
本発明において、イムノクロマト試験片の基本形態は特に限定されない。例えば、イムノクロマト試験片の生体試料溶液の添加部（滴下部）を上流側として、前記添加部を有するサンプルパッド、コンジュゲーションパッド、メンブレン、吸収パッドの順に連接配置されたイムノクロマト試験片が挙げられる。具体的には、図１および図２に示されるような形態であり、１はメンブレン、２はサンプルパッド、３はコンジュゲーションパッド、４は吸収パッド、７は粘着シートを示す。
図１の例では、イムノクロマト試験片は、幅４ｍｍ程度、長さ６０ｍｍ程度の細長い短冊状の形態をしている。なお、イムノクロマト試験片のコンジュゲーションパッド３には、第２の分析対象物質を特異的に識別する検出抗体と標識物質が坦持されている。また、メンブレン１の上流側の端部から約１０ｍｍの位置に第２の分析対象物質を特異的に識別する捕捉抗体を線状またはスポット状に固定化したテストライン５が形成されている。さらに、前記端部から約１５ｍｍの位置に標識物質を特異的に認識する抗体を線状またはスポット状に固定化したコントロールライン６が形成されている。
本発明において、イムノクロマト試験片は、サンプルパッドの下面の一部とコンジュゲーションパッドの上面の一部が接触可能なように配置されているのが好ましい。このような配置にすることで、イムノクロマト試験片に滴下した生体試料（溶液）が上流側から下流側に流れやすくなるだけでなく、サンプルパッドにて第１の分析対象物質を測定しやすくなる。すなわち、図３は、サンプルパッドに滴下した生体試料溶液が毛細管現象により展開し、コンジュゲーションパッドおよびメンブレンを通過して吸収パッドに到達するまでの流れを模式的に表した図である（実際の形態は図２と同様である）。図３において、符号８は第１の分析対象物質を測定するおおよその位置を示している。ここに特定の光を照射して生体試料溶液の呈色度合いを反射光として測定することにより定量することができる。
しかし、図３に示されるように、サンプルパッドからコンジュゲーションパッドへと展開された生体試料溶液は、コンジュゲーションパッドに含まれる着色粒子を溶解するため、着色粒子が拡散する。拡散した着色粒子がサンプルパッドに到達すると、サンプルパッドの色味が変化する原因となり、測定の精度や再現性が低下することになる。なお、サンプルパッドとコンジュゲーションパッドとの接触部（接触面積）を短く（小さく）するだけでは、着色粒子の拡散による影響を回避できない。
本発明において、サンプルパッドとコンジュゲーションパッドとの接触可能部の長さは、４ｍｍ以上とすることが好ましい。接触可能部の長さが短すぎると、サンプルパッドからコンジュゲーションパッドへの生体試料溶液の流路を確保できないとか、生体試料中の第１の分析対象物質を測定する領域を確保できないことがある。接触可能部の長さが長すぎると、コンパクト性が損なわれるとか、測定時間が長くなるとか、製造コスト増になるなど問題があるので、２０ｍｍ以下が好ましい。なお、接触可能部は、図１および図２におけるａで示される領域（サンプルパッドとコンジュゲーションパッドとの重なり部）である。
本発明において、コンジュゲーションパッドの上流側上面の一部がサンプルパッドの下面の一部と接触するように配置されるとともに、前記接触部より下流側のサンプルパッドがコンジュゲーションパッドと接触しないように拡散防止手段が設けられているのが好ましい。このような配置をとることにより、コンジュゲーションパッドに含浸された着色粒子がサンプルパッドに移動（拡散）して生体試料中の第１の分析対象物質の測定値に影響を与えることを効果的に防止することができる。なお、前記接触部の長さは、サンプルパッドからコンジュゲーションパッドへの生体試料溶液の流路が確保されていればよく特に限定されないが、０．５ｍｍ以上あれば十分である。
本発明において、イムノクロマト試験片は、サンプルパッドとコンジュゲーションパッドとの接触可能部（重なり部）に拡散防止手段が設けられていることを特徴とする。前記拡散防止手段を設けることにより、溶解し拡散した着色粒子がサンプルパッドに到達しサンプルパッドの色味が変化することを抑制することができる。
本発明において、前記拡散防止手段は、コンジュゲーションパッドに含まれる着色粒子等がサンプルパッドに移動することを抑制できるものであれば特に限定されず、図６に示されるようにイムノクロマト試験片を収容するハウジングケースにサンプルパッドの下流側領域とコンジュゲーションパッドとの接触を防止する部材（図６の符号９）を取り付けてもよいし、サンプルパッドの下流側領域とコンジュゲーションパッドとの接触を防ぐためのフィルムまたはシートを挟んでもよい（図４、図５の符号９）。また、何らか別の手段を用いてもよい。これらの中でフィルムまたはシートを用いるのが簡便、安価であり好ましい。
本発明において、フィルムまたはシート（板状物を含む）は、着色粒子が通過しないものであればよく、非孔質であっても多孔質であってもよい。多孔質の場合は、検出試薬の大きさにもよるが、孔径が５００ｎｍ以下のものが好ましく、３００ｎｍ以下のものがより好ましく、１００ｎｍ以下のものがさらに好ましい。また、その材料は、水に容易に溶解しないものであればよく、例えば、セルロースやセルロース誘導体、ポリテトラフルオロエチレン、ポリアミド、ポリイミド、ポリアラミド、ポリブチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルイミド、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリエチレンナフタレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ポリメチルペンテン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、シリコーン、ＡＢＳ樹脂、パーフルオロアルコキシ樹脂などが挙げられる。また、柔軟性のあるものでも剛直なものでもよい。しかし、厚みが厚すぎると、サンプルパッドとコンジュゲーションパッドの間に挟み難いとか、サンプルパッドとコンジュゲーションパッドの接触部（サンプルパッドからコンジュゲーションパッドへの生体試料溶液の流れ）を確保するのが難しくなるなどの生産性の問題やコストの問題が生じるので、３ｍｍ以下程度の厚みを有するものが好ましい。さらに、本発明の目的を達成するためには、フィルムまたはシートの幅は、サンプルパッドおよびコンジュゲーションパッドの幅と同幅以上であればよい。
本発明において、フィルムまたはシートの大きさは、生体試料溶液がサンプルパッドからコンジュゲーションパッドへと移動するための流路が確保され、かつコンジュゲーションパッドからサンプルパッドへの着色粒子の拡散（移動）を防止できる大きさのものであればよい。
本発明において、サンプルパッドは、生体試料を速やかに吸収、展開できるものであれば良く、特に制限されないが、セルロース製のろ紙や高分子製の多孔質体（不織布、ろ紙、スポンジなど）が挙げられる。
本発明において、コンジュゲーションパッドは、着色粒子等の検出試薬を乾燥状態で保持することができ、かつ生体試料溶液の展開と共に前記検出試薬を速やかに溶解および放出することができるものであれば良く、特に制限されないが、グラスファイバ製やセルロース製のろ紙、ポリエステル製の不織布などが挙げられる。
本発明において、吸収パッドは、生体試料溶液を速やかに吸収、保持できるものであればよく、特に限定されないが、セルロース製のろ紙や不織布などが挙げられる。
本発明において、メンブレンは、特に限定されないが、セルロース、セルロース誘導体、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロンなどが挙げられる。これらの材質で構成された膜、布帛、繊維状又は不織布状マトリックス等が好適である。
本発明において、生体試料は特に限定されない。例えば、血液、リンパ液、髄液、汗、尿、涙液、唾液、皮膚、粘膜、毛髪等などの生体試料を例示することができる。血液においては、全血のほか、血液を遠心分離して得られた血清、血球または血漿を試料とすることができる。また、生体試料はヒト由来に限らず、イヌ、ネコ、ウシ等の哺乳動物由来の生体試料も対象である。
本発明のイムノクロマト試験片の製造方法は、従来公知の方法を用いればよい。以下、イムノクロマト試験片の製造方法について詳述するが、本発明を何ら限定するものではない。
コンジュゲーションパッドは、一定量の検出抗体および標識物質を均一に塗布、噴霧または含浸した後、恒温槽内で適当な温度で一定時間乾燥することにより作製することが出来る。検出抗体および標識物質の塗布量は、好ましくはライン長１ｃｍあたり５〜５０μＬである。乾燥温度は、好ましくは２０℃〜８０℃である。乾燥時間は乾燥温度によって異なるが、通常は５〜１２０分間である。
メンブレンは、テストラインを形成する捕捉抗体（例えば、抗Ｈｂ抗体）とコントロールラインを形成する捕捉抗体（例えば、抗ビオチン抗体）を、それぞれ線状に一定量を異なる位置に塗布した後、恒温槽内で適当な温度で一定時間乾燥することで作製することが出来る。
前記調製したメンブレン１を粘着シート７の中程の位置に貼着し、コンジュゲーションパッド３をメンブレン１の末端の上に一部重ね合わせて連接するとともに、吸収パッド４をメンブレン１の逆側の末端上に一部重ね合わせて連接し、さらにコンジュゲーションパッド３の上流側末端にサンプルパッド２の一部が重なるようにして連接することでイムノクロマト試験片を作製することができる。なお、テストライン５およびコントロールライン６は試験片を作製した後に調製してもよいし、試験片を作製する前に調製してもよい。
本発明において、イムノクロマト分析キットは、生体試料を前処理および／または希釈するための生体試料希釈液、イムノクロマト試験片および、イムノクロマトリーダーおよび／または反射光測定装置を含む。
前記生体試料希釈液は、生体試料を展開させるための展開液として使用することができる。生体試料希釈液は、生体試料の展開性を向上させ、かつ免疫反応に影響しないノニオン性界面活性剤を含んでいてもよい。また、前記生体試料希釈液にはさらに、無機塩類やｐＨ調整に用いる緩衝剤を添加しても良い。
本発明において、イムノクロマト試験片は、生体試料溶液を滴下するための第一の開口部、サンプルパッド部に第１の分析対象物質を測定するための第二の開口部、メンブレン部（少なくともテストラインとコントロールラインを測定できる範囲）に第２の分析対象物質と標識物質を測定するための第三の開口部を有する適当なプラスチック製のハウジングケースに収容されていても良い（例えば、図６）。なお、第一の開口部と第二の開口部は一体になっていてもよい。
本発明において、サンプルパッド部で測定する第１の分析対象物質はヘモグロビン（Ｈｂと略すことがある）であり、メンブレン部で測定する第２の分析対象物質は、特に限定されないが、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃと略すことがある）、尿中アルブミン、シスタチンＣ、Ｃ反応性タンパク、プロカルシトニン、ヒト脳性ナトリウム利尿ペプチド、心筋トポロニンＩ、ミオグロビン、心臓由来脂肪酸結合タンパク、フィブリン分解物、α−フェトプロテイン、前立腺特異抗原、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、便潜血、甲状腺ホルモン、ガン抗原１２５、ガン胎児性抗原、フェリチン、ＩｇＥ抗原、インスリンなどが挙げられる。これらの中でも、ＨｂＡ１ｃが好ましい。以下、サンプルパット部で測定する項目がＨｂで、かつメンブレン部で測定する項目がＨｂＡ１ｃの場合について詳述するが、本発明を何ら限定するものではない。
テストラインを形成する捕捉抗体としては、第２の分析対象物質がＨｂＡ１ｃの場合は、Ｈｂを特異的に認識する抗体（以下、抗Ｈｂ抗体と略すことがある）、またはＨｂＡ１ｃを特異的に認識する抗体（以下、抗ＨｂＡ１ｃ抗体と略すことがある）が好ましく、より好ましくは抗Ｈｂ抗体である。
検出抗体としては、第２の分析対象物質がＨｂＡ１ｃの場合は、抗Ｈｂ抗体と検出粒子の複合体、または抗ＨｂＡ１ｃ抗体と検出粒子の複合体が好ましく、より好ましくは抗ＨｂＡ１ｃ抗体と検出粒子の複合体である。なお、捕捉抗体が抗Ｈｂ抗体のとき検出抗体は抗ＨｂＡ１ｃ抗体と検出粒子の複合体であり、捕捉抗体が抗ＨｂＡ１ｃ抗体のとき検出抗体は抗Ｈｂ抗体と検出粒子の複合体である必要がある。
コントロールラインを形成する捕捉抗体としては、標識物質を特異的に認識する抗体が好ましく、より好ましくはビオチンを特異的に認識する抗体（以下、抗ビオチン抗体と略すことがある）である。
標識物質としては、ビオチン標識タンパク質と検出粒子の複合体またはジゴキシゲニン標識タンパク質と検出粒子の複合体が好ましく、ビオチン標識タンパク質がより好ましい。
前記ビオチン標識タンパク質で用いるタンパク質の種類としては特に制限されないが、微生物由来タンパク質や動物由来タンパク質などが好ましく、微生物由来タンパク質としてはＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ、動物由来タンパク質としてはウシ血清アルブミンまたはカゼインがより好ましい。
本発明において、検出粒子は、着色粒子を用いるのが好ましい。着色粒子としては、金属粒子、ラテックス粒子、セルロース粒子などを例示することができる。金属粒子としては金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、パラジウムコロイド、金ナノロッド、金ナノプレート、銀ナノプレートなどを例示することができる。金属粒子の粒径は特に制限されないが、粒径１〜１００ｎｍのものが好ましい。ラテックス粒子としてはポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、アクリル酸重合体などの材質からなるものを例示することができ、粒径は特に制限されないが、粒径２５〜５００ｎｍのものが好ましい。セルロース粒子は、粒径１００〜５００ｎｍのものが好ましい。これらの中でも、汎用性が高く、視認性に優れたラテックス粒子やセルロース粒子を用いることが好ましい。
本発明において、イムノクロマト試験片を用いて、サンプルパッドで第１の分析対象物質の測定を行い、メンブレンで第２の分析対象物質の測定を行う方法は、例えば、第１の分析対象物質がＨｂ、第２の分析対象物質がＨｂＡ１ｃの場合は、以下の方法が例示される。まず、生体試料を必要に応じて生体試料希釈液と混合して展開可能な生体試料溶液を得た後、前記生体試料溶液をサンプルパッド２に滴下する。この際、生体試料と生体試料希釈液との混合割合（体積比）は、１：１００〜１：１０００とするのが好ましい。希釈しすぎると、当然ながら測定感度が低下することがある。一方、希釈の割合が低すぎると生体試料に含まれるビリルビン等の測定阻害物質の影響を受けやすくなるため定量性が低下することがある。
イムノクロマト試験片に滴下された生体試料溶液は、サンプルパッド２を通過してコンジュゲーションパッド３に展開される。前記生体試料溶液は、コンジュゲーションパッド３に坦持された検出抗体および標識物質を溶解しながら、ＨｂＡ１ｃと検出抗体（抗ＨｂＡ１ｃ抗体と検出粒子の複合体）が免疫複合体を形成しメンブレンに展開される。その後、さらに毛細管現象によって吸収パッド４側に流れる。前記生体試料溶液がメンブレンのテストライン５に到達すると、前記免疫複合体は捕捉抗体（抗Ｈｂ抗体）で捕捉され集積し、テストライン５が発色する。その後、標識物質を含む混合液はテストライン５を通過してコントロールライン６に到達する。ここで標識物質は捕捉抗体（抗ビオチン抗体）で捕捉され集積し、コントロールライン６が発色する。他の混合液は最終的に吸収パッドで吸収される。テストライン５とコントロールライン６の発色強度を、イムノクロマトリーダー等を使用して測定することで分析対象物質の濃度を測定することができる。
本発明において、イムノクロマト試験片のサンプルパッド部でＨｂの測定を行う方法は特に限定されない。例えば、図７および図８に示す反射光測定装置２０を用いる方法が例示される。反射光測定装置２０は、イムノクロマト試験片２２を装着部２１に固定でき、かつ、固定したイムノクロマト試験片２２のサンプルパッドに光を照射することができる反射光測定装置であって、さらに、発光素子２３より照射した光がサンプルパッドで反射した光を受光できるように受光素子２４を配置してあり、得られた測光値を経時的に測定することができるようになっている。イムノクロマト試験片を反射光測定装置の挿入口に設置し、電源をＯＮにして発光素子と受光素子とを連動させ、発光素子から特定波長の光を照射させる。サンプルパッド部に展開した生体試料溶液の呈色度合いを反射光として測定することでＨｂ濃度を測定することができる。発光素子としては例えばＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ Ｅｍｉｔｔｉｎｇ Ｄｉｏｄｅ）を使用することができる。前記ＬＥＤの波長は、Ｈｂを高感度で検出するために３７０〜４６０ｎｍが好ましく、４００〜４３０ｎｍがより好ましい。受光素子としては、例えばフォトダイオードを使用することができる。その他、ＣＣＤ、Ｃ−ＭＯＳなどを用いた画像解析システムも好適に使用することができる。
本発明において、Ｈｂ測定用の反射光測定装置とＨｂＡ１ｃ測定用のイムノクロマトリーダーは上記のように独立した装置を用いても良いし、これらが一体となった装置を用いても良い。測定の順番はＨｂが先であっても良いし、ＨｂＡ１ｃが先であっても良い。
以下、本発明を実施例に基づいてさらに説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。
（検出抗体（抗ＨｂＡ１ｃ抗体と検出粒子の複合体）の調製）
５μＬの１０％ラテックス粒子（Ｋ０１５、青色、Ｍｅｒｋ ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に４５μＬの５０ｍＭ ＰＢＳ（リン酸緩衝液）（ｐＨ７．５）を添加し、１％ラテックス溶液を調製した。また、市販の抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体（製品名：Ｈｕｍａｎ ＨｂＡ１ｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｃｌｏｎｅ １Ｄ３、品番：ＭＡＢ００３０−ＭＯ６Ａ、Ａｂｎｏｖａ社製）を５０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．５）で１．０ｍｇ／ｍＬに調製した。得られた抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体溶液の５μＬを１％ラテックス溶液に加え、ボルテックスで撹拌した後、室温で１時間静置した。ここに、０．３ｗｔ％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（東洋紡社製）および１．０ｗｔ％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を含む水溶液（以下、ＢＰＦ／ＰＥＧ水溶液と称する）１０μＬを加え、ボルテックスで撹拌した後、１時間室温で静置した。その後、９，３００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除去した。ここに、２００μＬの前記ＢＰＦ／ＰＥＧ水溶液を加え、ボルテックスで撹拌した後、室温で１時間静置した。９，３００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除去した。さらに、５０μＬの前記ＢＰＦ／ＰＥＧ水溶液を加え、ボルテックスで撹拌し検出抗体溶液を調製した。
５μＬの１０％ラテックス粒子（Ｋ０１５、青色、Ｍｅｒｋ ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に４５μＬの５０ｍＭ ＰＢＳ（リン酸緩衝液）（ｐＨ７．５）を添加し、１％ラテックス溶液を調製した。また、市販の抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体（製品名：Ｈｕｍａｎ ＨｂＡ１ｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｃｌｏｎｅ １Ｄ３、品番：ＭＡＢ００３０−ＭＯ６Ａ、Ａｂｎｏｖａ社製）を５０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．５）で１．０ｍｇ／ｍＬに調製した。得られた抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体溶液の５μＬを１％ラテックス溶液に加え、ボルテックスで撹拌した後、室温で１時間静置した。ここに、０．３ｗｔ％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（東洋紡社製）および１．０ｗｔ％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を含む水溶液（以下、ＢＰＦ／ＰＥＧ水溶液と称する）１０μＬを加え、ボルテックスで撹拌した後、１時間室温で静置した。その後、９，３００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除去した。ここに、２００μＬの前記ＢＰＦ／ＰＥＧ水溶液を加え、ボルテックスで撹拌した後、室温で１時間静置した。９，３００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除去した。さらに、５０μＬの前記ＢＰＦ／ＰＥＧ水溶液を加え、ボルテックスで撹拌し検出抗体溶液を調製した。
（標識物質の調製）
３．１５ｍｇのＤ−ビオチン（ナカライテスク社製）を７２μＬの蒸留水に溶解した。また、１０ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ナカライテスク社製）と１０ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ナカライテスク社製）を１００μＬの蒸留水に溶解した。これにＤ−ビオチン溶液を加え、室温で１時間緩やかに攪拌した。前記溶液に８０μＬの３ｗｔ％ＢＰＦ溶液を加え３０分間室温で静置し、ビオチン標識ＢＰＦ溶液を調製した。次に、５μＬの１０％ラテックス粒子に４５μＬの５０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．５）を添加し、１％ラテックス溶液を調製した。１５μＬのビオチン標識ＢＰＦ溶液を１％ラテックス溶液に加え、ボルテックスで撹拌した後、室温で１時間静置した。２００μＬの前記ＢＰＦ／ＰＥＧ水溶液を加え、ボルテックスで撹拌した後、１時間室温で静置した。その後、９，３００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除去した。２００μＬの前記ＢＰＦ／ＰＥＧ水溶液を加え、ボルテックスで撹拌した後、１時間室温で静置した。９，３００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除去した。５０μＬの前記ＢＰＦ／ＰＥＧ水溶液を加え、ボルテックスで撹拌し、標識物質を調製した。
３．１５ｍｇのＤ−ビオチン（ナカライテスク社製）を７２μＬの蒸留水に溶解した。また、１０ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ナカライテスク社製）と１０ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ナカライテスク社製）を１００μＬの蒸留水に溶解した。これにＤ−ビオチン溶液を加え、室温で１時間緩やかに攪拌した。前記溶液に８０μＬの３ｗｔ％ＢＰＦ溶液を加え３０分間室温で静置し、ビオチン標識ＢＰＦ溶液を調製した。次に、５μＬの１０％ラテックス粒子に４５μＬの５０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．５）を添加し、１％ラテックス溶液を調製した。１５μＬのビオチン標識ＢＰＦ溶液を１％ラテックス溶液に加え、ボルテックスで撹拌した後、室温で１時間静置した。２００μＬの前記ＢＰＦ／ＰＥＧ水溶液を加え、ボルテックスで撹拌した後、１時間室温で静置した。その後、９，３００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除去した。２００μＬの前記ＢＰＦ／ＰＥＧ水溶液を加え、ボルテックスで撹拌した後、１時間室温で静置した。９，３００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除去した。５０μＬの前記ＢＰＦ／ＰＥＧ水溶液を加え、ボルテックスで撹拌し、標識物質を調製した。
（ＨｂＡ１ｃ測定用メンブレンの作製）
２５ｍｍ×１５０ｍｍのニトロセルロースメンブレン（商品名：Ｈｉ−Ｆｌｏｗ ＰｌｕｓタイプＨＦ１２０（Ｍｅｒｋ ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製））の上流端から約１０ｍｍの位置にライン幅約１ｍｍのテストラインとして、１．０ｍｇ／ｍＬの捕捉抗体：抗Ｈｂモノクローナル抗体（製品名：Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、品番：７０Ｒ−７５８０、Ｆｉｔｇｅｒａｌｄ社製）溶液を、イムノクロマトディスペンサー（ＢＩＯＤＯＴ社製）を用いて１．０μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。次に、ニトロセルロースメンブレンの上流側から約１５ｍｍの位置にライン幅約１ｍｍのコントロールラインとして、１．０ｍｇ／ｍＬの抗ビオチンモノクローナル抗体（製品名：Ａｎｔｉ−Ｂｉｏｔｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、品番：ＧＴＸ４４３４４、ＧＥＮＥＴＥＸ社製）溶液をイムノクロマトディスペンサー（ＢＩＯＤＯＴ社製）を用いて１．０μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。その後、４０℃で３０分乾燥し、ＨｂＡ１ｃ測定用メンブレンを作製した。
２５ｍｍ×１５０ｍｍのニトロセルロースメンブレン（商品名：Ｈｉ−Ｆｌｏｗ ＰｌｕｓタイプＨＦ１２０（Ｍｅｒｋ ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製））の上流端から約１０ｍｍの位置にライン幅約１ｍｍのテストラインとして、１．０ｍｇ／ｍＬの捕捉抗体：抗Ｈｂモノクローナル抗体（製品名：Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、品番：７０Ｒ−７５８０、Ｆｉｔｇｅｒａｌｄ社製）溶液を、イムノクロマトディスペンサー（ＢＩＯＤＯＴ社製）を用いて１．０μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。次に、ニトロセルロースメンブレンの上流側から約１５ｍｍの位置にライン幅約１ｍｍのコントロールラインとして、１．０ｍｇ／ｍＬの抗ビオチンモノクローナル抗体（製品名：Ａｎｔｉ−Ｂｉｏｔｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、品番：ＧＴＸ４４３４４、ＧＥＮＥＴＥＸ社製）溶液をイムノクロマトディスペンサー（ＢＩＯＤＯＴ社製）を用いて１．０μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。その後、４０℃で３０分乾燥し、ＨｂＡ１ｃ測定用メンブレンを作製した。
（ＨｂＡ１ｃ測定用コンジュゲーションパッドの作製）
１０ｍｍ×１５０ｍｍのコンジュゲーションパッド（ＧＬＡＳＳＦＩＢＥＲ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣ ＰＡＤ ＧＦＤＸ（Ｍｅｒｋ ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製））に前記検出抗体と標識物質の混合液（混合比６：１）２２５μＬをイムノクロマトディスペンサー（ＢＩＯＤＯＴ社製）を用いて１５μＬ／ｃｍになるように均一に噴霧した。その後、４０℃で３０分乾燥し、ＨｂＡ１ｃ測定用コンジュゲーションパッドを作製した。
１０ｍｍ×１５０ｍｍのコンジュゲーションパッド（ＧＬＡＳＳＦＩＢＥＲ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣ ＰＡＤ ＧＦＤＸ（Ｍｅｒｋ ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製））に前記検出抗体と標識物質の混合液（混合比６：１）２２５μＬをイムノクロマトディスペンサー（ＢＩＯＤＯＴ社製）を用いて１５μＬ／ｃｍになるように均一に噴霧した。その後、４０℃で３０分乾燥し、ＨｂＡ１ｃ測定用コンジュゲーションパッドを作製した。
（Ｈｂ試料の調製）
市販のＨｂ標準物質である総ヘモグロビン常用参照標準物質ＪＣＣＲＭ９１２−２（一般社団法人検査医学標準物質機構社製）３水準を生体試料希釈液（５０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４＋１．０ｗｔ％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で５００倍に希釈し、ＨｂＡ１ｃ（％）が５．２％で、Ｈｂ濃度がそれぞれ０．１５６ｇ／Ｌ、０．２７４ｇ／Ｌ、０．３５９ｇ／Ｌの各Ｈｂ試料（３水準）を調製した。
市販のＨｂ標準物質である総ヘモグロビン常用参照標準物質ＪＣＣＲＭ９１２−２（一般社団法人検査医学標準物質機構社製）３水準を生体試料希釈液（５０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４＋１．０ｗｔ％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で５００倍に希釈し、ＨｂＡ１ｃ（％）が５．２％で、Ｈｂ濃度がそれぞれ０．１５６ｇ／Ｌ、０．２７４ｇ／Ｌ、０．３５９ｇ／Ｌの各Ｈｂ試料（３水準）を調製した。
（Ｈｂの検量線作成）
コンジュゲーションパッドに検出粒子を含まないイムノクロマト試験片を水平な台に設置した。次に、前記Ｈｂ試料（３水準）１００μＬをマイクロピペットで分取し、サンプルパッドに緩やかに滴下した。滴下してから１分後、サンプルパッド部においてＨｂ濃度を反射光測定装置を用いて測定した。なお、前記反射光測定装置は、発光素子として砲弾型ＬＥＤ（型番：ＯＳＳＶ５１１１Ａ、波長：４００ｎｍ、指向角：１５°、ＯｐｔｏＳｕｐｐｌｙ社製）を、受光素子としてフォトダイオード（型番；Ｓ８７４６−０１、浜松ホトニクス社製）をそれぞれ用いた。この結果、Ｈｂ濃度に応じた反射吸光度を確認することができた。Ｈｂ測定の結果（ｎ＝１０の平均値）を表１に示す。また、Ｈｂ濃度（Ｘ軸）と反射吸光度（Ｙ軸）の相関性からＨｂの検量線を作成した。結果を図１０に示す。
コンジュゲーションパッドに検出粒子を含まないイムノクロマト試験片を水平な台に設置した。次に、前記Ｈｂ試料（３水準）１００μＬをマイクロピペットで分取し、サンプルパッドに緩やかに滴下した。滴下してから１分後、サンプルパッド部においてＨｂ濃度を反射光測定装置を用いて測定した。なお、前記反射光測定装置は、発光素子として砲弾型ＬＥＤ（型番：ＯＳＳＶ５１１１Ａ、波長：４００ｎｍ、指向角：１５°、ＯｐｔｏＳｕｐｐｌｙ社製）を、受光素子としてフォトダイオード（型番；Ｓ８７４６−０１、浜松ホトニクス社製）をそれぞれ用いた。この結果、Ｈｂ濃度に応じた反射吸光度を確認することができた。Ｈｂ測定の結果（ｎ＝１０の平均値）を表１に示す。また、Ｈｂ濃度（Ｘ軸）と反射吸光度（Ｙ軸）の相関性からＨｂの検量線を作成した。結果を図１０に示す。
（ＨｂＡ１ｃ試料の調製）
市販のＨｂＡ１ｃ標準物質であるＨｂＡ１ｃ測定性能評価用試料ＱＲＭ ＨｂＡ１ｃ ２００７−１（一般社団法人検査医学標準物質機構社製）４水準を生体試料希釈液（５０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４＋１．０ｗｔ％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で５００倍に希釈しＨｂ濃度が０．３２０ｇ／Ｌで、ＨｂＡ１ｃ（％）が５．２９％、６．９６％、９．０８％、１０．７９％の各ＨｂＡ１ｃ試料（４水準）を調製した。
市販のＨｂＡ１ｃ標準物質であるＨｂＡ１ｃ測定性能評価用試料ＱＲＭ ＨｂＡ１ｃ ２００７−１（一般社団法人検査医学標準物質機構社製）４水準を生体試料希釈液（５０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４＋１．０ｗｔ％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で５００倍に希釈しＨｂ濃度が０．３２０ｇ／Ｌで、ＨｂＡ１ｃ（％）が５．２９％、６．９６％、９．０８％、１０．７９％の各ＨｂＡ１ｃ試料（４水準）を調製した。
（ＨｂＡ１ｃ（％）の検量線作成）
実施例２で得られたイムノクロマト試験片を水平な台に設置した。次に、ＨｂＡ１ｃ試料（４水準）１００μＬをマイクロピペットで分取し、サンプルパッドに緩やかに滴下した。滴下してから１０分後、メンブレン上のテストラインとコントロールラインをイムノクロマトリーダー（浜松ホトニクス社製：Ｃ１００６０−１０）を用いて測定した。結果、テストライン（Ｔ）はＨｂＡ１ｃ濃度に応じた反射吸光度を確認することができた。また、コントロールライン（Ｃ）はＨｂＡ１ｃ濃度に依存せず一定の反射吸光度を確認することができた。テストラインの反射吸光度をコントロールラインの反射吸光度で割算し、補正値（Ｔ／Ｃ）とした。ＨｂＡ１ｃ測定値（テストライン測定値）、コントロールライン測定値、補正値の結果（ｎ＝１０の平均値）を表２に示す。また、ＨｂＡ１ｃ濃度（Ｘ軸）と補正値（Ｙ軸）の相関性からＨｂＡ１ｃの検量線を作成した。結果を図１１に示す。
実施例２で得られたイムノクロマト試験片を水平な台に設置した。次に、ＨｂＡ１ｃ試料（４水準）１００μＬをマイクロピペットで分取し、サンプルパッドに緩やかに滴下した。滴下してから１０分後、メンブレン上のテストラインとコントロールラインをイムノクロマトリーダー（浜松ホトニクス社製：Ｃ１００６０−１０）を用いて測定した。結果、テストライン（Ｔ）はＨｂＡ１ｃ濃度に応じた反射吸光度を確認することができた。また、コントロールライン（Ｃ）はＨｂＡ１ｃ濃度に依存せず一定の反射吸光度を確認することができた。テストラインの反射吸光度をコントロールラインの反射吸光度で割算し、補正値（Ｔ／Ｃ）とした。ＨｂＡ１ｃ測定値（テストライン測定値）、コントロールライン測定値、補正値の結果（ｎ＝１０の平均値）を表２に示す。また、ＨｂＡ１ｃ濃度（Ｘ軸）と補正値（Ｙ軸）の相関性からＨｂＡ１ｃの検量線を作成した。結果を図１１に示す。
（実施例１）
（イムノクロマト試験片の作製）
イムノクロマト試験片は、イムノクロマトグラフで一般的に使用されるスライド構成で作製した。具体的には、検出粒子に青色のラテックス粒子を、サンプルパッドとして、セルロース製のろ紙（ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ ＦＩＢＥＲ ＳＡＭＰＬＥ ＰＡＤＳ ＣＦＳＰ（Ｍｅｒｋ ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製））、前記ＨｂＡ１ｃ測定用コンジュゲーションパッド、前記ＨｂＡ１ｃ測定用メンブレン、吸収パッド（ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ ＦＩＢＥＲ ＳＡＭＰＬＥ ＰＡＤＳ ＣＦＳＰ（Ｍｅｒｋ ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製））を、各々端部が一部重なるように連接配置し、図４に示されるような幅４ｍｍ、長さ６０ｍｍのイムノクロマト試験片を作製した。なお、サンプルパッドの長さは２０ｍｍ、コンジュゲーションパッドの長さは１０ｍｍ、サンプルパッドとコンジュゲーションパッドとの接触可能部の長さは４ｍｍとした。また、サンプルパッドの下面とコンジュゲーションパッドの上流側上面の接触長が１ｍｍになるようにサンプルパッドとコンジュゲーションパッドの間に長さ３ｍｍ、厚み１００μｍのポリエチレンテレフタレート製フィルム（コスモシャイン（登録商標）東洋紡社製）を設置した。
（イムノクロマト試験片の作製）
イムノクロマト試験片は、イムノクロマトグラフで一般的に使用されるスライド構成で作製した。具体的には、検出粒子に青色のラテックス粒子を、サンプルパッドとして、セルロース製のろ紙（ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ ＦＩＢＥＲ ＳＡＭＰＬＥ ＰＡＤＳ ＣＦＳＰ（Ｍｅｒｋ ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製））、前記ＨｂＡ１ｃ測定用コンジュゲーションパッド、前記ＨｂＡ１ｃ測定用メンブレン、吸収パッド（ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ ＦＩＢＥＲ ＳＡＭＰＬＥ ＰＡＤＳ ＣＦＳＰ（Ｍｅｒｋ ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製））を、各々端部が一部重なるように連接配置し、図４に示されるような幅４ｍｍ、長さ６０ｍｍのイムノクロマト試験片を作製した。なお、サンプルパッドの長さは２０ｍｍ、コンジュゲーションパッドの長さは１０ｍｍ、サンプルパッドとコンジュゲーションパッドとの接触可能部の長さは４ｍｍとした。また、サンプルパッドの下面とコンジュゲーションパッドの上流側上面の接触長が１ｍｍになるようにサンプルパッドとコンジュゲーションパッドの間に長さ３ｍｍ、厚み１００μｍのポリエチレンテレフタレート製フィルム（コスモシャイン（登録商標）東洋紡社製）を設置した。
（Ｈｂ濃度（ｇ／Ｌ）の測定）
得られたイムノクロマト試験片を水平な台に設置した。次に、前記Ｈｂ試料（３水準）１００μＬをマイクロピペットで分取し、サンプルパッドに緩やかに滴下した。滴下してから１分後、サンプルパッド部のＨｂを反射光測定装置を用いて測定した。
測定の感度は、Ｈｂ試料の高濃度品（０．３５９ｇ／Ｌ）の反射吸光度と、低濃度品（０．１５６ｇ／Ｌ）の反射吸光度の差（ΔＨｂ）で評価し、ΔＨｂ＞５０ｍＡｂｓを○（excellent）、１０ｍＡｂｓ≦ΔＨｂ≦５０ｍＡｂｓを△（good）、ΔＨｂ＜１０ｍＡｂｓを×（bad）とした。
また、測定の再現性は、反射吸光度のｎ＝１０のＣＶ（％）で評価し、ＣＶ（％）＜５％を○（excellent）、５％≦ＣＶ（％）≦１０％を△（good）、ＣＶ（％）＞１０％を×（bad）とした。
さらに、測定の正確性は、Ｈｂ試料の高濃度品（０．３５９ｇ／Ｌ）の反射吸光度を測定し、得られた吸光度と前記検量線とからＨｂ濃度を算出した。得られたＨｂ濃度を用い、下記式より評価した。正確性＜１０％を○（excellent）、１０％≦正確性≦２０％を△（good）、正確性＞２０％を×（bad）とした。
正確性％＝（Ｈｂ濃度−０．３５９）／０．３５９＊１００
これらの結果、実施例１のイムノクロマト試験片は、感度（ΔＨｂ）は１００ｍＡｂｓで○（excellent）、再現性（ＣＶ（％））は３％で○（excellent）、正確性は８％で○（excellent）と、いずれも良好であった。結果を表３にまとめた。
得られたイムノクロマト試験片を水平な台に設置した。次に、前記Ｈｂ試料（３水準）１００μＬをマイクロピペットで分取し、サンプルパッドに緩やかに滴下した。滴下してから１分後、サンプルパッド部のＨｂを反射光測定装置を用いて測定した。
測定の感度は、Ｈｂ試料の高濃度品（０．３５９ｇ／Ｌ）の反射吸光度と、低濃度品（０．１５６ｇ／Ｌ）の反射吸光度の差（ΔＨｂ）で評価し、ΔＨｂ＞５０ｍＡｂｓを○（excellent）、１０ｍＡｂｓ≦ΔＨｂ≦５０ｍＡｂｓを△（good）、ΔＨｂ＜１０ｍＡｂｓを×（bad）とした。
また、測定の再現性は、反射吸光度のｎ＝１０のＣＶ（％）で評価し、ＣＶ（％）＜５％を○（excellent）、５％≦ＣＶ（％）≦１０％を△（good）、ＣＶ（％）＞１０％を×（bad）とした。
さらに、測定の正確性は、Ｈｂ試料の高濃度品（０．３５９ｇ／Ｌ）の反射吸光度を測定し、得られた吸光度と前記検量線とからＨｂ濃度を算出した。得られたＨｂ濃度を用い、下記式より評価した。正確性＜１０％を○（excellent）、１０％≦正確性≦２０％を△（good）、正確性＞２０％を×（bad）とした。
正確性％＝（Ｈｂ濃度−０．３５９）／０．３５９＊１００
これらの結果、実施例１のイムノクロマト試験片は、感度（ΔＨｂ）は１００ｍＡｂｓで○（excellent）、再現性（ＣＶ（％））は３％で○（excellent）、正確性は８％で○（excellent）と、いずれも良好であった。結果を表３にまとめた。
（ＨｂＡ１ｃ（％）の測定）
得られたイムノクロマト試験片を水平な台に設置した。次に、ＨｂＡ１ｃ試料（４水準）１００μＬをマイクロピペットで分取し、サンプルパッドに緩やかに滴下した。滴下してから１０分後、メンブレン上のテストラインとコントロールラインをイムノクロマトリーダー（浜松ホトニクス社製：Ｃ１００６０−１０）を用いて測定した。
測定の感度は、ＨｂＡ１ｃ試料の高濃度品（１０．７９％）のテストラインの反射吸光度と、低濃度品（５．２９％）のテストラインの反射吸光度の差：ΔＨｂＡ１ｃで評価し、ΔＨｂＡ１ｃ＞１００ｍＡｂｓを○（excellent）、５０ｍＡｂｓ≦ΔＨｂＡ１ｃ≦１００ｍＡｂｓを△（good）、ΔＨｂＡ１ｃ＜５０ｍＡｂｓを×（bad）とした。
これらの結果、実施例１のイムノクロマト試験片は、感度（ΔＨｂＡ１ｃ）は１３０ｍＡｂｓで○（excellent）であった。結果を表３にまとめた。
得られたイムノクロマト試験片を水平な台に設置した。次に、ＨｂＡ１ｃ試料（４水準）１００μＬをマイクロピペットで分取し、サンプルパッドに緩やかに滴下した。滴下してから１０分後、メンブレン上のテストラインとコントロールラインをイムノクロマトリーダー（浜松ホトニクス社製：Ｃ１００６０−１０）を用いて測定した。
測定の感度は、ＨｂＡ１ｃ試料の高濃度品（１０．７９％）のテストラインの反射吸光度と、低濃度品（５．２９％）のテストラインの反射吸光度の差：ΔＨｂＡ１ｃで評価し、ΔＨｂＡ１ｃ＞１００ｍＡｂｓを○（excellent）、５０ｍＡｂｓ≦ΔＨｂＡ１ｃ≦１００ｍＡｂｓを△（good）、ΔＨｂＡ１ｃ＜５０ｍＡｂｓを×（bad）とした。
これらの結果、実施例１のイムノクロマト試験片は、感度（ΔＨｂＡ１ｃ）は１３０ｍＡｂｓで○（excellent）であった。結果を表３にまとめた。
（実施例２）
実施例１と同様の部材を用いて図５に示されるような幅４ｍｍ、長さ６０ｍｍのイムノクロマト試験片を作製した。なお、サンプルパッドの長さは２０ｍｍ、コンジュゲーションパッドの長さは１０ｍｍ、サンプルパッドとコンジュゲーションパッドとの接触可能部の長さは１０ｍｍとした。また、サンプルパッドの下面とコンジュゲーションパッドの上流側上面の接触長が１ｍｍになるようにサンプルパッドとコンジュゲーションパッドの間に長さ９ｍｍ、厚み１００μｍのポリエチレンテレフタレート製フィルム（コスモシャイン（登録商標）東洋紡社製）を設置した。
Ｈｂ測定の結果、感度（ΔＨｂ）は９０ｍＡｂｓで○（excellent）、再現性（ＣＶ（％））は５％で○（excellent）、正確性は３％で○（excellent）と、いずれも良好であった。
また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果、感度（ΔＨｂＡ１ｃ）は１２５ｍＡｂｓで○（excellent）であった。結果を表３にまとめた。
実施例１と同様の部材を用いて図５に示されるような幅４ｍｍ、長さ６０ｍｍのイムノクロマト試験片を作製した。なお、サンプルパッドの長さは２０ｍｍ、コンジュゲーションパッドの長さは１０ｍｍ、サンプルパッドとコンジュゲーションパッドとの接触可能部の長さは１０ｍｍとした。また、サンプルパッドの下面とコンジュゲーションパッドの上流側上面の接触長が１ｍｍになるようにサンプルパッドとコンジュゲーションパッドの間に長さ９ｍｍ、厚み１００μｍのポリエチレンテレフタレート製フィルム（コスモシャイン（登録商標）東洋紡社製）を設置した。
Ｈｂ測定の結果、感度（ΔＨｂ）は９０ｍＡｂｓで○（excellent）、再現性（ＣＶ（％））は５％で○（excellent）、正確性は３％で○（excellent）と、いずれも良好であった。
また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果、感度（ΔＨｂＡ１ｃ）は１２５ｍＡｂｓで○（excellent）であった。結果を表３にまとめた。
（実施例３）
実施例１と同様の部材を用いて図６に示されるようなハウジングケースに内蔵されたイムノクロマト試験片を作製した。なお、サンプルパッドの長さは２０ｍｍ、コンジュゲーションパッドの長さは１０ｍｍ、サンプルパッドとコンジュゲーションパッドとの接触可能部の長さは１０ｍｍとした。また、サンプルパッドの下面とコンジュゲーションパッドの上流側上面の接触長が２ｍｍになるようにサンプルパッドとコンジュゲーションパッドの間にハウジングケースに取り付けられた拡散防止部材を挟み込んだ。
Ｈｂ測定の結果、感度（ΔＨｂ）は９０ｍＡｂｓで○（excellent）、再現性（ＣＶ（％））は６％で△（good）、正確性は６％で○（excellent）と、いずれも良好であった。
また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果、感度（ΔＨｂＡ１ｃ）は１３０ｍＡｂｓで○（excellent）であった。結果を表３にまとめた。
実施例１と同様の部材を用いて図６に示されるようなハウジングケースに内蔵されたイムノクロマト試験片を作製した。なお、サンプルパッドの長さは２０ｍｍ、コンジュゲーションパッドの長さは１０ｍｍ、サンプルパッドとコンジュゲーションパッドとの接触可能部の長さは１０ｍｍとした。また、サンプルパッドの下面とコンジュゲーションパッドの上流側上面の接触長が２ｍｍになるようにサンプルパッドとコンジュゲーションパッドの間にハウジングケースに取り付けられた拡散防止部材を挟み込んだ。
Ｈｂ測定の結果、感度（ΔＨｂ）は９０ｍＡｂｓで○（excellent）、再現性（ＣＶ（％））は６％で△（good）、正確性は６％で○（excellent）と、いずれも良好であった。
また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果、感度（ΔＨｂＡ１ｃ）は１３０ｍＡｂｓで○（excellent）であった。結果を表３にまとめた。
（実施例４）
実施例１と同様の部材を用いて図５に示されるような幅４ｍｍ、長さ６０ｍｍのイムノクロマト試験片を作製した。なお、サンプルパッドの長さは２０ｍｍ、コンジュゲーションパッドの長さは１０ｍｍ、サンプルパッドとコンジュゲーションパッドとの接触可能部の長さは１０ｍｍとした。また、サンプルパッドの下面とコンジュゲーションパッドの上流側上面の接触長が１ｍｍになるようにサンプルパッドとコンジュゲーションパッドの間に長さ９ｍｍ、厚み６０μｍのポリプロピレン製フィルム（トレファン（登録商標）東レ社製）
Ｈｂ測定の結果、感度（ΔＨｂ）は８５ｍＡｂｓで○（excellent）、再現性（ＣＶ（％））は３％で○（excellent）、正確性は９％で○（excellent）と、いずれも良好であった。
また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果、感度（ΔＨｂＡ１ｃ）は１３０ｍＡｂｓで○（excellent）であった。結果を表３にまとめた。
実施例１と同様の部材を用いて図５に示されるような幅４ｍｍ、長さ６０ｍｍのイムノクロマト試験片を作製した。なお、サンプルパッドの長さは２０ｍｍ、コンジュゲーションパッドの長さは１０ｍｍ、サンプルパッドとコンジュゲーションパッドとの接触可能部の長さは１０ｍｍとした。また、サンプルパッドの下面とコンジュゲーションパッドの上流側上面の接触長が１ｍｍになるようにサンプルパッドとコンジュゲーションパッドの間に長さ９ｍｍ、厚み６０μｍのポリプロピレン製フィルム（トレファン（登録商標）東レ社製）
Ｈｂ測定の結果、感度（ΔＨｂ）は８５ｍＡｂｓで○（excellent）、再現性（ＣＶ（％））は３％で○（excellent）、正確性は９％で○（excellent）と、いずれも良好であった。
また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果、感度（ΔＨｂＡ１ｃ）は１３０ｍＡｂｓで○（excellent）であった。結果を表３にまとめた。
（実施例５）
実施例１と同様の部材を用いて図５に示されるような幅４ｍｍ、長さ６０ｍｍのイムノクロマト試験片を作製した。なお、サンプルパッドの長さは２０ｍｍ、コンジュゲーションパッドの長さは１０ｍｍ、サンプルパッドとコンジュゲーションパッドとの接触可能部の長さは１０ｍｍとした。また、サンプルパッドの下面とコンジュゲーションパッドの上流側上面の接触長が１ｍｍになるようにサンプルパッドとコンジュゲーションパッドの間に長さ９ｍｍ、厚み１００μｍのパーフルオロアルコキシ樹脂製フィルム（ネオフロン（登録商標）ダイキン社製）を設置した。
Ｈｂ測定の結果、感度（ΔＨｂ）は８５ｍＡｂｓで○（excellent）、再現性（ＣＶ（％））は２％で○（excellent）、正確性は７％で○（excellent）と、いずれも良好であった。
また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果、感度（ΔＨｂＡ１ｃ）は１２５ｍＡｂｓで○（excellent）であった。結果を表３にまとめた。
実施例１と同様の部材を用いて図５に示されるような幅４ｍｍ、長さ６０ｍｍのイムノクロマト試験片を作製した。なお、サンプルパッドの長さは２０ｍｍ、コンジュゲーションパッドの長さは１０ｍｍ、サンプルパッドとコンジュゲーションパッドとの接触可能部の長さは１０ｍｍとした。また、サンプルパッドの下面とコンジュゲーションパッドの上流側上面の接触長が１ｍｍになるようにサンプルパッドとコンジュゲーションパッドの間に長さ９ｍｍ、厚み１００μｍのパーフルオロアルコキシ樹脂製フィルム（ネオフロン（登録商標）ダイキン社製）を設置した。
Ｈｂ測定の結果、感度（ΔＨｂ）は８５ｍＡｂｓで○（excellent）、再現性（ＣＶ（％））は２％で○（excellent）、正確性は７％で○（excellent）と、いずれも良好であった。
また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果、感度（ΔＨｂＡ１ｃ）は１２５ｍＡｂｓで○（excellent）であった。結果を表３にまとめた。
（実施例６）
実施例１と同様の部材を用いて図５に示されるような幅４ｍｍ、長さ６０ｍｍのイムノクロマト試験片を作製した。なお、サンプルパッドの長さは２０ｍｍ、コンジュゲーションパッドの長さは１０ｍｍ、サンプルパッドとコンジュゲーションパッドとの接触可能部の長さは１０ｍｍとした。また、サンプルパッドの下面とコンジュゲーションパッドの上流側上面の接触長が１ｍｍになるようにサンプルパッドとコンジュゲーションパッドの間に長さ９ｍｍ、厚み１００μｍのポリエステル系合成紙（クリスパー（登録商標）東洋紡社製）を設置した。
Ｈｂ測定の結果、感度（ΔＨｂ）は１００ｍＡｂｓで○（excellent）、再現性（ＣＶ（％））は４％で○（excellent）、正確性は９％で○（excellent）と、いずれも良好であった。
また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果、感度（ΔＨｂＡ１ｃ）は１３０ｍＡｂｓで○（excellent）であった。
実施例１と同様の部材を用いて図５に示されるような幅４ｍｍ、長さ６０ｍｍのイムノクロマト試験片を作製した。なお、サンプルパッドの長さは２０ｍｍ、コンジュゲーションパッドの長さは１０ｍｍ、サンプルパッドとコンジュゲーションパッドとの接触可能部の長さは１０ｍｍとした。また、サンプルパッドの下面とコンジュゲーションパッドの上流側上面の接触長が１ｍｍになるようにサンプルパッドとコンジュゲーションパッドの間に長さ９ｍｍ、厚み１００μｍのポリエステル系合成紙（クリスパー（登録商標）東洋紡社製）を設置した。
Ｈｂ測定の結果、感度（ΔＨｂ）は１００ｍＡｂｓで○（excellent）、再現性（ＣＶ（％））は４％で○（excellent）、正確性は９％で○（excellent）と、いずれも良好であった。
また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果、感度（ΔＨｂＡ１ｃ）は１３０ｍＡｂｓで○（excellent）であった。
（実施例７）
検出粒子に赤色のラテックス粒子（Ｋ０１５、赤色、Ｍｅｒｋｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いた以外は、実施例１と同様にして実験を行った。実施例１と同様の部材を用いて図５に示されるような幅４ｍｍ、長さ６０ｍｍのイムノクロマト試験片を作製した。なお、サンプルパッドの長さは２０ｍｍ、コンジュゲーションパッドの長さは１０ｍｍ、サンプルパッドとコンジュゲーションパッドとの接触可能部の長さは１０ｍｍとした。また、サンプルパッドの下面とコンジュゲーションパッドの上流側上面の接触長が１ｍｍになるようにサンプルパッドとコンジュゲーションパッドの間に長さ９ｍｍ、厚み１００μｍのポリエステル系合成紙（クリスパー（登録商標）東洋紡社製）を設置した。
Ｈｂ測定の結果、感度（ΔＨｂ）は８０ｍＡｂｓで○（excellent）、再現性（ＣＶ（％））は４％で○（excellent）、正確性は９％で○（excellent）と、いずれも良好であった。
また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果、感度（ΔＨｂＡ１ｃ）は８０ｍＡｂｓで○（excellent）であった。
検出粒子に赤色のラテックス粒子（Ｋ０１５、赤色、Ｍｅｒｋｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いた以外は、実施例１と同様にして実験を行った。実施例１と同様の部材を用いて図５に示されるような幅４ｍｍ、長さ６０ｍｍのイムノクロマト試験片を作製した。なお、サンプルパッドの長さは２０ｍｍ、コンジュゲーションパッドの長さは１０ｍｍ、サンプルパッドとコンジュゲーションパッドとの接触可能部の長さは１０ｍｍとした。また、サンプルパッドの下面とコンジュゲーションパッドの上流側上面の接触長が１ｍｍになるようにサンプルパッドとコンジュゲーションパッドの間に長さ９ｍｍ、厚み１００μｍのポリエステル系合成紙（クリスパー（登録商標）東洋紡社製）を設置した。
Ｈｂ測定の結果、感度（ΔＨｂ）は８０ｍＡｂｓで○（excellent）、再現性（ＣＶ（％））は４％で○（excellent）、正確性は９％で○（excellent）と、いずれも良好であった。
また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果、感度（ΔＨｂＡ１ｃ）は８０ｍＡｂｓで○（excellent）であった。
（比較例１）
実施例１と同様の部材を用いて図３に示されるような幅４ｍｍ、長さ６０ｍｍのイムノクロマト試験片を作製した。なお、サンプルパッドの長さは２０ｍｍ、コンジュゲーションパッドの長さは１０ｍｍ、サンプルパッドとコンジュゲーションパッドとの接触可能部の長さは１０ｍｍとした。また、サンプルパッドとコンジュゲーションパッドの間に拡散防止手段を設けなかった。
Ｈｂ測定の結果、感度（ΔＨｂ）は９０ｍＡｂｓで○（excellent）、再現性（ＣＶ（％））は１３％で×（bad）、正確性は３０％で×（bad）であった。
また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果、感度（ΔＨｂＡ１ｃ）は１３０ｍＡｂｓで○（excellent）であった。
実施例１と同様の部材を用いて図３に示されるような幅４ｍｍ、長さ６０ｍｍのイムノクロマト試験片を作製した。なお、サンプルパッドの長さは２０ｍｍ、コンジュゲーションパッドの長さは１０ｍｍ、サンプルパッドとコンジュゲーションパッドとの接触可能部の長さは１０ｍｍとした。また、サンプルパッドとコンジュゲーションパッドの間に拡散防止手段を設けなかった。
Ｈｂ測定の結果、感度（ΔＨｂ）は９０ｍＡｂｓで○（excellent）、再現性（ＣＶ（％））は１３％で×（bad）、正確性は３０％で×（bad）であった。
また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果、感度（ΔＨｂＡ１ｃ）は１３０ｍＡｂｓで○（excellent）であった。
（比較例２）
実施例１と同様の部材を用いて図７に示されるような幅４ｍｍ、長さ６０ｍｍのイムノクロマト試験片を作製した。なお、サンプルパッドの長さは２０ｍｍ、コンジュゲーションパッドの長さは１０ｍｍ、サンプルパッドとコンジュゲーションパッドとの接触可能部の長さは２ｍｍとした。また、サンプルパッドとコンジュゲーションパッドの間に拡散防止手段を設けなかった。
サンプルパッドへの青色の検出粒子の逆流が目視にて確認できた。Ｈｂ測定の結果、感度（ΔＨｂ）は１００ｍＡｂｓで○（excellent）、再現性（ＣＶ（％））は８％で△（good）、正確性は２２％で×（bad）であった。
また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果、感度（ΔＨｂＡ１ｃ）は１２５ｍＡｂｓで○（excellent）であった。
実施例１と同様の部材を用いて図７に示されるような幅４ｍｍ、長さ６０ｍｍのイムノクロマト試験片を作製した。なお、サンプルパッドの長さは２０ｍｍ、コンジュゲーションパッドの長さは１０ｍｍ、サンプルパッドとコンジュゲーションパッドとの接触可能部の長さは２ｍｍとした。また、サンプルパッドとコンジュゲーションパッドの間に拡散防止手段を設けなかった。
サンプルパッドへの青色の検出粒子の逆流が目視にて確認できた。Ｈｂ測定の結果、感度（ΔＨｂ）は１００ｍＡｂｓで○（excellent）、再現性（ＣＶ（％））は８％で△（good）、正確性は２２％で×（bad）であった。
また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果、感度（ΔＨｂＡ１ｃ）は１２５ｍＡｂｓで○（excellent）であった。
（比較例３）
検出粒子に赤色のラテックス粒子（Ｋ０１５、赤色、Ｍｅｒｋ ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いた以外は、比較例１と同様にして実験を行った。
サンプルパッドへの赤色の検出粒子の逆流が目視にて確認できた。Ｈｂ測定の結果、感度（ΔＨｂ）は８０ｍＡｂｓで○（excellent）、再現性（ＣＶ（％））は９％で△（good）、正確性は４０％で×（bad）であった。
また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果、感度（ΔＨｂＡ１ｃ）は８０ｍＡｂｓで○（excellent）であった。
検出粒子に赤色のラテックス粒子（Ｋ０１５、赤色、Ｍｅｒｋ ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いた以外は、比較例１と同様にして実験を行った。
サンプルパッドへの赤色の検出粒子の逆流が目視にて確認できた。Ｈｂ測定の結果、感度（ΔＨｂ）は８０ｍＡｂｓで○（excellent）、再現性（ＣＶ（％））は９％で△（good）、正確性は４０％で×（bad）であった。
また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果、感度（ΔＨｂＡ１ｃ）は８０ｍＡｂｓで○（excellent）であった。
実施例１〜比較例３の全水準において、Ｈｂ測定の感度（ΔＨｂ）には差がみられなかった。しかし、拡散防止手段を設けた実施例の試験片は拡散防止手段を設けていない比較例の試験片に比較して、測定の再現性（ＣＶ（％））および正確性（％）の向上がみられた。
本発明により、簡便で測定精度の高いイムノクロマト試験片を提供することができる。
１：メンブレン
２：サンプルパッド
３：コンジュゲーションパッド
４：吸収パッド
５：テストライン
６：コントロールライン
７：粘着シート
８：第１の分析対象物質の測定部位
９：拡散防止手段
１０：第一の開口部
１１：第二の開口部
１２：第三の開口部
２０：反射光測定装置
２１：装着部
２２：イムノクロマト試験片
２３：発光素子
２４：受光素子
２：サンプルパッド
３：コンジュゲーションパッド
４：吸収パッド
５：テストライン
６：コントロールライン
７：粘着シート
８：第１の分析対象物質の測定部位
９：拡散防止手段
１０：第一の開口部
１１：第二の開口部
１２：第三の開口部
２０：反射光測定装置
２１：装着部
２２：イムノクロマト試験片
２３：発光素子
２４：受光素子
Claims (8)
- サンプルパッド、コンジュゲーションパッド、メンブレン、吸収パッドが順に連接配置され、前記サンプルパッドの下面の一部と前記コンジュゲーションパッドの上面の少なくとも一部が接触可能なように配置されており、前記接触可能部に拡散防止手段が設けられたイムノクロマト試験片を用い、少なくとも下記工程（ｉ）から（ｉｉｉ）をこの順に経て、生体試料中の第１の分析対象物質および第２の分析対象物質を定量する方法。
工程（ｉ）：生体試料と生体試料希釈液とを体積比１：１００〜１：１０００で混合して生体試料溶液を調製する工程
工程（ｉｉ）：工程（ｉ）で得られた生体試料溶液を、イムノクロマト試験片に滴下し、展開させる工程
工程（ｉｉｉ）：サンプルパッドにおいて第１の分析対象物質を比色定量する工程、およびメンブレンにおいて第２の分析対象物質を比色定量する工程 - 前記接触可能部の長さは、４ｍｍ以上である請求項１に記載の方法。
- 前記拡散防止手段は、着色粒子の拡散を防止するものである請求項１または２に記載の方法。
- 前記拡散防止手段は、フィルムまたはシートである請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記拡散防止手段は、前記コンジュゲーションパッドの上流側上面の一部が前記サンプルパッドと接触するように配置されている請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記コンジュゲーションパッドは、着色粒子を含有する請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第１の分析対象物質がヘモグロビンである請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第２の分析対象物質がヘモグロビンＡ１ｃである請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
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