JP7131546B2

JP7131546B2 - イムノクロマト試験片およびキットおよび測定方法

Info

Publication number: JP7131546B2
Application number: JP2019510141A
Authority: JP
Inventors: 淳岡本; 裕川南; 真希子平岡; 圭三米田
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2017-03-31
Filing date: 2018-03-29
Publication date: 2022-09-06
Anticipated expiration: 2038-03-29
Also published as: WO2018181741A1; JPWO2018181741A1

Description

本発明は、イムノクロマト法による生体試料中に含まれる分析対象物質（特に、ヘモグロビンＡ１ｃ）の測定方法、当該測定方法に用いるイムノクロマト試験片およびイムノクロマト試験片を含むキットに関する。

世界糖尿病連合（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＤｉａｂｅｔｅｓＦｅｄｅｒａｔｉｏｎ）によると、世界の糖尿病患者数はアメリカ、ヨーロッパなどの先進国に加え、中国、インド、ブラジルなどの新興国を含めて急増しており、２０１５年で約４．２億人存在し、２０４０年には約６．４億人に及ぶと予測され、糖尿病診断の重要性は増している。

糖尿病診断項目の一つであるヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃと略す場合がある）とは、血液中の酸素を運搬する役割を担うヘモグロビン（以下、Ｈｂと略す場合がある）に糖（グルコース）が結合した糖化ヘモグロビンの内、ヘモグロビンβ鎖のＮ末端側に位置するバリン残基が糖化された物質を指し、総Ｈｂ量に対するＨｂＡ１ｃ濃度が過去１～２ヶ月間の平均血糖値を反映することから、糖尿病の長期的な経過を観察するのに利用されている。

従来、ＨｂＡ１ｃの測定にはＨＰＬＣ法、キャピラリー電気泳動法、酵素法、免疫法などの測定技術が利用されていたが、これらの測定方法は専門知識を有することや分析装置が大型かつ高額であるなどの理由から、主に大規模病院や多数の検査を行う検査センターで利用されており、小規模病院ではＨｂＡ１ｃを簡単に測定できない点が問題となっていた。

近年、医療現場ではＰＯＣＴという言葉が注目を集めている。ＰＯＣＴとはＰｏｉｎｔＯｆＣａｒｅＴｅｓｔｉｎｇの略であり、医療従事者が被験者の傍らで行う臨床検査のことをいう。ＰＯＣＴは大規模病院の中央検査室等で行う臨床検査とは異なり、その場で瞬時に検査結果が得られることから、糖尿病診断においてもＰＯＣＴが広まりつつある。

ＨｂＡ１ｃ濃度の測定を目的としたＰＯＣＴの中に、イムノクロマト法を利用した技術が提案されている。イムノクロマト法とは毛細管現象を利用した免疫測定法であり、妊娠検査やインフルエンザ検査などにおいて世界的に普及している。従来のイムノクロマト法は目視判定（定性評価）が一般的であったが、近年、クロマトリーダー等の分析装置を利用して生体試料中に含まれる分析対象物質の濃度を定量する技術が開発されつつある。

イムノクロマト法を用いた分析対象物質の濃度を定量する手法の一つとしては、抗原抗体反応を利用したサンドイッチ法が挙げられる。サンドイッチ法では分析対象物質に対してエピトープの異なる２種類の抗体を利用する。一方の抗体は、金コロイド、着色ラテックスまたは蛍光粒子等の検出粒子と感作した検出抗体を使用する。他方の抗体は、多孔質支持体の表面に線状に固定した捕捉抗体としてテストラインを形成する。加えて、前記検出抗体を特異的に認識する抗体を多孔質支持体の表面の、前記テストラインとは異なる位置に線状に固定しコントロールラインを形成する。生体試料中に含まれる分析対象物質は、多孔質支持体の一端（上流側）から展開し、検出抗体と免疫複合体を形成しながら移動し、テストライン上で捕捉抗体と接触して捕捉され発色する。分析対象物質と免疫複合体を形成しなかった遊離の検出試薬はテストライン上を通過し、コントロールラインの抗体に捕捉され発色する。これらの発色強度をクロマトリーダー等の装置を利用することで分析対象物質の濃度を定量することができる。

特許文献１および２には、イムノクロマト法を用いたＨｂＡ１ｃ濃度を測定する技術が開示されている。当該方法は血液と環状多糖類を含む試薬を接触させることでＨｂβ鎖のＮ末端（エピトープ）を露出させ、その後、検出粒子（金コロイドあるいはラテックス粒子）で標識されたＨｂ抗体と免疫反応を行い、抗体固定化メンブレン上に展開し、抗ＨｂＡ１ｃ抗体固定化部および抗ＨｂＡ０固定化部に到達した免疫複合体をそれぞれ検出することで、血液中のＨｂＡ１ｃ（％）を簡便に求めることができる。

しかしながら、該手法では検出粒子に感作した抗Ｈｂ抗体がＨｂＡ１ｃやＨｂＡ０だけではなく、他のＨｂとも免疫反応を行うので、生体試料の種類によっては感度が低下することが問題となる。また、同一メンブレン上で２種類の免疫複合体を検出する場合、上流の免疫反応が下流の免疫反応に影響することがあり、測定精度が低下する問題がある。

一方、特許文献３には、イムノクロマト法において、サンプルパッドに保持されたＨｂを光学的に検出して、生体試料溶液中のヘマトクリット値を測定する技術が開示されている。該発明は、上流の免疫反応が下流の免疫反応に影響することがないため、測定精度の向上が期待される。しかしながら、該発明ではサンプルパッドにグラスファイバー製パッドが使用されており、グラスファイバー製パッドやセルロース製パッドをはじめとするサンプルパッドに一般的に使用される基材では、時間と共にＨｂ由来の色味が変化するため、生体試料溶液の展開性によって測定精度が低下する問題がある。また、サンプルパッドにおいて前記生体試料溶液を保持できる液量が少ないため、特に生体試料溶液の希釈倍率が高い場合に感度が不足する問題がある。

特開２０１２－２５１７８９号公報特開２０１５－１５８５１５号公報ＷＯ２０１３／１４７２００公報

本発明は、上記の問題点に鑑みて、従来よりも測定精度の高い生体試料中に含まれる分析対象物質（特に、ＨｂＡ１ｃ）の測定方法、当該測定方法に用いるイムノクロマト試験片およびイムノクロマト試験片を含むキットを提供することを課題とする。

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、イムノクロマト試験片において、Ｈｂをサンプルパッド部で測定し、分析対象物質（特に、ＨｂＡ１ｃ）をメンブレン部で測定することで、生体試料の種類や生体試料中の分析対象物質の濃度の影響を受けず、Ｈｂと分析対象物質（特に、ＨｂＡ１ｃ）をそれぞれ正確に測定できること見出した。

しかし、同一生体試料を用いても測定値に違い（ばらつき）が生じる新たな課題に直面した。この原因を調査したところ、サンプルパッドにおけるＨｂ由来の色味が時間と共に変化するため、生体試料溶液の展開性によって測定値がばらつくことが判明した。そこで、発明者はサンプルパッドに特定の構成を有する多孔質体を用いることで、サンプルパッドにおけるＨｂ由来の色味の経時変化を抑制することに成功した。また、サンプルパッドにおける生体試料溶液の保持量が向上し、生体試料をより高倍率に希釈しても測定可能であることを見出した。なお、生体試料をより高倍率に希釈することで、生体試料中の反応阻害物質の影響を低減でき、測定精度の更なる向上が期待できる。加えて、本発明者はさらにこの知見を基に、従来よりも測定精度の高い生体試料中に含まれる分析対象物質（特に、ＨｂＡ１ｃ）の測定方法、当該測定方法を用いるイムノクロマト試験片およびイムノクロマト試験片を含むキットの発明を完成させた。

すなわち代表的な本願発明は以下の通りである。
（１）サンプルパッド、コンジュゲーションパッド、メンブレン、吸収パッドが順に連接配置され、前記サンプルパッドは、保水率が２００ｗｔ％～１０００ｗｔ％、平均気孔径が２０μｍ～１００μｍである多孔質体からなる、イムノクロマト試験片、または前記イムノクロマト試験片、生体試料希釈液およびイムノクロマトリーダーおよび／または反射光測定装置を含む、イムノクロマト測定キットを用い、下記（ｉ）から（ｉｉｉ）の工程を順に経て、生体試料中のヘモグロビンおよび分析対象物質を定量する方法。
工程（ｉ）：生体試料と生体試料希釈液とを体積比１：１００～１：１０００で混合して生体試料溶液を調製する工程
工程（ｉｉ）：前記生体試料溶液を、サンプルパッドに点着する工程
工程（ｉｉｉ）：サンプルパッドの色味からヘモグロビンを比色定量する工程、およびメンブレン部のラインの色味から分析対象物質を比色定量する工程
（２）前記サンプルパッドは、ポリエチレン、ポリビニルアルコール、エチレン／酢酸ビニル共重合体、ポリウレタン、ポリ塩化ビニルからなる群から選ばれる１種以上である、（１）に記載の方法。
（３）前記分析対象物質は、ヘモグロビンＡ１ｃである、（１）または（２）に記載の方法。

本発明のイムノクロマト試験片は、特定の構成を有するサンプルパッドを使用しているので、生体試料中のＨｂをサンプルパッド部で、またＨｂＡ１ｃをメンブレン部でそれぞれ高精度かつ定量的に測定することができる。

本発明で使用するイムノクロマト試験片の一例を示す（上面）図である。本発明で使用するイムノクロマト試験片の一例を示す（側面）図である。本発明で使用する反射光測定装置の一例を示す（内部）図である。本発明で使用する反射光測定装置の一例を示す（外部）図である。本発明のイムノクロマト試験片を用いた、Ｈｂの測定結果を示すグラフである。本発明のイムノクロマト試験片を用いた、ＨｂＡ１ｃの測定結果を示すグラフである。

本発明のイムノクロマト試験片の形態は特に限定されない。例えば、イムノクロマト試験片の生体試料溶液の点着部（滴下部）を上流側として、前記点着部を有するサンプルパッド、コンジュゲーションパッド、メンブレン、吸収パッドの順に連接されたイムノクロマト試験片が挙げられる。

次いで、本発明のイムノクロマト試験片の一例を、図面を参照して説明する。図１、２において、１はメンブレン、２はサンプルパッド、３はコンジュゲーションパッド、４は吸収パッド、７は粘着シートを示す。

図１、２の例では、イムノクロマト試験片は、幅４ｍｍ程度、長さ６０ｍｍ程度の細長い短冊状の形態をしている。なお、イムノクロマト試験片のコンジュゲーションパッド３には分析対象物質を特異的に識別する検出抗体と標識物質が坦持されている。また、メンブレン１の上流側の端部から下流側に向かって約１０ｍｍの位置に分析対象物質を特異的に識別する捕捉抗体を線状に固定化したテストライン５が形成されている。さらに、前記端部から約１５ｍｍの位置には標識物質を特異的に認識する抗体を線状に固定したコントロールライン６が形成されている。

本発明において、サンプルパッド２は、多孔質体を用いることが好ましい。ここでいう多孔質体とは、粒子充填体、３次元網目構造体（スポンジ体）などを指すが、スポンジ体が好ましい。スポンジ体は、後述する保水率や平均細孔径において場所斑を小さくすることができるメリットがある。

本発明において、前記多孔質体は、保水率が２００ｗｔ％～１０００ｗｔ％である。保水率が小さすぎると、サンプルパッドにおいて比色定量する際の色味が薄くなり、特に低濃度の定量が難しくなる。一方、保水率が大きすぎると、生体試料溶液の下流への展開が阻害されるだけでなく、一度展開した生体試料溶液が逆流してサンプルパッドでのＨｂ測定を阻害する。また、サンプルパッドを構成する材料としてよく用いられてきた、セルロース製ろ紙やガラス製ろ紙を本発明に用いると、前記特性が均一ではないため測定箇所によるばらつきが大きくなる。保水率は、より好ましくは２５０ｗｔ％～１０００ｗｔ％である。

前記保水率とは、多孔質体の質量に対する含浸させた水分の質量の割合を示し、４ｍｍ×４ｍｍのサイズにカットした多孔質体の質量（Ｍ１）を測定し、前記多孔質体を蒸留水中に１０分間浸漬したものの質量（Ｍ２）を測定し、下記式にて算出される値である。
保水率（％）＝｛（Ｍ２－Ｍ１）／Ｍ１｝×１００

本発明において、前記多孔質体の気孔率は６０％～９５％が好適である。気孔率が小さすぎると吸収可能な生体試料溶液の量が低下し、例えばサンプルパッドにおいて比色定量する際の色味が薄くなり、特に低濃度の定量が困難となる恐れがある。一方、気孔率が大きすぎると実用的強度に乏しくなることがある。

前記気孔率とは、乾燥機で乾燥された乾燥状態の多孔質体の真体積を乾式自動密度計にて測定し、多孔質体の見掛け体積と真体積とから、下記式にて算出される値である。
気孔率（％）＝（見掛け体積－真体積）／見掛け体積×１００

本発明において、前記多孔質体の平均気孔径は２０μｍ～１００μｍである。平均気孔径が小さすぎると、毛細管現象による生体試料溶液の吸水が進みすぎ、下流のコンジュゲーションパッド、メンブレン、吸収パッドへの展開が阻害されるだけでなく、一度展開した生体試料溶液が逆流する。一方、平均気孔径が大きすぎると、構造の均一性が損なわれ、測定箇所によるばらつきが大きくなる。平均気孔径は、より好ましくは２５μｍ～８０μｍである。

前記平均気孔径は、水銀ポロシメーターを用いて後述するような条件で測定し、得られた気孔径分布曲線より見積もることができる。

本発明において、前記多孔質体を構成する材料は特に限定されないが、適度な親水性を有する（特定の接触角を有する）材料からなることが好ましい。疎水性や撥水性の強い材料を用いると、試験片として使用するにあたり湿潤化の前処理が必要になるし、逆に親水性の強い材料を用いると、細孔径にもよるが生体試料溶液の下流側への展開が進まないことがある。好ましい材料として、具体的には、ポリエチレン（水に対する接触角：７０～８３ｄｅｇ）、ポリプロピレン（水に対する接触角：およそ９１ｄｅｇ）、エチレン／酢酸ビニル共重合体（水に対する接触角：およそ８０ｄｅｇ）、ポリウレタン（水に対する接触角：８８～９６ｄｅｇ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ、水に対する接触角：およそ３６ｄｅｇ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ、水に対する接触角：およそ８７ｄｅｇ）から選ばれる１つ以上からなることが好ましい。

本発明において、コンジュゲーションパッド３としては、検出試薬を乾燥状態で保持することができ、かつ生体試料溶液の展開と共に検出試薬を速やかに放出することができる材質のものであれば良く、特に制限されないが、ガラスファイバー、セルロース製のろ紙、ポリエステル製の不織布などが挙げられる。

本発明において、吸収パッド４としては、生体試料溶液を速やかに吸収、保持できる材質のものであればよく、特に限定されないが、セルロース製のろ紙や不織布が挙げられる。

本発明において、メンブレン１としては、特に限定されないが、セルロース、セルロース誘導体、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロンが挙げられる。これらの材質で構成された膜、布帛、繊維状又は不織布状マトリックス等が好適である。

本発明において、生体試料は特に限定されない。例えば、血液、リンパ液、髄液、汗、尿、涙液、唾液、皮膚、粘膜、毛髪等などの生体試料を例示することができる。血液においては、全血のほか、血液を遠心分離して得られた血清、血球または血漿を試料とすることができる。また、生体試料はヒト由来に限らず、イヌ、ネコ、ウシ等の哺乳動物由来の生体試料も対象である。

本発明のイムノクロマト試験片の製造方法は、従来公知の方法を用いればよい。以下、イムノクロマト試験片の製造方法について詳述するが、本発明を何ら限定するものではない。

コンジュゲーションパッドは、シート状のガラスファイバーに一定量の検出抗体および標識物質を均一に塗布、噴霧または含浸した後、恒温槽内で適当な温度で一定時間乾燥することで作製することが出来る。検出抗体および標識物質の塗布量は特に限定されないが、好ましくはライン長１ｃｍ辺り５μＬ～５０μＬである。

前記コンジュゲーションパッドの乾燥温度は特に限定されないが、好ましくは２０℃～８０℃である。乾燥時間は乾燥温度によって異なるが、通常は５分～１２０分間である。

メンブレンは、テストラインを形成する捕捉抗体（例えば、抗Ｈｂ抗体）とコントロールラインを形成する捕捉抗体（例えば、抗ビオチン抗体）を、それぞれ線上に一定量を異なる位置に塗布した後、恒温槽内で適当な温度で一定時間乾燥することで作製することが出来る。テストラインを形成する捕捉抗体とコントロールラインを形成する捕捉抗体の塗布量は特に限定されないが、好ましくはライン長１ｃｍ辺り０．１μＬ～２μＬである。また、テストラインを形成する捕捉抗体とコントロールラインを形成する捕捉抗体の塗布濃度も特に限定されないが、好ましくは２．０ｍｇ／ｍＬ～０．１ｍｇ／ｍＬである。

前記メンブレンの乾燥温度は特に限定されないが、好ましくは２０℃～８０℃である。乾燥時間は乾燥温度によって異なるが、通常は５分～１２０分間である。

前記調製したメンブレン１を粘着シート７の中程の位置に貼着し、コンジュゲーションパッド３をメンブレン１の末端の上に一部重ね合わせて連接するとともに、吸収パッド４をメンブレン１の逆側の末端上に一部重ね合わせて連接し、さらにコンジュゲーションパッド３の上流側末端にサンプルパッド２の一部が重なるようにして連接することでイムノクロマト試験片を作製することができる。なお、テストライン５およびコントロールライン６は試験片を作製した後に調製してもよいし、試験片を作製する前に調製してもよい。

本発明において、イムノクロマト分析キットは、生体試料を前処理および／または希釈するための生体試料希釈液、イムノクロマト試験片およびイムノクロマトリーダーおよび／または反射光測定装置を含む。

前記生体試料希釈液は、生体試料を展開させるための展開液として使用することができる。生体試料希釈液は、生体試料の展開性を向上させ、かつ免疫反応に影響しないノニオン性界面活性剤を含んでいてもよい。

前記ノニオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アルキルグルコシド、ショ糖脂肪酸エステル等が挙げられる。また、前記界面活性剤は単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。

前記ノニオン性界面活性剤の濃度としては、好ましくは０．０１ｗｔ％～５．０ｗｔ％である。

前記生体試料希釈液にはさらに、無機塩類やｐＨ調整に用いる緩衝剤を添加しても良い。前記緩衝剤としては、目的とするｐＨ範囲において充分な緩衝能力を有していれば、いかなる種類の緩衝剤を用いてもよく、例えば、トリス、リン酸、フタル酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、ホウ酸、酒石酸、酢酸、炭酸、グッドバッファー（ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミン塩酸、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド、ビシン）等が挙げられる。

本発明において、前記イムノクロマト試験片は、生体試料溶液を点着（滴下）するための第一の開口部、サンプルパッド部にＨｂを測定するための第二の開口部、メンブレン部（少なくともテストラインとコントロールラインを測定できる範囲）に分析対象物質と標識物質を測定するための第三の開口部を有する適当なプラスチック製のハウジングケースに収容しても良い。なお、第一の開口部と第二の開口部は一体になっていてもよい。

本発明において、サンプルパッド部で測定する項目はＨｂであり、メンブレン部で測定する項目は、特に限定されないが、ＨｂＡ１ｃ、尿中アルブミン、シスタチンＣ、Ｃ反応性タンパク、プロカルシトニン、ヒト脳性ナトリウム利尿ペプチド、心筋トポロニンＩ、ミオグロビン、心臓由来脂肪酸結合タンパク、フィブリン分解物、α－フェトプロテイン、前立腺特異抗原、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、便潜血、甲状腺ホルモン、ガン抗原１２５、ガン胎児性抗原、フェリチン、ＩｇＥ抗原、インスリンなどが挙げられる。これらの中でも、ＨｂＡ１ｃが好ましい。以下、サンプルパット部で測定する項目がＨｂで、かつメンブレン部で測定する項目がＨｂＡ１ｃの場合について詳述するが、本発明を何ら限定するものではない。

テストラインを形成する捕捉抗体としては、分析対象物質がＨｂＡ１ｃの場合は、Ｈｂを特異的に認識する抗体（以下、抗Ｈｂ抗体と略す場合がある）、またはＨｂＡ１ｃを特異的に認識する抗体（以下、抗ＨｂＡ１ｃ抗体と略す場合がある）が好ましく、より好ましくは抗Ｈｂ抗体である。抗Ｈｂ抗体または抗ＨｂＡ１ｃ抗体は、市販されているものがあればそれを用いても良いし、別途公知の方法で製造しても良い。分子サイズも特に制限されない。

検出抗体としては、分析対象物質がＨｂＡ１ｃの場合は、抗Ｈｂ抗体と検出粒子の複合体、または抗ＨｂＡ１ｃ抗体と検出粒子の複合体が好ましく、より好ましくは抗ＨｂＡ１ｃ抗体と検出粒子の複合体である。なお、捕捉抗体が抗Ｈｂ抗体のとき検出抗体は抗ＨｂＡ１ｃ抗体と検出粒子の複合体であり、捕捉抗体が抗ＨｂＡ１ｃ抗体のとき検出抗体は抗Ｈｂ抗体と検出粒子の複合体である必要がある。抗Ｈｂ抗体または抗ＨｂＡ１ｃ抗体は、市販されているものがあればそれを用いても良いし、別途公知の方法で製造しても良い。分子サイズも特に制限されない。

コントロールラインを形成する捕捉抗体としては、標識物質を特異的に認識する抗体が好ましく、より好ましくはビオチンを特異的に認識する抗体（以下、抗ビオチン抗体と略す場合がある）である。抗ビオチン抗体は、市販されているものがあればそれを用いても良いし、別途公知の方法で製造しても良い。分子サイズも特に制限されない。例えば、Ａｎｔｉ－Ｂｉｏｔｉｎａｎｔｉｂｏｄｙ（ＧＥＮＥＴＥＸ社製）、Ａｎｔｉ－Ｂｉｏｔｉｎ，Ｇｏａｔ－Ｐｏｌｙ（ＢｅｔｈｙｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、ＩｇＧＦｒａｃｔｉｏｎＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＭｏｕｓｅＡｎｔｉ－Ｂｉｏｔｉｎ（岩井化学薬品社製）等が挙げられる。

標識物質としては、ビオチン標識タンパク質と検出粒子の複合体またはジゴキシゲニン標識タンパク質と検出粒子の複合体が好ましく、ビオチン標識タンパク質がより好ましい。

前記ビオチン標識タンパク質で用いるタンパク質の種類としては特に制限されないが、微生物由来タンパク質や動物由来タンパク質などが好ましく、微生物由来タンパク質としてはＢｌｏｃｋｉｎｇＰｅｐｔｉｄｅＦｒａｇｍｅｎｔ、動物由来タンパク質としてはウシ血清アルブミンまたはカゼインがより好ましい。これらのタンパク質は市販されているものがあればそれを用いても良いし、別途公知の方法で製造しても良い。分子サイズも特に制限されないが、平均分子量で１００ｋＤａ以下が好ましい。一般的にタンパク質の分子サイズが小さいほど検出粒子１粒子に対するタンパク質の結合量は増加するので、感度などの性能が高くなる。

前記ビオチン標識タンパク質のビオチンの標識方法は特に限定されないが、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド法を例示できる。Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド法を用いることでビオチンのカルボキシル基をＮ－ヒドロキシアミン系化合物と脱水縮合剤存在下で縮合反応し、選択的に活性化し、タンパク質のアミノ基とアミド結合を介して標識することができる。

前記縮合反応に使用するＮ－ヒドロキシアミン系化合物は、特に制限されないが、例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ－ヒドロキシノルボルネン－２，３－ジカルボン酸イミド、２－ヒドロキシイミノ－２－シアノ酢酸エチルエステル、２－ヒドロキシイミノ－２－シアノ酢酸アミド、Ｎ－ヒドロキシピペリジン、Ｎ－ヒドロキシフタルイミド、Ｎ－ヒドロキシイミダゾール、Ｎ－ヒドロキシマレイミド等が挙げられる。これら化合物を２種以上用いてもよい。中でも、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（以下、ＮＨＳと表記する場合がある）が、比較的安価で、入手し易いことやペプチド合成分野等で実績があることから、より好適である。

前記縮合反応に使用する脱水縮合剤としては、特に制限されないが、例えば１－エチル－３－ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（以下、ＥＤＣ・ＨＣｌと表記する場合がある）、１－シクロヘキシル－（２－モルホニル－４－エチル）－カルボジイミド・メソｐ－トルエンスルホネート等が挙げられる。中でもＥＤＣ・ＨＣｌがペプチド合成分野等で汎用的な水溶性縮合剤として実績があることから、より好適である。

前記ビオチン標識タンパク質におけるビオチンの導入量は、タンパク質とビオチンのモル比を調整することで制御することができる。感度などの性能を高めるためには、ビオチンの導入量は高いものが望ましい。より具体的には、タンパク質のモル数に対してビオチンのモル数が、１．０モル倍以上であることが好ましい。前記モル比は一例であるためタンパク質の種類や現実の感度に応じて適宜増減して良い。

前記ビオチン標識タンパク質と検出粒子の結合方法としては特に制限されないが、疎水結合による物理吸着、あるいは共有結合を介した結合方法が例示できる。疎水結合においてはビオチン標識タンパク質と検出粒子の表面層で直接的に結合するので、ビオチン標識タンパク質の等電点付近のｐＨで処理することが好ましい。共有結合においては、検出粒子表面の官能基によって、結合方法は異なるが、一例を挙げると検出粒子の表面に存在する官能基がアミノ基の場合は、前述したＮ－ヒドロキシスクシンイミド法を用いて結合することができる。

反応温度は、特に限定されない。好ましい下限は１０℃、好ましい上限は５０℃である。反応時間は反応温度によって異なり、特に限定されない。好ましい下限は１時間、好ましい上限は２４時間である。なお、反応液中に含まれる未反応のＮ－ヒドロキシアミン系化合物や脱水縮合剤は濾過や遠心分離などにより水溶媒から容易に分離することができる。

検出粒子としては特に制限されないが、着色粒子や蛍光粒子を用いることができる。着色粒子としては金属粒子、ラテックス粒子、セルロース粒子などを例示することができる。金属粒子としては金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、パラジウムコロイド、金ナノロッド、金ナノプレート、銀ナノプレートなどを例示することができる。金属粒子の粒径は特に制限されないが、粒径１ｎｍ～１００ｎｍのものが好ましい。ラテックス粒子としてはポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、アクリル酸重合体などの材質からなるものを例示することができ、粒径は特に制限されないが、粒径２５ｎｍ～５００ｎｍのものが好ましい。セルロース粒子は、粒径１００ｎｍ～５００ｎｍのものが好ましい。蛍光粒子は、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリビニルトルエン、シリカなどの材質からなるものを例示することができる。蛍光色素は、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、シアニン及びその誘導体などを例示することができる。これらの中でも、汎用性が高く、視認性に優れたラテックス粒子やセルロース粒子を用いることが好ましい。

本発明において、イムノクロマト試験片を用いてメンブレン上で分析対象物質の測定を行う方法は特に限定されない。例えば、分析対象物質がＨｂＡ１ｃの場合は、以下の方法が例示される。まず、生体試料を必要に応じて生体試料希釈液と混合して展開可能な混合液（生体試料溶液）を得た後、当該混合液をサンプルパッド２に滴下する。当該混合液は、サンプルパッド２を通過してコンジュゲーションパッド３に展開される。前記混合液は、コンジュゲーションパッド３に坦持された検出抗体および標識物質を溶解しながら、ＨｂＡ１ｃと検出抗体（抗ＨｂＡ１ｃ抗体と検出粒子の複合体）が免疫複合体を形成しメンブレンに展開される。その後、さらに毛細管現象によって吸収パッド４側に流れる。前記混合液がメンブレンのテストライン５に到達すると、前記免疫複合体は捕捉抗体（抗Ｈｂ抗体）で捕捉され集積し、テストライン５が発色する。その後、標識物質を含む混合液はテストライン５を通過してコントロールライン６に到達する。ここで標識物質は捕捉抗体（抗ビオチン抗体）で捕捉され集積し、コントロールライン６が発色する。他の混合液は最終的に吸収パッドで吸収される。テストライン５とコントロールライン６の発色強度を、イムノクロマトリーダー等を使用して測定することで分析対象物質の濃度を測定することができる。

本発明において、イムノクロマト試験片のサンプルパッド部でＨｂの測定を行う方法は特に限定されない。例えば、図３および図４に示す反射光測定装置８を用いる方法が例示される。反射光測定装置８は、イムノクロマト試験片１２を装着部９に固定でき、かつ、固定したイムノクロマト試験片１２のサンプルパッドに光を照射することができる反射光測定装置であって、さらに、発光素子１０より照射した光がサンプルパッドで反射した光を受光できるように受光素子１１を配置してあり、得られた測光値を経時的に測定することができるようになっている。サンプルパッド部に展開した生体試料溶液の呈色度合いを反射光として測定することでＨｂ濃度を測定することができる。その他、ＣＣＤ、Ｃ－ＭＯＳなどを用いた画像解析システムも好適に使用することができる。

本発明において、Ｈｂ測定用の反射光測定装置とＨｂＡ１ｃ測定用のイムノクロマトリーダーは上記のように独立した装置を用いても良いし、これらが一体型となった装置を用いても良い。また、測定の順番はＨｂが先であっても良いし、ＨｂＡ１ｃが先であっても良い。

以下、本発明を実施例に基づいてさらに説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。

（保水率の測定）
保水率は、４ｍｍ×４ｍｍのサイズにカットした多孔質体の質量（Ｍ１）、および前記多孔質体を蒸留水中に１０分間浸漬した後の質量（Ｍ２）から、下記式にて算出した。
保水率（％）＝｛（Ｍ２－Ｍ１）／Ｍ１｝×１００

（平均気孔径の測定）
多孔質体を１２０℃で４時間恒温乾燥したものを下記の測定に用いた。
測定：水銀圧入法により気孔径０．００１８～１００μｍの気孔径分布を求めた。
気孔径はＷａｓｈｂｕｒｎの式を用いて算出した。
Ｗａｓｈｂｕｒｎの式：Ｄ=－４γcosθ／Ｐ
Ｐ：圧力（Ｐａ） γ：水銀の表面張力（Ｎ／ｍ）
Ｄ：気孔直径（ｍ） θ：水銀と多孔質体との接触角（ｄｅｇ）
測定条件：多孔質体と水銀の接触角：１４０ｄｅｇ
水銀の表面張力０．４８Ｎ／ｍ（１ｄｙｎｅ＝１０^－５Ｎで換算）
測定装置：オートポアＩＶ９５２０（ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ社製）
測定数：ｎ＝３⇒これらの平均値を気孔径とした。
なお、本発明において、気孔径とは、測定圧力から得られた気孔分布曲線において次のように定義した値である。気孔分布曲線におけるメジャーなピークの極大値を本発明の気孔径と定義した。

（気孔率の測定）
気孔率は、乾燥機で乾燥した多孔質体の真体積を乾式自動密度計にて測定し、多孔質体の見掛け体積と真体積とから、下記式にて算出した。
気孔率（％）＝（見掛け体積－真体積）／見掛け体積×１００

（実施例１）
（１）検出抗体（抗ＨｂＡ１ｃ抗体と検出粒子の複合体）の調製
５μＬの１０％ラテックス粒子（Ｋ０１６、Ｍｅｒｋｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に４５μＬの５０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．５）を添加し、１％ラテックス溶液を調製した。市販の抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体（製品名：ＨｕｍａｎＨｂＡ１ｃｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ、ｃｌｏｎｅ１Ｄ３、品番：ＭＡＢ００３０－ＭＯ６Ａ、Ａｂｎｏｖａ社製）を５０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．５）で１．０ｍｇ／ｍＬに調製した。５μＬの抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体溶液を１％ラテックス粒子溶液に加え、ボルテックスで撹拌した後、室温で1時間静置した。１０μＬの０．３ｗｔ％ＢｌｏｃｋｉｎｇＰｅｐｔｉｄｅＦｒａｇｍｅｎｔ（東洋紡社製）（以下、ＢＰＦと略す場合がある）と１．０ｗｔ％ＰＥＧ水溶液（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）（以下、ＰＥＧと略す場合がある）を加え、ボルテックスで撹拌した後、1時間室温で静置した。その後、９,３００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除去した。２００μＬの０．３ｗｔ％ＢＰＦと１．０ｗｔ％ＰＥＧ水溶液を加え、ボルテックスで撹拌した後、室温で1時間静置した。９,３００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除去した。５０μＬの０．３ｗｔ％ＢＰＦ＋１．０ｗｔ％ＰＥＧ水溶液を加え、ボルテックスで撹拌し検出抗体を調製した。

（２）標識物質の調製
３．１５ｍｇのＤ－ビオチン（ナカライテスク社製）を７２μＬの蒸留水で溶解した。また、１０ｍｇの１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ナカライテスク社製）と１０ｍｇのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ナカライテスク社製）を１００μＬの蒸留水に溶解した。これにＤ－ビオチン溶液を加え、室温で１時間緩やかに攪拌した。前記溶液に８０μＬの３ｗｔ％ＢＰＦ溶液を加え３０分間室温で静置し、ビオチン標識ＢＰＦ溶液を調製した。次に、５μＬの１０％ラテックス粒子に４５μＬの５０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．５）を添加し、１％ラテックス溶液を調製した。１５μＬのビオチン標識ＢＰＦ溶液を１％ラテックス溶液に加え、ボルテックスで撹拌した後、室温で1時間静置した。２００μＬの０．３ｗｔ％ＢＰＦと１．０ｗｔ％ＰＥＧ２００００水溶液を加え、ボルテックスで撹拌した後、1時間室温で静置した。その後、９,３００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除去した。２００μＬの０．３ｗｔ％ＢＳＡと１．０ｗｔ％ＰＥＧ水溶液を加え、ボルテックスで撹拌した後、1時間室温で静置した。９,３００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除去した。５０μＬの０．３ｗｔ％ＢＰＦと１．０ｗｔ％ＰＥＧ水溶液を加え、ボルテックスで撹拌し、標識物質を調製した。

（３）ＨｂＡ１ｃ測定用メンブレンの作製
２５ｍｍ×１５０ｍｍのニトロセルロースメンブレン（商品名：Ｈｉ－ＦｌｏｗＰｌｕｓタイプＨＦ１２０（Ｍｅｒｋｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製））の上流側から１０ｍｍの位置にライン幅約１ｍｍのテストラインとして、１．０ｍｇ／ｍＬの捕捉抗体：抗Ｈｂモノクローナル抗体（製品名：Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎａｎｔｉｂｏｄｙ、品番：７０Ｒ－７５８０、Ｆｉｔｇｅｒａｌｄ社製）溶液を、イムノクロマトディスペンサー（ＢＩＯＤＯＴ社製）を用いて１．０μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。次に、ニトロセルロースメンブレンの上流側から１５ｍｍの位置にライン幅約１ｍｍのコントロールラインとして、１．０ｍｇ／ｍＬの抗ビオチンモノクローナル抗体（製品名：Ａｎｔｉ－Ｂｉｏｔｉｎａｎｔｉｂｏｄｙ、品番：ＧＴＸ４４３４４、ＧＥＮＥＴＥＸ社製）溶液をイムノクロマトディスペンサー（ＢＩＯＤＯＴ社製）を用いて１．０μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。その後、４０℃で３０分乾燥し、ＨｂＡ１ｃ測定用メンブレンを作製した。

（４）ＨｂＡ１ｃ測定用コンジュゲーションパッドの作製
１０ｍｍ×１５０ｍｍのコンジュゲーションパッド（ＧＬＡＳＳＦＩＢＥＲＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＰＡＤＧＦＤＸ（Ｍｅｒｋｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製））に前記検出抗体と標識物質の混合液（混合比６：１）２２５μＬをイムノクロマトディスペンサー（ＢＩＯＤＯＴ社製）を用いて１５μＬ／ｃｍになるように均一に噴霧した。その後、４０℃で３０分乾燥し、ＨｂＡ１ｃ測定用コンジュゲーションパッドを作製した。

（５）イムノクロマト試験片の作製
イムノクロマト試験片は、イムノクロマトグラフで一般的に使用される構成で作製した。具体的には、サンプルパッド（商品名ピオラスシートＥＶＡ厚さ１ｍｍ（アイオン社製））、前記ＨｂＡ１ｃ測定用コンジュゲーションパッド、前記ＨｂＡ１ｃ測定用メンブレン、吸収パッド（ＣＥＬＬＵＬＯＳＥＦＩＢＥＲＳＡＭＰＬＥＰＡＤＳＣＦＳＰ（Ｍｅｒｋｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製））を、各々端部が一部重なるように連接配置し、幅４ｍｍ、長さ６０ｍｍのイムノクロマト試験片を作製した。用いたサンプルパッドの保水率は３４０ｗｔ％、気孔率は７７％、平均気孔径は２５μｍであった。

（６）Ｈｂ試料の調製
市販のＨｂ標準物質である総ヘモグロビン常用参照標準物質ＪＣＣＲＭ９１２－２（一般社団法人検査医学標準物質機構社製）３水準を生体試料希釈液（５０ｍＭＰＢＳ、ｐＨ７．４＋１．０ｗｔ％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）で５００倍に希釈し、ＨｂＡ１ｃ（％）が５．２％で、Ｈｂ濃度が０．１５６ｇ／Ｌ、０．２７４ｇ／Ｌ、０．３５９ｇ／Ｌの各Ｈｂ試料（３水準）を調製した。

（７）ＨｂＡ１ｃ試料の調製
市販のＨｂＡ１ｃ標準物質であるＨｂＡ１ｃ測定性能評価用試料ＱＲＭＨｂＡ１ｃ２００７－１（一般社団法人検査医学標準物質機構社製）４水準を生体試料希釈液（５０ｍＭＰＢＳ、ｐＨ７．４＋１．０ｗｔ％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）で５００倍に希釈しＨｂ濃度が０．３２０ｇ／Ｌで、ＨｂＡ１ｃ（％）が５．２９％、６．９６％、９．０８％、１０．７９％の各ＨｂＡ１ｃ試料（４水準）を調製した。

（８）Ｈｂ濃度（ｇ／Ｌ）の検量線の作成
得られたイムノクロマト試験片を水平な台に設置した。次に、前記Ｈｂ試料（３水準）１００μＬをマイクロピペットで分取し、サンプルパッドに緩やかに滴下した。滴下してから１分後、サンプルパッド部のＨｂを反射光測定装置を用いて測定した。結果、Ｈｂ濃度に応じた反射吸光度を確認することができた。Ｈｂ測定の結果（ｎ＝１０の平均値）を表１に示す。また、Ｈｂ濃度（Ｘ軸）と反射吸光度（Ｙ軸）の相関性からＨｂの検量線を作成した。結果を図５に示す。
Ｈｂの検量線はＹ＝３８８Ｘ＋０．６１３となった。なお、測定の感度はＨｂ試料の高濃度品（０．３５９ｇ／Ｌ）の反射吸光度と、低濃度品（０．１５６ｇ／Ｌ）の反射吸光度の差：ΔＨｂで評価し、ΔＨｂ＞５０ｍＡｂｓをｇｏｏｄ、１０ｍＡｂｓ≦ΔＨｂ≦５０ｍＡｂｓをａｖｅｒａｇｅ、ΔＨｂ＜１０ｍＡｂｓをｂａｄとした。また、測定の再現性は、反射吸光度のｎ＝１０のＣＶ（％）で評価し、ＣＶ（％）＜５％をｇｏｏｄ、５％≦ＣＶ（％）≦１０％をａｖｅｒａｇｅ、ＣＶ（％）＞１０％をｂａｄとした。
さらに、測定の安定性はＨｂ試料の高濃度品（０．３５９ｇ／Ｌ）の反射吸光度を経時的に測定し、１０分後の反射吸光度と、１分後の反射吸光度の差：Δ１０で評価し、Δ１０＜２０ｍＡｂｓをｇｏｏｄ、２０ｍＡｂｓ≦Δ１０≦３０ｍＡｂｓをａｖｅｒａｇｅ、Δ１０＞３０ｍＡｂｓをｂａｄとした。
これらの結果、実施例１のイムノクロマト試験片は、感度：ΔＨｂ＝８０ｍＡｂｓでｇｏｏｄ、再現性：ＣＶ（％）＝３％でｇｏｏｄ、安定性：Δ１０＝１５ｍＡｂｓでｇｏｏｄと、良好であった。

（９）ＨｂＡ１ｃ（％）の検量線の作成
得られたイムノクロマト試験片を水平な台に設置した。次に、ＨｂＡ１ｃ試料（４水準）１００μＬをマイクロピペットで分取し、サンプルパッドに緩やかに滴下した。滴下してから１０分後、メンブレン上のテストラインとコントロールラインをイムノクロマトリーダー（浜松ホトニクス社製：Ｃ１００６０－１０）を用いて測定した。結果、テストライン（Ｔ）はＨｂＡ１ｃ濃度に応じた反射吸光度を確認することができた。また、コントロールライン（Ｃ）はＨｂＡ１ｃ濃度に依存せず一定の反射吸光度を確認することができた。テストラインの反射吸光度をコントロールラインの反射吸光度で割算し、補正値（Ｔ／Ｃ）とした。ＨｂＡ１ｃ測定値(テストライン測定値)、コントロールライン測定値、補正値の結果（ｎ＝１０の平均値）を表２に示す。また、ＨｂＡ１ｃ濃度（Ｘ軸）と補正値（Ｙ軸）の相関性からＨｂＡ１ｃの検量線を作成した。結果を図６に示す。
ＨｂＡ１ｃの検量線はＹ＝０．０５１９Ｘ＋０．０９４５となった。なお、測定の感度はＨｂＡ１ｃ試料の高濃度品（１０．７９％）のテストラインの反射吸光度と、低濃度品（５．２９％）のテストラインの反射吸光度の差：ΔＨｂＡ１ｃで評価し、ΔＨｂＡ１ｃ＞１００ｍＡｂｓをｇｏｏｄ、５０ｍＡｂｓ≦ΔＨｂＡ１ｃ≦１００ｍＡｂｓをａｖｅｒａｇｅ、ΔＨｂＡ１ｃ＜５０ｍＡｂｓをｂａｄとした。
これらの結果、実施例１のイムノクロマト試験片は、感度：ΔＨｂＡ１ｃ＝１２５ｍＡｂｓでｇｏｏｄであった。

（実施例２）
サンプルパッドとして、ポリエチレン製の多孔質シート（商品名：ピオラスシートＰＥ厚さ１ｍｍ（アイオン社製））を用いた以外は、実施例１と同様にしてイムノクロマト試験片を作製した。サンプルパッドの保水率は２９０ｗｔ％、気孔率は７４％、平均気孔径は２５μｍであった。
Ｈｂ測定の結果は、感度：ΔＨｂ＝６０ｍＡｂｓでｇｏｏｄ、再現性：ＣＶ（％）＝４％でｇｏｏｄ、安定性：Δ１０＝１８ｍＡｂｓでｇｏｏｄであった。また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果は、感度：ΔＨｂＡ１ｃ＝１０５ｍＡｂｓでｇｏｏｄであった。

（実施例３）
サンプルパッドとして、ウレタン製の多孔質シート（商品名：ＡＣスポンジＵ厚さ１ｍｍ（エー・シーケミカル社製））を用いた以外は、実施例１と同様にしてイムノクロマト試験片を作製した。サンプルパッドの保水率は３５０ｗｔ％、気孔率は８５％、平均気孔径は６０μｍであった。
Ｈｂ測定の結果は、感度：ΔＨｂ＝９０ｍＡｂｓでｇｏｏｄ、再現性：ＣＶ（％）＝４％でｇｏｏｄ、安定性：Δ１０＝１５ｍＡｂｓでｇｏｏｄであった。また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果は、感度：ΔＨｂＡ１ｃ＝１４０ｍＡｂｓでｇｏｏｄであった。

（実施例４）
サンプルパッドとして、ポリ塩化ビニル製の多孔質シート（商品名：ＡＣスポンジＶ厚さ１ｍｍ（エー・シーケミカル社製））を用いた以外は、実施例１と同様にしてイムノクロマト試験片を作製した。サンプルパッドの保水率は４００ｗｔ％、気孔率は７５％、平均気孔径は６０μｍであった。
Ｈｂ測定の結果は、感度：ΔＨｂ＝７０ｍＡｂｓでｇｏｏｄ、再現性：ＣＶ（％）＝４％でｇｏｏｄ、安定性：Δ１０＝１７ｍＡｂｓでｇｏｏｄであった。また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果は、感度：ΔＨｂＡ１ｃ＝１１０ｍＡｂｓでｇｏｏｄであった。

（実施例５）
サンプルパッドとして、ポリエチレン製の多孔質シート（商品名：ＡＣスポンジＯ厚さ１ｍｍ（エー・シーケミカル社製））を用いた以外は、実施例１と同様にしてイムノクロマト試験片を作製した。サンプルパッドの保水率は２５０ｗｔ％、気孔率は７５％、平均気孔径は６０μｍであった。
Ｈｂ測定の結果は、感度：ΔＨｂ＝６０ｍＡｂｓでｇｏｏｄ、再現性：ＣＶ（％）＝４％でｇｏｏｄ、安定性：Δ１０＝１５ｍＡｂｓでｇｏｏｄであった。また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果は、感度：ΔＨｂＡ１ｃ＝１１０ｍＡｂｓでｇｏｏｄであった。

（実施例６）
サンプルパッドとして、ポリビニルアルコール製の多孔質シート（商品名：ベルクリン厚さ１ｍｍ（アイオン社製））を用いた以外は、実施例１と同様にしてイムノクロマト試験片を作製した。サンプルパッドの保水率は１０００ｗｔ％、気孔率は８９％、平均気孔径は８０μｍであった。
Ｈｂ測定の結果は、感度：ΔＨｂ＝１１０ｍＡｂｓでｇｏｏｄ、再現性：ＣＶ（％）＝７％でａｖｅｒａｇｅ、安定性：Δ１０＝８ｍＡｂｓでｇｏｏｄであった。また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果は、感度：ΔＨｂＡ１ｃ＝６０ｍＡｂｓでａｖｅｒａｇｅであった。

（実施例７）
実施例１において、Ｈｂ標準物質を生体試料希釈液で３００倍に希釈したもの、およびＨｂＡ１ｃ標準物質を生体試料希釈液で３００倍に希釈したものを用いた以外は、実施例１と同様にして実験を行った。
Ｈｂ測定の結果は、感度：ΔＨｂ＝２００ｍＡｂｓでｇｏｏｄ、再現性：ＣＶ（％）＝２％でｇｏｏｄ、安定性：Δ１０＝１８ｍＡｂｓでｇｏｏｄであった。また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果は、感度：ΔＨｂＡ１ｃ＝１１５ｍＡｂｓでｇｏｏｄであった。

（実施例８）
実施例１において、Ｈｂ標準物質を生体試料希釈液で１０００倍に希釈したもの、およびＨｂＡ１ｃ標準物質を生体試料希釈液で１０００倍に希釈したものを用いた以外は、実施例１と同様にして実験を行った。
Ｈｂ測定の結果は、感度：ΔＨｂ＝６０ｍＡｂｓでｇｏｏｄ、再現性：ＣＶ（％）＝４％でｇｏｏｄ、安定性：Δ１０＝５ｍＡｂｓでｇｏｏｄであった。また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果は、感度：ΔＨｂＡ１ｃ＝１２０ｍＡｂｓでｇｏｏｄであった。

（比較例１）
サンプルパッドとして、セルロース製のろ紙（ＣＥＬＬＵＬＯＳＥＦＩＢＥＲＳＡＭＰＬＥＰＡＤＳＣＦＳＰ（Ｍｅｒｋｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製））を用いた以外は、実施例１と同様にしてイムノクロマト試験片を作製した。
Ｈｂ測定の結果は、感度：ΔＨｂ＝２０ｍＡｂｓでａｖｅｒａｇｅ、再現性：ＣＶ（％）＝１２％でｂａｄ、安定性：Δ１０＝２５ｍＡｂｓでａｖｅｒａｇｅであった。また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果は、感度：ΔＨｂＡ１ｃ＝１１０ｍＡｂｓでｇｏｏｄであった。

（比較例２）
サンプルパッドとして、ガラス繊維製のろ紙（ＧＬＡＳＳＦＩＢＥＲＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＰＡＤＧＦＤＸ（Ｍｅｒｋｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製））を用いた以外は、実施例１と同様にしてイムノクロマト試験片を作製した。
Ｈｂ測定の結果は、感度：ΔＨｂ＝８ｍＡｂｓでｂａｄ、再現性：ＣＶ（％）＝１１％でｂａｄ、安定性：Δ１０＝２０ｍＡｂｓでａｖｅｒａｇｅであった。また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果は、感度：ΔＨｂＡ１ｃ＝１３０ｍＡｂｓでｇｏｏｄであった。

（比較例３）
比較例２において、Ｈｂ標準物質を生体試料希釈液で１０００倍に希釈したもの、およびＨｂＡ１ｃ標準物質を生体試料希釈液で１０００倍に希釈したものを用いた以外は、実施例１と同様にして実験を行った。
Ｈｂ測定の結果は、感度：ΔＨｂ＝５ｍＡｂｓでｂａｄ、再現性：ＣＶ（％）＝１３％でｂａｄ、安定性：Δ１０＝１７ｍＡｂｓでｇｏｏｄであった。また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果は、感度：ΔＨｂＡ１ｃ＝９０ｍＡｂｓでａｖｅｒａｇｅであった。

（比較例４）
サンプルパッドとして、ポリビニルアルコール製の多孔質シート（商品名：ＡＣスポンジＰ厚さ１ｍｍ（エー・シーケミカル社製））を用いた以外は、実施例１と同様にしてイムノクロマト試験片を作製した。サンプルパッドの保水率は１１００ｗｔ％、気孔率は９０％、平均気孔径は１３０μｍであった。
Ｈｂ測定の結果は、感度：ΔＨｂ＝１２０ｍＡｂｓでｇｏｏｄ、安定性：Δ１０＝１０ｍＡｂｓでｇｏｏｄであったものの、再現性：ＣＶ（％）＝１５％でｂａｄであった。また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果は、感度：ΔＨｂＡ１ｃ＝４０ｍＡｂｓでｂａｄであった。測定後のサンプルパッドは検出粒子の逆流により、少し青みがかっていた。

（比較例５）
サンプルパッドとして、ポリウレタン製の多孔質シート（商品名：ルビセルクリーンＲＫ厚さ０．８ｍｍ（ハーベスト社製））を用いた以外は、実施例１と同様にしてイムノクロマト試験片を作製した。サンプルパッドの保水率は４６０％、気孔率は８０％、平均気孔径は６μｍであった。
Ｈｂ測定の結果は、感度：ΔＨｂ＝１１０ｍＡｂｓでｇｏｏｄ、安定性：Δ１０＝１０ｍＡｂｓでｇｏｏｄであったものの、再現性：ＣＶ（％）＝１３％でｂａｄであった。また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果は、感度：ΔＨｂＡ１ｃ＝４０ｍＡｂｓでｂａｄであった。測定後のサンプルパッドは検出粒子の逆流により、少し青みがかっていた。

本発明により、簡便で測定精度の高いイムノクロマト試験片を提供することができる。

１：メンブレン
２：サンプルパッド
３：コンジュゲーションパッド
４：吸収パッド
５：テストライン
６：コントロールライン
７：粘着シート
８：反射光測定装置
９：装着部
１０：発光素子
１１：受光素子

Claims

サンプルパッド、コンジュゲーションパッド、メンブレン、吸収パッドが順に連接配置され、前記サンプルパッドは、保水率が２００ｗｔ％～１０００ｗｔ％、平均気孔径が２０μｍ～１００μｍである多孔質体からなる、イムノクロマト試験片、または前記イムノクロマト試験片、生体試料希釈液およびイムノクロマトリーダーおよび／または反射光測定装置を含む、イムノクロマト測定キットを用い、下記（ｉ）から（ｉｉｉ）の工程を順に経て、生体試料中のヘモグロビンおよび分析対象物質を定量する方法。
工程（ｉ）：生体試料と生体試料希釈液とを体積比１：１００～１：１０００で混合して生体試料溶液を調製する工程
工程（ｉｉ）：前記生体試料溶液を、サンプルパッドに点着する工程
工程（ｉｉｉ）：サンプルパッドの色味からヘモグロビンを比色定量する工程、およびメンブレン部のラインの色味から分析対象物質を比色定量する工程
前記サンプルパッドは、ポリエチレン、ポリビニルアルコール、エチレン／酢酸ビニル共重合体、ポリウレタン、ポリ塩化ビニルからなる群から選ばれる１種以上である、請求項１に記載の方法。
前記分析対象物質は、ヘモグロビンＡ１ｃである、請求項１または２に記載の方法。