WO2018181741A1 - イムノクロマト試験片およびキットおよび測定方法 - Google Patents

イムノクロマト試験片およびキットおよび測定方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2018181741A1
WO2018181741A1 PCT/JP2018/013311 JP2018013311W WO2018181741A1 WO 2018181741 A1 WO2018181741 A1 WO 2018181741A1 JP 2018013311 W JP2018013311 W JP 2018013311W WO 2018181741 A1 WO2018181741 A1 WO 2018181741A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pad
test piece
biological sample
hba1c
measurement
Prior art date
Application number
PCT/JP2018/013311
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
岡本　淳
裕 川南
真希子 平岡
圭三 米田
Original Assignee
東洋紡株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 東洋紡株式会社 filed Critical 東洋紡株式会社
Priority to JP2019510141A priority Critical patent/JP7131546B2/ja
Publication of WO2018181741A1 publication Critical patent/WO2018181741A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring a substance to be analyzed (particularly hemoglobin A1c) contained in a biological sample by an immunochromatography method, an immunochromatographic test piece used in the measuring method, and a kit containing an immunochromatographic test piece.
  • Hemoglobin A1c which is one of the diagnostic items for diabetes, is that sugar (glucose) is present in hemoglobin that plays a role in transporting oxygen in blood (hereinafter, abbreviated as Hb).
  • HbA1c sugar (glucose) is present in hemoglobin that plays a role in transporting oxygen in blood
  • Hb oxygen in blood
  • the valine residue located on the N-terminal side of the hemoglobin ⁇ chain refers to a glycated substance
  • the HbA1c concentration relative to the total Hb amount reflects the average blood glucose level over the past 1 to 2 months It is used to observe the long-term course of diabetes.
  • POCT is an abbreviation for Point Of Care Testing, and refers to a clinical test performed by a medical worker beside the subject. Unlike clinical tests performed in a central laboratory of a large-scale hospital or the like, POCT can obtain test results instantly, so POCT is also spreading in diabetes diagnosis.
  • a technique using an immunochromatography method is proposed in POCT for the purpose of measuring the concentration of HbA1c.
  • the immunochromatography method is an immunoassay method using a capillary phenomenon, and is widely used worldwide in pregnancy tests and influenza tests.
  • Conventional immunochromatography is generally performed by visual judgment (qualitative evaluation), but in recent years, a technique for quantifying the concentration of an analysis target substance contained in a biological sample using an analytical device such as a chromatographic reader is being developed. is there.
  • One of the methods for quantifying the concentration of an analyte using an immunochromatography method is a sandwich method using an antigen-antibody reaction.
  • sandwich method two types of antibodies having different epitopes with respect to the substance to be analyzed are used.
  • One antibody uses a detection antibody sensitized with detection particles such as gold colloid, colored latex or fluorescent particles.
  • detection particles such as gold colloid, colored latex or fluorescent particles.
  • the other antibody forms a test line as a capture antibody fixed linearly on the surface of the porous support.
  • an antibody that specifically recognizes the detection antibody is linearly fixed at a position different from the test line on the surface of the porous support to form a control line.
  • the analyte contained in the biological sample is developed from one end (upstream side) of the porous support, moves while forming an immune complex with the detection antibody, and is captured on contact with the capture antibody on the test line. Color develops.
  • the free detection reagent that has not formed an immune complex with the analyte is passed through the test line, captured by the control line antibody, and colored.
  • the concentration of the substance to be analyzed can be quantified using these color development intensities by using an apparatus such as a chromatographic reader.
  • Patent Documents 1 and 2 disclose techniques for measuring HbA1c concentration using an immunochromatography method.
  • the N-terminus (epitope) of the Hb ⁇ chain is exposed by contacting a reagent containing blood and a cyclic polysaccharide, and then immunoreacts with the Hb antibody labeled with detection particles (gold colloid or latex particles). Then, by developing on the antibody-immobilized membrane and detecting each immune complex reaching the anti-HbA1c antibody-immobilized part and the anti-HbA0-immobilized part, HbA1c (%) in the blood can be easily obtained.
  • the anti-Hb antibody sensitized to the detection particles performs an immune reaction not only with HbA1c and HbA0 but also with other Hb, there is a problem that the sensitivity decreases depending on the type of biological sample. Further, when two types of immune complexes are detected on the same membrane, there is a problem that the upstream immune reaction may affect the downstream immune reaction, resulting in a decrease in measurement accuracy.
  • Patent Document 3 discloses a technique for optically detecting Hb held on a sample pad and measuring a hematocrit value in a biological sample solution in an immunochromatography method.
  • the invention is expected to improve measurement accuracy because the upstream immune reaction does not affect the downstream immune reaction.
  • a glass fiber pad is used as the sample pad, and in a substrate generally used for a sample pad such as a glass fiber pad or a cellulose pad, the color derived from Hb with time. Therefore, there is a problem that the measurement accuracy is lowered due to the developability of the biological sample solution.
  • the amount of liquid that can hold the biological sample solution in the sample pad is small, there is a problem that the sensitivity is insufficient particularly when the dilution rate of the biological sample solution is high.
  • JP 2012-251789 A Japanese Patent Laying-Open No. 2015-158515 WO2013 / 147200 publication
  • the present invention provides a method for measuring a substance to be analyzed (particularly HbA1c) contained in a biological sample with higher measurement accuracy than before, an immunochromatographic test piece and an immunochromatographic test piece used in the measuring method. It is an object to provide a kit including the same.
  • the present inventor measured Hb at the sample pad portion and measured the analysis target substance (particularly, HbA1c) at the membrane portion in the immunochromatographic test piece. It was found that Hb and the substance to be analyzed (particularly HbA1c) can be accurately measured without being affected by the type of the substance and the concentration of the substance to be analyzed in the biological sample.
  • the present inventor further has a method for measuring a substance to be analyzed (particularly HbA1c) contained in a biological sample with higher measurement accuracy than before, an immunochromatographic test strip and an immunochromatographic test using the measuring method.
  • the invention of a kit including a piece was completed.
  • sample pad in which a sample pad, a conjugation pad, a membrane, and an absorption pad are sequentially connected, and the sample pad has a water retention rate of 200 wt% to 1000 wt% and an average pore diameter of 20 ⁇ m to 100 ⁇ m.
  • a test piece made of a porous material.
  • the sample pad is at least one selected from the group consisting of polyethylene, polyvinyl alcohol, ethylene / vinyl acetate copolymer, polyurethane, and polyvinyl chloride.
  • An immunochromatographic measurement kit comprising the immunochromatographic test strip according to (1) or (2), a biological sample diluent, an immunochromatographic reader, and / or a reflected light measuring device.
  • the following steps (i) to (iii) are sequentially performed, and hemoglobin in the biological sample And a method for quantifying an analyte.
  • the analyte is hemoglobin A1c
  • the immunochromatographic test piece of the present invention uses a sample pad having a specific configuration, it is possible to measure Hb in a biological sample with a sample pad part and HbA1c with a membrane part with high accuracy and quantitative measurement. it can.
  • the form of the immunochromatographic test piece of the present invention is not particularly limited.
  • 1 is a membrane
  • 2 is a sample pad
  • 3 is a conjugation pad
  • 4 is an absorption pad
  • 7 is an adhesive sheet.
  • the immunochromatographic test piece is in the form of an elongated strip having a width of about 4 mm and a length of about 60 mm.
  • the conjugation pad 3 of the immunochromatographic test piece carries a detection antibody and a labeling substance that specifically identify the substance to be analyzed.
  • a test line 5 in which a capture antibody that specifically identifies an analyte to be analyzed is linearly immobilized is formed at a position of about 10 mm from the upstream end of the membrane 1 toward the downstream side.
  • a control line 6 in which an antibody that specifically recognizes the labeling substance is linearly fixed is formed at a position about 15 mm from the end.
  • the sample pad 2 is preferably a porous body.
  • the porous body refers to a particle packed body, a three-dimensional network structure (sponge body), and the like, and a sponge body is preferable.
  • the sponge body has an advantage that the spot spots can be reduced in the water retention rate and the average pore diameter described later.
  • the porous body has a water retention rate of 200 wt% to 1000 wt%. If the water retention rate is too small, the color at the time of colorimetric quantification in the sample pad will be light, and it will be particularly difficult to determine the low concentration. On the other hand, if the water retention rate is too large, not only the development of the biological sample solution downstream is inhibited, but also the biological sample solution developed once flows backward to inhibit the Hb measurement on the sample pad. Further, when cellulose filter paper or glass filter paper, which has been often used as a material constituting the sample pad, is used in the present invention, the above characteristics are not uniform, so that the variation depending on the measurement location increases.
  • the water retention rate is more preferably 250 wt% to 1000 wt%.
  • the water retention rate is the ratio of the mass of impregnated water to the mass of the porous body, the mass (M1) of the porous body cut to a size of 4 mm ⁇ 4 mm is measured, and the porous body is removed from distilled water.
  • the mass (M2) of the sample immersed for 10 minutes is measured, and is a value calculated by the following formula.
  • Water retention rate (%) ⁇ (M2-M1) / M1 ⁇ ⁇ 100
  • the porosity of the porous body is preferably 60% to 95%. If the porosity is too small, the amount of the biological sample solution that can be absorbed decreases, and for example, the color at the time of colorimetric quantification in the sample pad becomes thin, and there is a possibility that quantification at a low concentration is particularly difficult. On the other hand, if the porosity is too high, the practical strength may be poor.
  • the porosity is calculated by the following formula from the apparent volume and the true volume of the porous body measured by a dry automatic densimeter by measuring the true volume of the dried porous body dried by a dryer. Value.
  • Porosity (%) (apparent volume ⁇ true volume) / apparent volume ⁇ 100
  • the porous body has an average pore diameter of 20 ⁇ m to 100 ⁇ m. If the average pore size is too small, the water absorption of the biological sample solution due to capillary action proceeds too much, not only inhibiting the development of the downstream conjugation pad, membrane, and absorption pad, but also the biological sample solution once developed flows backward. . On the other hand, if the average pore diameter is too large, the uniformity of the structure is impaired, and the variation depending on the measurement location increases.
  • the average pore diameter is more preferably 25 ⁇ m to 80 ⁇ m.
  • the average pore diameter can be estimated from the pore diameter distribution curve obtained by measuring under the conditions described later using a mercury porosimeter.
  • the material constituting the porous body is not particularly limited, but is preferably made of a material having appropriate hydrophilicity (having a specific contact angle). If a material with strong hydrophobicity or water repellency is used, pretreatment for wetting is required before using it as a test piece. Conversely, if a material with strong hydrophilicity is used, it depends on the pore diameter, The downstream development may not progress.
  • preferable materials include polyethylene (contact angle with water: 70 to 83 deg), polypropylene (contact angle with water: approximately 91 deg), ethylene / vinyl acetate copolymer (contact angle with water: approximately 80 deg), polyurethane (Contact angle with respect to water: 88 to 96 deg), polyvinyl alcohol (PVA, contact angle with respect to water: approximately 36 deg), polyvinyl chloride (PVC, contact angle with respect to water: approximately 87 deg) is preferable. .
  • the conjugation pad 3 may be made of a material that can hold the detection reagent in a dry state and that can quickly release the detection reagent with the development of the biological sample solution.
  • a material that can hold the detection reagent in a dry state and that can quickly release the detection reagent with the development of the biological sample solution Although not, glass fiber, a filter paper made of cellulose, a nonwoven fabric made of polyester, and the like can be mentioned.
  • the absorbent pad 4 may be made of a material that can quickly absorb and hold a biological sample solution, and is not particularly limited, and examples thereof include cellulose filter paper and nonwoven fabric.
  • the membrane 1 is not particularly limited, and examples thereof include cellulose, cellulose derivatives, nitrocellulose, cellulose acetate, polyurethane, polyester, polyethylene, polyvinyl chloride, polyvinylidene fluoride, and nylon. Membranes, fabrics, fibrous or non-woven matrices made of these materials are suitable.
  • the biological sample is not particularly limited.
  • biological samples such as blood, lymph, spinal fluid, sweat, urine, tears, saliva, skin, mucous membrane, and hair can be exemplified.
  • blood in addition to whole blood, serum, blood cells or plasma obtained by centrifuging blood can be used as a sample.
  • biological samples are not limited to human origin, and biological samples derived from mammals such as dogs, cats, and cows are also targeted.
  • a conventionally known method may be used as a method for producing the immunochromatographic test piece of the present invention.
  • the manufacturing method of an immunochromatography test piece is explained in full detail, this invention is not limited at all.
  • the conjugation pad can be prepared by uniformly applying, spraying, or impregnating a predetermined amount of detection antibody and labeling substance to a sheet-like glass fiber, and then drying at a suitable temperature in a thermostat for a certain period of time.
  • the application amount of the detection antibody and the labeling substance is not particularly limited, but is preferably 5 ⁇ L to 50 ⁇ L per 1 cm line length.
  • the drying temperature of the conjugation pad is not particularly limited, but is preferably 20 ° C. to 80 ° C.
  • the drying time varies depending on the drying temperature, but is usually 5 minutes to 120 minutes.
  • the membrane is coated with a specific amount of capture antibody (eg, anti-Hb antibody) forming a test line and a capture antibody (eg, anti-biotin antibody) forming a control line on different lines, and then in a thermostatic chamber. And can be produced by drying at an appropriate temperature for a certain period of time.
  • the application amount of the capture antibody forming the test line and the capture antibody forming the control line is not particularly limited, but is preferably 0.1 ⁇ L to 2 ⁇ L per 1 cm line length. Further, the application concentration of the capture antibody forming the test line and the capture antibody forming the control line is not particularly limited, but is preferably 2.0 mg / mL to 0.1 mg / mL.
  • the drying temperature of the membrane is not particularly limited, but is preferably 20 ° C. to 80 ° C.
  • the drying time varies depending on the drying temperature, but is usually 5 minutes to 120 minutes.
  • the prepared membrane 1 is adhered to the middle position of the pressure-sensitive adhesive sheet 7, the conjugation pad 3 is partially overlapped on the end of the membrane 1 and connected, and the absorbent pad 4 is connected to the opposite side of the membrane 1.
  • An immunochromatographic test piece can be prepared by connecting a part of the sample pad 2 so as to overlap the end of the conjugation pad 3 so as to overlap the end of the conjugation pad 3.
  • the test line 5 and the control line 6 may be prepared after producing the test piece, or may be prepared before producing the test piece.
  • the immunochromatography analysis kit includes a biological sample diluent for pretreatment and / or dilution of a biological sample, an immunochromatographic test piece, an immunochromatographic reader, and / or a reflected light measurement device.
  • the biological sample diluent can be used as a developing solution for developing a biological sample.
  • the biological sample diluent may contain a nonionic surfactant that improves the developability of the biological sample and does not affect the immune reaction.
  • nonionic surfactant examples include polyoxyethylene alkyl phenyl ether (Triton (registered trademark) surfactant, etc.), polyoxyethylene alkyl ether (Brij (registered trademark) surfactant, etc.), polyoxyethylene sorbitan.
  • examples include fatty acid esters (such as Tween (registered trademark) surfactants), polyoxyethylene fatty acid esters, sorbitan fatty acid esters, alkyl glucosides, and sucrose fatty acid esters.
  • the said surfactant may be used independently or may be used in combination of 2 or more type.
  • the concentration of the nonionic surfactant is preferably 0.01 wt% to 5.0 wt%.
  • an inorganic salt or a buffer used for pH adjustment may be added to the biological sample diluent.
  • the buffer any kind of buffer may be used as long as it has a sufficient buffering capacity in a target pH range.
  • tris phosphoric acid, phthalic acid, citric acid, maleic acid, Succinic acid, oxalic acid, boric acid, tartaric acid, acetic acid, carbonic acid, good buffer (MES, ADA, PIPES, ACES, collamine hydrochloride, BES, TES, HEPES, acetamidoglycine, tricine, glycinamide, bicine) and the like.
  • the immunochromatographic test piece includes a first opening for spotting (dropping) a biological sample solution, a second opening for measuring Hb on the sample pad portion, and a membrane portion (at least a test line). And a control line can be measured) in an appropriate plastic housing case having a third opening for measuring the analyte and the labeled substance. Note that the first opening and the second opening may be integrated.
  • the item to be measured at the sample pad portion is Hb
  • the item to be measured at the membrane portion is not particularly limited.
  • HbA1c is preferable.
  • the present invention is not limited in any way.
  • an antibody that specifically recognizes Hb hereinafter sometimes abbreviated as anti-Hb antibody
  • an antibody that specifically recognizes HbA1c hereinafter, it may be abbreviated as an anti-HbA1c antibody
  • an anti-Hb antibody As long as there is a commercially available anti-Hb antibody or anti-HbA1c antibody, it may be used, or may be produced by a known method.
  • the molecular size is not particularly limited.
  • the detection antibody when the substance to be analyzed is HbA1c, a complex of anti-Hb antibody and detection particles, or a complex of anti-HbA1c antibody and detection particles is preferable, and a complex of anti-HbA1c antibody and detection particles is more preferable. is there.
  • the capture antibody is an anti-Hb antibody
  • the detection antibody is a complex of anti-HbA1c antibody and detection particles.
  • the capture antibody is an anti-HbA1c antibody
  • the detection antibody must be a complex of anti-Hb antibody and detection particles.
  • the molecular size is not particularly limited.
  • the capture antibody that forms the control line is preferably an antibody that specifically recognizes a labeling substance, and more preferably an antibody that specifically recognizes biotin (hereinafter sometimes abbreviated as an anti-biotin antibody).
  • an anti-biotin antibody As long as there is a commercially available anti-biotin antibody, it may be used, or may be produced by a known method.
  • the molecular size is not particularly limited.
  • Anti-Biotin antibody manufactured by GENETEX
  • Anti-Biotin Goat-Poly (manufactured by Bethyl Laboratories), IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Biotin (manufactured by Iwai Chemicals), etc.
  • the labeling substance a complex of biotin-labeled protein and detection particles or a complex of digoxigenin-labeled protein and detection particles is preferable, and biotin-labeled protein is more preferable.
  • the type of protein used in the biotin-labeled protein is not particularly limited, but is preferably a microorganism-derived protein or animal-derived protein, the microorganism-derived protein is preferably Blocking Peptide Fragment, and the animal-derived protein is more preferably bovine serum albumin or casein. If these proteins are commercially available, they may be used, or may be produced by separately known methods.
  • the molecular size is not particularly limited, the average molecular weight is preferably 100 kDa or less. Generally, as the molecular size of the protein is smaller, the amount of protein binding to one detection particle increases, so the performance such as sensitivity becomes higher.
  • the biotin labeling method of the biotin labeled protein is not particularly limited, and an N-hydroxysuccinimide method can be exemplified.
  • N-hydroxysuccinimide method the carboxyl group of biotin is condensed in the presence of an N-hydroxyamine compound in the presence of a dehydrating condensing agent, selectively activated, and labeled via the amino group and amide bond of the protein. Can do.
  • the N-hydroxyamine compound used in the condensation reaction is not particularly limited.
  • N-hydroxysuccinimide hereinafter sometimes referred to as NHS
  • NHS is more preferable because it is relatively inexpensive, easily available, and has a track record in the field of peptide synthesis.
  • the dehydrating condensing agent used in the condensation reaction is not particularly limited.
  • 1-ethyl-3-dimethylaminopropylcarbodiimide hydrochloride hereinafter sometimes referred to as EDC ⁇ HCl
  • EDC ⁇ HCl 1-cyclohexyl- (2 And -morpholin-4-ethyl) -carbodiimide / meso p-toluenesulfonate.
  • EDC ⁇ HCl is more preferable because it has a track record as a general-purpose water-soluble condensing agent in the field of peptide synthesis and the like.
  • the amount of biotin introduced into the biotin-labeled protein can be controlled by adjusting the molar ratio of protein to biotin. In order to improve performance such as sensitivity, it is desirable that the amount of biotin introduced is high. More specifically, it is preferable that the number of moles of biotin is 1.0 mole times or more with respect to the number of moles of protein. Since the molar ratio is an example, it may be appropriately increased or decreased according to the type of protein and the actual sensitivity.
  • the method for binding the biotin-labeled protein and the detection particles is not particularly limited, and examples include a physical adsorption by a hydrophobic bond or a binding method via a covalent bond.
  • hydrophobic binding the biotin-labeled protein is directly bound to the surface layer of the detection particle, and therefore, it is preferable to treat at a pH near the isoelectric point of the biotin-labeled protein.
  • covalent bonding the bonding method varies depending on the functional group on the surface of the detection particle. For example, when the functional group present on the surface of the detection particle is an amino group, bonding is performed using the N-hydroxysuccinimide method described above. can do.
  • the reaction temperature is not particularly limited. A preferred lower limit is 10 ° C and a preferred upper limit is 50 ° C.
  • the reaction time varies depending on the reaction temperature and is not particularly limited. A preferred lower limit is 1 hour and a preferred upper limit is 24 hours.
  • the unreacted N-hydroxyamine compound and the dehydrating condensing agent contained in the reaction solution can be easily separated from the aqueous solvent by filtration or centrifugation.
  • Detecting particles are not particularly limited, but colored particles and fluorescent particles can be used.
  • the colored particles include metal particles, latex particles, and cellulose particles.
  • the metal particles include gold colloid, silver colloid, platinum colloid, palladium colloid, gold nanorod, gold nanoplate, and silver nanoplate.
  • the particle size of the metal particles is not particularly limited, but those having a particle size of 1 nm to 100 nm are preferable.
  • latex particles include those made of materials such as polystyrene, polymethyl methacrylate, and acrylic acid polymer.
  • the particle size is not particularly limited, but those having a particle size of 25 nm to 500 nm are preferable.
  • the cellulose particles preferably have a particle size of 100 nm to 500 nm.
  • the fluorescent particles include those made of materials such as polystyrene, polymethyl methacrylate, polyvinyl toluene, and silica.
  • the fluorescent dye include fluorescein and derivatives thereof, rhodamine and derivatives thereof, cyanine and derivatives thereof, and the like. Among these, it is preferable to use latex particles or cellulose particles having high versatility and excellent visibility.
  • the method for measuring the substance to be analyzed on the membrane using the immunochromatographic test piece is not particularly limited.
  • the substance to be analyzed is HbA1c
  • the following method is exemplified. First, a biological sample is mixed with a biological sample diluent as necessary to obtain a developable mixed solution (biological sample solution), and then the mixed solution is dropped onto the sample pad 2. The liquid mixture passes through the sample pad 2 and is developed on the conjugation pad 3. In the mixed solution, the detection antibody and the labeling substance carried on the conjugation pad 3 are dissolved, and the HbA1c and the detection antibody (complex of anti-HbA1c antibody and detection particles) form an immune complex and spread on the membrane.
  • the absorbent pad 4 by capillary action.
  • the mixed solution reaches the test line 5 of the membrane, the immune complex is captured and collected by the capture antibody (anti-Hb antibody), and the test line 5 develops color.
  • the mixed solution containing the labeling substance passes through the test line 5 and reaches the control line 6.
  • the labeling substance is captured and collected by the capture antibody (anti-biotin antibody), and the control line 6 develops color.
  • the other liquid mixture is finally absorbed by the absorbent pad.
  • the concentration of the analyte can be measured by measuring the color intensity of the test line 5 and the control line 6 using an immunochromatographic reader or the like.
  • the method for measuring Hb at the sample pad portion of the immunochromatographic test piece is not particularly limited.
  • a method using the reflected light measurement device 8 shown in FIGS. 3 and 4 is exemplified.
  • the reflected light measuring device 8 is a reflected light measuring device capable of fixing the immunochromatographic test piece 12 to the mounting portion 9 and irradiating the sample pad of the fixed immunochromatographic test piece 12 with light.
  • the light receiving element 11 is arranged so that the light irradiated from 10 can receive the light reflected by the sample pad, and the obtained photometric value can be measured over time.
  • the Hb concentration can be measured by measuring the coloration degree of the biological sample solution developed on the sample pad portion as reflected light.
  • an image analysis system using a CCD, C-MOS, or the like can also be suitably used.
  • the reflected light measurement device for Hb measurement and the immunochromatography reader for HbA1c measurement may be independent devices as described above, or may be an integrated device. Further, the order of measurement may be Hb first, or HbA1c first.
  • the water retention rate was calculated by the following formula from the mass (M1) of the porous body cut to a size of 4 mm ⁇ 4 mm and the mass (M2) after the porous body was immersed in distilled water for 10 minutes.
  • Water retention rate (%) ⁇ (M2-M1) / M1 ⁇ ⁇ 100
  • the porosity was calculated by the following formula from the apparent volume and the true volume of the porous body after measuring the true volume of the porous body dried with a dryer with a dry automatic densimeter.
  • Porosity (%) (apparent volume ⁇ true volume) / apparent volume ⁇ 100
  • Example 1 Preparation of detection antibody (complex of anti-HbA1c antibody and detection particle) 45 ⁇ L of 50 mM phosphate buffered saline (PBS, pH 7.5) was added to 5 ⁇ L of 10% latex particles (K016, manufactured by Merck Millipore). Add 1% latex solution.
  • a commercially available anti-HbA1c monoclonal antibody (product name: Human HbA1c monoantibody, clone 1D3, product number: MAB0030-MO6A, manufactured by Abnova) was prepared to 1.0 mg / mL with 50 mM PBS (pH 7.5).
  • the mixture was centrifuged at 9,300 rpm for 10 minutes, and the supernatant was removed.
  • 200 ⁇ L of 0.3 wt% BSA and 1.0 wt% PEG aqueous solution were added, stirred by vortexing, and allowed to stand at room temperature for 1 hour. Centrifugation was performed at 9,300 rpm for 10 minutes, and the supernatant was removed.
  • 50 ⁇ L of 0.3 wt% BPF and 1.0 wt% PEG aqueous solution were added, and vortexed to prepare a labeling substance.
  • a 1.0 mg / mL anti-biotin monoclonal antibody (product name: Anti-Biotin antibody, product number: GTX44344, manufactured by GENETEX) is used as a control line having a line width of about 1 mm at a position 15 mm from the upstream side of the nitrocellulose membrane.
  • the solution was applied with an application amount of 1.0 ⁇ L / cm using an immunochromatographic dispenser (manufactured by BIODOT). Then, it dried at 40 degreeC for 30 minutes, and produced the membrane for HbA1c measurement.
  • the immunochromatographic test piece was prepared in a configuration generally used in an immunochromatograph. Specifically, a sample pad (trade name: Peorus sheet EVA, thickness 1 mm (manufactured by Aion)), a conjugation pad for measuring HbA1c, a membrane for measuring HbA1c, an absorption pad (CELLULOSE FIBER SAMPLE PADS CFSP (manufactured by Merck Millipore) ) Were connected to each other so that the end portions overlap each other, and an immunochromatographic test piece having a width of 4 mm and a length of 60 mm was produced.
  • the sample pad used had a water retention rate of 340 wt%, a porosity of 77%, and an average pore diameter of 25 ⁇ m.
  • Hb sample 3 levels of commercially available Hb standard reference substance total hemoglobin reference standard substance JCCRM912-2 (manufactured by National Institute of Standards and Technology), biological sample diluent (50 mM PBS, pH 7.4 + 1. 0 wt% TritonX-100) diluted 500 times, HbA1c (%) 5.2%, Hb concentrations 0.156 g / L, 0.274 g / L, 0.359 g / L for each Hb sample (3 Level) was prepared.
  • HbA1c sample A commercially available HbA1c standard substance, HbA1c measurement performance evaluation sample QRM HbA1c 2007-1 (manufactured by National Institute of Medical Science Standards) 4 levels of biological sample diluent (50 mM PBS, pH 7. (4 + 1.0 wt% Triton X-100) diluted 500 times, Hb concentration was 0.320 g / L, HbA1c (%) was 5.29%, 6.96%, 9.08%, 10.79% HbA1c samples (4 levels) were prepared.
  • the sensitivity of the measurement is evaluated by ⁇ Hb, which is the difference between the reflected absorbance of the high concentration product (0.359 g / L) of the Hb sample and the reflected absorbance of the low concentration product (0.156 g / L), and ⁇ Hb> 50 mAbs is good. 10 mAbs ⁇ ⁇ Hb ⁇ 50 mAbs was average and ⁇ Hb ⁇ 10 mAbs was bad.
  • the stability of the measurement was evaluated by measuring the reflection absorbance of a high-concentration Hb sample (0.359 g / L) over time, and the difference between the reflection absorbance after 10 minutes and the reflection absorbance after 1 minute: ⁇ 10.
  • ⁇ 10 ⁇ 20 mAbs was good, 20 mAbs ⁇ ⁇ 10 ⁇ 30 mAbs was average, and ⁇ 10> 30 mAbs was bad.
  • the reflected absorbance at the test line was divided by the reflected absorbance at the control line to obtain a correction value (T / C).
  • a calibration curve for HbA1c was created from the correlation between the HbA1c concentration (X axis) and the correction value (Y axis). The results are shown in FIG.
  • ⁇ HbA1c The sensitivity of the measurement is evaluated by ⁇ HbA1c, which is a difference between the reflection absorbance of the test line of the high concentration product (10.79%) of the HbA1c sample and the reflection absorbance of the test line of the low concentration product (5.29%): ⁇ HbA1c > 100 mAbs as good, 50 mAbs ⁇ ⁇ HbA1c ⁇ 100 mAbs as average, and ⁇ HbA1c ⁇ 50 mAbs as bad.
  • Example 2 An immunochromatographic test piece was prepared in the same manner as in Example 1 except that a polyethylene porous sheet (trade name: Peorus sheet PE, thickness 1 mm (manufactured by Aion)) was used as a sample pad. The water retention of the sample pad was 290 wt%, the porosity was 74%, and the average pore diameter was 25 ⁇ m.
  • Example 3 An immunochromatographic test piece was prepared in the same manner as in Example 1 except that a urethane porous sheet (trade name: AC sponge U, thickness 1 mm (manufactured by AC Chemical Co., Ltd.)) was used as a sample pad.
  • the water retention of the sample pad was 350 wt%, the porosity was 85%, and the average pore diameter was 60 ⁇ m.
  • Example 4 An immunochromatographic test piece was prepared in the same manner as in Example 1 except that a porous sheet made of polyvinyl chloride (trade name: AC sponge V, thickness 1 mm (manufactured by AC Chemical)) was used as a sample pad. .
  • the water retention of the sample pad was 400 wt%, the porosity was 75%, and the average pore diameter was 60 ⁇ m.
  • sensitivity: good at ⁇ Hb 70 mAbs
  • reproducibility: good at CV (%) 4%
  • stability: good at ⁇ 10 17 mAbs.
  • Example 5 An immunochromatographic test piece was prepared in the same manner as in Example 1 except that a polyethylene porous sheet (trade name: AC sponge O, thickness 1 mm (manufactured by AC Chemical Co., Ltd.)) was used as the sample pad.
  • the water retention of the sample pad was 250 wt%, the porosity was 75%, and the average pore diameter was 60 ⁇ m.
  • Example 6 An immunochromatographic test piece was produced in the same manner as in Example 1 except that a porous sheet made of polyvinyl alcohol (trade name: Berclin thickness 1 mm (manufactured by Aion)) was used as a sample pad.
  • the water retention of the sample pad was 1000 wt%, the porosity was 89%, and the average pore diameter was 80 ⁇ m.
  • Example 1 An immunochromatographic test piece was prepared in the same manner as in Example 1 except that cellulose filter paper (CELLULOSE FIBER SAMPLE PADS CFSP (manufactured by Merck Millipore)) was used as a sample pad.
  • cellulose filter paper CELLULOSE FIBER SAMPLE PADS CFSP (manufactured by Merck Millipore)
  • Example 2 An immunochromatographic test piece was prepared in the same manner as in Example 1 except that glass fiber filter paper (GLASSFIBER DIAGNOSTIC PAD GFDX (manufactured by Merck Millipore)) was used as the sample pad.
  • glass fiber filter paper GLASSFIBER DIAGNOSTIC PAD GFDX (manufactured by Merck Millipore)
  • CV (%) 11%
  • Example 4 An immunochromatographic test piece was prepared in the same manner as in Example 1 except that a porous sheet made of polyvinyl alcohol (trade name: AC sponge P, thickness 1 mm (manufactured by AC Chemical)) was used as the sample pad.
  • the water retention of the sample pad was 1100 wt%, the porosity was 90%, and the average pore diameter was 130 ⁇ m.
  • the sample pad after the measurement was slightly bluish due to the backflow of the detected particles.
  • a polyurethane porous sheet trade name: Rubycell Clean RK thickness 0.8 mm (manufactured by Harvest)
  • an immunochromatographic test piece that is simple and has high measurement accuracy can be provided.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

【課題】簡便かつ測定精度の高いイムノクロマト試験片を提供する。 【解決手段】本発明は、サンプルパッド、コンジュゲーションパッド、メンブレン、吸収パッドが順に連接配置されたイムノクロマト試験片であって、前記サンプルパッドは、保水率が２００ｗｔ％～１０００ｗｔ％、平均気孔径が２０μｍ～１００μｍである多孔質体からなる、試験片である。

Description

イムノクロマト試験片およびキットおよび測定方法
　本発明は、イムノクロマト法による生体試料中に含まれる分析対象物質（特に、ヘモグロビンＡ１ｃ）の測定方法、当該測定方法に用いるイムノクロマト試験片およびイムノクロマト試験片を含むキットに関する。
　世界糖尿病連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ）によると、世界の糖尿病患者数はアメリカ、ヨーロッパなどの先進国に加え、中国、インド、ブラジルなどの新興国を含めて急増しており、２０１５年で約４．２億人存在し、２０４０年には約６．４億人に及ぶと予測され、糖尿病診断の重要性は増している。
　糖尿病診断項目の一つであるヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃと略す場合がある）とは、血液中の酸素を運搬する役割を担うヘモグロビン（以下、Ｈｂと略す場合がある）に糖（グルコース）が結合した糖化ヘモグロビンの内、ヘモグロビンβ鎖のＮ末端側に位置するバリン残基が糖化された物質を指し、総Ｈｂ量に対するＨｂＡ１ｃ濃度が過去１～２ヶ月間の平均血糖値を反映することから、糖尿病の長期的な経過を観察するのに利用されている。
　従来、ＨｂＡ１ｃの測定にはＨＰＬＣ法、キャピラリー電気泳動法、酵素法、免疫法などの測定技術が利用されていたが、これらの測定方法は専門知識を有することや分析装置が大型かつ高額であるなどの理由から、主に大規模病院や多数の検査を行う検査センターで利用されており、小規模病院ではＨｂＡ１ｃを簡単に測定できない点が問題となっていた。
　近年、医療現場ではＰＯＣＴという言葉が注目を集めている。ＰＯＣＴとはＰｏｉｎｔ Ｏｆ Ｃａｒｅ Ｔｅｓｔｉｎｇの略であり、医療従事者が被験者の傍らで行う臨床検査のことをいう。ＰＯＣＴは大規模病院の中央検査室等で行う臨床検査とは異なり、その場で瞬時に検査結果が得られることから、糖尿病診断においてもＰＯＣＴが広まりつつある。
　ＨｂＡ１ｃ濃度の測定を目的としたＰＯＣＴの中に、イムノクロマト法を利用した技術が提案されている。イムノクロマト法とは毛細管現象を利用した免疫測定法であり、妊娠検査やインフルエンザ検査などにおいて世界的に普及している。従来のイムノクロマト法は目視判定（定性評価）が一般的であったが、近年、クロマトリーダー等の分析装置を利用して生体試料中に含まれる分析対象物質の濃度を定量する技術が開発されつつある。
　イムノクロマト法を用いた分析対象物質の濃度を定量する手法の一つとしては、抗原抗体反応を利用したサンドイッチ法が挙げられる。サンドイッチ法では分析対象物質に対してエピトープの異なる２種類の抗体を利用する。一方の抗体は、金コロイド、着色ラテックスまたは蛍光粒子等の検出粒子と感作した検出抗体を使用する。他方の抗体は、多孔質支持体の表面に線状に固定した捕捉抗体としてテストラインを形成する。加えて、前記検出抗体を特異的に認識する抗体を多孔質支持体の表面の、前記テストラインとは異なる位置に線状に固定しコントロールラインを形成する。生体試料中に含まれる分析対象物質は、多孔質支持体の一端（上流側）から展開し、検出抗体と免疫複合体を形成しながら移動し、テストライン上で捕捉抗体と接触して捕捉され発色する。分析対象物質と免疫複合体を形成しなかった遊離の検出試薬はテストライン上を通過し、コントロールラインの抗体に捕捉され発色する。これらの発色強度をクロマトリーダー等の装置を利用することで分析対象物質の濃度を定量することができる。
　特許文献１および２には、イムノクロマト法を用いたＨｂＡ１ｃ濃度を測定する技術が開示されている。当該方法は血液と環状多糖類を含む試薬を接触させることでＨｂβ鎖のＮ末端（エピトープ）を露出させ、その後、検出粒子（金コロイドあるいはラテックス粒子）で標識されたＨｂ抗体と免疫反応を行い、抗体固定化メンブレン上に展開し、抗ＨｂＡ１ｃ抗体固定化部および抗ＨｂＡ０固定化部に到達した免疫複合体をそれぞれ検出することで、血液中のＨｂＡ１ｃ（％）を簡便に求めることができる。
　しかしながら、該手法では検出粒子に感作した抗Ｈｂ抗体がＨｂＡ１ｃやＨｂＡ０だけではなく、他のＨｂとも免疫反応を行うので、生体試料の種類によっては感度が低下することが問題となる。また、同一メンブレン上で２種類の免疫複合体を検出する場合、上流の免疫反応が下流の免疫反応に影響することがあり、測定精度が低下する問題がある。
　一方、特許文献３には、イムノクロマト法において、サンプルパッドに保持されたＨｂを光学的に検出して、生体試料溶液中のヘマトクリット値を測定する技術が開示されている。該発明は、上流の免疫反応が下流の免疫反応に影響することがないため、測定精度の向上が期待される。しかしながら、該発明ではサンプルパッドにグラスファイバー製パッドが使用されており、グラスファイバー製パッドやセルロース製パッドをはじめとするサンプルパッドに一般的に使用される基材では、時間と共にＨｂ由来の色味が変化するため、生体試料溶液の展開性によって測定精度が低下する問題がある。また、サンプルパッドにおいて前記生体試料溶液を保持できる液量が少ないため、特に生体試料溶液の希釈倍率が高い場合に感度が不足する問題がある。
特開２０１２－２５１７８９号公報 特開２０１５－１５８５１５号公報 ＷＯ２０１３／１４７２００公報
　本発明は、上記の問題点に鑑みて、従来よりも測定精度の高い生体試料中に含まれる分析対象物質（特に、ＨｂＡ１ｃ）の測定方法、当該測定方法に用いるイムノクロマト試験片およびイムノクロマト試験片を含むキットを提供することを課題とする。
　本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、イムノクロマト試験片において、Ｈｂをサンプルパッド部で測定し、分析対象物質（特に、ＨｂＡ１ｃ）をメンブレン部で測定することで、生体試料の種類や生体試料中の分析対象物質の濃度の影響を受けず、Ｈｂと分析対象物質（特に、ＨｂＡ１ｃ）をそれぞれ正確に測定できること見出した。
　しかし、同一生体試料を用いても測定値に違い（ばらつき）が生じる新たな課題に直面した。この原因を調査したところ、サンプルパッドにおけるＨｂ由来の色味が時間と共に変化するため、生体試料溶液の展開性によって測定値がばらつくことが判明した。そこで、発明者はサンプルパッドに特定の構成を有する多孔質体を用いることで、サンプルパッドにおけるＨｂ由来の色味の経時変化を抑制することに成功した。また、サンプルパッドにおける生体試料溶液の保持量が向上し、生体試料をより高倍率に希釈しても測定可能であることを見出した。なお、生体試料をより高倍率に希釈することで、生体試料中の反応阻害物質の影響を低減でき、測定精度の更なる向上が期待できる。加えて、本発明者はさらにこの知見を基に、従来よりも測定精度の高い生体試料中に含まれる分析対象物質（特に、ＨｂＡ１ｃ）の測定方法、当該測定方法を用いるイムノクロマト試験片およびイムノクロマト試験片を含むキットの発明を完成させた。
　すなわち代表的な本願発明は以下の通りである。
（１）　サンプルパッド、コンジュゲーションパッド、メンブレン、吸収パッドが順に連接配置されたイムノクロマト試験片であって、前記サンプルパッドは、保水率が２００ｗｔ％～１０００ｗｔ％、平均気孔径が２０μｍ～１００μｍである多孔質体からなる、試験片。
（２）　前記サンプルパッドは、ポリエチレン、ポリビニルアルコール、エチレン／酢酸ビニル共重合体、ポリウレタン、ポリ塩化ビニルからなる群から選ばれる１種以上である、（１）に記載の試験片。
（３）　（１）または（２）に記載のイムノクロマト試験片、生体試料希釈液およびイムノクロマトリーダーおよび／または反射光測定装置を含む、イムノクロマト測定キット。
（４）　（１）または（２）に記載のイムノクロマト試験片、または（３）に記載のイムノクロマト測定キットを用い、下記（ｉ）から（ｉｉｉ）の工程を順に経て、前記生体試料中のヘモグロビンおよび分析対象物質を定量する方法。
　工程（ｉ）：生体試料と生体試料希釈液とを体積比１：１００～１：１０００で混合して生体試料溶液を調製する工程
　工程（ｉｉ）：前記生体試料溶液を、サンプルパッドに点着する工程
　工程（ｉｉｉ）：サンプルパッドの色味からヘモグロビンを比色定量する工程、およびメンブレン部のラインの色味から分析対象物質を比色定量する工程
（５）　前記分析対象物質は、ヘモグロビンＡ１ｃである、（４）に記載の方法。
　本発明のイムノクロマト試験片は、特定の構成を有するサンプルパッドを使用しているので、生体試料中のＨｂをサンプルパッド部で、またＨｂＡ１ｃをメンブレン部でそれぞれ高精度かつ定量的に測定することができる。
本発明で使用するイムノクロマト試験片の一例を示す（上面）図である。 本発明で使用するイムノクロマト試験片の一例を示す（側面）図である。 本発明で使用する反射光測定装置の一例を示す（内部）図である。 本発明で使用する反射光測定装置の一例を示す（外部）図である。 本発明のイムノクロマト試験片を用いた、Ｈｂの測定結果を示すグラフである。 本発明のイムノクロマト試験片を用いた、ＨｂＡ１ｃの測定結果を示すグラフである。
　本発明のイムノクロマト試験片の形態は特に限定されない。例えば、イムノクロマト試験片の生体試料溶液の点着部（滴下部）を上流側として、前記点着部を有するサンプルパッド、コンジュゲーションパッド、メンブレン、吸収パッドの順に連接されたイムノクロマト試験片が挙げられる。
　次いで、本発明のイムノクロマト試験片の一例を、図面を参照して説明する。図１、２において、１はメンブレン、２はサンプルパッド、３はコンジュゲーションパッド、４は吸収パッド、７は粘着シートを示す。
　図１、２の例では、イムノクロマト試験片は、幅４ｍｍ程度、長さ６０ｍｍ程度の細長い短冊状の形態をしている。なお、イムノクロマト試験片のコンジュゲーションパッド３には分析対象物質を特異的に識別する検出抗体と標識物質が坦持されている。また、メンブレン１の上流側の端部から下流側に向かって約１０ｍｍの位置に分析対象物質を特異的に識別する捕捉抗体を線状に固定化したテストライン５が形成されている。さらに、前記端部から約１５ｍｍの位置には標識物質を特異的に認識する抗体を線状に固定したコントロールライン６が形成されている。
　本発明において、サンプルパッド２は、多孔質体を用いることが好ましい。ここでいう多孔質体とは、粒子充填体、３次元網目構造体（スポンジ体）などを指すが、スポンジ体が好ましい。スポンジ体は、後述する保水率や平均細孔径において場所斑を小さくすることができるメリットがある。
　本発明において、前記多孔質体は、保水率が２００ｗｔ％～１０００ｗｔ％である。保水率が小さすぎると、サンプルパッドにおいて比色定量する際の色味が薄くなり、特に低濃度の定量が難しくなる。一方、保水率が大きすぎると、生体試料溶液の下流への展開が阻害されるだけでなく、一度展開した生体試料溶液が逆流してサンプルパッドでのＨｂ測定を阻害する。また、サンプルパッドを構成する材料としてよく用いられてきた、セルロース製ろ紙やガラス製ろ紙を本発明に用いると、前記特性が均一ではないため測定箇所によるばらつきが大きくなる。保水率は、より好ましくは２５０ｗｔ％～１０００ｗｔ％である。
　前記保水率とは、多孔質体の質量に対する含浸させた水分の質量の割合を示し、４ｍｍ×４ｍｍのサイズにカットした多孔質体の質量（Ｍ１）を測定し、前記多孔質体を蒸留水中に１０分間浸漬したものの質量（Ｍ２）を測定し、下記式にて算出される値である。
　保水率（％）＝｛（Ｍ２－Ｍ１）／Ｍ１｝×１００
　本発明において、前記多孔質体の気孔率は６０％～９５％が好適である。気孔率が小さすぎると吸収可能な生体試料溶液の量が低下し、例えばサンプルパッドにおいて比色定量する際の色味が薄くなり、特に低濃度の定量が困難となる恐れがある。一方、気孔率が大きすぎると実用的強度に乏しくなることがある。
　前記気孔率とは、乾燥機で乾燥された乾燥状態の多孔質体の真体積を乾式自動密度計にて測定し、多孔質体の見掛け体積と真体積とから、下記式にて算出される値である。
　気孔率（％）＝（見掛け体積－真体積）／見掛け体積×１００
　本発明において、前記多孔質体の平均気孔径は２０μｍ～１００μｍである。平均気孔径が小さすぎると、毛細管現象による生体試料溶液の吸水が進みすぎ、下流のコンジュゲーションパッド、メンブレン、吸収パッドへの展開が阻害されるだけでなく、一度展開した生体試料溶液が逆流する。一方、平均気孔径が大きすぎると、構造の均一性が損なわれ、測定箇所によるばらつきが大きくなる。平均気孔径は、より好ましくは２５μｍ～８０μｍである。
　前記平均気孔径は、水銀ポロシメーターを用いて後述するような条件で測定し、得られた気孔径分布曲線より見積もることができる。
　本発明において、前記多孔質体を構成する材料は特に限定されないが、適度な親水性を有する（特定の接触角を有する）材料からなることが好ましい。疎水性や撥水性の強い材料を用いると、試験片として使用するにあたり湿潤化の前処理が必要になるし、逆に親水性の強い材料を用いると、細孔径にもよるが生体試料溶液の下流側への展開が進まないことがある。好ましい材料として、具体的には、ポリエチレン（水に対する接触角：７０～８３ｄｅｇ）、ポリプロピレン（水に対する接触角：およそ９１ｄｅｇ）、エチレン／酢酸ビニル共重合体（水に対する接触角：およそ８０ｄｅｇ）、ポリウレタン（水に対する接触角：８８～９６ｄｅｇ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ、水に対する接触角：およそ３６ｄｅｇ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ、水に対する接触角：およそ８７ｄｅｇ）から選ばれる１つ以上からなることが好ましい。
　本発明において、コンジュゲーションパッド３としては、検出試薬を乾燥状態で保持することができ、かつ生体試料溶液の展開と共に検出試薬を速やかに放出することができる材質のものであれば良く、特に制限されないが、ガラスファイバー、セルロース製のろ紙、ポリエステル製の不織布などが挙げられる。
　本発明において、吸収パッド４としては、生体試料溶液を速やかに吸収、保持できる材質のものであればよく、特に限定されないが、セルロース製のろ紙や不織布が挙げられる。
　本発明において、メンブレン１としては、特に限定されないが、セルロース、セルロース誘導体、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロンが挙げられる。これらの材質で構成された膜、布帛、繊維状又は不織布状マトリックス等が好適である。
　本発明において、生体試料は特に限定されない。例えば、血液、リンパ液、髄液、汗、尿、涙液、唾液、皮膚、粘膜、毛髪等などの生体試料を例示することができる。血液においては、全血のほか、血液を遠心分離して得られた血清、血球または血漿を試料とすることができる。また、生体試料はヒト由来に限らず、イヌ、ネコ、ウシ等の哺乳動物由来の生体試料も対象である。
　本発明のイムノクロマト試験片の製造方法は、従来公知の方法を用いればよい。以下、イムノクロマト試験片の製造方法について詳述するが、本発明を何ら限定するものではない。
　コンジュゲーションパッドは、シート状のガラスファイバーに一定量の検出抗体および標識物質を均一に塗布、噴霧または含浸した後、恒温槽内で適当な温度で一定時間乾燥することで作製することが出来る。検出抗体および標識物質の塗布量は特に限定されないが、好ましくはライン長１ｃｍ辺り５μＬ～５０μＬである。
　前記コンジュゲーションパッドの乾燥温度は特に限定されないが、好ましくは２０℃～８０℃である。乾燥時間は乾燥温度によって異なるが、通常は５分～１２０分間である。
　メンブレンは、テストラインを形成する捕捉抗体（例えば、抗Ｈｂ抗体）とコントロールラインを形成する捕捉抗体（例えば、抗ビオチン抗体）を、それぞれ線上に一定量を異なる位置に塗布した後、恒温槽内で適当な温度で一定時間乾燥することで作製することが出来る。テストラインを形成する捕捉抗体とコントロールラインを形成する捕捉抗体の塗布量は特に限定されないが、好ましくはライン長１ｃｍ辺り０．１μＬ～２μＬである。また、テストラインを形成する捕捉抗体とコントロールラインを形成する捕捉抗体の塗布濃度も特に限定されないが、好ましくは２．０ｍｇ／ｍＬ～０．１ｍｇ／ｍＬである。
　前記メンブレンの乾燥温度は特に限定されないが、好ましくは２０℃～８０℃である。乾燥時間は乾燥温度によって異なるが、通常は５分～１２０分間である。
　前記調製したメンブレン１を粘着シート７の中程の位置に貼着し、コンジュゲーションパッド３をメンブレン１の末端の上に一部重ね合わせて連接するとともに、吸収パッド４をメンブレン１の逆側の末端上に一部重ね合わせて連接し、さらにコンジュゲーションパッド３の上流側末端にサンプルパッド２の一部が重なるようにして連接することでイムノクロマト試験片を作製することができる。なお、テストライン５およびコントロールライン６は試験片を作製した後に調製してもよいし、試験片を作製する前に調製してもよい。
　本発明において、イムノクロマト分析キットは、生体試料を前処理および／または希釈するための生体試料希釈液、イムノクロマト試験片およびイムノクロマトリーダーおよび／または反射光測定装置を含む。
　前記生体試料希釈液は、生体試料を展開させるための展開液として使用することができる。生体試料希釈液は、生体試料の展開性を向上させ、かつ免疫反応に影響しないノニオン性界面活性剤を含んでいてもよい。
　前記ノニオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アルキルグルコシド、ショ糖脂肪酸エステル等が挙げられる。また、前記界面活性剤は単独で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
　前記ノニオン性界面活性剤の濃度としては、好ましくは０．０１ｗｔ％～５．０ｗｔ％である。
　前記生体試料希釈液にはさらに、無機塩類やｐＨ調整に用いる緩衝剤を添加しても良い。前記緩衝剤としては、目的とするｐＨ範囲において充分な緩衝能力を有していれば、いかなる種類の緩衝剤を用いてもよく、例えば、トリス、リン酸、フタル酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、ホウ酸、酒石酸、酢酸、炭酸、グッドバッファー（ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミン塩酸、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド、ビシン）等が挙げられる。
　本発明において、前記イムノクロマト試験片は、生体試料溶液を点着（滴下）するための第一の開口部、サンプルパッド部にＨｂを測定するための第二の開口部、メンブレン部（少なくともテストラインとコントロールラインを測定できる範囲）に分析対象物質と標識物質を測定するための第三の開口部を有する適当なプラスチック製のハウジングケースに収容しても良い。なお、第一の開口部と第二の開口部は一体になっていてもよい。
　本発明において、サンプルパッド部で測定する項目はＨｂであり、メンブレン部で測定する項目は、特に限定されないが、ＨｂＡ１ｃ、尿中アルブミン、シスタチンＣ、Ｃ反応性タンパク、プロカルシトニン、ヒト脳性ナトリウム利尿ペプチド、心筋トポロニンＩ、ミオグロビン、心臓由来脂肪酸結合タンパク、フィブリン分解物、α－フェトプロテイン、前立腺特異抗原、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、便潜血、甲状腺ホルモン、ガン抗原１２５、ガン胎児性抗原、フェリチン、ＩｇＥ抗原、インスリンなどが挙げられる。これらの中でも、ＨｂＡ１ｃが好ましい。以下、サンプルパット部で測定する項目がＨｂで、かつメンブレン部で測定する項目がＨｂＡ１ｃの場合について詳述するが、本発明を何ら限定するものではない。
　テストラインを形成する捕捉抗体としては、分析対象物質がＨｂＡ１ｃの場合は、Ｈｂを特異的に認識する抗体（以下、抗Ｈｂ抗体と略す場合がある）、またはＨｂＡ１ｃを特異的に認識する抗体（以下、抗ＨｂＡ１ｃ抗体と略す場合がある）が好ましく、より好ましくは抗Ｈｂ抗体である。抗Ｈｂ抗体または抗ＨｂＡ１ｃ抗体は、市販されているものがあればそれを用いても良いし、別途公知の方法で製造しても良い。分子サイズも特に制限されない。
　検出抗体としては、分析対象物質がＨｂＡ１ｃの場合は、抗Ｈｂ抗体と検出粒子の複合体、または抗ＨｂＡ１ｃ抗体と検出粒子の複合体が好ましく、より好ましくは抗ＨｂＡ１ｃ抗体と検出粒子の複合体である。なお、捕捉抗体が抗Ｈｂ抗体のとき検出抗体は抗ＨｂＡ１ｃ抗体と検出粒子の複合体であり、捕捉抗体が抗ＨｂＡ１ｃ抗体のとき検出抗体は抗Ｈｂ抗体と検出粒子の複合体である必要がある。抗Ｈｂ抗体または抗ＨｂＡ１ｃ抗体は、市販されているものがあればそれを用いても良いし、別途公知の方法で製造しても良い。分子サイズも特に制限されない。
　コントロールラインを形成する捕捉抗体としては、標識物質を特異的に認識する抗体が好ましく、より好ましくはビオチンを特異的に認識する抗体（以下、抗ビオチン抗体と略す場合がある）である。抗ビオチン抗体は、市販されているものがあればそれを用いても良いし、別途公知の方法で製造しても良い。分子サイズも特に制限されない。例えば、Ａｎｔｉ－Ｂｉｏｔｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＧＥＮＥＴＥＸ社製）、Ａｎｔｉ－Ｂｉｏｔｉｎ，Ｇｏａｔ－Ｐｏｌｙ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、ＩｇＧ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｂｉｏｔｉｎ（岩井化学薬品社製）等が挙げられる。
　標識物質としては、ビオチン標識タンパク質と検出粒子の複合体またはジゴキシゲニン標識タンパク質と検出粒子の複合体が好ましく、ビオチン標識タンパク質がより好ましい。
　前記ビオチン標識タンパク質で用いるタンパク質の種類としては特に制限されないが、微生物由来タンパク質や動物由来タンパク質などが好ましく、微生物由来タンパク質としてはＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ、動物由来タンパク質としてはウシ血清アルブミンまたはカゼインがより好ましい。これらのタンパク質は市販されているものがあればそれを用いても良いし、別途公知の方法で製造しても良い。分子サイズも特に制限されないが、平均分子量で１００ｋＤａ以下が好ましい。一般的にタンパク質の分子サイズが小さいほど検出粒子１粒子に対するタンパク質の結合量は増加するので、感度などの性能が高くなる。
　前記ビオチン標識タンパク質のビオチンの標識方法は特に限定されないが、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド法を例示できる。Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド法を用いることでビオチンのカルボキシル基をＮ－ヒドロキシアミン系化合物と脱水縮合剤存在下で縮合反応し、選択的に活性化し、タンパク質のアミノ基とアミド結合を介して標識することができる。
　前記縮合反応に使用するＮ－ヒドロキシアミン系化合物は、特に制限されないが、例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ－ヒドロキシノルボルネン－２，３－ジカルボン酸イミド、２－ヒドロキシイミノ－２－シアノ酢酸エチルエステル、２－ヒドロキシイミノ－２－シアノ酢酸アミド、Ｎ－ヒドロキシピペリジン、Ｎ－ヒドロキシフタルイミド、Ｎ－ヒドロキシイミダゾール、Ｎ－ヒドロキシマレイミド等が挙げられる。これら化合物を２種以上用いてもよい。中でも、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（以下、ＮＨＳと表記する場合がある）が、比較的安価で、入手し易いことやペプチド合成分野等で実績があることから、より好適である。
　前記縮合反応に使用する脱水縮合剤としては、特に制限されないが、例えば１－エチル－３－ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（以下、ＥＤＣ・ＨＣｌと表記する場合がある）、１－シクロヘキシル－（２－モルホニル－４－エチル）－カルボジイミド・メソｐ－トルエンスルホネート等が挙げられる。中でもＥＤＣ・ＨＣｌがペプチド合成分野等で汎用的な水溶性縮合剤として実績があることから、より好適である。
　前記ビオチン標識タンパク質におけるビオチンの導入量は、タンパク質とビオチンのモル比を調整することで制御することができる。感度などの性能を高めるためには、ビオチンの導入量は高いものが望ましい。より具体的には、タンパク質のモル数に対してビオチンのモル数が、１．０モル倍以上であることが好ましい。前記モル比は一例であるためタンパク質の種類や現実の感度に応じて適宜増減して良い。
　前記ビオチン標識タンパク質と検出粒子の結合方法としては特に制限されないが、疎水結合による物理吸着、あるいは共有結合を介した結合方法が例示できる。疎水結合においてはビオチン標識タンパク質と検出粒子の表面層で直接的に結合するので、ビオチン標識タンパク質の等電点付近のｐＨで処理することが好ましい。共有結合においては、検出粒子表面の官能基によって、結合方法は異なるが、一例を挙げると検出粒子の表面に存在する官能基がアミノ基の場合は、前述したＮ－ヒドロキシスクシンイミド法を用いて結合することができる。
　反応温度は、特に限定されない。好ましい下限は１０℃、好ましい上限は５０℃である。反応時間は反応温度によって異なり、特に限定されない。好ましい下限は１時間、好ましい上限は２４時間である。なお、反応液中に含まれる未反応のＮ－ヒドロキシアミン系化合物や脱水縮合剤は濾過や遠心分離などにより水溶媒から容易に分離することができる。
　検出粒子としては特に制限されないが、着色粒子や蛍光粒子を用いることができる。着色粒子としては金属粒子、ラテックス粒子、セルロース粒子などを例示することができる。金属粒子としては金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、パラジウムコロイド、金ナノロッド、金ナノプレート、銀ナノプレートなどを例示することができる。金属粒子の粒径は特に制限されないが、粒径１ｎｍ～１００ｎｍのものが好ましい。ラテックス粒子としてはポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、アクリル酸重合体などの材質からなるものを例示することができ、粒径は特に制限されないが、粒径２５ｎｍ～５００ｎｍのものが好ましい。セルロース粒子は、粒径１００ｎｍ～５００ｎｍのものが好ましい。蛍光粒子は、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリビニルトルエン、シリカなどの材質からなるものを例示することができる。蛍光色素は、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、シアニン及びその誘導体などを例示することができる。これらの中でも、汎用性が高く、視認性に優れたラテックス粒子やセルロース粒子を用いることが好ましい。
　本発明において、イムノクロマト試験片を用いてメンブレン上で分析対象物質の測定を行う方法は特に限定されない。例えば、分析対象物質がＨｂＡ１ｃの場合は、以下の方法が例示される。まず、生体試料を必要に応じて生体試料希釈液と混合して展開可能な混合液（生体試料溶液）を得た後、当該混合液をサンプルパッド２に滴下する。当該混合液は、サンプルパッド２を通過してコンジュゲーションパッド３に展開される。前記混合液は、コンジュゲーションパッド３に坦持された検出抗体および標識物質を溶解しながら、ＨｂＡ１ｃと検出抗体（抗ＨｂＡ１ｃ抗体と検出粒子の複合体）が免疫複合体を形成しメンブレンに展開される。その後、さらに毛細管現象によって吸収パッド４側に流れる。前記混合液がメンブレンのテストライン５に到達すると、前記免疫複合体は捕捉抗体（抗Ｈｂ抗体）で捕捉され集積し、テストライン５が発色する。その後、標識物質を含む混合液はテストライン５を通過してコントロールライン６に到達する。ここで標識物質は捕捉抗体（抗ビオチン抗体）で捕捉され集積し、コントロールライン６が発色する。他の混合液は最終的に吸収パッドで吸収される。テストライン５とコントロールライン６の発色強度を、イムノクロマトリーダー等を使用して測定することで分析対象物質の濃度を測定することができる。
　本発明において、イムノクロマト試験片のサンプルパッド部でＨｂの測定を行う方法は特に限定されない。例えば、図３および図４に示す反射光測定装置８を用いる方法が例示される。反射光測定装置８は、イムノクロマト試験片１２を装着部９に固定でき、かつ、固定したイムノクロマト試験片１２のサンプルパッドに光を照射することができる反射光測定装置であって、さらに、発光素子１０より照射した光がサンプルパッドで反射した光を受光できるように受光素子１１を配置してあり、得られた測光値を経時的に測定することができるようになっている。サンプルパッド部に展開した生体試料溶液の呈色度合いを反射光として測定することでＨｂ濃度を測定することができる。その他、ＣＣＤ、Ｃ－ＭＯＳなどを用いた画像解析システムも好適に使用することができる。
　本発明において、Ｈｂ測定用の反射光測定装置とＨｂＡ１ｃ測定用のイムノクロマトリーダーは上記のように独立した装置を用いても良いし、これらが一体型となった装置を用いても良い。また、測定の順番はＨｂが先であっても良いし、ＨｂＡ１ｃが先であっても良い。
　以下、本発明を実施例に基づいてさらに説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。
（保水率の測定）
　保水率は、４ｍｍ×４ｍｍのサイズにカットした多孔質体の質量（Ｍ１）、および前記多孔質体を蒸留水中に１０分間浸漬した後の質量（Ｍ２）から、下記式にて算出した。
　　保水率（％）＝｛（Ｍ２－Ｍ１）／Ｍ１｝×１００
（平均気孔径の測定）
　多孔質体を１２０℃で４時間恒温乾燥したものを下記の測定に用いた。
測定：水銀圧入法により気孔径０．００１８～１００μｍの気孔径分布を求めた。
　　　気孔径はＷａｓｈｂｕｒｎの式を用いて算出した。
　　　Ｗａｓｈｂｕｒｎの式：Ｄ=－４γcosθ／Ｐ
　　　　　　　Ｐ：圧力（Ｐａ）　　　　　γ：水銀の表面張力（Ｎ／ｍ）
　　　　　　　Ｄ：気孔直径（ｍ）　　　　θ：水銀と多孔質体との接触角（ｄｅｇ）
測定条件：多孔質体と水銀の接触角：１４０ｄｅｇ
　　　　　水銀の表面張力０．４８Ｎ／ｍ（１ｄｙｎｅ＝１０－５Ｎで換算）
測定装置：オートポアＩＶ９５２０（ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ社製）
測定数：ｎ＝３⇒これらの平均値を気孔径とした。
　なお、本発明において、気孔径とは、測定圧力から得られた気孔分布曲線において次のように定義した値である。気孔分布曲線におけるメジャーなピークの極大値を本発明の気孔径と定義した。
（気孔率の測定）
　気孔率は、乾燥機で乾燥した多孔質体の真体積を乾式自動密度計にて測定し、多孔質体の見掛け体積と真体積とから、下記式にて算出した。
　　気孔率（％）＝（見掛け体積－真体積）／見掛け体積×１００
（実施例１）
（１）検出抗体（抗ＨｂＡ１ｃ抗体と検出粒子の複合体）の調製
　５μＬの１０％ラテックス粒子（Ｋ０１６、Ｍｅｒｋ ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に４５μＬの５０ｍＭ リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．５）を添加し、１％ラテックス溶液を調製した。市販の抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体（製品名：Ｈｕｍａｎ ＨｂＡ１ｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｃｌｏｎｅ １Ｄ３、品番：ＭＡＢ００３０－ＭＯ６Ａ、Ａｂｎｏｖａ社製）を５０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．５）で１．０ｍｇ／ｍＬに調製した。５μＬの抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体溶液を１％ラテックス粒子溶液に加え、ボルテックスで撹拌した後、室温で1時間静置した。１０μＬの０．３ｗｔ％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（東洋紡社製）（以下、ＢＰＦと略す場合がある）と１．０ｗｔ％ＰＥＧ水溶液（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）（以下、ＰＥＧと略す場合がある）を加え、ボルテックスで撹拌した後、1時間室温で静置した。その後、９,３００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除去した。２００μＬの０．３ｗｔ％ＢＰＦと１．０ｗｔ％ＰＥＧ水溶液を加え、ボルテックスで撹拌した後、室温で1時間静置した。９,３００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除去した。５０μＬの０．３ｗｔ％ＢＰＦ＋１．０ｗｔ％ＰＥＧ水溶液を加え、ボルテックスで撹拌し検出抗体を調製した。
（２）標識物質の調製
　３．１５ｍｇのＤ－ビオチン（ナカライテスク社製）を７２μＬの蒸留水で溶解した。また、１０ｍｇの１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ナカライテスク社製）と１０ｍｇのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ナカライテスク社製）を１００μＬの蒸留水に溶解した。これにＤ－ビオチン溶液を加え、室温で１時間緩やかに攪拌した。前記溶液に８０μＬの３ｗｔ％ＢＰＦ溶液を加え３０分間室温で静置し、ビオチン標識ＢＰＦ溶液を調製した。次に、５μＬの１０％ラテックス粒子に４５μＬの５０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．５）を添加し、１％ラテックス溶液を調製した。１５μＬのビオチン標識ＢＰＦ溶液を１％ラテックス溶液に加え、ボルテックスで撹拌した後、室温で1時間静置した。２００μＬの０．３ｗｔ％ＢＰＦと１．０ｗｔ％ＰＥＧ２００００水溶液を加え、ボルテックスで撹拌した後、1時間室温で静置した。その後、９,３００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除去した。２００μＬの０．３ｗｔ％ＢＳＡと１．０ｗｔ％ＰＥＧ水溶液を加え、ボルテックスで撹拌した後、1時間室温で静置した。９,３００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除去した。５０μＬの０．３ｗｔ％ＢＰＦと１．０ｗｔ％ＰＥＧ水溶液を加え、ボルテックスで撹拌し、標識物質を調製した。
（３）ＨｂＡ１ｃ測定用メンブレンの作製
　２５ｍｍ×１５０ｍｍのニトロセルロースメンブレン（商品名：Ｈｉ－Ｆｌｏｗ　ＰｌｕｓタイプＨＦ１２０（Ｍｅｒｋ ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製））の上流側から１０ｍｍの位置にライン幅約１ｍｍのテストラインとして、１．０ｍｇ／ｍＬの捕捉抗体：抗Ｈｂモノクローナル抗体（製品名：Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ、品番：７０Ｒ－７５８０、Ｆｉｔｇｅｒａｌｄ社製）溶液を、イムノクロマトディスペンサー（ＢＩＯＤＯＴ社製）を用いて１．０μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。次に、ニトロセルロースメンブレンの上流側から１５ｍｍの位置にライン幅約１ｍｍのコントロールラインとして、１．０ｍｇ／ｍＬの抗ビオチンモノクローナル抗体（製品名：Ａｎｔｉ－Ｂｉｏｔｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、品番：ＧＴＸ４４３４４、ＧＥＮＥＴＥＸ社製）溶液をイムノクロマトディスペンサー（ＢＩＯＤＯＴ社製）を用いて１．０μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。その後、４０℃で３０分乾燥し、ＨｂＡ１ｃ測定用メンブレンを作製した。
（４）ＨｂＡ１ｃ測定用コンジュゲーションパッドの作製
　１０ｍｍ×１５０ｍｍのコンジュゲーションパッド（ＧＬＡＳＳＦＩＢＥＲ　ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣ　ＰＡＤ　ＧＦＤＸ（Ｍｅｒｋ ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製））に前記検出抗体と標識物質の混合液（混合比６：１）２２５μＬをイムノクロマトディスペンサー（ＢＩＯＤＯＴ社製）を用いて１５μＬ／ｃｍになるように均一に噴霧した。その後、４０℃で３０分乾燥し、ＨｂＡ１ｃ測定用コンジュゲーションパッドを作製した。
（５）イムノクロマト試験片の作製
　イムノクロマト試験片は、イムノクロマトグラフで一般的に使用される構成で作製した。具体的には、サンプルパッド（商品名ピオラスシートＥＶＡ　厚さ１ｍｍ（アイオン社製））、前記ＨｂＡ１ｃ測定用コンジュゲーションパッド、前記ＨｂＡ１ｃ測定用メンブレン、吸収パッド（ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ　ＦＩＢＥＲ　ＳＡＭＰＬＥ　ＰＡＤＳ　ＣＦＳＰ（Ｍｅｒｋ ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製））を、各々端部が一部重なるように連接配置し、幅４ｍｍ、長さ６０ｍｍのイムノクロマト試験片を作製した。用いたサンプルパッドの保水率は３４０ｗｔ％、気孔率は７７％、平均気孔径は２５μｍであった。
（６）Ｈｂ試料の調製
　市販のＨｂ標準物質である総ヘモグロビン常用参照標準物質ＪＣＣＲＭ９１２－２（一般社団法人　検査医学標準物質機構社製）３水準を生体試料希釈液（５０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４＋１．０ｗｔ％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）で５００倍に希釈し、ＨｂＡ１ｃ（％）が５．２％で、Ｈｂ濃度が０．１５６ｇ／Ｌ、０．２７４ｇ／Ｌ、０．３５９ｇ／Ｌの各Ｈｂ試料（３水準）を調製した。
（７）ＨｂＡ１ｃ試料の調製
　市販のＨｂＡ１ｃ標準物質であるＨｂＡ１ｃ測定性能評価用試料ＱＲＭ ＨｂＡ１ｃ ２００７－１（一般社団法人検査医学標準物質機構社製）４水準を生体試料希釈液（５０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４＋１．０ｗｔ％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）で５００倍に希釈しＨｂ濃度が０．３２０ｇ／Ｌで、ＨｂＡ１ｃ（％）が５．２９％、６．９６％、９．０８％、１０．７９％の各ＨｂＡ１ｃ試料（４水準）を調製した。
（８）Ｈｂ濃度（ｇ／Ｌ）の検量線の作成
　得られたイムノクロマト試験片を水平な台に設置した。次に、前記Ｈｂ試料（３水準）１００μＬをマイクロピペットで分取し、サンプルパッドに緩やかに滴下した。滴下してから１分後、サンプルパッド部のＨｂを反射光測定装置を用いて測定した。結果、Ｈｂ濃度に応じた反射吸光度を確認することができた。Ｈｂ測定の結果（ｎ＝１０の平均値）を表１に示す。また、Ｈｂ濃度（Ｘ軸）と反射吸光度（Ｙ軸）の相関性からＨｂの検量線を作成した。結果を図５に示す。
　Ｈｂの検量線はＹ＝３８８Ｘ＋０．６１３となった。なお、測定の感度はＨｂ試料の高濃度品（０．３５９ｇ／Ｌ）の反射吸光度と、低濃度品（０．１５６ｇ／Ｌ）の反射吸光度の差：ΔＨｂで評価し、ΔＨｂ＞５０ｍＡｂｓをｇｏｏｄ、１０ｍＡｂｓ≦ΔＨｂ≦５０ｍＡｂｓをａｖｅｒａｇｅ、ΔＨｂ＜１０ｍＡｂｓをｂａｄとした。また、測定の再現性は、反射吸光度のｎ＝１０のＣＶ（％）で評価し、ＣＶ（％）＜５％をｇｏｏｄ、５％≦ＣＶ（％）≦１０％をａｖｅｒａｇｅ、ＣＶ（％）＞１０％をｂａｄとした。
　さらに、測定の安定性はＨｂ試料の高濃度品（０．３５９ｇ／Ｌ）の反射吸光度を経時的に測定し、１０分後の反射吸光度と、１分後の反射吸光度の差：Δ１０で評価し、Δ１０＜２０ｍＡｂｓをｇｏｏｄ、２０ｍＡｂｓ≦Δ１０≦３０ｍＡｂｓをａｖｅｒａｇｅ、Δ１０＞３０ｍＡｂｓをｂａｄとした。
　これらの結果、実施例１のイムノクロマト試験片は、感度：ΔＨｂ＝８０ｍＡｂｓでｇｏｏｄ、再現性：ＣＶ（％）＝３％でｇｏｏｄ、安定性：Δ１０＝１５ｍＡｂｓでｇｏｏｄと、良好であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（９）ＨｂＡ１ｃ（％）の検量線の作成
　得られたイムノクロマト試験片を水平な台に設置した。次に、ＨｂＡ１ｃ試料（４水準）１００μＬをマイクロピペットで分取し、サンプルパッドに緩やかに滴下した。滴下してから１０分後、メンブレン上のテストラインとコントロールラインをイムノクロマトリーダー（浜松ホトニクス社製：Ｃ１００６０－１０）を用いて測定した。結果、テストライン（Ｔ）はＨｂＡ１ｃ濃度に応じた反射吸光度を確認することができた。また、コントロールライン（Ｃ）はＨｂＡ１ｃ濃度に依存せず一定の反射吸光度を確認することができた。テストラインの反射吸光度をコントロールラインの反射吸光度で割算し、補正値（Ｔ／Ｃ）とした。ＨｂＡ１ｃ測定値(テストライン測定値)、コントロールライン測定値、補正値の結果（ｎ＝１０の平均値）を表２に示す。また、ＨｂＡ１ｃ濃度（Ｘ軸）と補正値（Ｙ軸）の相関性からＨｂＡ１ｃの検量線を作成した。結果を図６に示す。
　ＨｂＡ１ｃの検量線はＹ＝０．０５１９Ｘ＋０．０９４５となった。なお、測定の感度はＨｂＡ１ｃ試料の高濃度品（１０．７９％）のテストラインの反射吸光度と、低濃度品（５．２９％）のテストラインの反射吸光度の差：ΔＨｂＡ１ｃで評価し、ΔＨｂＡ１ｃ＞１００ｍＡｂｓをｇｏｏｄ、５０ｍＡｂｓ≦ΔＨｂＡ１ｃ≦１００ｍＡｂｓをａｖｅｒａｇｅ、ΔＨｂＡ１ｃ＜５０ｍＡｂｓをｂａｄとした。
　これらの結果、実施例１のイムノクロマト試験片は、感度：ΔＨｂＡ１ｃ＝１２５ｍＡｂｓでｇｏｏｄであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（実施例２）
　サンプルパッドとして、ポリエチレン製の多孔質シート（商品名：ピオラスシートＰＥ　厚さ１ｍｍ（アイオン社製））を用いた以外は、実施例１と同様にしてイムノクロマト試験片を作製した。サンプルパッドの保水率は２９０ｗｔ％、気孔率は７４％、平均気孔径は２５μｍであった。
　Ｈｂ測定の結果は、感度：ΔＨｂ＝６０ｍＡｂｓでｇｏｏｄ、再現性：ＣＶ（％）＝４％でｇｏｏｄ、安定性：Δ１０＝１８ｍＡｂｓでｇｏｏｄであった。また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果は、感度：ΔＨｂＡ１ｃ＝１０５ｍＡｂｓでｇｏｏｄであった。
（実施例３）
　サンプルパッドとして、ウレタン製の多孔質シート（商品名：ＡＣスポンジＵ　厚さ１ｍｍ（エー・シーケミカル社製））を用いた以外は、実施例１と同様にしてイムノクロマト試験片を作製した。サンプルパッドの保水率は３５０ｗｔ％、気孔率は８５％、平均気孔径は６０μｍであった。
　Ｈｂ測定の結果は、感度：ΔＨｂ＝９０ｍＡｂｓでｇｏｏｄ、再現性：ＣＶ（％）＝４％でｇｏｏｄ、安定性：Δ１０＝１５ｍＡｂｓでｇｏｏｄであった。また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果は、感度：ΔＨｂＡ１ｃ＝１４０ｍＡｂｓでｇｏｏｄであった。
（実施例４）
　サンプルパッドとして、ポリ塩化ビニル製の多孔質シート（商品名：ＡＣスポンジＶ　厚さ１ｍｍ（エー・シーケミカル社製））を用いた以外は、実施例１と同様にしてイムノクロマト試験片を作製した。サンプルパッドの保水率は４００ｗｔ％、気孔率は７５％、平均気孔径は６０μｍであった。
　Ｈｂ測定の結果は、感度：ΔＨｂ＝７０ｍＡｂｓでｇｏｏｄ、再現性：ＣＶ（％）＝４％でｇｏｏｄ、安定性：Δ１０＝１７ｍＡｂｓでｇｏｏｄであった。また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果は、感度：ΔＨｂＡ１ｃ＝１１０ｍＡｂｓでｇｏｏｄであった。
（実施例５）
　サンプルパッドとして、ポリエチレン製の多孔質シート（商品名：ＡＣスポンジＯ　厚さ１ｍｍ（エー・シーケミカル社製））を用いた以外は、実施例１と同様にしてイムノクロマト試験片を作製した。サンプルパッドの保水率は２５０ｗｔ％、気孔率は７５％、平均気孔径は６０μｍであった。
　Ｈｂ測定の結果は、感度：ΔＨｂ＝６０ｍＡｂｓでｇｏｏｄ、再現性：ＣＶ（％）＝４％でｇｏｏｄ、安定性：Δ１０＝１５ｍＡｂｓでｇｏｏｄであった。また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果は、感度：ΔＨｂＡ１ｃ＝１１０ｍＡｂｓでｇｏｏｄであった。
（実施例６）
　サンプルパッドとして、ポリビニルアルコール製の多孔質シート（商品名：ベルクリン　厚さ１ｍｍ（アイオン社製））を用いた以外は、実施例１と同様にしてイムノクロマト試験片を作製した。サンプルパッドの保水率は１０００ｗｔ％、気孔率は８９％、平均気孔径は８０μｍであった。
　Ｈｂ測定の結果は、感度：ΔＨｂ＝１１０ｍＡｂｓでｇｏｏｄ、再現性：ＣＶ（％）＝７％でａｖｅｒａｇｅ、安定性：Δ１０＝８ｍＡｂｓでｇｏｏｄであった。また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果は、感度：ΔＨｂＡ１ｃ＝６０ｍＡｂｓでａｖｅｒａｇｅであった。
（実施例７）
　実施例１において、Ｈｂ標準物質を生体試料希釈液で３００倍に希釈したもの、およびＨｂＡ１ｃ標準物質を生体試料希釈液で３００倍に希釈したものを用いた以外は、実施例１と同様にして実験を行った。
　Ｈｂ測定の結果は、感度：ΔＨｂ＝２００ｍＡｂｓでｇｏｏｄ、再現性：ＣＶ（％）＝２％でｇｏｏｄ、安定性：Δ１０＝１８ｍＡｂｓでｇｏｏｄであった。また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果は、感度：ΔＨｂＡ１ｃ＝１１５ｍＡｂｓでｇｏｏｄであった。
（実施例８）
　実施例１において、Ｈｂ標準物質を生体試料希釈液で１０００倍に希釈したもの、およびＨｂＡ１ｃ標準物質を生体試料希釈液で１０００倍に希釈したものを用いた以外は、実施例１と同様にして実験を行った。
　Ｈｂ測定の結果は、感度：ΔＨｂ＝６０ｍＡｂｓでｇｏｏｄ、再現性：ＣＶ（％）＝４％でｇｏｏｄ、安定性：Δ１０＝５ｍＡｂｓでｇｏｏｄであった。また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果は、感度：ΔＨｂＡ１ｃ＝１２０ｍＡｂｓでｇｏｏｄであった。
（比較例１）
　サンプルパッドとして、セルロース製のろ紙（ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ　ＦＩＢＥＲ　ＳＡＭＰＬＥ　ＰＡＤＳ　ＣＦＳＰ（Ｍｅｒｋ ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製））を用いた以外は、実施例１と同様にしてイムノクロマト試験片を作製した。
　Ｈｂ測定の結果は、感度：ΔＨｂ＝２０ｍＡｂｓでａｖｅｒａｇｅ、再現性：ＣＶ（％）＝１２％でｂａｄ、安定性：Δ１０＝２５ｍＡｂｓでａｖｅｒａｇｅであった。また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果は、感度：ΔＨｂＡ１ｃ＝１１０ｍＡｂｓでｇｏｏｄであった。
（比較例２）
　サンプルパッドとして、ガラス繊維製のろ紙（ＧＬＡＳＳＦＩＢＥＲ　ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣ　ＰＡＤ　ＧＦＤＸ（Ｍｅｒｋ ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製））を用いた以外は、実施例１と同様にしてイムノクロマト試験片を作製した。
　Ｈｂ測定の結果は、感度：ΔＨｂ＝８ｍＡｂｓでｂａｄ、再現性：ＣＶ（％）＝１１％でｂａｄ、安定性：Δ１０＝２０ｍＡｂｓでａｖｅｒａｇｅであった。また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果は、感度：ΔＨｂＡ１ｃ＝１３０ｍＡｂｓでｇｏｏｄであった。
（比較例３）
　比較例２において、Ｈｂ標準物質を生体試料希釈液で１０００倍に希釈したもの、およびＨｂＡ１ｃ標準物質を生体試料希釈液で１０００倍に希釈したものを用いた以外は、実施例１と同様にして実験を行った。
　Ｈｂ測定の結果は、感度：ΔＨｂ＝５ｍＡｂｓでｂａｄ、再現性：ＣＶ（％）＝１３％でｂａｄ、安定性：Δ１０＝１７ｍＡｂｓでｇｏｏｄであった。また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果は、感度：ΔＨｂＡ１ｃ＝９０ｍＡｂｓでａｖｅｒａｇｅであった。
（比較例４）
　サンプルパッドとして、ポリビニルアルコール製の多孔質シート（商品名：ＡＣスポンジＰ　厚さ１ｍｍ（エー・シーケミカル社製））を用いた以外は、実施例１と同様にしてイムノクロマト試験片を作製した。サンプルパッドの保水率は１１００ｗｔ％、気孔率は９０％、平均気孔径は１３０μｍであった。
　Ｈｂ測定の結果は、感度：ΔＨｂ＝１２０ｍＡｂｓでｇｏｏｄ、安定性：Δ１０＝１０ｍＡｂｓでｇｏｏｄであったものの、再現性：ＣＶ（％）＝１５％でｂａｄであった。また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果は、感度：ΔＨｂＡ１ｃ＝４０ｍＡｂｓでｂａｄであった。測定後のサンプルパッドは検出粒子の逆流により、少し青みがかっていた。
（比較例５）
　サンプルパッドとして、ポリウレタン製の多孔質シート（商品名：ルビセルクリーンＲＫ厚さ０．８ｍｍ（ハーベスト社製））を用いた以外は、実施例１と同様にしてイムノクロマト試験片を作製した。サンプルパッドの保水率は４６０％、気孔率は８０％、平均気孔径は６μｍであった。
　Ｈｂ測定の結果は、感度：ΔＨｂ＝１１０ｍＡｂｓでｇｏｏｄ、安定性：Δ１０＝１０ｍＡｂｓでｇｏｏｄであったものの、再現性：ＣＶ（％）＝１３％でｂａｄであった。また、ＨｂＡ１ｃ測定の結果は、感度：ΔＨｂＡ１ｃ＝４０ｍＡｂｓでｂａｄであった。測定後のサンプルパッドは検出粒子の逆流により、少し青みがかっていた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　本発明により、簡便で測定精度の高いイムノクロマト試験片を提供することができる。
１：メンブレン
２：サンプルパッド
３：コンジュゲーションパッド
４：吸収パッド
５：テストライン
６：コントロールライン
７：粘着シート
８：反射光測定装置
９：装着部
１０：発光素子
１１：受光素子

Claims (5)

  1. 　サンプルパッド、コンジュゲーションパッド、メンブレン、吸収パッドが順に連接配置されたイムノクロマト試験片であって、前記サンプルパッドは、保水率が２００ｗｔ％～１０００ｗｔ％、平均気孔径が２０μｍ～１００μｍである多孔質体からなる、試験片。
  2. 　前記サンプルパッドは、ポリエチレン、ポリビニルアルコール、エチレン／酢酸ビニル共重合体、ポリウレタン、ポリ塩化ビニルからなる群から選ばれる１種以上である、請求項１に記載の試験片。
  3. 　請求項１または２に記載のイムノクロマト試験片、生体試料希釈液およびイムノクロマトリーダーおよび／または反射光測定装置を含む、イムノクロマト測定キット。
  4. 　請求項１または２に記載のイムノクロマト試験片、または請求項３に記載のイムノクロマト測定キットを用い、下記（ｉ）から（ｉｉｉ）の工程を順に経て、前記生体試料中のヘモグロビンおよび分析対象物質を定量する方法。
    　工程（ｉ）：生体試料と生体試料希釈液とを体積比１：１００～１：１０００で混合して生体試料溶液を調製する工程
    　工程（ｉｉ）：前記生体試料溶液を、サンプルパッドに点着する工程
    　工程（ｉｉｉ）：サンプルパッドの色味からヘモグロビンを比色定量する工程、およびメンブレン部のラインの色味から分析対象物質を比色定量する工程
  5. 　前記分析対象物質は、ヘモグロビンＡ１ｃである、請求項４に記載の方法。
     
     
PCT/JP2018/013311 2017-03-31 2018-03-29 イムノクロマト試験片およびキットおよび測定方法 WO2018181741A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019510141A JP7131546B2 (ja) 2017-03-31 2018-03-29 イムノクロマト試験片およびキットおよび測定方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017070525 2017-03-31
JP2017-070525 2017-03-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018181741A1 true WO2018181741A1 (ja) 2018-10-04

Family

ID=63676416

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2018/013311 WO2018181741A1 (ja) 2017-03-31 2018-03-29 イムノクロマト試験片およびキットおよび測定方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP7131546B2 (ja)
WO (1) WO2018181741A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020091029A1 (ja) * 2018-11-02 2020-05-07 積水メディカル株式会社 マイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的検出方法
JP2021156809A (ja) * 2020-03-30 2021-10-07 アドテック株式会社 溶媒含有物質検査キット

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006080438A1 (ja) * 2005-01-28 2006-08-03 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. イムノクロマト用試験具およびこれを用いた半定量方法
WO2012137832A1 (ja) * 2011-04-05 2012-10-11 オリンパス株式会社 膵臓検査方法および膵臓検査キット
WO2013147200A1 (ja) * 2012-03-29 2013-10-03 積水メディカル株式会社 ヘマトクリット値の測定方法
JP2015049158A (ja) * 2013-09-02 2015-03-16 アイオン株式会社 吸収パッド
WO2015166969A1 (ja) * 2014-04-30 2015-11-05 田中貴金属工業株式会社 免疫クロマト分析キット、免疫クロマト分析装置及び免疫クロマト分析方法
JP2016125875A (ja) * 2014-12-26 2016-07-11 ロート製薬株式会社 サンプルパッドおよびそれを用いた液体試料検査具
JP2016176938A (ja) * 2015-03-19 2016-10-06 株式会社リコー 検査装置、転写材、検査装置の製造方法、及び検査キット
US20170074873A1 (en) * 2015-09-11 2017-03-16 Rega Biotechnology Inc. Immunoassay kit

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006080438A1 (ja) * 2005-01-28 2006-08-03 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. イムノクロマト用試験具およびこれを用いた半定量方法
WO2012137832A1 (ja) * 2011-04-05 2012-10-11 オリンパス株式会社 膵臓検査方法および膵臓検査キット
WO2013147200A1 (ja) * 2012-03-29 2013-10-03 積水メディカル株式会社 ヘマトクリット値の測定方法
JP2015049158A (ja) * 2013-09-02 2015-03-16 アイオン株式会社 吸収パッド
WO2015166969A1 (ja) * 2014-04-30 2015-11-05 田中貴金属工業株式会社 免疫クロマト分析キット、免疫クロマト分析装置及び免疫クロマト分析方法
JP2016125875A (ja) * 2014-12-26 2016-07-11 ロート製薬株式会社 サンプルパッドおよびそれを用いた液体試料検査具
JP2016176938A (ja) * 2015-03-19 2016-10-06 株式会社リコー 検査装置、転写材、検査装置の製造方法、及び検査キット
US20170074873A1 (en) * 2015-09-11 2017-03-16 Rega Biotechnology Inc. Immunoassay kit

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020091029A1 (ja) * 2018-11-02 2020-05-07 積水メディカル株式会社 マイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的検出方法
JP2021156809A (ja) * 2020-03-30 2021-10-07 アドテック株式会社 溶媒含有物質検査キット
JP7208640B2 (ja) 2020-03-30 2023-01-19 アドテック株式会社 溶媒含有物質検査キット

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2018181741A1 (ja) 2020-03-05
JP7131546B2 (ja) 2022-09-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8093057B2 (en) System for quantitative measurement of glycohemoglobin and method for measuring glycohemoglobin
JP3543000B2 (ja) バイオセンサ
JP4383860B2 (ja) バイオセンサ、及び測定方法
JP7352831B2 (ja) イムノクロマト試験片および測定キットおよび測定方法
KR100910982B1 (ko) 당화헤모글로빈의 정량분석을 위한 시스템 및 이를 이용한당화헤모글로빈 측정 방법
KR101947884B1 (ko) 면역 크로마토그래피 분석 방법
JP6741013B2 (ja) イムノクロマト試験片
JP7184054B2 (ja) 測定試料希釈液およびキットおよび測定方法
JP4562854B2 (ja) クロマトグラフィー測定方法
EP3076177B1 (en) Immunochromatography-assisted detection method
JP6103776B2 (ja) ヘマトクリット値の測定方法
JP2019196917A (ja) 測定試料希釈液
JP5590651B2 (ja) 血液試料の品質評価方法
JP4223163B2 (ja) 免疫クロマトグラフィー試験片、及びクロマトグラフ分析方法
WO2018181741A1 (ja) イムノクロマト試験片およびキットおよび測定方法
WO2017094825A1 (ja) イムノクロマト試験片
JP3920741B2 (ja) 物質の検出試薬及び検出方法
JP2019015583A (ja) イムノクロマト試験片
JP2011209069A (ja) 高感度免疫測定法
JP4990692B2 (ja) イムノクロマトグラフィー測定法及びキット
JP2010032396A (ja) バイオセンサ
JP2021162467A (ja) イムノクロマト試験片およびそれを用いた測定方法
JPWO2020166698A1 (ja) イムノクロマト試験片およびそれを用いた測定方法
JP6939106B2 (ja) イムノクロマト試験片およびキットおよび測定方法
JP6595215B2 (ja) 免疫クロマト分析装置およびその製造方法並びに免疫クロマト分析方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18775738

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019510141

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 18775738

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1