WO2020091029A1 - マイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的検出方法 - Google Patents

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WO2020091029A1
WO2020091029A1 PCT/JP2019/042968 JP2019042968W WO2020091029A1 WO 2020091029 A1 WO2020091029 A1 WO 2020091029A1 JP 2019042968 W JP2019042968 W JP 2019042968W WO 2020091029 A1 WO2020091029 A1 WO 2020091029A1
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mycoplasma pneumoniae
ether
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protein
synthetic
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泰史 落合
知史 中村
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積水メディカル株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a method for immunologically detecting Mycoplasma pneumoniae.
  • it relates to a method for immunologically detecting Mycoplasma pneumoniae using an antibody against the P30 protein of Mycoplasma pneumoniae.
  • Mycoplasma pneumoniae is a respiratory tract infection caused by Mycoplasma pneumoniae, which has a high morbidity rate in children, 30% of patients under 4 years old, and 60% or more under 9 years old. Occupy. Most patients with mycoplasma pneumonia have only bronchitis, but some may become more severe and may also develop pneumonia and other complications. Therefore, since rapid definitive diagnosis and selection of an appropriate antibacterial drug are important, immunochromatographic analysis is suitable because the operation is simple and rapid detection is possible.
  • Patent Document 1 discloses an immunochromatographic analyzer using a monoclonal antibody specific for the P30 protein of Mycoplasma pneumoniae.
  • Patent Document 2 discloses an immunochromatographic analyzer using an antibody specific to the ribosomal protein Ribosome Protein L7 / L12 of Mycoplasma pneumoniae.
  • Patent Document 1 discloses a kit in which a sample diluent containing a nonionic surfactant having an HLB value of 13 to 17 is used together with the immunochromatographic analyzer.
  • nonionic surfactants 13 to 17 there are enormous kinds of nonionic surfactants 13 to 17, and what is actually described in Examples is polyoxyethylene octyl phenyl ether (triton X-100) and polyoxyethylene sorbitan monooleate.
  • Tween 20 1: 1 mixture and only 1: 1 mixture of polyoxyethylene octyl phenyl ether (nonidet p-40) and polyoxyethylene / polyoxypropylene-alkyl ether (nonion MN-811).
  • Patent Document 2 discloses a kit in which a sample diluent containing a polyoxyethylene alkyl ether and a nonionic surfactant having an HLB value of 12 to 15 is used together with the immunochromatographic analyzer.
  • the antibody has been confirmed only for the antibody against the ribosomal protein L7 / L12 of Mycoplasma pneumoniae, and the effect of these nonionic surfactants for the antibody for the P30 protein has not been disclosed or suggested.
  • a technique for highly sensitive detection has not yet been established.
  • An object of the present invention is to provide a method for detecting Mycoplasma pneumoniae with high sensitivity in an immunological detection method for carrying out an immune reaction using an antibody against Mycoplasma pneumoniae P30 protein.
  • the present inventors have conducted an immune reaction using an antibody against Mycoplasma pneumoniae P30 protein in the presence of a specific nonionic surfactant to enhance Mycoplasma pneumoniae. They have found that they can be detected with high sensitivity and have completed the present invention. That is, the present invention has the following configurations.
  • the immunological detection method is a method using immunochromatography.
  • the method according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the method of detection using immunochromatography includes the following steps (A) to (C).
  • A Sample containing Mycoplasma pneumoniae, polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene oleyl ether, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyalkylene branched decyl ether, polyoxyalkylene alkyl ether, polyethylene glycol monolaurate, synthetic alcohol Mixing a sample diluent containing one or more nonionic surfactants selected from the group consisting of EO adducts, synthetic secondary alcohol EO adducts, and synthetic alcohol EO / PO adducts
  • B A process test strip for supplying the mixture obtained in (A) to the sample supply unit;
  • the membrane comprises a porous body having at least a sample supply part, a developing part and a detecting part, and a part of the developing part is provided with an antibody against the P30 protein of the first Mycoplasma pneumoniae labeled with a labeling substance.
  • the conjugate containing is retained so that it can be eluted, and further has a detection part, which is a part of the development part and is downstream of the conjugate retention part, in which an antibody against the P30 protein of Mycoplasma pneumoniae is immobilized (C )
  • a step ⁇ 4> of detecting a complex of Mycoplasma pneumoniae and a conjugate in a sample at a detection part A Mycoplasma pneumoniae detection kit including the following configurations (1) and (2).
  • Detection reagent using an antibody against P30 protein of Mycoplasma pneumoniae (2) Polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene oleyl ether, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyalkylene branched decyl ether, polyoxyalkylene alkyl ether, Sample diluent ⁇ 5> containing one or more nonionic surfactants selected from the group consisting of polyethylene glycol monolaurate, synthetic alcohol EO adduct, synthetic secondary alcohol EO adduct, and synthetic alcohol EO / PO adduct.
  • the detection kit according to ⁇ 4>, wherein the detection reagent using the antibody against the Mycoplasma pneumoniae P30 protein of (1) has the following configuration (1) ′.
  • (1) 'A P30 of the first Mycoplasma pneumoniae having a membrane made of a porous body having at least a sample supply unit, a developing unit and a detecting unit, and a part of the developing unit being labeled with a labeling substance.
  • a conjugate containing an antibody against the protein is retained so that it can be eluted, and an antibody against the P30 protein of the second Mycoplasma pneumoniae is immobilized at a part of the development part and downstream of the part holding the conjugate.
  • Immunochromatographic test strip ⁇ 6> having a detection part A sample diluent in an immunological detection method using an antibody against Mycoplasma pneumoniae P30 protein, which comprises polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene oleyl ether, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyalkylene branched decyl ether, and polyoxy.
  • the above dilution containing one or more nonionic surfactants selected from the group consisting of alkylene alkyl ethers, polyethylene glycol monolaurate, synthetic alcohol EO adducts, synthetic secondary alcohol EO adducts, and synthetic alcohol EO / PO adducts. liquid.
  • a method for improving detection sensitivity in a method for immunologically detecting Mycoplasma pneumoniae using an antibody against P30 protein of Mycoplasma pneumoniae comprising: Polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene oleyl ether, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyalkylene branched decyl ether, polyoxyalkylene alkyl ether, polyethylene glycol monolaurate, synthetic alcohol EO adduct, synthetic secondary alcohol EO adduct And a synthetic alcohol EO / PO adduct, wherein the immune reaction is carried out in the presence of one or more nonionic surfactants selected from the group consisting of EO / PO adducts.
  • the present invention polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene oleyl ether, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyalkylene branched decyl ether, polyoxyalkylene alkyl ether, polyethylene glycol monolaurate, synthetic alcohol EO adduct, synthetic secondary
  • an immune reaction using an antibody against Mycoplasma pneumoniae P30 protein in the presence of one or more nonionic surfactants selected from the group consisting of alcohol EO adducts and synthetic alcohol EO / PO adducts
  • Mycoplasma pneumoniae Can be detected with high sensitivity.
  • test strip of this invention It is a schematic block diagram of the test strip of this invention.
  • a sample refers to a specimen that may contain Mycoplasma pneumoniae, which is a detection target and is collected from a patient.
  • the patient specimen may be used as a sample as it is, or may be appropriately diluted with a sample diluent to give a sample.
  • the sample diluent may be referred to as a sample diluent, a sample extract, a sample developing solution, a sample suspension, etc., but they are all used synonymously.
  • the immunological detection method of the present invention comprises polyoxyethylene lauryl ether, polyoxyethylene oleyl ether, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyalkylene branched decyl ether, polyoxyalkylene alkyl ether, polyethylene glycol monolaurate, synthetic alcohol EO.
  • One or more nonionic surfactants selected from the group consisting of adducts, synthetic secondary alcohol EO adducts, and synthetic alcohol EO / PO adducts hereinafter, abbreviated to "specific nonionic surfactants" in the present specification). (Sometimes referred to as an "agent").
  • HLB of these specific nonionic surfactants of the present invention is preferably about 5.0 to 18.0, more preferably 6.0 to 16.0, and more preferably 7. 0 to 12.0 is even more preferable, and 9.0 to 11.0 is the most preferable.
  • polyoxyethylene lauryl ether is sold under the trade names of Emulgen (registered trademark, the same applies hereinafter) 108, Emulgen 103, Emulgen 106, Emulgen 123P, Brij (registered trademark, the same applies below) 35, etc. Is mentioned.
  • Examples of the polyoxyethylene oleyl ether include those sold under the trade names of Emulgen 420 and Emulgen 430.
  • Examples of the polyoxyethylene alkyl ether include those sold under the trade names of Emulgen 705 and Emulgen 1108.
  • Examples of the polyoxyalkylene branched decyl ether include those sold under the trade names of Neugen (registered trademark, the same applies hereinafter) XL-90, and polyoxyalkylene alkyl ethers such as Emulgen LS-114.
  • Examples of polyethylene glycol monolaurate include those sold under the trade names of Emanone (registered trademark) 1112 and the like.
  • Examples of synthetic alcohol EO adducts include Leocol (registered trademark, the same applies hereinafter) TD-50, Leocol TD-70, and Leocol TD-90, and synthetic secondary alcohol EO adducts are Leocol SC-120 and Leocor SC. -400, synthetic alcohol EO / PO adducts include Lyonol (registered trademark, the same applies hereinafter) L-950, and Lyonol TD730.
  • the concentration of the specific nonionic surfactant in the immune reaction system is preferably 0.01% to 10.0%, more preferably 0.1% to 5%, even more preferably 0.2% to 3%. 0.3 to 1.5% is the most preferable.
  • the specific nonionic surfactant of the present invention may be directly added to the immune reaction system, but typically, it is contained in the sample diluent as described later, An embodiment in which it is present in the immune reaction system by contacting it with an antibody against Mycoplasma pneumoniae P30 protein is included.
  • the sample diluent of the present invention preferably contains a specific nonionic surfactant and further contains a buffer.
  • the lower limit of the concentration of the specific nonionic surfactant in the sample diluent of the present invention is preferably 0.01% or more, more preferably 0.1% or more, even more preferably 0.2% or more, and even more preferably 0.1. 3% or more is the most preferable.
  • the upper limit is preferably 10.0% or less, more preferably 5% or less, even more preferably 3% or less, most preferably 1.5% or less.
  • the concentration range is preferably 0.01% to 10.0%, more preferably 0.1% to 5%, even more preferably 0.2% to 3%, and 0.3 to 1.5%. Most preferred.
  • Examples of the buffer solution contained in the sample diluent according to the present invention include a commonly used buffer solution such as a phosphate buffer solution, a Tris buffer solution, and a Good's buffer solution.
  • the sample diluent of the present invention may be any solution containing the above compound and a buffer solution, may be a buffer solution containing the above compound, and further salts such as sodium chloride, stabilizers and preservatives such as sucrose, Procrine (registered trademark). ) Etc. may be included. Salts include those added for the purpose of adjusting the ionic strength such as sodium chloride, and those added for the purpose of adjusting the pH of the buffer solution such as sodium hydroxide.
  • the pH of the sample diluent of the present invention is preferably in the range of 6.0 to 10.0, more preferably 7.0 to 9.0, and even more preferably 7.5 to 8.5. Since the sample diluting solution of the present invention is a solution for diluting a sample, the role of adding a sample (specimen) containing Mycoplasma pneumoniae to the sample diluting solution to dissolve, extract, or disperse the sample Is responsible for Therefore, typically, the sample and sample diluent are mixed at the time the sample is applied to the sample pad of the test strip.
  • the sample is supplied directly or diluted with another diluent other than the sample diluent of the present invention to the sample pad, and at the same time or after a delay, the sample diluent of the present invention is supplied to the sample pad.
  • the case is also included in the detection method of the present invention.
  • the immunological detection method of the present invention may be any detection method utilizing an immune reaction, and examples thereof include a latex immunoagglutination method (hereinafter referred to as LTIA method) which is a particle agglutination immunoassay method, and typical sandwich immunization.
  • LTIA method latex immunoagglutination method
  • An ELISA method which is a measurement method and a labeled immunoassay method, a detection method using immunochromatography, and the like can be mentioned.
  • the detection method using immunochromatography is particularly preferable.
  • Examples of the detection method using immunochromatography include a Fluo-slow method and a lateral flow method, and a detection method using lateral flow immunochromatography is desirable because it is simple and rapid.
  • the sample can be diluted with the sample diluent of the present invention and then mixed with a latex reagent to detect an immune agglutination reaction.
  • the latex reagent is composed of the first reagent containing the buffer solution and the second reagent containing the latex reagent, the sample diluent of the present invention can be used as the first reagent.
  • the present invention also provides a sample pretreatment method for immunologically detecting Mycoplasma pneumoniae, which comprises a step of contacting a specific nonionic surfactant with a sample containing Mycoplasma pneumoniae.
  • pretreatment can be performed by including a specific nonionic surfactant in the sample diluent and mixing the sample diluent with the sample.
  • the substance to be detected in the present invention is Mycoplasma pneumoniae.
  • the present invention directly detects or quantifies the presence of Mycoplasma pneumoniae by detecting Mycoplasma pneumoniae P30 protein using an antibody against Mycoplasma pneumoniae P30 protein.
  • the immunochromatographic test strip of the present invention is a test strip for detecting a complex of a substance to be detected and a conjugate in a sample by expanding the sample in an insoluble membrane.
  • the test strip has a membrane made of a porous body including (1) sample supply section, (2) development section, and (3) detection section, and a part of the development section is labeled with a labeling substance.
  • the thus-obtained conjugate containing the first antibody is retained so that it can be eluted, and further has a detection part, which is a part of the development part and has the second antibody immobilized on the downstream side of the conjugate holding part.
  • the specific nonionic surfactant of the present invention may be contained in the sample diluent, or may be impregnated in a part of the pad constituting the test strip.
  • the conjugate is an antibody in which an antibody that immunologically reacts with the substance to be detected is immobilized on a labeled body.
  • the conjugate is used as a conjugate pad such as a sample pad, a third pad, an insoluble membrane. It may exist in a state of being impregnated with another pad other than (Type A), or may exist as a conjugate part in a part of the sample pad (Type B). Alternatively, it may be present as a separate conjugation reagent to be mixed with the analyte (type C).
  • test strip of the type A in which the conjugate is present will be described.
  • the sample pad, the conjugate pad, the third pad, and the insoluble membrane are arranged in this order from upstream to downstream in the flow direction of the sample, and they are arranged so as to at least partially overlap the upper and lower layers, respectively.
  • a test strip having such an arrangement is shown in FIG.
  • the complex is then passed through a porous third pad that is placed in contact with the lower surface of the conjugate pad and deployed to the insoluble membrane. Since the antibody that immunologically reacts with the substance to be detected is immobilized on a part of the insoluble membrane, the complex is bound and immobilized by the immunoreaction here.
  • the immobilized complex is detected by means for detecting the absorbance, reflected light, fluorescence, magnetism and the like derived from the conjugate.
  • the difference from the type A test strip is that the sample pad and the conjugate pad are integrated, that is, the sample supply part and the conjugate part are formed in a part of the sample pad.
  • the sample supply part is a part that supplies a sample containing a substance to be detected
  • the conjugate part is a part that contains a conjugate
  • the sample supply part is on the upstream side of the conjugate part.
  • a test strip in which the type of existence of the conjugate is type C will be described.
  • the difference from the type A test strips above is that there is no conjugate pad and the conjugates exist as separate conjugation reagents.
  • a filter chip in which a conjugate is incorporated in a filter can be mentioned.
  • the conjugate and the substance to be detected are bound to each other by passing the sample diluent and the substance to be detected to form a complex (aggregate).
  • the substance to be detected can be detected by supplying this to the same test strip as in type A except that it has no conjugate pad.
  • the conjugate pad and the filter chip can also contain the specific nonionic surfactant of the present invention.
  • the sample pad used in the present invention is a site for receiving a sample, and includes any substance and form capable of absorbing a sample of a liquid in a state of being molded in the pad and allowing the liquid and an object to be detected to pass through.
  • materials suitable for the sample pad include, but are not limited to, glass fiber, acrylic fiber, hydrophilic polyethylene material, dry paper, paper pulp, woven fabric, and the like. A glass fiber pad is preferably used.
  • the sample pad can also have the function of a conjugate pad described later.
  • the sample pad may contain a blocking reagent which is usually used for the purpose of preventing / suppressing non-specific reaction (adsorption) on the antibody-immobilized membrane.
  • the sample pad may contain a specific nonionic surfactant of the present invention.
  • the third pad is arranged as necessary depending on the properties of the sample, and any third pad can be used as long as it can pass the complex of the substance to be detected and the conjugate in the sample.
  • the third pad is preferably arranged downstream of the sample pad and upstream of the insoluble membrane.
  • the average pore size of the third pad of the present invention is, for example, 1 to 100 ⁇ m, preferably 5 to 80 ⁇ m, more preferably 10 to 60 ⁇ m, further preferably 15 to 55 ⁇ m, particularly preferably 20 to 50 ⁇ m, and particularly 25 to 45 ⁇ m. Most preferred.
  • the third pad may contain the specific nonionic surfactant of the present invention.
  • the insoluble membrane used in the present invention has at least one detection part on which an antibody that immunologically reacts with the substance to be detected is immobilized. Immobilization of an antibody that immunologically reacts with the substance to be detected on the insoluble membrane carrier can be carried out by a conventionally known method.
  • a lateral flow type immunochromatographic reagent an apparatus having a mechanism capable of preparing a liquid containing the above antibody at a predetermined concentration and horizontally moving it while discharging the liquid from a nozzle at a constant speed The solution can be immobilized on the insoluble membrane carrier by applying the solution in a line on the insoluble membrane carrier and drying.
  • the concentration of the antibody in the above liquid is preferably 0.1 to 5 mg / mL, more preferably 0.5 to 2 mg / mL.
  • the amount of the antibody immobilized on the insoluble membrane carrier can be optimized by adjusting the discharge rate from the nozzle of the above device, and 0.5 to 2 ⁇ L / cm is preferable. ..
  • the measurement method using the lateral flow immunochromatographic reagent is a measurement method of a method in which the sample is developed so as to move in parallel to the insoluble membrane carrier due to a capillary phenomenon.
  • a solution containing the above antibody at a predetermined concentration can be prepared by adding the antibody to a buffer solution.
  • the buffer solution examples include phosphate buffer solution, Tris buffer solution, Good's buffer solution and other commonly used buffer solutions.
  • the pH of the buffer solution is preferably in the range of 6.0 to 9.5, more preferably 6.5 to 8.5, and further preferably 7.0 to 8.0.
  • the buffer solution may further contain salts such as sodium chloride, stabilizers and preservatives such as sucrose, and preservatives such as Proclin (registered trademark). Salts include those added for the purpose of adjusting the ionic strength such as sodium chloride, and those added for the purpose of adjusting the pH of the buffer solution such as sodium hydroxide.
  • a control capture reagent conventionally used in immunochromatography reagents may be immobilized on the insoluble membrane.
  • the control capture reagent is a reagent for ensuring the reliability of the assay and captures the control reagent contained in the conjugate pad.
  • the moss-derived hemocyanin (hereinafter referred to as KLH) labeled on the conjugate pad is included as a control reagent, the anti-KLH antibody or the like corresponds to the control capture reagent.
  • the position at which the control capture reagent is immobilized can be appropriately selected to suit the design of the assay system.
  • the insoluble membrane may contain a specific nonionic surfactant of the present invention.
  • the membrane that constitutes the insoluble membrane used in the present invention a known membrane that has been conventionally used as an insoluble membrane carrier for immunochromatographic reagents can be used.
  • Specific examples include glass fiber filter paper and cellulose filter paper commercially available from Sartorius, Millipore, Toyo Roshi, Whatman and the like. Among them, Sartorius, UniSart CN140 is preferable. Further, by appropriately selecting the pore size and structure of the insoluble membrane carrier, it is possible to control the speed at which the complex of the conjugate and the substance to be detected in the sample flows through the insoluble membrane carrier.
  • the above immunochromatographic test strip is preferably placed on a solid support such as a plastic pressure sensitive adhesive sheet.
  • the solid support is composed of materials that do not interfere with the capillary flow of the sample and conjugate.
  • the immunochromatographic test strip may be immobilized on a solid support with an adhesive or the like.
  • the adhesive component and the like are composed of substances that do not interfere with the capillary flow of the sample and the conjugate.
  • the immunochromatographic test strip is stored in an appropriate container (housing) in consideration of the size of the immunochromatographic test strip, the sample addition method and position, the insoluble membrane detection part formation position, the signal detection method, and the like. -It can be installed and used, and the state of being stored and installed in this way is called a "device".
  • the antibody against the P30 protein of Mycoplasma pneumoniae of the present invention may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as it can specifically detect the protein, and among them, the monoclonal antibody is preferable.
  • Antibodies against P30 protein of Mycoplasma pneumoniae include, for example, recombinant P30 protein extracted and purified by genetically expressing P30 protein extracted from Mycoplasma pneumoniae cells or cloned P30 protein gene in a host such as Escherichia coli, Alternatively, a polypeptide constituting a part of P30 protein can be obtained as an immunizing antigen according to a conventional method.
  • a polyclonal antibody it can be obtained from an antiserum obtained by immunizing an animal such as a mouse with the immunizing antigen, and a monoclonal antibody is obtained by immunizing an animal such as a mouse and then spleen cells and myeloma cells of the immunized animal.
  • the fused cells obtained by cell fusion of and are selected in a HAT-containing medium and then grown, and the P30 protein is utilized to obtain, for example, an anti-P30 protein antibody-producing strain.
  • the antibody against the P30 protein of Mycoplasma pneumoniae of the present invention also includes an antibody fragment and a modified antibody against the P30 protein of Mycoplasma pneumoniae substantially equivalent to the antibody.
  • the antibody fragment include Fab fragment, F (ab ′) 2 fragment, Fab ′ fragment, scFv fragment and the like.
  • the labeled antibody that is the first antibody and the immobilized antibody that is the second antibody against the P30 protein of Mycoplasma pneumoniae of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but at least one of them is a monoclonal antibody. More preferably, both are monoclonal antibodies.
  • the first antibody and the second antibody are preferably antibodies that recognize different epitopes present in the P30 protein.
  • P30 protein is one of the adhesion proteins with a molecular weight of 30 kDa. In Mycoplasma pneumoniae cells, it is a transmembrane protein that is localized on the cell surface at the tip of the adhesion organ and has an N-terminal buried inside the cell membrane and a C-terminal located outside the cell membrane. In addition, a repeating structure of an amino acid sequence containing a large amount of proline is present on the C-terminal side. Generally, a region consisting of an amino acid sequence containing proline is known to have a steric higher-order structure, and is known to be an epitope with which an antibody reacts.
  • the antibody against the P30 protein of the present invention may be any antibody capable of specifically recognizing the P30 protein, and as the monoclonal antibody, a portion consisting of a repeating structure of an amino acid sequence containing proline in the extracellular region of the P30 protein is recognized.
  • Preferred monoclonal antibody As the antibody against the P30 protein of Mycoplasma pneumoniae of the present invention, a commercially available anti-P30 monoclonal antibody may be used. Examples of commercially available anti-P30 monoclonal antibodies include Meridian's C01939M, C01940M, C01941M, C01942M, C01943M and the like.
  • anti-P30 monoclonal antibody used in the following tests was obtained by a method commonly used by those skilled in the art for producing a monoclonal antibody (such as the method of Kohler and Milstein (Nature, 256, 495 (1975)).
  • colloidal metal particles such as gold colloid particles and platinum colloid particles, color latex particles, magnetic particles and fluorescent particles are preferable, and gold colloid particles and color latex particles are particularly preferable.
  • the conjugate used in the present invention is one in which an antibody that immunologically reacts with Mycoplasma pneumoniae, which is a substance to be detected, is immobilized on the above-described label.
  • the conjugate is preferably an anti-Mycoplasma pneumoniae P30 protein monoclonal antibody or a polyclonal antibody immobilized on colloidal gold particles.
  • Examples of the method for immobilizing an antibody that immunologically reacts with a substance to be detected on a label include physical adsorption and chemical bonding, and immobilization is generally performed by physical adsorption.
  • the detection kit for Mycoplasma pneumoniae of the present invention comprises a detection reagent using an antibody against the P30 protein of Mycoplasma pneumoniae and a sample diluent, and the detection reagent and / or the sample diluent contains a specific nonionic surfactant.
  • a kit for detecting Mycoplasma pneumoniae using immunochromatography of the present invention comprises a test strip for immunochromatography and a sample diluent using an antibody against P30 protein of Mycoplasma pneumoniae, and a test strip for immunochromatography and / or sample dilution. Any liquid may be used as long as it contains a specific nonionic surfactant.
  • the detection kit may further include reagents necessary for detection, a test tube, a device for collecting a sample, an instruction manual, a housing for storing a test strip, and the like.
  • upstream or downstream is used to mean “upstream side” or “downstream side” in the sample flow direction. That is, in the test strip of the present invention, when the sample pad, the conjugate pad, the third pad, and the insoluble membrane are laminated so as to partially overlap with each other, the sample pad is the most upstream and the insoluble membrane is the downstream. Become.
  • the end pad may be laminated on the insoluble membrane so that the downstream end of the insoluble membrane overlaps with each other. In this case, the end pad is the most downstream.
  • Test Material A test device including a test strip for immunochromatography using a monoclonal antibody against Mycoplasma pneumoniae P30 protein was produced.
  • FIG. 1 shows a schematic configuration diagram of the immunochromatographic test strip of the present invention.
  • An insoluble membrane (b) is attached to a plastic pressure-sensitive adhesive sheet (a), then a third pad (g), a conjugate pad (d), and a sample pad (e) are arranged and attached in that order, and an absorption pad is provided at the opposite end. (F) was placed and mounted.
  • the conjugate pad is impregnated with a conjugate prepared by sensitizing gold colloid with anti-P30 protein monoclonal antibody, and the insoluble membrane is coated with anti-P30 protein monoclonal antibody (immobilized antibody, coating concentration 0.75 mg / mL, coating The amount of 1.0 ⁇ L / cm) and the control reagent (goat anti-mouse IgG, coating concentration of 0.75 mg / mL, coating amount of 1.0 ⁇ L / cm) are immobilized in a line perpendicular to the flow direction.
  • the pads are laminated and arranged so that the upper and lower pads are partially in contact with each other.
  • test line (c1) The line containing the anti-P30 protein monoclonal antibody is called the test line (c2)
  • control line (c2) the line containing the control reagent is called the control line (c2).
  • Test method 120 ⁇ L of the sample was dropped on the test device, and 15 minutes later, the color development intensity of the test line was visually evaluated.
  • the sample diluent was prepared by adding two concentrations of 0.1% and 1.0% of the surfactants having the compositions shown in Tables 1 and 2 to 20 mM phosphate buffer (pH 7.5) such that NaCl was 50 mM. Was prepared. BSA 0.25% was added as an additive.
  • the color development intensity was evaluated based on the case where Emulgen 108, which had little concentration-dependent variation in sensitivity, was added.
  • Mycoplasma pneumoniae can be detected with high sensitivity by carrying out an immune reaction using an antibody against Mycoplasma pneumoniae P30 protein in the presence of a specific nonionic surfactant.

Abstract

マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を用いてマイコプラズマ・ニューモニエを免疫学的に検出する方法であって、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレン分岐デシルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコールモノラウレート、合成アルコールEO付加物、合成2級アルコールEO付加物、及び合成アルコールEO/PO付加物からなる群から選ばれる１以上のノニオン性界面活性剤の存在下、免疫反応を行う前記検出方法を提供する。

Description

マイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的検出方法
　本発明は、マイコプラズマ・ニューモニエを免疫学的に検出する方法に関する。特に、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を用いてマイコプラズマ・ニューモニエを免疫学的に検出する方法に関する。
　マイコプラズマ肺炎は、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を原因菌とする呼吸器系の感染症であり、小児の罹患率が高く、４歳未満が患者の３０％を、９歳未満が６０％以上を占める。  マイコプラズマ肺炎の多くの患者は気管支炎程度ですむが、一部は重症化して肺炎や他の合併症も併発するおそれがある。したがって、迅速な確定診断と適切な抗菌薬の選択が重要であることから、操作が簡便かつ迅速な検出が可能であるイムノクロマト分析が適している。
  例えば、特許文献１には、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を用いたイムノクロマト分析装置が開示されている。
  また、特許文献２には、マイコプラズマ・ニューモニエのリボソームタンパク質Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＰｒｏｔｅｉｎＬ７／Ｌ１２に特異的な抗体を用いたイムノクロマト分析装置が開示されている。
　ところで抗体により検出をする場合、検出対象となる菌体やタンパク質を界面活性剤などで前処理をして抗体検出部位を露出させた上で検出する必要がある場合がある。
　特許文献１では、ＨＬＢ値が１３～１７の非イオン界面活性剤を含有する検体希釈液を前記イムノクロマト分析装置と共に使用するキットが開示されている。しかし、１３～１７の非イオン界面活性剤の種類は膨大に存在するところ、実際に実施例に記載されているのは、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（ｔｒｉｔｏｎＸ－１００）とポリオキシエチレンソルビタンモノオレート（ｔｗｅｅｎ２０）の１：１混合物と、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（ノニデットｐ－４０）とポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレン－アルキルエーテル（ノニオンＭＮ－８１１）の１：１混合物のみのわずか２例であり、その他の膨大な数のＨＬＢ値が１３～１７の非イオン界面活性剤については使用できるかどうかは開示されていない。
　特許文献２では、ポリオキシエチレンアルキルエーテルやＨＬＢ値が１２～１５の非イオン界面活性剤を含有する検体希釈液を前記イムノクロマト分析装置と共に使用するキットが開示されている。しかし、抗体は、マイコプラズマ・ニューモニエのリボゾームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体のみについてしか確認されておらず、Ｐ３０タンパクに対する抗体についてのこれらの非イオン界面活性剤の効果については開示も示唆もされていない。
　このように、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を用いてマイコプラズマ・ニューモニエを免疫学的に検出する方法において、高感度で検出する方法についての技術は未だ確立されていない。
特開2017-9571号公報 特開2014-167439号公報
　本発明は、マイコプラズマ・ニューモニエＰ３０タンパク質に対する抗体を用いて免疫反応を行う免疫学的検出方法において、マイコプラズマ・ニューモニエを高感度に検出する方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、特定のノニオン性界面活性剤存在下で、マイコプラズマ・ニューモニエＰ３０タンパク質に対する抗体を用いて免疫反応を行うことにより、マイコプラズマ・ニューモニエを高感度に検出できることを見出し本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の構成を有する。
＜１＞
マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を用いてマイコプラズマ・ニューモニエを免疫学的に検出する方法であって、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレン分岐デシルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコールモノラウレート、合成アルコールＥＯ付加物、合成２級アルコールＥＯ付加物、及び合成アルコールＥＯ／ＰＯ付加物からなる群から選ばれる１以上のノニオン性界面活性剤の存在下、免疫反応を行う前記検出方法。
＜２＞
免疫学的に検出する方法がイムノクロマトグラフィーを利用して検出する方法である＜１＞に記載の検出方法。
＜３＞
イムノクロマトグラフィーを利用して検出する方法が以下の（Ａ）～（Ｃ）の工程を含む＜１＞又は＜２＞に記載の方法。
（Ａ）マイコプラズマ・ニューモニエを含むサンプルと、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレン分岐デシルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコールモノラウレート、合成アルコールＥＯ付加物、合成２級アルコールＥＯ付加物、及び合成アルコールＥＯ／ＰＯ付加物からなる群から選ばれる１以上のノニオン性界面活性剤を含むサンプル希釈液を混合する工程
（Ｂ）下記テストストリップのサンプル供給部に、前記（Ａ）で得られた混合物を供給する工程
テストストリップ；
少なくともサンプル供給部、展開部および検出部とを備えた多孔質体からなるメンブレンを有し、展開部の一部には、標識物質で標識された第一のマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を含むコンジュゲートが溶出可能に保持され、さらに展開部の一部であってコンジュゲート保持部分より下流側に第二のマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体が固定化されている検出部を有する
（Ｃ）サンプル中のマイコプラズマ・ニューモニエとコンジュゲートの複合体を検出部において検出する工程
＜４＞
以下の構成（１）および（２）を含む、マイコプラズマ・ニューモニエ検出キット。
（１）マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を用いた検出試薬
（２）ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレン分岐デシルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコールモノラウレート、合成アルコールＥＯ付加物、合成２級アルコールＥＯ付加物、及び合成アルコールＥＯ／ＰＯ付加物からなる群から選ばれる１以上のノニオン性界面活性剤を含むサンプル希釈液
＜５＞
前記（１）のマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を用いた検出試薬が以下の構成（１）’である＜４＞に記載の検出キット。
（１）’少なくともサンプル供給部、展開部および検出部とを備えた多孔質体からなるメンブレンを有し、展開部の一部には、標識物質で標識された第一のマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を含むコンジュゲートが溶出可能に保持され、さらに展開部の一部であって前記コンジュゲート保持部分より下流側に、第二のマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体が固定化されている検出部を有するイムノクロマトグラフィー用テストストリップ
＜６＞
マイコプラズマ・ニューモニエＰ３０タンパク質に対する抗体を用いた免疫学的検出方法におけるサンプル希釈液であって、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレン分岐デシルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコールモノラウレート、合成アルコールＥＯ付加物、合成２級アルコールＥＯ付加物、及び合成アルコールＥＯ／ＰＯ付加物からなる群から選ばれる１以上のノニオン性界面活性剤を含む前記希釈液。
＜７＞
ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレン分岐デシルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコールモノラウレート、合成アルコールＥＯ付加物、合成２級アルコールＥＯ付加物、及び合成アルコールＥＯ／ＰＯ付加物からなる群から選ばれる１以上のノニオン性界面活性剤と、マイコプラズマ・ニューモニエを含むサンプルとを接触させる工程を含む、マイコプラズマ・ニューモニエを免疫学的に検出するためのサンプル前処理方法。
＜８＞
マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を用いてマイコプラズマ・ニューモニエを免疫学的に検出する方法における検出感度の向上方法であって、
ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレン分岐デシルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコールモノラウレート、合成アルコールＥＯ付加物、合成２級アルコールＥＯ付加物、及び合成アルコールＥＯ／ＰＯ付加物からなる群から選ばれる１以上のノニオン性界面活性剤の存在下、免疫反応を行う前記方法。
　本発明は、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレン分岐デシルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコールモノラウレート、合成アルコールＥＯ付加物、合成２級アルコールＥＯ付加物、及び合成アルコールＥＯ／ＰＯ付加物からなる群から選ばれる１以上のノニオン性界面活性剤存在下、マイコプラズマ・ニューモニエＰ３０タンパク質に対する抗体を用いて免疫反応を行うことにより、マイコプラズマ・ニューモニエを高感度に検出できる。
本発明のテストストリップの模式構成図である。
（サンプル）
　本発明において、サンプルとは患者から採取した被検出対象であるマイコプラズマ・ニューモニエを含む可能性がある検体をいう。
　患者検体は、そのままサンプルとして用いてもよく、適宜サンプル希釈液によって希釈してサンプルとしてもよい。また、適宜希釈し濾過したものをサンプルとして用いてもよい。なお、サンプル希釈液は、他では検体希釈液、サンプル抽出液、サンプル展開液、サンプル浮遊液などと呼ばれることもあるが、いずれも同義で用いられる。
（本発明の特定のノニオン性界面活性剤）
　本発明の免疫学的検出方法は、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレン分岐デシルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコールモノラウレート、合成アルコールＥＯ付加物、合成２級アルコールＥＯ付加物、及び合成アルコールＥＯ／ＰＯ付加物からなる群から選ばれる１以上のノニオン性界面活性剤（以下、本願明細書中、略して「特定のノニオン性界面活性剤」ということがある）の存在下で免疫反応を行うことを特徴とする。
　これらの本発明の特定のノニオン性界面活性剤としては、水に対する溶けやすさを考慮し、ＨＬＢが５．０～１８．０程度が好ましく、６．０～１６．０がより好ましく、７．０～１２．０がよりいっそう好ましく、９．０～１１．０がもっとも好ましい。
　具体的には、ポリオキシエチレンラウリルエーテルは、エマルゲン（登録商標、以下同じ）１０８　、エマルゲン１０３、エマルゲン１０６、エマルゲン１２３Ｐ、Ｂｒｉｊ（登録商標、以下同じ）３５などの商品名で販売されているものが挙げられる。
　ポリオキシエチレンオレイルエーテルは、エマルゲン４２０、エマルゲン４３０などの商品名で販売されているものが挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルエーテルは、エマルゲン７０５、エマルゲン１１０８などの商品名で販売されているものが挙げられる。
　ポリオキシアルキレン分岐デシルエーテルは、ノイゲン（登録商標、以下同じ）ＸＬ－９０、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルは、エマルゲンＬＳ－１１４などの商品名で販売されているものが挙げられる。
　ポリエチレングリコールモノラウレートは、エマノーン（登録商標）１１１２などの商品名で販売されているものが挙げられる。
　合成アルコールＥＯ付加物としては、レオコール（登録商標、以下同じ）ＴＤ－５０、レオコールＴＤ－７０、レオコールＴＤ－９０が挙げられ、合成２級アルコールＥＯ付加物としては、レオコールＳＣ－１２０、レオコールＳＣ－４００、合成アルコールＥＯ／ＰＯ付加物としてはライオノール（登録商標、以下同じ）Ｌ－９５０、ライオノールＴＤ７３０が挙げられる。
　免疫反応系における特定のノニオン性界面活性剤の濃度は、０．０１％～１０．０％が好ましく、０．１％～５％がさらに好ましく、０．２％～３％がよりいっそう好ましく、０．３～１．５％がもっとも好ましい。
　本発明の特定のノニオン性界面活性剤を反応系に存在させる態様としては、免疫反応系に直接添加してもよいが、典型的には、後述するようにサンプル希釈液に含有させておき、マイコプラズマ・ニューモニエＰ３０タンパク質に対する抗体と接触させることにより免疫反応系に存在させる態様が挙げられる。
(サンプル希釈液）
　本発明のサンプル希釈液は、特定のノニオン性界面活性剤含み、さらに緩衝液を含むものが好ましい。
　本発明のサンプル希釈液中の特定のノニオン性界面活性剤の濃度の下限としては０．０１％以上が好ましく、０．１％以上がさらに好ましく、０．２％以上がよりいっそう好ましく、０．３％以上がもっとも好ましい。
上限としては、１０．０％以下が好ましく、５％以下がさらに好ましく、３％以下がよりいっそう好ましく、１．５％以下がもっとも好ましい。
　また、濃度範囲としては０．０１％～１０．０％が好ましく、０．１％～５％がさらに好ましく、０．２％～３％がよりいっそう好ましく、０．３～１．５％がもっとも好ましい。
　本発明のサンプル希釈液に含まれる緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液など通常使用される緩衝液をあげることができる。本発明のサンプル希釈液は、上記化合物と緩衝液を含むものであればよく、上記化合物を含む緩衝液でもよく、さらに塩化ナトリウムなどの塩類、スクロースなどの安定剤や保存剤、プロクリン(登録商標)などの防腐剤等を含んでもよい。塩類は塩化ナトリウムなどのようにイオン強度の調整のために含ませるもののほか、水酸化ナトリウムなど緩衝液のｐＨを調整する目的で添加するものも含まれる。本発明のサンプル希釈液のｐＨは、６．０～１０．０の範囲が好ましく、７．０～９．０がより好ましく、７．５～８．５がよりいっそう好ましい。
　本発明のサンプル希釈液は、サンプルを希釈するための液であるから、マイコプラズマ・ニューモニエを含むサンプル（検体）をサンプル希釈液に添加して、サンプルを溶解、抽出、あるいは分散して希釈する役割を担っている。したがって、典型的には、テストストリップのサンプルパッドにサンプルを供給する時点でサンプルとサンプル希釈液は混合されている。しかし、このほかに、サンプルを直接あるいは他の本発明のサンプル希釈液以外の希釈液で希釈したものをサンプルパッドに供給し、同時にあるいは遅れて本発明のサンプル希釈液を前記サンプルパッドに供給する場合も本発明の検出方法に含まれる。
　本発明の免疫学的検出方法としては、免疫反応を利用する検出方法であればいずれでもよく、例えば、粒子凝集イムノアッセイ法であるラテックス免疫凝集法（以下、ＬＴＩＡ法という）、代表的なサンドイッチ免疫測定法であり標識イムノアッセイ法でもあるＥＬＩＳＡ法、イムノクロマトグラフィーを利用した検出方法等が挙げられるが、このうちでも特に、イムノクロマトグラフィーを利用した検出方法が望ましい。イムノクロマトグラフィーを利用した検出方法としては、フルースロー式とラテラルフロー式が挙げられるが、ラテラルフロー式のイムノクロマトグラフィーを利用した検出方法が簡便かつ迅速であり望ましい。
　前記ＬＴＩＡ法において本発明のサンプル希釈液を使う場合は、サンプルを本発明のサンプル希釈液で希釈した後、ラテックス試薬と混合することで免疫凝集反応を検出することができる。ラテックス試薬が、緩衝液を含む第一試薬とラテックス試薬を含む第二試薬からなる場合は、第一試薬として本発明の検体希釈液を使用することができる。
　また、本発明は、特定のノニオン性界面活性剤と、マイコプラズマ・ニューモニエを含むサンプルとを接触させる工程からなるマイコプラズマ・ニューモニエを免疫学的に検出するためのサンプル前処理方法も提供する。
典型的には、特定のノニオン性界面活性剤を検体希釈液に含有させ、当該検体希釈液とサンプルを混合することにより前処理を行うことができる。
（被検出物質）
　本発明の被検出物質はマイコプラズマ・ニューモニエである。本発明は、直接的には、マイコプラズマ・ニューモニエＰ３０タンパク質に対する抗体を用いて、マイコプラズマ・ニューモニエＰ３０タンパク質を検出することにより、マイコプラズマ・ニューモニエの存在を検出し、または定量する。
（イムノクロマトグラフィー用を利用した検出）
　本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップは、サンプルを不溶性メンブレン中を展開させることにより、サンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出するテストストリップである。当該テストストリップは、（１）サンプル供給部、（２）展開部、（３）検出部、とを備えた多孔質体からなるメンブレンを有し、展開部の一部には、標識物質で標識された第一の抗体を含むコンジュゲートが溶出可能に保持され、さらに展開部の一部であってコンジュゲート保持部分より下流側に第二の抗体が固定化されている検出部を有する。
　本発明の特定のノニオン性界面活性剤は、前記サンプル希釈液に含まれている態様のほか、テストストリップを構成するパッドの一部に含浸させる態様もあり得る。例えば、サンプルパッド、サードパッド、コンジュゲートパッド、不溶性メンブレンなどである。また、本発明の特定のノニオン性界面活性剤は、フィルターチップに含浸される態様もあり得る。
　コンジュゲートは、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体が標識体に固定化されたものであり、コンジュゲートの存在様式としては、コンジュゲートパッドとして、サンプルパッド、サードパッド、不溶性メンブレン以外の別のパッドに含浸された状態で存在してもよいし（タイプＡ）、サンプルパッドの一部にコンジュゲート部として存在してもよいし（タイプＢ）、さらには、テストストリップとは別に、検体と混合されるように個別のコンジュゲート試薬として存在してもよい（タイプＣ）。
　以下、コンジュゲートの存在様式が上記タイプＡのテストストリップについて説明する。
　サンプルの流れ方向の上流より下流に向かって、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、サードパッド、不溶性メンブレンの順で配置され、それぞれ上下の層と少なくとも一部が重複するように配置される。このような配置例のテストストリップを図１に示す。
　このようなテストストリップのサンプルパッドに、被検出物質を含有するサンプルが供給されると、被検出物質はサンプルパッドを通過して下流側のコンジュゲートパッドへと流れる。コンジュゲートパッドでは、被検出物質とコンジュゲートが接触して複合体（凝集体）を形成しながら当該パッドを通過する。その後、複合体はコンジュゲートパッドの下面に接触して配置された多孔質サードパッドを通過し、不溶性メンブレンへと展開される。
　不溶性メンブレンには、その一部に被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体が固定化されているため、該複合体がここで免疫反応により結合して固定化されることになる。固定化された複合体は、コンジュゲートに由来する吸光度、反射光、蛍光、磁気等を検出する手段により検出される。
　次に、コンジュゲートの存在様式がタイプＢのテストストリップについて説明する。
　上記タイプＡのテストストリップとの違いは、サンプルパッドとコンジュゲートパッドが一体になった点であり、つまり、サンプルパッドの一部にサンプル供給部およびコンジュゲート部が構成されている点である。
　上記サンプル供給部は、被検出物質を含有するサンプルを供給する部位であり、上記コンジュゲート部は、コンジュゲートを含有する部位であり、サンプル供給部がコンジュゲート部の上流側となる。
　次に、コンジュゲートの存在様式がタイプＣのテストストリップについて説明する。
　上記タイプＡのテストストリップとの違いは、コンジュゲートパッドが存在せず、コンジュゲートは個別のコンジュゲート試薬として存在する点である。例えば、フィルター中にコンジュゲートが内蔵されたフィルターチップが挙げられる。このようなフィルターチップを使って、サンプル希釈液及び被検出物質を通過させることでコンジュゲートと被検出物質が結合し、複合体（凝集体）を形成する。これを、コンジュゲートパッドを有さないこと以外はタイプＡと同一の前記テストストリップに供給することで、被検出物質を検出することができる。
　コンジュゲートパッドやフィルターチップには、このほかに、本発明の特定のノニオン性界面活性剤を含ませることもできる。
（サンプルパッド）
　本発明に用いられるサンプルパッドとは、サンプルを受け入れる部位であり、パッドに成型された状態で液体のサンプルを吸収し、液体と検出対象物とが通り抜けることができるどんな物質及び形態をも含む。サンプルパッドに適した材料の具体例として、ガラス繊維（グラスファイバー）、アクリル繊維、親水性ポリエチレン材、乾燥紙、紙パルプ、織物等が含まれるが、これらに限定されない。好適には、グラスファイバー製パッドが用いられる。該サンプルパッドには、後述するコンジュゲートパッドの機能を併せ持たせることも出来る。また、サンプルパッドには、抗体固定化メンブレンにおける非特異的反応（吸着）を防止・抑制する目的で、通常使用されるブロッキング試薬を含ませることができる。
　サンプルパッドには、このほかに、本発明の特定のノニオン性界面活性剤を含ませることもできる。
（サードパッド）
　サードパッドは、試料の性状等により必要に応じて配置されることが望ましく、サンプル中の被検出物質とコンジュゲートの複合体を透過させることができるものであればいずれでもよい。サードパッドは、サンプルパッドの下流であって、不溶性メンブレンの上流に配置されていることが好ましい。
　また、本発明のサードパッドの平均孔径は、１～１００μｍが例示され、５～８０μｍが好ましく、１０～６０μｍがより好ましく、１５～５５μｍがさらに好ましく、２０～５０μｍが特に好ましく、２５～４５μｍが最も好ましい。
　サードパッドには、このほかに、本発明の特定のノニオン性界面活性剤を含ませることもできる。
（不溶性メンブレン）
　本発明に用いられる不溶性メンブレンは、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体が固定化された少なくとも１つの検出部を有する。被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体の不溶性メンブレン担体への固定化は、従来公知の方法で実施することができる。
　ラテラルフロー式のイムノクロマト試薬の場合には、上記の抗体を所定の濃度で含有する液を調製し、ノズルから液を一定の速度で吐出しながら水平方向に移動させることのできる機構を有する装置などを用いて、上記液をライン状に不溶性メンブレン担体に塗布し、乾燥させることにより固定化させることができる。上記液の抗体の濃度は０．１～５ｍｇ／ｍＬが好ましく、０．５～２ｍｇ／ｍＬがさらに好適である。また、抗体の不溶性メンブレン担体への固定化量は、ラテラルフロー式の場合には上記の装置のノズルからの吐出速度を調節することによって最適化でき、０．５～２μＬ／ｃｍが好適である。
　なお、上記ラテラルフロー式のイムノクロマト試薬を用いた測定方法は、サンプルが毛細管現象により不溶性メンブレン担体に対して並行方向に移動するように展開する方式の測定方法である。
　また、上記の抗体を所定の濃度で含有する液は、緩衝液に抗体を添加することにより調製することができる。該緩衝液の種類としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液など通常使用される緩衝液をあげることができる。緩衝液のｐＨは６．０～９．５の範囲が好ましく、６．５～８．５がより好ましく、７．０～８．０がさらに好ましい。緩衝液には、さらに塩化ナトリウムなどの塩類、スクロースなどの安定剤や保存剤、プロクリン(登録商標)などの防腐剤等を含んでもよい。塩類は塩化ナトリウムなどのようにイオン強度の調整のために含ませるもののほか、水酸化ナトリウムなど緩衝液のｐＨを調整する目的で添加するものも含まれる。
　不溶性メンブレンに抗体を固定化した後、さらに、通常使用されるブロッキング剤を溶液あるいは蒸気状にして抗体を固定化した部位以外を被覆し、ブロッキングを行うこともできる。
　なお、不溶性メンブレンには、従来からイムノクロマト試薬で用いられているコントロール捕捉試薬を固定化してもよい。該コントロール捕捉試薬は、アッセイの信頼性を担保するための試薬であって、コンジュゲートパッドに含ませたコントロール試薬を捕捉するものである。例えば、コンジュゲートパッドに標識されたスカシ貝由来ヘモシアニン（以下、ＫＬＨという）をコントロール試薬として含む場合には、抗ＫＬＨ抗体などがコントロール捕捉試薬に該当する。コントロール捕捉試薬を固定化する位置は、アッセイ系の設計に適合するよう適宜選択することができる。
　不溶性メンブレンには、このほかに、本発明の特定のノニオン性界面活性剤を含ませることもできる。
　本発明で用いられる不溶性メンブレンを構成するメンブレンとしては、従来からイムノクロマト試薬の不溶性メンブレン担体として用いられている公知のメンブレンが使用できる。例えば、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン類、ガラス、セルロースやセルロース誘導体などの多糖類、セラミックス等からなる繊維から構成されるメンブレンがあげられる。具体的には、ザルトリウス社、ミリポア社、東洋濾紙社、ワットマン社などから市販されているガラス繊維ろ紙やセルロースろ紙などが挙げられる。中でも、ザルトリウス社、UniSart CN140が好ましい。また、この不溶性メンブレン担体の孔径と構造を適宜選択することにより、コンジュゲートとサンプル中の被検出物質との複合体が不溶性メンブレン担体中を流れる速度を制御することが可能である。
　上記イムノクロマトグラフィー用テストストリップは、プラスチック製粘着シートのような固相支持体上に配置させることが好ましい。該固相支持体は、サンプル及びコンジュゲートの毛管流を妨げない物質で構成する。また、イムノクロマトグラフィー用テストストリップを固相支持体上に接着剤等で固定化してもよい。この場合、接着剤の成分等においてもサンプル及びコンジュゲートの毛管流を妨げない物質で構成する。該イムノクロマトグラフィー用テストストリップは、イムノクロマトグラフィー用テストストリップの大きさ、サンプルの添加方法や添加位置、不溶性メンブレンの検出部の形成位置、シグナルの検出方法などを考慮した適当な容器（ハウジング）に格納・搭載して使用することができ、このように格納・搭載された状態を「デバイス」という。
（マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体）
　本発明のマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体とは、該タンパク質を特異的に検出できる抗体であればポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよく、このうちでもモノクローナル抗体が好ましい。
　マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体は、例えば、マイコプラズマ・ニューモニエ菌体から抽出したＰ３０タンパク質またはクローニングされたＰ３０タンパク質の遺伝子を大腸菌などの宿主で遺伝子工学的に発現させて抽出精製した組み換えＰ３０タンパク質、又はＰ３０タンパク質の一部を構成するポリペプチドを免疫用抗原として、常法に従って得ることができる。ポリクローナル抗体の場合は、前記免疫用抗原でマウスなどの動物を免疫した抗血清から得ることができ、モノクローナル抗体は、マウスなどの動物に免疫した後、この免疫された動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを細胞融合して得られた融合細胞をＨＡＴ含有培地で選択した後に増殖させて、Ｐ３０タンパク質を利用して、例えば、抗Ｐ３０タンパク質抗体産生株をスクリーニングすることにより得ることができる。
  本発明のマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体は、当該抗体と実質的に同等のマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体フラグメントおよび改変抗体も含む。抗体フラグメントとしてはＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、ｓｃＦｖフラグメントなどが挙げられる。
　本発明のマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する第一の抗体である標識抗体と第二の抗体である固定化抗体は、それぞれ、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、少なくともいずれか一方がモノクローナル抗体である方が好ましく、両方がモノクローナル抗体である方がより好ましい。
　また、第一の抗体と第二の抗体は、Ｐ３０タンパク質に存在する異なるエピトープを認識する抗体であることが好ましい。
  Ｐ３０タンパク質は分子量３０ｋＤａの接着タンパク質の１つである。マイコプラズマ・ニューモニエの菌体においては、接着器官の先端部の細胞表面に局在しており、細胞膜内に埋没しているＮ末端と細胞膜外に存在するＣ末端を持つ膜貫通型タンパク質である。
　また、Ｃ末端側にはプロリンを多く含むアミノ酸配列の繰り返し構造が存在する。一般的にプロリンを含むアミノ酸配列からなる領域は、立体的な高次構造をとることが知られており、抗体の反応するエピトープとなり得ることが知られている。
  本発明のＰ３０タンパク質に対する抗体は、Ｐ３０タンパク質を特異的に認識できる抗体であればよく、モノクローナル抗体としては、Ｐ３０タンパク質の細胞外領域における、プロリンを多く含むアミノ酸配列の繰り返し構造からなる部分を認識するモノクローナル抗体が好ましい。
　また、本発明のマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体は、市販の抗Ｐ３０モノクローナル抗体を用いてもよい。市販の抗Ｐ３０モノクローナル抗体の例としては、Ｍｅｒｉｄｉａｎ社のＣ０１９３９Ｍ、Ｃ０１９４０Ｍ、Ｃ０１９４１Ｍ、Ｃ０１９４２Ｍ、Ｃ０１９４３Ｍなどが挙げられる。
（抗Ｐ３０モノクローナル抗体の調製例）
　以下の試験に用いた抗Ｐ３０モノクローナル抗体は、当業者がモノクローナル抗体を製造するために通常行う方法（ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ、第２５６巻４９５頁（１９７５年）等）により得られた。
（標識体）
　本発明で用いられる標識体は、従来からイムノクロマトグラフィー用テストストリップに用いられている公知の標識体を用いることができる。例えば、金コロイド粒子や白金コロイド粒子などのコロイド状金属粒子、カラーラテックス粒子、磁性粒子、蛍光粒子などが好ましく、特に金コロイド粒子、カラーラテックス粒子が好ましい。
（コンジュゲート）
　本発明で用いられるコンジュゲートは、上記のような標識体に被検出物質であるマイコプラズマ・ニューモニエに対して免疫学的に反応する抗体が固定化されたものである。コンジュゲートは、金コロイド粒子に抗マイコプラズマ・ニューモニエＰ３０タンパク質モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体が固定化されたものが好ましい。
　被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体を標識体へ固定化させる方法としては、物理吸着、化学結合等が挙げられ、物理吸着により固定化させるのが一般的である。
（キット）
　本発明のマイコプラズマ・ニューモニエの検出キットは、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を用いた検出試薬及びサンプル希釈液を含み、検出試薬及び/又はサンプル希釈液に特定のノニオン性界面活性剤を含むものであればよい。
　また、本発明のイムノクロマトグラフィーを利用したマイコプラズマ・ニューモニエ検出キットは、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を用いたイムノクロマトグラフィー用テストストリップ及びサンプル希釈液を含み、イムノクロマトグラフィー用テストストリップ及び/又はサンプル希釈液に特定のノニオン性界面活性剤を含むものであればよい。
　本検出キットは、他に検出に必要な試薬、試験用チューブ、サンプル採取用の器具、取扱い説明書、テストストリップ格納用のハウジングなどを含んでもよい。
(その他)
　本明細書中、上流または下流という意味は、サンプルの流れる方向の上流側、下流側という意味で用いる。すなわち、本発明のテストストリップで上からサンプルパッド、コンジュゲートパッド、サードパッド、不溶性メンブレンが一部で重なるように積層されている場合、サンプルパッドがもっとも上流であり、不溶性メンブレンが下流ということになる。また、不溶性メンブレンの下流側端部が重なるように上にエンドパッドが積層されることがあるが、この場合、エンドパッドがもっとも下流である。
〔実施例１〕サンプル希釈液への界面活性剤の添加検討
　上記実施例に先駆け、検出感度を上げる化合物探索のためノニオン性界面活性剤及びアニオン性界面活性剤について感度評価試験を行った。
１．試験材料
（１）テストデバイス
　マイコプラズマ・ニューモニエＰ３０タンパク質に対するモノクローナル抗体を使用したイムノクロマトグラフィー用テストストリップを含むテストデバイスを製造した。　
　図１に、本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップの模式構成図を示した。
　プラスチック製粘着シート（ａ）に不溶性メンブレン（ｂ）を貼り、次いで、サードパッド（ｇ）、コンジュゲートパッド（ｄ）、サンプルパッド（ｅ）を順に配置装着し、反対側の端には吸収パッド（ｆ）を配置装着した。コンジュゲートパッドには、金コロイドに抗Ｐ３０タンパク質モノクローナル抗体を感作したコンジュゲートが含浸されており、不溶性メンブレンには、抗Ｐ３０タンパク質モノクローナル抗体（固定化抗体、塗布濃度０．７５ｍｇ／ｍＬ、塗布量１．０μＬ／ｃｍ）、およびコントロール試薬（ヤギ抗マウスＩｇＧ、塗布濃度０．７５ｍｇ／ｍＬ、塗布量１．０μＬ／ｃｍ）が流れ方向に対して垂直にライン状に固定化されている。各パッドは、上下のパッドとその一部が接するように積層して配置される。抗Ｐ３０タンパク質モノクローナル抗体からなるラインをテストライン（ｃ１）、コントロール試薬からなるラインをコントロールライン（ｃ２）という。
　このように各構成要素を重ね合わせた構造物を一定幅に切断してイムノクロマトグラフィー用テストストリップを作製した。テストストリップを専用のプラスチック製ハウジングに格納・搭載し、イムノクロマトテストデバイス（図示せず）の形態にした。
（２）サンプル
　ＮＢＲＣより受領し、凍結したマイコプラズマを遠心にて濃縮し、生理食塩水により希釈したものを検体として用いた。各サンプル希釈液３００μＬに各検体１５μＬを懸濁し、サンプルとした。
２．試験方法
　テストデバイスにサンプル１２０μＬを滴下し、１５分後にテストラインの発色強度を目視で評価した。サンプル希釈液は表１、２に示す組成の界面活性剤０．１％及び１．０％の２種の濃度で、ＮａＣｌを５０ｍＭとなるように２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に添加して調製した。添加剤としてＢＳＡ０．２５％を添加した。
　発色強度は、濃度依存的な感度の変動の少なかったエマルゲン１０８を添加した場合を基準に評価した。すなわち、サンプル希釈液に０．１％及び１．０％の各界面活性剤を添加し、同濃度のエマルゲン１０８を添加した場合の発色強度と比較して以下の4段階で評価した。
◎：発色強度の顕著な増強を認めた
〇：同等の発色強度若しくは発色強度の増強を認めた
△：発色が見られるが弱いあるいは非常に弱い
×：発色が見られない
３．試験結果
　結果を表１、２に示す。本結果によれば、アニオン性界面活性剤はいずれも感度が悪く、検出が不能であり（表２）、ノニオン性界面活性剤では本発明の特定のノニオン性界面活性剤である、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレン分岐デシルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコールモノラウレート、合成アルコールＥＯ付加物、合成２級アルコールＥＯ付加物、及び合成アルコールＥＯ／ＰＯ付加物を用いた場合は、感度が高く、それ以外のノニオン性界面活性剤を用いた場合は感度が低いことがわかった（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本発明によれば、マイコプラズマ・ニューモニエＰ３０タンパク質に対する抗体を用いて行う免疫反応を特定のノニオン性界面活性剤の存在下で行うことにより、マイコプラズマ・ニューモニエを高感度に検出できる。
（ａ）プラスチック製粘着シート
（ｂ）不溶性メンブレン
（ｃ１）テストライン
（ｃ２）コントロールライン
（ｄ）コンジュゲートパッド
（ｅ）サンプルパッド
（ｆ）吸収パッド
（ｇ）サードパッド
 
 

Claims (8)

  1. マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を用いてマイコプラズマ・ニューモニエを免疫学的に検出する方法であって、
    ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレン分岐デシルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコールモノラウレート、合成アルコールＥＯ付加物、合成２級アルコールＥＯ付加物、及び合成アルコールＥＯ／ＰＯ付加物からなる群から選ばれる１以上のノニオン性界面活性剤の存在下、免疫反応を行う前記検出方法。
  2. 免疫学的に検出する方法がイムノクロマトグラフィーを利用して検出する方法である請求項１に記載の検出方法。
  3. イムノクロマトグラフィーを利用して検出する方法が以下の（Ａ）～（Ｃ）の工程を含む請求項１又は２に記載の方法。
    （Ａ）マイコプラズマ・ニューモニエを含むサンプルと、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレン分岐デシルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコールモノラウレート、合成アルコールＥＯ付加物、合成２級アルコールＥＯ付加物、及び合成アルコールＥＯ／ＰＯ付加物からなる群から選ばれる１以上のノニオン性界面活性剤を含むサンプル希釈液を混合する工程
    （Ｂ）下記テストストリップのサンプル供給部に、前記（Ａ）で得られた混合物を供給する工程
    テストストリップ；
    少なくともサンプル供給部、展開部および検出部とを備えた多孔質体からなるメンブレンを有し、展開部の一部には、標識物質で標識された第一のマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を含むコンジュゲートが溶出可能に保持され、さらに展開部の一部であってコンジュゲート保持部分より下流側に第二のマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体が固定化されている検出部を有する
    （Ｃ）サンプル中のマイコプラズマ・ニューモニエとコンジュゲートの複合体を検出部において検出する工程
  4. 以下の構成（１）および（２）を含む、マイコプラズマ・ニューモニエ検出キット。
    （１）マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を用いた検出試薬
    （２）ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレン分岐デシルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコールモノラウレート、合成アルコールＥＯ付加物、合成２級アルコールＥＯ付加物、及び合成アルコールＥＯ／ＰＯ付加物からなる群から選ばれる１以上のノニオン性界面活性剤を含むサンプル希釈液
  5. 前記（１）のマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を用いた検出試薬が以下の構成（１）’である請求項４に記載の検出キット。
    （１）’少なくともサンプル供給部、展開部および検出部とを備えた多孔質体からなるメンブレンを有し、展開部の一部には、標識物質で標識された第一のマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を含むコンジュゲートが溶出可能に保持され、さらに展開部の一部であって前記コンジュゲート保持部分より下流側に、第二のマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体が固定化されている検出部を有するイムノクロマトグラフィー用テストストリップ
  6. マイコプラズマ・ニューモニエＰ３０タンパク質に対する抗体を用いた免疫学的検出方法におけるサンプル希釈液であって、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレン分岐デシルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコールモノラウレート、合成アルコールＥＯ付加物、合成２級アルコールＥＯ付加物、及び合成アルコールＥＯ／ＰＯ付加物からなる群から選ばれる１以上のノニオン性界面活性剤を含む前記希釈液。
  7. ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレン分岐デシルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコールモノラウレート、合成アルコールＥＯ付加物、合成２級アルコールＥＯ付加物、及び合成アルコールＥＯ／ＰＯ付加物からなる群から選ばれる１以上のノニオン性界面活性剤と、マイコプラズマ・ニューモニエを含むサンプルとを接触させる工程を含む、マイコプラズマ・ニューモニエを免疫学的に検出するためのサンプル前処理方法。
  8. マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を用いてマイコプラズマ・ニューモニエを免疫学的に検出する方法における検出感度の向上方法であって、
    ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレン分岐デシルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコールモノラウレート、合成アルコールＥＯ付加物、合成２級アルコールＥＯ付加物、及び合成アルコールＥＯ／ＰＯ付加物からなる群から選ばれる１以上のノニオン性界面活性剤の存在下、免疫反応を行う前記方法。
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