WO2020091028A1 - マイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的検出方法 - Google Patents

マイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的検出方法 Download PDF

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WO2020091028A1
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pad
sample
mycoplasma pneumoniae
test strip
conjugate
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知史 中村
泰史 落合
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積水メディカル株式会社
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses

Definitions

  • the present invention relates to a test strip for immunologically detecting Mycoplasma pneumoniae and an immunological detection method using the test strip.
  • Mycoplasma pneumoniae is a respiratory infection caused by Mycoplasma pneumoniae, which has a high morbidity rate in children: under 4 years old, 30% of patients; under 9 years old, 60% or more. Occupy. Most patients with mycoplasma pneumonia have only bronchitis, but some may become more severe and may also develop pneumonia and other complications. Therefore, since rapid definitive diagnosis and selection of an appropriate antibacterial drug are important, immunochromatographic analysis is suitable because the operation is simple and rapid detection is possible.
  • Patent Document 1 discloses an immunochromatographic analyzer using a monoclonal antibody specific for the P30 protein of Mycoplasma pneumoniae.
  • Patent Document 1 discloses a method of using a sample diluent containing a nonionic surfactant having an HLB value of 13 to 17 together with the immunochromatographic analyzer for the purpose of highly sensitive detection.
  • Patent Document 2 discloses an immunochromatographic analyzer using an antibody specific to the ribosomal protein Ribosome Protein L7 / L12 of Mycoplasma pneumoniae.
  • Patent Document 2 discloses a kit in which a sample diluent containing a polyoxyethylene alkyl ether and a nonionic surfactant having an HLB value of 12 to 15 is used with the immunochromatographic analyzer.
  • the present invention in a method for immunologically detecting Mycoplasma pneumoniae, provides a method for detecting Mycoplasma pneumoniae with high sensitivity by an approach different from the selection of the surfactant added to the sample diluent.
  • the present inventors have conducted extensive studies to solve the above problems, and by applying a polysulfone third pad to a test strip for immunochromatography for detecting Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae can be detected with high sensitivity.
  • the present invention has been completed. That is, the present invention has the following configurations.
  • ⁇ 1> A test strip for immunochromatography for detecting Mycoplasma pneumoniae, which has at least the following configurations (1) to (3).
  • (1) A sample pad having a sample supply section (2)
  • An antibody against Mycoplasma pneumoniae was immobilized Insoluble membrane with detection part ⁇ 2>
  • An immunochromatographic detection method for detecting Mycoplasma pneumoniae in a sample using a test strip for immunochromatography having the following configurations (1) to (3).
  • Test strip (1) A sample pad having a sample supply section (2) A polysulfone porous third pad arranged downstream of the sample pad and upstream of the insoluble membrane (3) An antibody against Mycoplasma pneumoniae was immobilized Insoluble membrane with detection part ⁇ 6>
  • the immunochromatographic detection method according to ⁇ 5>, wherein the immunochromatographic test strip further has the following configuration (4).
  • An immunochromatographic detection kit comprising the immunochromatographic test strip according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>.
  • the present invention can detect Mycoplasma pneumoniae with high sensitivity by using a test strip for immunochromatography to which a third pad made of polysulfone is applied.
  • test strip of this invention It is a schematic block diagram of the test strip of this invention provided with the third pad. It is a schematic block diagram of the test strip of a comparative example which does not comprise a third pad.
  • the immunochromatographic test strip of the present invention is a test strip for detecting a complex of a substance to be detected such as Mycoplasma pneumoniae-derived protein in the sample and a conjugate by expanding the sample in an insoluble membrane.
  • the test strip has at least the following configurations (1) to (3). (1) A sample pad having a sample supply section (2) A polysulfone porous third pad arranged downstream of the sample pad and upstream of the insoluble membrane (3) An antibody against Mycoplasma pneumoniae was immobilized Insoluble membrane with detector
  • the conjugate is one in which an antibody or an antigen that immunologically reacts with a substance to be detected is immobilized on a label, and the mode of existence of the conjugate is as a conjugate pad, a sample pad.
  • a third pad, or a pad other than the insoluble membrane may be present in a state of being impregnated (type A), or may be present as a conjugate part in a part of the sample pad (type B). May be present as a separate conjugation reagent to be mixed with the analyte separately from the test strip (Type C).
  • the type A will be described.
  • the sample pad, the conjugate pad, the third pad, and the insoluble membrane are arranged in this order from upstream to downstream in the flow direction of the sample, and they are arranged so as to at least partially overlap the upper and lower layers, respectively.
  • a test strip having such an arrangement is shown in FIG.
  • the sample containing the substance to be detected is supplied to the sample pad of such a test strip, the substance to be detected flows through the sample pad to the conjugate pad on the downstream side.
  • the conjugate pad the substance to be detected and the conjugate pass through the pad while forming a complex (aggregate).
  • the complex is then passed through a porous third pad that is placed in contact with the lower surface of the conjugate pad and deployed to the insoluble membrane.
  • the complex Since the antibody that immunologically reacts with the substance to be detected is immobilized on a part of the insoluble membrane, the complex is bound and immobilized by the immunoreaction here.
  • the immobilized complex is detected by means for detecting the absorbance, reflected light, fluorescence, magnetism and the like derived from the conjugate.
  • the type B existing as a conjugate part in a part of the sample pad will be described.
  • the difference from the type A test strip is that the sample pad and the conjugate pad are integrated, that is, the sample supply part and the conjugate part are formed in a part of the sample pad.
  • the sample supply part is a part that supplies a sample containing a substance to be detected
  • the conjugate part is a part that contains a conjugate
  • the sample supply part is on the upstream side of the conjugate part.
  • the arrangement of each pad is from the upstream to the sample pad / conjugate pad, the third pad, and the insoluble membrane.
  • Type C which exists as a separate conjugating reagent so as to be mixed with the analyte separately from the test strip, will be described.
  • the difference from the type A test strips above is that there is no conjugate pad and the conjugates exist as separate conjugation reagents.
  • a filter chip in which a conjugate is incorporated in a filter can be mentioned.
  • the conjugate and the substance to be detected are bound to each other by passing the sample diluent and the substance to be detected to form a complex (aggregate).
  • the substance to be detected can be detected by supplying it to the same test strip as in type A except that it has no conjugate pad. In this case, the arrangement of each pad is from the upstream to the sample pad, the third pad, and the insoluble membrane.
  • the sample pad used in the present invention is a site for receiving a sample, and includes any substance and form capable of absorbing a sample of a liquid in a state of being molded in the pad and allowing the liquid and an object to be detected to pass through.
  • materials suitable for the sample pad include, but are not limited to, glass fiber, acrylic fiber, hydrophilic polyethylene material, dry paper, paper pulp, woven fabric, and the like.
  • a glass fiber pad is preferably used.
  • the sample pad can also have the function of a conjugate pad described later. Further, the sample pad may contain a blocking reagent which is usually used for the purpose of preventing / suppressing non-specific reaction (adsorption) on the antibody-immobilized membrane.
  • the third pad of the present invention may be any one as long as it can pass the complex of the substance to be detected and the conjugate in the sample, but it is a porous member made of polysulfone.
  • the third pad made of this material can detect Mycoplasma pneumoniae with high sensitivity, although the reason is not clear.
  • the present invention can also be said to be a method of improving detection sensitivity in a method of detecting Mycoplasma pneumoniae in a sample using a test strip including the third pad.
  • the lower limit of the average pore diameter of the porous third pad of the present invention is 1 ⁇ m or more, preferably 2 ⁇ m or more.
  • the upper limit is, for example, 100 ⁇ m or less, preferably 50 ⁇ m or less, more preferably 30 ⁇ m or less, further preferably 20 ⁇ m or less, particularly preferably 15 ⁇ m or less, most preferably 10 ⁇ m or less.
  • the range of the average pore diameter is, for example, 1 to 100 ⁇ m which is a combination of the above lower limit and the upper limit, preferably 1 to 50 ⁇ m, more preferably 1 to 30 ⁇ m, further preferably 1 to 20 ⁇ m, particularly preferably 1 to 10 ⁇ m. 1 to 5 ⁇ m is most preferable.
  • the polysulfone membrane of the present invention is a so-called asymmetric membrane having different cross-sectional structures on the front and back sides, and is arranged so that the pore diameter decreases from the surface to the bottom of the test strip.
  • the average pore diameter is the average pore diameter on the so-called dense layer (also referred to as a functional layer) on the bottom surface side, and can be obtained by measuring from the electron micrograph of the dense layer side surface of the third pad.
  • the insoluble membrane used in the present invention has at least one detection part on which an antibody that immunologically reacts with the substance to be detected is immobilized. Immobilization of an antibody that immunologically reacts with the substance to be detected on the insoluble membrane carrier can be carried out by a conventionally known method.
  • a lateral flow type immunochromatographic reagent an apparatus having a mechanism capable of preparing a liquid containing the above antibody at a predetermined concentration and horizontally moving it while discharging the liquid from a nozzle at a constant speed The solution can be immobilized on the insoluble membrane carrier by applying the solution in a line on the insoluble membrane carrier and drying.
  • the concentration of the antibody in the above liquid is preferably 0.1 to 5 mg / mL, more preferably 0.5 to 2 mg / mL.
  • the amount of the antibody immobilized on the insoluble membrane carrier can be optimized by adjusting the discharge rate from the nozzle of the above device, and 0.5 to 2 ⁇ L / cm is preferable. ..
  • the measurement method using the lateral flow immunochromatographic reagent is a measurement method of a method in which the sample is developed so as to move in parallel to the insoluble membrane carrier due to a capillary phenomenon.
  • a solution containing the above antibody at a predetermined concentration can be prepared by adding the antibody to a buffer solution.
  • the buffer solution include phosphate buffer solution, Tris buffer solution, Good's buffer solution and other commonly used buffer solutions.
  • control capture reagent conventionally used in immunochromatography reagents may be immobilized on the insoluble membrane.
  • the control capture reagent is a reagent for ensuring the reliability of the assay and captures the control reagent contained in the conjugate pad.
  • the moss-derived hemocyanin (hereinafter referred to as KLH) labeled on the conjugate pad is included as a control reagent
  • the anti-KLH antibody or the like corresponds to the control capture reagent.
  • the position at which the control capture reagent is immobilized can be appropriately selected to suit the design of the assay system.
  • the membrane that constitutes the insoluble membrane used in the present invention a known membrane that has been conventionally used as an insoluble membrane carrier for immunochromatographic reagents can be used.
  • the membrane include polyethylene, polyethylene terephthalate, nylons, glass, polysaccharides such as cellulose and cellulose derivatives, and fibers composed of ceramics.
  • Specific examples include glass fiber filter paper and cellulose filter paper commercially available from Sartorius, Millipore, Toyo Roshi, Whatman and the like. Among them, Sartorius, UniSart CN140 is preferable.
  • the above immunochromatographic test strip is preferably placed on a solid support such as a plastic adhesive sheet.
  • the solid support is composed of materials that do not interfere with the capillary flow of the sample and conjugate.
  • the immunochromatographic test strip may be immobilized on a solid support with an adhesive or the like.
  • the adhesive component and the like are composed of substances that do not interfere with the capillary flow of the sample and the conjugate.
  • the immunochromatographic test strip is stored in an appropriate container (housing) in consideration of the size of the immunochromatographic test strip, the sample addition method and the addition position, the formation position of the detection part of the insoluble membrane, the signal detection method, and the like. -It can be installed and used, and the state of being stored and installed in this way is called a "device".
  • the sample refers to a sample that may contain Mycoplasma pneumoniae that is a detection target collected from a patient, and is a runny nose, nasal swab, pharyngeal swab, etc., among which a pharyngeal swab is preferable.
  • the patient specimen may be used as a sample as it is, or may be appropriately diluted with a sample diluent to give a sample. Moreover, you may use what was appropriately diluted and filtered as a sample.
  • the sample diluent may be referred to as a sample diluent, a sample extract, a sample developing solution, a sample suspension, etc., but they are all used synonymously.
  • the sample diluting solution of the present invention may be any one that can dilute a sample, and includes water and a buffer solution.
  • the buffer solution contained in the sample diluent according to the present invention include a commonly used buffer solution such as a phosphate buffer solution, a Tris buffer solution, and a Good's buffer solution.
  • the sample diluent of the present invention may be any solution containing the above compound and a buffer solution, may be a buffer solution containing the above compound, and further salts such as sodium chloride, stabilizers and preservatives such as sucrose, Procrine (registered trademark). ) Etc. may be included.
  • Salts include those added for the purpose of adjusting the ionic strength such as sodium chloride, and those added for the purpose of adjusting the pH of the buffer solution such as sodium hydroxide.
  • the pH of the sample diluent of the present invention is preferably in the range of 6.0 to 10.0, more preferably 7.0 to 9.0, and even more preferably 7.5 to 8.5.
  • the sample diluting solution of the present invention is a solution for diluting a sample
  • the role of adding a sample (specimen) containing Mycoplasma pneumoniae to the sample diluting solution to dissolve, extract, or disperse the sample Is responsible for Therefore typically, the sample and sample diluent are mixed at the time the sample is applied to the sample pad of the test strip.
  • the sample is supplied directly or diluted with another diluent other than the sample diluent of the present invention to the sample pad, and at the same time or after a delay, the sample diluent of the present invention is supplied to the sample pad.
  • the case is also included in the detection method of the present invention.
  • the substance to be detected in the present invention is Mycoplasma pneumoniae.
  • the present invention is a method for detecting or quantifying a Mycoplasma pneumoniae-derived protein by using an antibody against a Mycoplasma pneumoniae protein to detect or quantify the presence of Mycoplasma pneumoniae.
  • Mycoplasma pneumoniae proteins include P1 protein, P30 protein, and ribosomal protein L7 / L12 protein.
  • the antibody against Mycoplasma pneumoniae of the present invention may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as it is an antibody capable of specifically detecting the protein of Mycoplasma pneumoniae, and among them, the monoclonal antibody is preferable.
  • Specific antibodies that specifically detect Mycoplasma pneumoniae include antibodies to ribosomal proteins L7 / L12 and antibodies to membrane antigen proteins P1 and P30. Among these, an antibody against P30 is preferable.
  • P30 protein is one of the adhesion proteins with a molecular weight of 30 kDa.
  • Mycoplasma pneumoniae cells it is a transmembrane protein that is localized on the cell surface at the tip of the adhesion organ and has an N-terminal buried inside the cell membrane and a C-terminal located outside the cell membrane.
  • the antibody against the P30 protein may be any antibody capable of specifically recognizing the P30 protein, and as the monoclonal antibody, a monoclonal antibody that recognizes a portion consisting of a repeating structure of an amino acid sequence containing proline in the extracellular region of the P30 protein can be used. Is preferred.
  • Antibodies against Mycoplasma pneumoniae are, for example, recombinant proteins extracted or purified by expressing a gene of a protein extracted from Mycoplasma pneumoniae cells or a cloned protein by genetic engineering in a host such as Escherichia coli, or a part of the protein. It can be obtained according to a conventional method by using the polypeptide which constitutes as an immunizing antigen.
  • a polyclonal antibody it can be obtained from an antiserum obtained by immunizing an animal such as a mouse with the immunizing antigen, and a monoclonal antibody is obtained by immunizing an animal such as a mouse and then spleen cells and myeloma cells of the immunized animal.
  • the cells can be obtained by screening the desired antibody-producing strain by allowing the fused cells obtained by cell fusion of and to be grown in a HAT-containing medium, followed by growth.
  • the antibodies against Mycoplasma pneumoniae of the present invention also include antibody fragments and modified antibodies that are substantially equivalent to the antibodies.
  • the antibody fragment include Fab fragment, F (ab ′) 2 fragment, Fab ′ fragment, scFv fragment and the like.
  • the labeled antibody which is the first antibody against Mycoplasma pneumoniae of the present invention and the immobilized antibody which is the second antibody may each be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but at least one of them is preferably a monoclonal antibody. More preferably, both are monoclonal antibodies.
  • the first antibody and the second antibody are preferably antibodies that recognize different epitopes.
  • anti-P30 monoclonal antibody used in the following tests was obtained by a method commonly used by those skilled in the art for producing a monoclonal antibody (such as the method of Kohler and Milstein (Nature, 256, 495 (1975)).
  • colloidal metal particles such as gold colloid particles and platinum colloid particles, color latex particles, magnetic particles and fluorescent particles are preferable, and gold colloid particles and color latex particles are particularly preferable.
  • the conjugate used in the present invention is one in which an antibody that immunologically reacts with Mycoplasma pneumoniae, which is a substance to be detected, is immobilized on the above-described label.
  • the conjugate is preferably an anti-Mycoplasma pneumoniae P30 protein monoclonal antibody or a polyclonal antibody immobilized on colloidal gold particles.
  • Examples of the method for immobilizing an antibody that immunologically reacts with a substance to be detected on a label include physical adsorption and chemical bonding, and immobilization is generally performed by physical adsorption.
  • the Mycoplasma pneumoniae detection kit using immunochromatography of the present invention may be any kit containing the test strip having at least the following configurations (1) to (3).
  • the present detection kit may further include a sample diluent, a reagent necessary for detection, a test tube, a sample collecting instrument, an instruction manual, a housing for storing a test strip, and the like.
  • upstream or downstream is used to mean “upstream side” or “downstream side” in the sample flow direction. That is, in the test strip of the present invention, when the sample pad, the conjugate pad, the third pad, and the insoluble membrane are laminated so as to partially overlap with each other, the sample pad is the most upstream and the insoluble membrane is the downstream. Become.
  • the end pad may be laminated on the insoluble membrane so that the downstream end of the insoluble membrane overlaps with each other. In this case, the end pad is the most downstream.
  • Test Material (1) Test Device (1-1) Test Device of the Present Invention A test device including a test strip for immunochromatography using a monoclonal antibody against Mycoplasma pneumoniae P30 protein was produced.
  • FIG. 1 shows a schematic configuration diagram of the immunochromatographic test strip of the present invention.
  • the conjugate pad is impregnated with a conjugate in which gold colloid is sensitized with an anti-P30 protein monoclonal antibody (anti-S08222R, S08224R, S08228R), and the insoluble membrane has an anti-P30 protein monoclonal antibody (antibody S08210R), and
  • the control reagent is immobilized in a line perpendicular to the flow direction.
  • the pads are laminated and arranged so that the upper and lower pads are partially in contact with each other.
  • the line containing the anti-P30 protein monoclonal antibody is called the test line (c1)
  • the line containing the control reagent is called the control line (c2).
  • sample diluting solution was prepared by adding 1.0% polyoxyethylene alkylamine and 50 mM NaCl to a 20 mM phosphate buffer solution (pH 7.5). BSA 0.25% was added as an additive.
  • Sample A commercially available antigen (manufacturer: Fitzgerald, product name: Mycoplasma pneumoniae protein (Cat #: 30-AM40)) was concentrated by centrifugation and diluted with physiological saline at the magnification in the table to be used as a sample. I was there. 15 ⁇ L of each specimen was suspended in 400 ⁇ L of each sample diluent to prepare a sample.
  • Test method 120 ⁇ L of the sample was dropped on the test device, and 15 minutes later, the color development intensity of the test line was visually evaluated by the following criteria using a color sample called a “color chart”. The results of the dilution ratio in the detectable range are shaded. ⁇ Evaluation criteria> +: Coloring is seen ⁇ : Coloring is seen but weak or very weak-: No coloration is seen
  • Example 2 Evaluation study of immunochromatographic test strip using a third pad (2) Since it was found from Example 1 that the detection sensitivity was improved by using the third pad as compared with the case without the third pad, the type of the third pad was changed and it was examined which one was appropriate.
  • Test Material (1) Test Device (1-1) The test device of the present invention was the same as the device using the labeled antibody S08224R of Example 1. (1-2) Comparative Example 1 Test Device A test device was prepared in the same manner as the test device of the present invention, except that the material of the third pad was changed to the same glass fiber as the sample pad.
  • the present invention can detect Mycoplasma pneumoniae with high sensitivity by using a test strip for immunochromatography to which a third pad made of polysulfone is applied.

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Abstract

マイコプラズマ・ニューモニエを免疫学的に検出する方法において、検体希釈液に添加する界面活性剤の選択とは異なるアプローチにより、マイコプラズマ・ニューモニエを高感度で検出する方法を提供することを課題とする。　マイコプラズマ・ニューモニエ検出するためのイムノクロマトグラフィー用 テストストリップであって、少なくとも以下の構成（１）～（３）を有する前記テストストリップを提供する。 （１）サンプル供給部を有するサンプルパッド （２）サンプルパッドの下流であって、不溶性メンブレンの上流に配置されたポリスルホン製多孔質性のサードパッド （３）マイコプラズマ・ニューモニエに対する抗体が固定化された検出部を有する不溶性メンブレン

Description

マイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的検出方法
　本発明は、マイコプラズマ・ニューモニエを免疫学的に検出するためのテストストリップ及び当該テストストリップを使用した免疫学的検出方法に関する。
　マイコプラズマ肺炎は、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を原因菌とする呼吸器系の感染症であり、小児の罹患率が高く、４歳未満が患者の３０％を、９歳未満が６０％以上を占める。
  マイコプラズマ肺炎の多くの患者は気管支炎程度ですむが、一部は重症化して肺炎や他の合併症も併発するおそれがある。したがって、迅速な確定診断と適切な抗菌薬の選択が重要であることから、操作が簡便かつ迅速な検出が可能であるイムノクロマト分析が適している。
  特許文献１には、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を用いたイムノクロマト分析装置が開示されている。
　本特許文献１では、高感度な検出を目的として、ＨＬＢ値が１３～１７の非イオン界面活性剤を含有する検体希釈液を前記イムノクロマト分析装置と共に使用する方法が開示されている。
　また、特許文献２には、マイコプラズマ・ニューモニエのリボソームタンパク質Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＰｒｏｔｅｉｎＬ７／Ｌ１２に特異的な抗体を用いたイムノクロマト分析装置が開示されている。
　本特許文献２では、ポリオキシエチレンアルキルエーテルやＨＬＢ値が１２～１５の非イオン界面活性剤を含有する検体希釈液を前記イムノクロマト分析装置と共に使用するキットが開示されている。
　これらの界面活性剤は、検出対象となる菌体やタンパク質を処理することで抗体検出部位を露出させることで検出感度を高めるという役割を果たしていると考えられる。
　しかし、検体希釈液に当該界面活性剤を添加した前処理だけでは十分な検出感度が得られない場合も想定され、さらなる検出感度の向上が求められていた。
特開2017-9571号公報 特開2014-167439号公報
　本発明は、マイコプラズマ・ニューモニエを免疫学的に検出する方法において、検体希釈液に添加する界面活性剤の選択とは異なるアプローチにより、マイコプラズマ・ニューモニエを高感度で検出する方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、マイコプラズマ・ニューモニエ検出するためのイムノクロマトグラフィー用テストストリップにポリスルホン製サードパッドを適用することによって、マイコプラズマ・ニューモニエを高感度に検出できることを見出し本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の構成を有する。
＜１＞
マイコプラズマ・ニューモニエを検出するためのイムノクロマトグラフィー用テストストリップであって、少なくとも以下の構成（１）～（３）を有する前記テストストリップ。
（１）サンプル供給部を有するサンプルパッド
（２）サンプルパッドの下流であって、不溶性メンブレンの上流に配置されたポリスルホン製多孔質性のサードパッド
（３）マイコプラズマ・ニューモニエに対する抗体が固定化された検出部を有する不溶性メンブレン
＜２＞
さらに以下の構成（４）を有する＜１＞に記載のテストストリップ。
（４）マイコプラズマ・ニューモニエに対する抗体が標識体に固定化されたコンジュゲートが含浸されたコンジュゲートパッドであって、前記サンプルパッドの下流であって前記サードパッドの上流に配置されたコンジュゲートパッド
＜３＞ 
ポリスルホン製多孔質性のサードパッドの平均孔径が１～２０μｍである、＜１＞又は＜２＞に記載のイムノクロマトグラフィー用テストストリップ。
＜４＞
マイコプラズマ・ニューモニエに対する抗体が、抗マイコプラズマ・ニューモニエのＰ１又はＰ３０タンパク質に対する抗体である＜１＞～＜３＞のいずれかに記載のテストストリップ。
＜５＞
以下の構成（１）～（３）を有するイムノクロマトグラフィー用テストストリップを用いてサンプル中のマイコプラズマ・ニューモニエを検出するイムノクロマト検出方法。
テストストリップ；
（１）サンプル供給部を有するサンプルパッド
（２）サンプルパッドの下流であって、不溶性メンブレンの上流に配置されたポリスルホン製多孔質性のサードパッド
（３）マイコプラズマ・ニューモニエに対する抗体が固定化された検出部を有する不溶性メンブレン
＜６＞
イムノクロマトグラフィー用テストストリップがさらに以下の構成（４）を有する＜５＞に記載のイムノクロマト検出方法。
（４）マイコプラズマ・ニューモニエに対する抗体が標識体に固定化されたコンジュゲートが含浸されたコンジュゲートパッドであって、前記サンプルパッドの下流であって前記サードパッドの上流に配置されたコンジュゲートパッド
＜７＞
ポリスルホン製多孔質性のサードパッドの平均孔径が１～２０μｍである、＜５＞又は＜６＞に記載のイムノクロマト検出方法。
＜８＞
マイコプラズマ・ニューモニエに対する抗体が、抗マイコプラズマ・ニューモニエのＰ１又はＰ３０タンパク質に対する抗体である＜５＞～＜７＞のいずれかに記載のイムノクロマト検出方法。
＜９＞
＜１＞～＜４＞のいずれかに記載のイムノクロマトグラフィー用テストストリップを含むイムノクロマト検出キット。
＜１０＞
以下の構成（１）～（３）を有するイムノクロマトグラフィー用テストストリップを用いてサンプル中のマイコプラズマ・ニューモニエを検出する方法における検出感度の向上方法。
テストストリップ；
（１）サンプル供給部を有するサンプルパッド
（２）サンプルパッドの下流であって、不溶性メンブレンの上流に配置されたポリスルホン製多孔質性のサードパッド
（３）マイコプラズマ・ニューモニエに対する抗体が固定化された検出部を有する不溶性メンブレン
　本発明は、ポリスルホン製サードパッドを適用したイムノクロマトグラフィー用テストストリップを用いることにより、マイコプラズマ・ニューモニエを高感度に検出できる。
サードパッドを備えた本発明のテストストリップの模式構成図である。 サードパッドを具備しない比較例のテストストリップの模式構成図である。
（イムノクロマトグラフィー用を利用した検出）
　本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップは、サンプルを不溶性メンブレン中を展開させることにより、サンプル中のマイコプラズマ・ニューモニエ由来タンパクなどの被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出するテストストリップである。当該テストストリップは、少なくとも以下の構成（１）～（３）を有する。
（１）サンプル供給部を有するサンプルパッド
（２）サンプルパッドの下流であって、不溶性メンブレンの上流に配置されたポリスルホン製多孔質性のサードパッド
（３）マイコプラズマ・ニューモニエに対する抗体が固定化された検出部を有する不溶性メンブレン
　本発明において、コンジュゲートは、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体または抗原が標識体に固定化されたものであり、コンジュゲートの存在様式としては、コンジュゲートパッドとして、サンプルパッド、サードパッド、不溶性メンブレン以外の別のパッドに含浸された状態で存在してもよいし（タイプＡ）、サンプルパッドの一部にコンジュゲート部として存在してもよいし（タイプＢ）、さらには、テストストリップとは別に、検体と混合されるように個別のコンジュゲート試薬として存在してもよい（タイプＣ）。
　以下、詳細にそれぞれの存在様式とその作用を説明する。
　タイプＡについて説明する。サンプルの流れ方向の上流より下流に向かって、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、サードパッド、不溶性メンブレンの順で配置され、それぞれ上下の層と少なくとも一部が重複するように配置される。このような配置例のテストストリップを図１に示す。
　このようなテストストリップのサンプルパッドに、被検出物質を含有するサンプルが供給されると、被検出物質はサンプルパッドを通過して下流側のコンジュゲートパッドへと流れる。コンジュゲートパッドでは、被検出物質とコンジュゲートが接触して複合体（凝集体）を形成しながら当該パッドを通過する。その後、複合体はコンジュゲートパッドの下面に接触して配置された多孔質サードパッドを通過し、不溶性メンブレンへと展開される。
　不溶性メンブレンには、その一部に被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体が固定化されているため、該複合体がここで免疫反応により結合して固定化されることになる。固定化された複合体は、コンジュゲートに由来する吸光度、反射光、蛍光、磁気等を検出する手段により検出される。
　サンプルパッドの一部にコンジュゲート部として存在するタイプＢについて説明する。
　上記タイプＡのテストストリップとの違いは、サンプルパッドとコンジュゲートパッドが一体になった点であり、つまり、サンプルパッドの一部にサンプル供給部およびコンジュゲート部が構成されている点である。
　上記サンプル供給部は、被検出物質を含有するサンプルを供給する部位であり、上記コンジュゲート部は、コンジュゲートを含有する部位であり、サンプル供給部がコンジュゲート部の上流側となる。この場合、各パッドの配置は、上流よりサンプルパッド兼コンジュゲートパッド、サードパッド、不溶性メンブレンの順である。
　テストストリップとは別に、検体と混合されるように個別のコンジュゲート試薬として存在するタイプＣについて説明する。
　上記タイプＡのテストストリップとの違いは、コンジュゲートパッドが存在せず、コンジュゲートは個別のコンジュゲート試薬として存在する点である。例えば、フィルター中にコンジュゲートが内蔵されたフィルターチップが挙げられる。このようなフィルターチップを使って、サンプル希釈液及び被検出物質を通過させることでコンジュゲートと被検出物質が結合し、複合体（凝集体）を形成する。これをコンジュゲートパッドを有さないこと以外はタイプＡと同一の前記テストストリップに供給することで、被検出物質を検出することができる。この場合、各パッドの配置は、上流からサンプルパッド、サードパッド、不溶性メンブレンの順になる。
（サンプルパッド）
　本発明に用いられるサンプルパッドとは、サンプルを受け入れる部位であり、パッドに成型された状態で液体のサンプルを吸収し、液体と検出対象物とが通り抜けることができるどんな物質及び形態をも含む。サンプルパッドに適した材料の具体例として、ガラス繊維（グラスファイバー）、アクリル繊維、親水性ポリエチレン材、乾燥紙、紙パルプ、織物等が含まれるが、これらに限定されない。好適には、グラスファイバー製パッドが用いられる。該サンプルパッドには、後述するコンジュゲートパッドの機能を併せ持たせることも出来る。また、サンプルパッドには、抗体固定化メンブレンにおける非特異的反応（吸着）を防止・抑制する目的で、通常使用されるブロッキング試薬を含ませることができる。
（サードパッド）
　本発明のサードパッドは、サンプル中の被検出物質とコンジュゲートの複合体を透過させることができるものであればいずれでもよいが、ポリスルホン製の多孔質性部材である。この材質のサードパッドは、理由は定かではないがマイコプラズマ・ニューモニエを高感度に検出させることができる。一方で、ポリスルホン以外の材質であるグラスファイバー製、ポリエーテルスルホン製のサードパッドでは高感度な検出ができなかった。　また、本発明は、当該サードパッドを含むテストストリップを用いてサンプル中のマイコプラズマ・ニューモニエを検出する方法における検出感度の向上方法とも言える。
　また、本発明の多孔質性サードパッドの平均孔径は、下限としては１μｍ以上が例示され、２μｍ以上が好ましい。上限としては、１００μｍ以下が例示され、５０μｍ以下が好ましく、３０μｍ以下がより好ましく、２０μｍ以下がさらに好ましく、１５μｍ以下が特に好ましく、１０μｍ以下が最も好ましい。また、平均孔径の範囲としては、上記下限と上限の組み合わせである１～１００μｍが例示され、１～５０μｍが好ましく、１～３０μｍがより好ましく、１～２０μｍがさらに好ましく、１～１０μｍが特に好ましく、１～５μｍが最も好ましい。
　１μｍ未満では詰まりの原因となり、検体の流れ自体が遅くなるからであり１００μｍより大きいと感度が低下するためと思われるからである。
　本発明のポリスルホン製の膜は表裏で断面構造の異なるいわゆる非対称膜と呼ばれるものであり、テストストリップの表面から底面に向かって孔径が小さくなるように配置する。上記平均孔径は、底面側のいわゆる緻密層（機能層とも呼ばれる）といわれる側の平均孔径であり、サードパッドの緻密層側の面の電子顕微鏡写真から計測して求めることができる。
（不溶性メンブレン）
　本発明に用いられる不溶性メンブレンは、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体が固定化された少なくとも１つの検出部を有する。被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体の不溶性メンブレン担体への固定化は、従来公知の方法で実施することができる。
　ラテラルフロー式のイムノクロマト試薬の場合には、上記の抗体を所定の濃度で含有する液を調製し、ノズルから液を一定の速度で吐出しながら水平方向に移動させることのできる機構を有する装置などを用いて、上記液をライン状に不溶性メンブレン担体に塗布し、乾燥させることにより固定化させることができる。上記液の抗体の濃度は０．１～５ｍｇ／ｍＬが好ましく、０．５～２ｍｇ／ｍＬがさらに好適である。また、抗体の不溶性メンブレン担体への固定化量は、ラテラルフロー式の場合には上記の装置のノズルからの吐出速度を調節することによって最適化でき、０．５～２μＬ／ｃｍが好適である。
　なお、上記ラテラルフロー式のイムノクロマト試薬を用いた測定方法は、サンプルが毛細管現象により不溶性メンブレン担体に対して並行方向に移動するように展開する方式の測定方法である。
　また、上記の抗体を所定の濃度で含有する液は、緩衝液に抗体を添加することにより調製することができる。該緩衝液の種類としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液など通常使用される緩衝液をあげることができる。
　なお、不溶性メンブレンには、従来からイムノクロマト試薬で用いられているコントロール捕捉試薬を固定化してもよい。該コントロール捕捉試薬は、アッセイの信頼性を担保するための試薬であって、コンジュゲートパッドに含ませたコントロール試薬を捕捉するものである。例えば、コンジュゲートパッドに標識されたスカシ貝由来ヘモシアニン（以下、ＫＬＨという）をコントロール試薬として含む場合には、抗ＫＬＨ抗体などがコントロール捕捉試薬に該当する。コントロール捕捉試薬を固定化する位置は、アッセイ系の設計に適合するよう適宜選択することができる。
　本発明で用いられる不溶性メンブレンを構成するメンブレンとしては、従来からイムノクロマト試薬の不溶性メンブレン担体として用いられている公知のメンブレンが使用できる。例えば、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン類、ガラス、セルロースやセルロース誘導体などの多糖類、セラミックス等からなる繊維から構成されるメンブレンがあげられる。具体的には、ザルトリウス社、ミリポア社、東洋濾紙社、ワットマン社などから市販されているガラス繊維ろ紙やセルロースろ紙などが挙げられる。中でも、ザルトリウス社、UniSart CN140が好ましい。
　上記イムノクロマトグラフィー用テストストリップは、プラスチック製粘着シートのような固相支持体上に配置させることが好ましい。該固相支持体は、サンプル及びコンジュゲートの毛管流を妨げない物質で構成する。また、イムノクロマトグラフィー用テストストリップを固相支持体上に接着剤等で固定化してもよい。この場合、接着剤の成分等においてもサンプル及びコンジュゲートの毛管流を妨げない物質で構成する。該イムノクロマトグラフィー用テストストリップは、イムノクロマトグラフィー用テストストリップの大きさ、サンプルの添加方法や添加位置、不溶性メンブレンの検出部の形成位置、シグナルの検出方法などを考慮した適当な容器（ハウジング）に格納・搭載して使用することができ、このように格納・搭載された状態を「デバイス」という。
（サンプル）
　本発明において、サンプルとは患者から採取した被検出対象であるマイコプラズマ・ニューモニエを含む可能性がある検体をいい、鼻水、鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液などであり、このうちでも咽頭拭い液が好適である。
　患者検体は、そのままサンプルとして用いてもよく、適宜サンプル希釈液によって希釈してサンプルとしてもよい。また、適宜希釈し濾過したものをサンプルとして用いてもよい。なお、サンプル希釈液は、他では検体希釈液、サンプル抽出液、サンプル展開液、サンプル浮遊液などと呼ばれることもあるが、いずれも同義で用いられる。
(サンプル希釈液）
　本発明のサンプル希釈液は、サンプルを希釈できるものであればよく、水、緩衝液を含む。
　本発明のサンプル希釈液に含まれる緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液など通常使用される緩衝液をあげることができる。本発明のサンプル希釈液は、上記化合物と緩衝液を含むものであればよく、上記化合物を含む緩衝液でもよく、さらに塩化ナトリウムなどの塩類、スクロースなどの安定剤や保存剤、プロクリン(登録商標)などの防腐剤等を含んでもよい。塩類は塩化ナトリウムなどのようにイオン強度の調整のために含ませるもののほか、水酸化ナトリウムなど緩衝液のｐＨを調整する目的で添加するものも含まれる。本発明のサンプル希釈液のｐＨは、６．０～１０．０の範囲が好ましく、７．０～９．０がより好ましく、７．５～８．５がよりいっそう好ましい。
　本発明のサンプル希釈液は、サンプルを希釈するための液であるから、マイコプラズマ・ニューモニエを含むサンプル（検体）をサンプル希釈液に添加して、サンプルを溶解、抽出、あるいは分散して希釈する役割を担っている。したがって、典型的には、テストストリップのサンプルパッドにサンプルを供給する時点でサンプルとサンプル希釈液は混合されている。しかし、このほかに、サンプルを直接あるいは他の本発明のサンプル希釈液以外の希釈液で希釈したものをサンプルパッドに供給し、同時にあるいは遅れて本発明のサンプル希釈液を前記サンプルパッドに供給する場合も本発明の検出方法に含まれる。
（被検出物質）
　本発明の被検出物質はマイコプラズマ・ニューモニエである。本発明は、マイコプラズマ・ニューモニエのタンパク質に対する抗体を用いて、マイコプラズマ・ニューモニエ由来タンパク質を検出し、または定量することで、マイコプラズマ・ニューモニエの存在を検出し、または定量する方法である。マイコプラズマ・ニューモニエのタンパク質としては、Ｐ１タンパク質、Ｐ３０タンパク質、リボソームタンパクであるＬ７／Ｌ１２タンパク質などが挙げられる。
（マイコプラズマ・ニューモニエに対する抗体）
　本発明のマイコプラズマ・ニューモニエに対する抗体とは、該マイコプラズマ・ニューモニエのタンパク質を特異的に検出できる抗体であればポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよく、このうちでもモノクローナル抗体が好ましい。
　具体的なマイコプラズマ・ニューモニエを特異的に検出する抗体としては、リボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体、膜抗原蛋白質であるＰ１、Ｐ３０に対する抗体が挙げられる。これらの中でも、Ｐ３０に対する抗体が好ましい。
　Ｐ３０タンパク質は分子量３０ｋＤａの接着タンパク質の１つである。マイコプラズマ・ニューモニエの菌体においては、接着器官の先端部の細胞表面に局在しており、細胞膜内に埋没しているＮ末端と細胞膜外に存在するＣ末端を持つ膜貫通型タンパク質である。
  Ｐ３０タンパク質に対する抗体は、Ｐ３０タンパク質を特異的に認識できる抗体であればよく、モノクローナル抗体としては、Ｐ３０タンパク質の細胞外領域における、プロリンを多く含むアミノ酸配列の繰り返し構造からなる部分を認識するモノクローナル抗体が好ましい。
　マイコプラズマ・ニューモニエに対する抗体は、例えば、マイコプラズマ・ニューモニエ菌体から抽出したタンパク質またはクローニングされたタンパク質の遺伝子を大腸菌などの宿主で遺伝子工学的に発現させて抽出精製した組み換えタンパク質、又は当該タンパク質の一部を構成するポリペプチドを免疫用抗原として、常法に従って得ることができる。ポリクローナル抗体の場合は、前記免疫用抗原でマウスなどの動物を免疫した抗血清から得ることができ、モノクローナル抗体は、マウスなどの動物に免疫した後、この免疫された動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを細胞融合して得られた融合細胞をＨＡＴ含有培地で選択した後に増殖させて、所望の抗体産生株をスクリーニングすることにより得ることができる。
  本発明のマイコプラズマ・ニューモニエに対する抗体は、当該抗体と実質的に同等の抗体フラグメントおよび改変抗体も含む。抗体フラグメントとしてはＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、ｓｃＦｖフラグメントなどが挙げられる。
　本発明のマイコプラズマ・ニューモニエに対する第一の抗体である標識抗体と第二の抗体である固定化抗体は、それぞれ、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、少なくともいずれか一方がモノクローナル抗体である方が好ましく、両方がモノクローナル抗体である方がより好ましい。
　また、第一の抗体と第二の抗体は、異なるエピトープを認識する抗体であることが好ましい。
（抗Ｐ３０モノクローナル抗体の調製例）
　以下の試験に用いた抗Ｐ３０モノクローナル抗体は、当業者がモノクローナル抗体を製造するために通常行う方法（ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ、第２５６巻４９５頁（１９７５年）等）により得られた。
（標識体）
　本発明で用いられる標識体は、従来からイムノクロマトグラフィー用テストストリップに用いられている公知の標識体を用いることができる。例えば、金コロイド粒子や白金コロイド粒子などのコロイド状金属粒子、カラーラテックス粒子、磁性粒子、蛍光粒子などが好ましく、特に金コロイド粒子、カラーラテックス粒子が好ましい。
（コンジュゲート）
　本発明で用いられるコンジュゲートは、上記のような標識体に被検出物質であるマイコプラズマ・ニューモニエに対して免疫学的に反応する抗体が固定化されたものである。コンジュゲートは、金コロイド粒子に抗マイコプラズマ・ニューモニエＰ３０タンパク質モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体が固定化されたものが好ましい。
　被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体を標識体へ固定化させる方法としては、物理吸着、化学結合等が挙げられ、物理吸着により固定化させるのが一般的である。
（キット）
　本発明のイムノクロマトグラフィーを利用したマイコプラズマ・ニューモニエ検出キットは、少なくとも以下の構成（１）～（３）を有する前記テストストリップを含むものであればよい。
（１）サンプル供給部を有するサンプルパッド
（２）サンプルパッドの下流であって、不溶性メンブレンの上流に配置されたポリスルホン製多孔質性のサードパッド
（３）マイコプラズマ・ニューモニエに対する抗体が固定化された検出部を有する不溶性メンブレン
　本検出キットは、他に、検体希釈液、検出に必要な試薬、試験用チューブ、サンプル採取用の器具、取扱い説明書、テストストリップ格納用のハウジングなどを含んでもよい。
(その他)
　本明細書中、上流または下流という意味は、サンプルの流れる方向の上流側、下流側という意味で用いる。すなわち、本発明のテストストリップで上からサンプルパッド、コンジュゲートパッド、サードパッド、不溶性メンブレンが一部で重なるように積層されている場合、サンプルパッドがもっとも上流であり、不溶性メンブレンが下流ということになる。また、不溶性メンブレンの下流側端部が重なるように上にエンドパッドが積層されることがあるが、この場合、エンドパッドがもっとも下流である。
〔実施例１〕サードパッドを利用したイムノクロマトテストストリップの評価検討（１）
１．試験材料
（１）テストデバイス
（１－１）本発明テストデバイスマイコプラズマ・ニューモニエＰ３０タンパク質に対するモノクローナル抗体を使用したイムノクロマトグラフィー用テストストリップを含むテストデバイスを製造した。　
　図１に、本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップの模式構成図を示した。
　プラスチック製粘着シート（a）に不溶性メンブレン（b）を貼り、次いで、ポリスルホン製サードパッド（緻密層側孔径2 μm、製造元：Pall　corporation、製品名：Vivid PS GF 10 mm×254 mm）(g)、コンジュゲートパッド（d)、サンプルパッド（e）を順に配置装着し、反対側の端には吸収パッド(ｆ)を配置装着した。コンジュゲートパッドには、金コロイドに抗Ｐ３０タンパク質モノクローナル抗体（抗S08222R、S08224R、S08228R）を感作したコンジュゲートが含浸されており、不溶性メンブレンには、抗Ｐ３０タンパク質モノクローナル抗体（抗体S08210R）、およびコントロール試薬が流れ方向に対して垂直にライン状に固定化されている。各パッドは、上下のパッドとその一部が接するように積層して配置される。抗Ｐ３０タンパク質モノクローナル抗体からなるラインをテストライン（ｃ１）、コントロール試薬からなるラインをコントロールライン（ｃ２）という。
　このように各構成要素を重ね合わせた構造物を一定幅に切断してイムノクロマトグラフィー用テストストリップを作製した。テストストリップを専用のプラスチック製ハウジングに格納・搭載し、イムノクロマトテストデバイス（図示せず）の形態にした。
（１－２）比較例テストデバイス
　本比較例のテストストリップを図２に示す。本テストストリップはサードパッドが存在しないため、コンジュゲートパッドの流れ方向下流端部が不溶性メンブレンと、上流端部がサンプルパッドとそれぞれ接するように、サンプルパッドの長さが長いものに代えて配置装着した。それ以外は、本発明テストデバイスと同様に作製した。
（２）サンプル希釈液
　ポリオキシエチレンアルキルアミンを１．０％、ＮａＣｌを５０ｍＭとなるように２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に添加してサンプル希釈液を調製した。添加剤としてＢＳＡ０．２５％を添加した。
（３）サンプル
　市販抗原（製造元：Fitzgerald社、製品名：Mycoplasma pneumoniae protein (Cat# : 30-AM40)）を遠心にて濃縮し、表中の倍率で生理食塩水により希釈したものを検体として用いた。各サンプル希釈液４００μＬに各検体１５μＬを懸濁し、サンプルとした。
２．試験方法
　テストデバイスにサンプル１２０μＬを滴下し、１５分後にテストラインの発色強度を「カラーチャート」という色見本を用いて以下の基準により目視で評価した。検出できる範囲の希釈率の結果に網掛けを付した。
＜評価基準＞
＋：発色が見られる
±：発色が見られるが弱いあるいは非常に弱い
－：発色が一切見られない
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
３．試験結果
　いずれの標識抗体を用いた場合でも、サードパッドを配置することで、サードパッドが無い場合に比べて感度が上昇することがわかった。
〔実施例２〕サードパッドを利用したイムノクロマトテストストリップの評価検討（２）
　実施例１によりサードパッドを利用することでサードパッドが無い場合に比べて検出感度が上がることがわかったため、サードパッドの種類を変更して、いずれが適切か検討を行った。
１．試験材料
（１）テストデバイス
（１－１）本発明テストデバイスは、実施例１の標識抗体S08224Rを用いたデバイスと同じものを用いた。
（１－２）比較例１テストデバイス
　サードパッドの材質をサンプルパッドと同じグラスファイバー製に変更した以外は本発明テストデバイスと同様に作製した。
（１－３）比較例２テストデバイス
　サードパッドをポリエーテルスルホン製のパッド（緻密層側の孔径１．２μｍ、Pall corporation製、Supor pad(Cat#: S80730)）に変更した以外は本発明テストデバイスと同様に作製した。
（１－４）比較例３テストデバイス
　実施例１の比較例と同じ。
２．試験方法
　実施例１と同じ。
３．試験結果
　結果を表２に示す。
　本結果によれば、サードパッドとしてポリスルホン製のものを採用することで他の材質に比べて感度が格段に向上することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本発明は、ポリスルホン製サードパッドを適用したイムノクロマトグラフィー用テストストリップを用いることにより、マイコプラズマ・ニューモニエを高感度に検出できる。
（ａ）プラスチック製粘着シート
（ｂ）不溶性メンブレン
（ｃ１）テストライン
（ｃ２）コントロールライン
（ｄ）コンジュゲートパッド
（ｅ）サンプルパッド
（ｆ）吸収パッド
（ｇ）サードパッド
 

Claims (10)

  1. マイコプラズマ・ニューモニエを検出するためのイムノクロマトグラフィー用テストストリップであって、少なくとも以下の構成（１）～（３）を有する前記テストストリップ。
    （１）サンプル供給部を有するサンプルパッド
    （２）サンプルパッドの下流であって、不溶性メンブレンの上流に配置されたポリスルホン製多孔質性のサードパッド
    （３）マイコプラズマ・ニューモニエに対する抗体が固定化された検出部を有する不溶性メンブレン
  2. さらに以下の構成（４）を有する請求項１に記載のテストストリップ。
    （４）マイコプラズマ・ニューモニエに対する抗体が標識体に固定化されたコンジュゲートが含浸されたコンジュゲートパッドであって、前記サンプルパッドの下流であって前記サードパッドの上流に配置されたコンジュゲートパッド
  3. ポリスルホン製多孔質性のサードパッドの平均孔径が１～２０μｍである、請求項１又は２に記載のイムノクロマトグラフィー用テストストリップ。
  4. マイコプラズマ・ニューモニエに対する抗体が、抗マイコプラズマ・ニューモニエのＰ１又はＰ３０タンパク質に対する抗体である請求項１～３のいずれかに記載のテストストリップ。
  5. 以下の構成（１）～（３）を有するイムノクロマトグラフィー用テストストリップを用いてサンプル中のマイコプラズマ・ニューモニエを検出するイムノクロマト検出方法。
    テストストリップ；
    （１）サンプル供給部を有するサンプルパッド
    （２）サンプルパッドの下流であって、不溶性メンブレンの上流に配置されたポリスルホン製多孔質性のサードパッド
    （３）マイコプラズマ・ニューモニエに対する抗体が固定化された検出部を有する不溶性メンブレン
  6. イムノクロマトグラフィー用テストストリップがさらに以下の構成（４）を有する請求項５に記載のイムノクロマト検出方法。
    （４）マイコプラズマ・ニューモニエに対する抗体が標識体に固定化されたコンジュゲートが含浸されたコンジュゲートパッドであって、前記サンプルパッドの下流であって前記サードパッドの上流に配置されたコンジュゲートパッド
  7. ポリスルホン製多孔質性のサードパッドの平均孔径が１～２０μｍである、請求項５又は６に記載のイムノクロマト検出方法。
  8. マイコプラズマ・ニューモニエに対する抗体が、抗マイコプラズマ・ニューモニエのＰ１又はＰ３０タンパク質に対する抗体である請求項５～７のいずれかに記載のイムノクロマト検出方法。
  9. 請求項１～４のいずれかに記載のイムノクロマトグラフィー用テストストリップを含むイムノクロマト検出キット。
  10. 以下の構成（１）～（３）を有するイムノクロマトグラフィー用テストストリップを用いてサンプル中のマイコプラズマ・ニューモニエを検出する方法における検出感度の向上方法。
    テストストリップ；
    （１）サンプル供給部を有するサンプルパッド
    （２）サンプルパッドの下流であって、不溶性メンブレンの上流に配置されたポリスルホン製多孔質性のサードパッド
    （３）マイコプラズマ・ニューモニエに対する抗体が固定化された検出部を有する不溶性メンブレン
     
     
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EP3835788A4 (en) * 2018-08-06 2022-03-16 Sekisui Medical Co., Ltd. METHOD FOR THE IMMUNOLOGICAL DETECTION OF MYCOPLASMA PNEUMONIAE

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