WO2020031931A1 - マイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的検出方法 - Google Patents

マイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的検出方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2020031931A1
WO2020031931A1 PCT/JP2019/030629 JP2019030629W WO2020031931A1 WO 2020031931 A1 WO2020031931 A1 WO 2020031931A1 JP 2019030629 W JP2019030629 W JP 2019030629W WO 2020031931 A1 WO2020031931 A1 WO 2020031931A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
mycoplasma pneumoniae
sample
protein
detection
conjugate
Prior art date
Application number
PCT/JP2019/030629
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
泰史 落合
知史 中村
Original Assignee
積水メディカル株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 積水メディカル株式会社 filed Critical 積水メディカル株式会社
Priority to US17/264,749 priority Critical patent/US20210302426A1/en
Priority to CN201980051975.8A priority patent/CN112513638A/zh
Priority to EP19846491.9A priority patent/EP3835788A4/en
Publication of WO2020031931A1 publication Critical patent/WO2020031931A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56933—Mycoplasma
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
    • G01N33/54388—Immunochromatographic test strips based on lateral flow
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/30—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Mycoplasmatales, e.g. Pleuropneumonia-like organisms [PPLO]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host

Definitions

  • the present invention relates to a method for immunologically detecting Mycoplasma pneumoniae.
  • the present invention relates to a method for immunologically detecting Mycoplasma pneumoniae using an antibody against the P30 protein of Mycoplasma pneumoniae.
  • Mycoplasma pneumonia is a respiratory tract infection caused by Mycoplasma pneumoniae, which causes a high incidence of pediatric disease in children under the age of 4 and 30% of patients under the age of 9 to 60% or more. Occupy. Although most patients with mycoplasma pneumonia require only bronchitis, some may become more severe and may be accompanied by pneumonia and other complications. Therefore, since rapid definitive diagnosis and selection of an appropriate antibacterial agent are important, immunochromatographic analysis, which is simple in operation and enables rapid detection, is suitable.
  • Patent Document 1 discloses an immunochromatographic analyzer using a monoclonal antibody specific to Mycoplasma pneumoniae P30 protein.
  • Patent Literature 2 discloses an immunochromatography analyzer using an antibody specific to the ribosomal protein Ribosomal Protein L7 / L12 of Mycoplasma pneumoniae. Meanwhile, in the case of detection with an antibody, there is a case where a cell or a protein to be detected is pre-treated with a surfactant or the like to detect an antibody detection site after exposing the antibody detection site.
  • Patent Document 1 discloses a kit that uses a sample diluent containing a nonionic surfactant having an HLB value of 13 to 17 together with the immunochromatography analyzer.
  • a nonionic surfactant having an HLB value of 13 to 17 there are an enormous number of types of nonionic surfactants having an HLB value of 13 to 17, but the examples actually describe polyoxyethylene octyl phenyl ether (triton X-100) and polyoxyethylene. Only a 1: 1 mixture of sorbitan monooleate (tween 20) and a 1: 1 mixture of polyoxyethylene octylphenyl ether (Nonidet p-40) and polyoxyethylene / polyoxypropylene-alkyl ether (Nonion MN-811) were used.
  • Patent Document 2 discloses a kit in which a sample diluent containing a polyoxyethylene alkyl ether or a nonionic surfactant having an HLB value of 12 to 15 is used together with the immunochromatography analyzer.
  • a sample diluent containing a polyoxyethylene alkyl ether or a nonionic surfactant having an HLB value of 12 to 15 is used together with the immunochromatography analyzer.
  • the polyoxyethylene cetyl ether (Brij58) and the synthetic alcohol EO adduct (Leochol TD90, 120) are actually described in the examples, and a huge number of other HLB values of 12 to 15 are shown.
  • No non-ionic surfactant is disclosed.
  • only antibodies against mycoplasma pneumoniae ribosomal proteins L7 / L12 have been confirmed, and no disclosure or suggestion has been made regarding the effects of these nonionic surfactants on antibodies against the P30 protein.
  • any of polyoxyethylene cetyl ether (Brij58) and synthetic alcohol EO adduct (Leocol TD90, 120) was used as a sample diluent.
  • Brij58 polyoxyethylene cetyl ether
  • Leocol TD90, 120 synthetic alcohol EO adduct
  • An object of the present invention is to provide a method for detecting Mycoplasma pneumoniae with high sensitivity in an immunological detection method for performing an immune reaction using an antibody against Mycoplasma pneumoniae P30 protein.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result of performing an immunoreaction using an antibody against Mycoplasma pneumoniae P30 protein in the presence of polyoxyethylene alkylamine among many surfactants. As a result, the present inventors have found that Mycoplasma pneumoniae can be detected with high sensitivity, and have completed the present invention. That is, the present invention has the following configuration. ⁇ 1> A method for immunologically detecting Mycoplasma pneumoniae using an antibody against P30 protein of Mycoplasma pneumoniae, The above-described detection method, wherein an immunological reaction is performed in the presence of polyoxyethylene alkylamine.
  • the detection method according to ⁇ 1>, wherein the method for immunologically detecting is a method for detecting using immunochromatography.
  • the method according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the method for detecting using immunochromatography comprises the following steps (A) to (C).
  • Step of mixing a sample containing Mycoplasma pneumoniae with a sample diluent containing polyoxyethylene alkylamine Step of supplying the mixture obtained in (A) above to a sample supply section of a test strip described below Test strip;
  • An antibody against a P30 protein of the first Mycoplasma pneumoniae labeled with a labeling substance has a membrane composed of a porous body having at least a sample supply unit, a developing unit, and a detecting unit.
  • a conjugate comprising a detection part on which an antibody against the P30 protein of the second Mycoplasma pneumoniae is immobilized, which is a part of the developing part and downstream of the conjugate holding part (C )
  • a Mycoplasma pneumoniae detection kit comprising the following configurations (1) and (2).
  • the detection kit according to ⁇ 4>, wherein the detection reagent using the antibody against P30 protein of Mycoplasma pneumoniae in (1) has the following configuration (1) ′.
  • a conjugate containing an antibody against the protein is retained so as to be eluted, and an antibody against the P30 protein of the second Mycoplasma pneumoniae is immobilized on a part of the developing portion and downstream of the conjugate retaining portion.
  • Test strip for immunochromatography having a detection part
  • a sample pretreatment method for immunologically detecting Mycoplasma pneumoniae comprising a step of contacting a polyoxyethylene alkylamine with a sample containing Mycoplasma pneumoniae.
  • Mycoplasma pneumoniae can be detected with high sensitivity by performing an immune reaction using an antibody against Mycoplasma pneumoniae P30 protein in the presence of polyoxyethylene alkylamine.
  • test strip of the present invention It is a schematic structure figure of a test strip of the present invention.
  • a sample refers to a sample collected from a patient and possibly containing Mycoplasma pneumoniae as a detection target.
  • the patient specimen may be used as a sample as it is, or may be appropriately diluted with a sample diluent to obtain a sample. Moreover, what was diluted appropriately and filtered may be used as a sample.
  • the sample diluent may be referred to as a sample diluent, a sample extract, a sample developing solution, a sample suspension, etc., but all of them are used synonymously.
  • the immunological detection method of the present invention is characterized in that an immunological reaction is performed in the presence of polyoxyethylene alkylamine.
  • Polyoxyethylene alkylamine is represented by the following general formula, and is weakly cationic. However, as oxyethylene increases, nonionicity increases and affinity for water increases (HLB increases). Having.
  • the polyoxyethylene alkylamine of the present invention preferably has an HLB of about 5.0 to 18.0, more preferably 6.0 to 16.0, and more preferably 7.0 to 12 in consideration of solubility in water. 0 is even more preferred, and 9.0 to 11.0 is most preferred.
  • Amyte (registered trademark, the same applies hereinafter) 102 (HLB 6.3), Amyte 105 (HLB 9.8), Amyte 105A (HLB 10.8), Amyte 302 (HLB 5.1), and Amyte 320 (HLB 15. 4)
  • Amyte 102 (HLB 6.3), Amyte 105 (HLB 9.8), Amyte 105A (HLB 10.8), Amyte 302 (HLB 5.1), and Amyte 320 (HLB 15. 4)
  • Liponol (registered trademark) series (Lion), Brownon series (Aoki Yushi Kogyo), and Ionette (registered trademark) EP-300S (Sanyo Chemical) can be
  • concentration of polyoxyethylene alkylamine in the immune reaction system is preferably from 0.01% to 10.0%, more preferably from 0.1% to 5%, even more preferably from 0.2% to 3%.
  • the polyoxyethylene alkylamine may be directly added to the immune reaction system.
  • the polyoxyethylene alkylamine is contained in a sample diluent as described later, and the Mycoplasma pneumoniae P30 protein is added. Contact with an antibody to cause the antibody to be present in the immune reaction system.
  • the sample diluent of the present invention preferably contains a polyoxyethylene alkylamine and further contains a buffer.
  • the concentration range of the polyoxyethylene alkylamine in the sample diluent of the present invention is preferably 0.01% to 10.0%, more preferably 0.1% to 5%, and more preferably 0.2% to 3%. More preferably, 0.3 to 1.5% is most preferable.
  • Examples of the buffer contained in the sample diluent of the present invention include commonly used buffers such as phosphate buffer, Tris buffer, and Good buffer.
  • the sample diluent of the present invention may be any one containing the above compound and a buffer, and may be a buffer containing the above compound, furthermore, salts such as sodium chloride, stabilizers and preservatives such as sucrose, procrine (registered trademark) ) And the like.
  • Salts include those added for the purpose of adjusting the ionic strength, such as sodium chloride, and those added for the purpose of adjusting the pH of the buffer, such as sodium hydroxide.
  • the pH of the sample diluent of the present invention is preferably in the range of 6.0 to 10.0, more preferably 7.0 to 9.0, and even more preferably 7.5 to 8.5. Since the sample diluent of the present invention is a liquid for diluting a sample, a sample (analyte) containing Mycoplasma pneumoniae is added to the sample diluent to dissolve, extract, or disperse and dilute the sample. Is responsible for. Therefore, typically, the sample and the sample diluent are mixed at the time of supplying the sample to the sample pad of the test strip.
  • a sample diluted directly with a diluent other than the sample diluent of the present invention or another diluent other than the sample diluent of the present invention is supplied to the sample pad, and the sample diluent of the present invention is supplied to the sample pad simultaneously or with a delay.
  • the case is also included in the detection method of the present invention.
  • any detection method utilizing an immune reaction may be used.
  • a latex immunoagglutination method (hereinafter referred to as an LTIA method) which is a particle agglutination immunoassay, a typical sandwich immunization method
  • An ELISA method which is both a measurement method and a labeled immunoassay method, a detection method using immunochromatography, and the like can be mentioned.
  • a detection method using immunochromatography is particularly preferable. Examples of a detection method using immunochromatography include a flow-throw method and a lateral flow method, and a detection method using lateral flow immunochromatography is simple, rapid, and desirable.
  • an immunoagglutination reaction can be detected by diluting a sample with the sample diluent of the present invention and mixing with a latex reagent.
  • the latex reagent comprises a first reagent containing a buffer and a second reagent containing a latex reagent
  • the sample diluent of the present invention can be used as the first reagent.
  • the present invention also provides a sample pretreatment method for immunologically detecting Mycoplasma pneumoniae, comprising a step of contacting a sample containing Mycoplasma pneumoniae with a polyoxyethylene alkylamine.
  • the pretreatment can be performed by including a polyoxyethylene alkylamine in a sample diluent and mixing the sample with the sample diluent.
  • the substance to be detected in the present invention is Mycoplasma pneumoniae.
  • the present invention directly detects or quantifies the presence of Mycoplasma pneumoniae by detecting Mycoplasma pneumoniae P30 protein using an antibody against Mycoplasma pneumoniae P30 protein.
  • the test strip for immunochromatography of the present invention is a test strip for detecting a complex of a substance to be detected and a conjugate in a sample by developing the sample in an insoluble membrane.
  • the test strip has a porous membrane having (1) a sample supply unit (2) a developing unit (3) and a detecting unit, and a part of the developing unit is labeled with a labeling substance.
  • a conjugate containing the first antibody is held so as to be able to be eluted, and further, a detection part is provided as a part of the developing part and the second antibody is immobilized downstream of the conjugate holding part.
  • the polyoxyethylene alkylamine of the present invention may be included in the sample diluent, or may be partially impregnated in a pad constituting a test strip. For example, sample pads, third pads, conjugate pads, insoluble membranes, and the like. In some embodiments, the polyoxyethylene alkylamine of the present invention is impregnated into a filter chip.
  • the conjugate is one in which an antibody that immunologically reacts with the substance to be detected is immobilized on a label, and the conjugate is present as a conjugate pad, or as a sample pad, a third pad, It may be in a state of being impregnated in another pad other than the insoluble membrane (type A), may be present as a conjugate part in a part of the sample pad (type B), and may further be a test strip. Alternatively, it may be present as a separate conjugate reagent to be mixed with the analyte (Type C).
  • FIG. 1 shows a test strip having such an arrangement example.
  • the composite passes through a porous third pad placed in contact with the lower surface of the conjugate pad and is developed into an insoluble membrane. Since the antibody that immunologically reacts with the substance to be detected is immobilized on a part of the insoluble membrane, the complex is bound and immobilized by the immune reaction. The immobilized complex is detected by means for detecting absorbance, reflected light, fluorescence, magnetism, etc. derived from the conjugate.
  • the sample supply section is a section for supplying a sample containing the substance to be detected
  • the conjugate section is a section containing the conjugate
  • the sample supply section is on the upstream side of the conjugate section.
  • a test strip in which the existence mode of the conjugate is type C.
  • the difference from the type A test strip is that there is no conjugate pad and the conjugate exists as a separate conjugate reagent.
  • a filter chip in which a conjugate is incorporated in a filter may be mentioned. By passing the sample diluent and the substance to be detected using such a filter chip, the conjugate and the substance to be detected are bound to form a complex (aggregate). By supplying this to the same test strip as in type A except that it does not have a conjugate pad, the substance to be detected can be detected.
  • the conjugate pad and the filter chip may further contain the polyoxyethylene alkylamine of the present invention.
  • sample pad is a site for receiving a sample, and includes any substance and form that absorbs a sample of a liquid when molded into the pad and allows the liquid and the target to pass through.
  • materials suitable for the sample pad include, but are not limited to, glass fibers (glass fibers), acrylic fibers, hydrophilic polyethylene materials, dried paper, paper pulp, textiles, and the like. Preferably, a glass fiber pad is used.
  • the sample pad can also have the function of a conjugate pad described later.
  • the sample pad may contain a blocking reagent which is usually used for the purpose of preventing / suppressing non-specific reaction (adsorption) in the antibody-immobilized membrane.
  • the sample pad may contain the polyoxyethylene alkylamine of the present invention.
  • the third pad is desirably disposed as necessary depending on the properties of the sample and the like, and may be any as long as it can transmit the complex of the target substance and the conjugate in the sample.
  • the average pore size of the third pad of the present invention is, for example, 1 to 100 ⁇ m, preferably 5 to 80 ⁇ m, more preferably 10 to 60 ⁇ m, further preferably 15 to 55 ⁇ m, particularly preferably 20 to 50 ⁇ m, and particularly preferably 25 to 45 ⁇ m. Most preferred.
  • the third pad may further contain the polyoxyethylene alkylamine of the present invention.
  • the insoluble membrane used in the present invention has at least one detection unit on which an antibody that immunologically reacts with the substance to be detected is immobilized.
  • the immobilization of the antibody immunologically reactive with the substance to be detected to the insoluble membrane carrier can be carried out by a conventionally known method.
  • a lateral flow type immunochromatographic reagent an apparatus having a mechanism capable of preparing a liquid containing the above antibody at a predetermined concentration and moving the liquid in a horizontal direction while discharging the liquid from a nozzle at a constant speed, etc.
  • the solution can be immobilized by applying the solution in a line to an insoluble membrane carrier and drying the solution.
  • the antibody concentration of the above solution is preferably 0.1 to 5 mg / mL, more preferably 0.5 to 2 mg / mL.
  • the amount of the antibody immobilized on the insoluble membrane carrier can be optimized by adjusting the discharge speed from the nozzle of the above apparatus, and is preferably 0.5 to 2 ⁇ L / cm. .
  • the measuring method using the lateral flow type immunochromatographic reagent is a measuring method of a method in which a sample is developed so as to move in a direction parallel to an insoluble membrane carrier due to a capillary phenomenon. Further, a solution containing the above antibody at a predetermined concentration can be prepared by adding the antibody to a buffer solution.
  • the buffer examples include commonly used buffers such as phosphate buffer, Tris buffer and Good buffer.
  • the pH of the buffer is preferably in the range of 6.0 to 9.5, more preferably 6.5 to 8.5, and even more preferably 7.0 to 8.0.
  • the buffer may further contain salts such as sodium chloride, stabilizers and preservatives such as sucrose, preservatives such as Proculin (registered trademark), and the like. Salts include those added for the purpose of adjusting the ionic strength, such as sodium chloride, and those added for the purpose of adjusting the pH of the buffer, such as sodium hydroxide.
  • control capture reagent conventionally used in immunochromatographic reagents may be immobilized on the insoluble membrane.
  • the control capture reagent is a reagent for ensuring the reliability of the assay, and captures the control reagent contained in the conjugate pad.
  • KLH hemocyanin derived from keyhole mussel
  • an anti-KLH antibody or the like corresponds to the control capture reagent.
  • the position where the control capture reagent is immobilized can be appropriately selected so as to be compatible with the design of the assay system.
  • the insoluble membrane may further contain the polyoxyethylene alkylamine of the present invention.
  • a known membrane conventionally used as an insoluble membrane carrier for an immunochromatographic reagent can be used.
  • membranes composed of fibers made of polyethylene, polyethylene terephthalate, nylons, glass, polysaccharides such as cellulose and cellulose derivatives, ceramics and the like can be mentioned.
  • Specific examples include glass fiber filter paper and cellulose filter paper commercially available from Sartorius, Millipore, Toyo Roshi, Whatman, and the like. Among them, Sartorius and UniSart @ CN140 are preferred.
  • the pore size and structure of the insoluble membrane carrier it is possible to control the speed at which the complex of the conjugate and the substance to be detected in the sample flows through the insoluble membrane carrier.
  • the immunochromatographic test strip is preferably disposed on a solid support such as a plastic adhesive sheet.
  • the solid support comprises a material that does not impede the capillary flow of the sample and the conjugate.
  • a test strip for immunochromatography may be immobilized on a solid support with an adhesive or the like.
  • the adhesive and the like are made of a substance that does not hinder the capillary flow of the sample and the conjugate.
  • the test strip for immunochromatography is stored in an appropriate container (housing) in consideration of the size of the test strip for immunochromatography, the method of adding and the position of the sample, the position of forming the detection portion of the insoluble membrane, the method of detecting the signal, and the like.
  • -A device that can be mounted and used, and thus stored and mounted, is called a "device".
  • the antibody against the P30 protein of Mycoplasma pneumoniae of the present invention may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it is an antibody capable of specifically detecting the protein, and among them, a monoclonal antibody is preferable.
  • Antibodies against the P30 protein of Mycoplasma pneumoniae include, for example, a recombinant P30 protein extracted and purified by expressing the gene of the P30 protein extracted from mycoplasma pneumoniae cells or the gene of the cloned P30 protein by genetic engineering in a host such as Escherichia coli, Alternatively, a polypeptide constituting a part of the P30 protein can be obtained as an immunizing antigen according to a conventional method.
  • a polyclonal antibody it can be obtained from an antiserum obtained by immunizing an animal such as a mouse with the antigen for immunization, and a monoclonal antibody can be obtained by immunizing an animal such as a mouse and then spleen cells and myeloma cells of the immunized animal.
  • the cells can be obtained by selecting a fused cell obtained by cell fusion of the above with a HAT-containing medium and then growing the same, and screening for an anti-P30 protein antibody-producing strain using the P30 protein.
  • the antibody against the Mycoplasma pneumoniae P30 protein of the present invention also includes antibody fragments and modified antibodies against the Mycoplasma pneumoniae P30 protein that are substantially equivalent to the antibody.
  • Antibody fragments include Fab fragments, F (ab) 2 fragments, Fab fragments, scFv fragments, and the like.
  • the labeled antibody that is the first antibody against the Mycoplasma pneumoniae P30 protein of the present invention and the immobilized antibody that is the second antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, respectively, but at least one of them is a monoclonal antibody. More preferably, both are monoclonal antibodies.
  • the first antibody and the second antibody are preferably antibodies that recognize different epitopes present on the P30 protein.
  • P30 protein is one of the adhesion proteins having a molecular weight of 30 KDa.
  • Mycoplasma pneumoniae is a transmembrane protein localized on the cell surface at the tip of the adherent organ and having an N-terminal buried in the cell membrane and a C-terminal existing outside the cell membrane.
  • On the C-terminal side there is a repeating structure of an amino acid sequence containing a large amount of proline.
  • a region consisting of an amino acid sequence containing proline is known to have a three-dimensional higher-order structure, and is known to be an epitope to which an antibody reacts.
  • the antibody against the P30 protein of the present invention may be any antibody capable of specifically recognizing the P30 protein.
  • the monoclonal antibody recognizes a portion of the extracellular region of the P30 protein consisting of a proline-rich amino acid sequence repeating structure.
  • Monoclonal antibodies are preferred.
  • a commercially available anti-P30 monoclonal antibody may be used as the antibody against the P30 protein of Mycoplasma pneumoniae of the present invention.
  • Examples of commercially available anti-P30 monoclonal antibodies include Meridian's C01939M, C01940M, C01941M, C01942M, C01943M, and the like.
  • anti-P30 monoclonal antibody (Preparation example of anti-P30 monoclonal antibody) The anti-P30 monoclonal antibody used in the following tests was obtained by a method commonly used by a person skilled in the art to produce a monoclonal antibody (the method of Kohler and Milstein (Nature, 256, 495 (1975)).
  • Marker As the label used in the present invention, a known label conventionally used for a test strip for immunochromatography can be used.
  • colloidal metal particles such as colloidal gold particles and colloidal platinum particles, color latex particles, magnetic particles, fluorescent particles, and the like are preferable, and colloidal gold particles and color latex particles are particularly preferable.
  • the conjugate used in the present invention is obtained by immobilizing an antibody that immunologically reacts with Mycoplasma pneumoniae, which is a substance to be detected, on the above-described label.
  • the conjugate is preferably one in which anti-Mycoplasma pneumoniae P30 protein monoclonal antibody and polyclonal antibody are immobilized on colloidal gold particles.
  • Examples of a method of immobilizing an antibody that immunologically reacts with a substance to be detected to a label include physical adsorption and chemical bonding, and the method is generally immobilization by physical adsorption.
  • the detection kit for Mycoplasma pneumoniae of the present invention may be any kit that contains a detection reagent using an antibody against P30 protein of Mycoplasma pneumoniae and a sample diluent containing polyoxyethylene alkylamine.
  • the Mycoplasma pneumoniae detection kit using the immunochromatography of the present invention may be a kit containing an immunochromatography test strip using an antibody against P30 protein of Mycoplasma pneumoniae and a sample diluent containing polyoxyethylene alkylamine.
  • the detection kit may include other reagents necessary for detection, a test tube, a sample collection device, an instruction manual, a housing for storing a test strip, and the like.
  • upstream and downstream are used to mean upstream and downstream in the direction in which the sample flows. That is, in the test strip of the present invention, when the sample pad, the conjugate pad, the third pad, and the insoluble membrane are partially laminated from above, the sample pad is the most upstream and the insoluble membrane is the downstream. Become. Further, an end pad may be laminated on the insoluble membrane so that the downstream ends thereof overlap with each other. In this case, the end pad is the most downstream.
  • Test Material A test device including a test strip for immunochromatography using a monoclonal antibody against Mycoplasma pneumoniae P30 protein was produced.
  • FIG. 1 shows a schematic configuration diagram of a test strip for immunochromatography of the present invention. Paste the insoluble membrane (b) on the plastic adhesive sheet (a), then arrange the third pad (g), the conjugate pad (d), and the sample pad (e) in this order, and attach the absorbent pad on the opposite end. (f) was placed and mounted.
  • the conjugate pad is impregnated with a conjugate obtained by sensitizing gold colloid with an anti-P30 protein monoclonal antibody (labeled antibody S08214R shown in the table), and the insoluble membrane contains an anti-P30 protein monoclonal antibody (immobilized antibody S08210R, Application concentration 0.75 mg / mL, application amount 1.0 ⁇ L / cm) and control reagent (goat anti-mouse IgG, application concentration 0.75 mg / mL, application amount 1.0 ⁇ L / cm) perpendicular to the flow direction It is fixed on the line.
  • Each pad is laminated and arranged so that upper and lower pads are in contact with a part thereof.
  • test line (c1) The line consisting of the anti-P30 protein monoclonal antibody
  • control line (c2) the line consisting of the control reagent
  • sample diluent was prepared by adding 1.0% of polyoxyethylene alkylamine and 50 mM of NaCl to a 20 mM phosphate buffer (pH 7.5). 0.25% of BSA was added as an additive.
  • Test results The results are shown in Table 1.
  • the color intensity of the test line is described in the column “myco”, and the color intensity of the control line is described in the column “cont”.
  • the results below the limiting dilution ratio (the dilution ratio within the detectable range) are shaded.
  • the sensitivity was higher when the sample diluent of the present invention was used than when Emulgen 108 (registered trademark, the same applies hereinafter) (0.5%), which had relatively high sensitivity, was used. Whether it was high was used as an evaluation criterion of the present invention.
  • Example 2 Study on addition of surfactant to sample diluent (2) A sensitivity evaluation test was performed in the same manner as in Example 1, except that the labeled antibody was changed to S08222R. Table 2 shows the results. According to this result, the detection limit of Emulgen 108 was 80 times, and the amyte 105 of the present invention could be detected even at 1280 times.
  • Example 3 Study on addition of surfactant to sample diluent (3) A sensitivity evaluation test was conducted in the same manner as in Example 1, except that the labeled antibody was changed to S08224R and the addition concentration of the two polyoxyethylene alkylamines was changed to 0.1%. Table 3 shows the results. According to this result, when the detection limit of Emulgen 108 was 80 times, the amate 105 and amate 320 of the present invention could be detected even at 320 times.
  • Example 4 Study on addition of surfactant to sample diluent (4) A sensitivity evaluation test was performed in the same manner as in Example 1, except that the labeled antibody was changed to S08228R. Table 4 shows the results. According to the results, the detection limit of Emulgen 108 was 160 times the dilution ratio, and the amyte 105 of the present invention could be detected even at 640 times.
  • Mycoplasma pneumoniae can be detected with high sensitivity by performing an immune reaction using an antibody against Mycoplasma pneumoniae P30 protein in the presence of polyoxyethylene alkylamine.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本発明は、マイコプラズマ・ニューモニエＰ３０タンパク質に対する抗体を用い て免疫反応を行う免疫学的検出方法において、マイコプラズマ・ニューモニエを高感度に検出する方法を提供することを課題とする。　マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を用いてマイコプラズマ・ニューモニエを免疫学的に検出する方法であって、ポリオキシエチレンアルキルアミンの存在下、免疫反応を行う前記検出方法を提供する。　また、免疫学的に検出する方法がイムノクロマトグラフィーを利用して検出する方法である検出方法を提供する。

Description

マイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的検出方法
　本発明は、マイコプラズマ・ニューモニエを免疫学的に検出する方法に関する。特に、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を用いてマイコプラズマ・ニューモニエを免疫学的に検出する方法に関する。
　マイコプラズマ肺炎は、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を原因菌とする呼吸器系の感染症であり、小児の罹患率が高く、４歳未満が患者の３０％を、９歳未満が６０％以上を占める。
  マイコプラズマ肺炎の多くの患者は気管支炎程度ですむが、一部は重症化して肺炎や他の合併症も併発するおそれがある。したがって、迅速な確定診断と適切な抗菌薬の選択が重要であることから、操作が簡便かつ迅速な検出が可能であるイムノクロマト分析が適している。
  例えば、特許文献１には、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を用いたイムノクロマト分析装置が開示されている。
  また、特許文献２には、マイコプラズマ・ニューモニエのリボソームタンパク質Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＰｒｏｔｅｉｎＬ７／Ｌ１２に特異的な抗体を用いたイムノクロマト分析装置が開示されている。
　ところで、抗体により検出をする場合、検出対象となる菌体やタンパク質を界面活性剤などで前処理をして抗体検出部位を露出させた上で検出する場合がある。
　特許文献１では、ＨＬＢ値が１３～１７の非イオン界面活性剤を含有する検体希釈液を前記イムノクロマト分析装置と共に使用するキットが開示されている。しかし、ＨＬＢ値が１３～１７の非イオン界面活性剤の種類は膨大に存在するところ、実際に実施例に記載されているのは、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（ｔｒｉｔｏｎＸ－１００）とポリオキシエチレンソルビタンモノオレート（ｔｗｅｅｎ２０）の１：１混合物と、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（ノニデットｐ－４０）とポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレン－アルキルエーテル（ノニオンＭＮ－８１１）の１：１混合物のみのわずか２例であり、その他の膨大な数のＨＬＢ値が１３～１７の非イオン界面活性剤については使用できるかどうかは開示されていない。
　また、本発明者らの試験によれば、これらのポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（ｔｒｉｔｏｎＸ－１００）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート（ｔｗｅｅｎ２０）、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（ノニデットｐ－４０）のいずれもマイコプラズマ・ニューモニエＰ３０モノクローナル抗体を用いた検出において十分な感度が得られなかった。
　特許文献２では、ポリオキシエチレンアルキルエーテルやＨＬＢ値が１２～１５の非イオン界面活性剤を含有する検体希釈液を前記イムノクロマト分析装置と共に使用するキットが開示されている。しかし、実際に実施例に記載されているのは、ポリオキシエチレンセチルエーテル（Ｂｒｉｊ５８）、合成アルコールＥＯ付加物（レオコールＴＤ９０、１２０）のみであり、その他の膨大な数のＨＬＢ値が１２～１５の非イオン界面活性剤については開示されていない。また、抗体は、マイコプラズマ・ニューモニエのリボゾームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体のみについてしか確認されておらず、Ｐ３０タンパクに対する抗体についてのこれらの非イオン界面活性剤の効果については開示も示唆もされていない。
　また、本発明者らの試験によれば、マイコプラズマ・ニューモニエＰ３０モノクローナル抗体を用いた検出において、ポリオキシエチレンセチルエーテル（Ｂｒｉｊ５８）、合成アルコールＥＯ付加物（レオコールＴＤ９０、１２０）のいずれを検体希釈液に添加した場合も十分な感度が得られなかった。
　このように、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を用いてマイコプラズマ・ニューモニエを免疫学的に検出する方法において、高感度で検出する方法についての技術は未だ確立されていない。
特開2017-9571号公報 特開2014-167439号公報
　本発明は、マイコプラズマ・ニューモニエＰ３０タンパク質に対する抗体を用いて免疫反応を行う免疫学的検出方法において、マイコプラズマ・ニューモニエを高感度に検出する方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、多数の界面活性剤のうちでもポリオキシエチレンアルキルアミン存在下で、マイコプラズマ・ニューモニエＰ３０タンパク質に対する抗体を用いて免疫反応を行うことにより、マイコプラズマ・ニューモニエを高感度に検出できることを見出し本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の構成を有する。
＜１＞
マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を用いてマイコプラズマ・ニューモニエを免疫学的に検出する方法であって、
ポリオキシエチレンアルキルアミンの存在下、免疫反応を行う前記検出方法。
＜２＞
免疫学的に検出する方法がイムノクロマトグラフィーを利用して検出する方法である＜１＞に記載の検出方法。
＜３＞
イムノクロマトグラフィーを利用して検出する方法が以下の（Ａ）～（Ｃ）の工程を含む＜１＞又は＜２＞に記載の方法。
（Ａ）マイコプラズマ・ニューモニエを含むサンプルと、ポリオキシエチレンアルキルアミンを含むサンプル希釈液を混合する工程
（Ｂ）下記テストストリップのサンプル供給部に、前記（Ａ）で得られた混合物を供給する工程
テストストリップ；
少なくともサンプル供給部、展開部および検出部とを備えた多孔質体からなるメンブレンを有し、展開部の一部には、標識物質で標識された第一のマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を含むコンジュゲートが溶出可能に保持され、さらに展開部の一部であってコンジュゲート保持部分より下流側に第二のマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体が固定化されている検出部を有する
（Ｃ）サンプル中のマイコプラズマ・ニューモニエとコンジュゲートの複合体を検出部において検出する工程
＜４＞
以下の構成（１）および（２）を含む、マイコプラズマ・ニューモニエ検出キット。
（１）マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を用いた検出試薬
（２）ポリオキシエチレンアルキルアミンを含むサンプル希釈液
＜５＞
前記（１）のマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を用いた検出試薬が以下の構成（１）’である＜４＞に記載の検出キット。
（１）’少なくともサンプル供給部、展開部および検出部とを備えた多孔質体からなるメンブレンを有し、展開部の一部には、標識物質で標識された第一のマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を含むコンジュゲートが溶出可能に保持され、さらに展開部の一部であって前記コンジュゲート保持部分より下流側に、第二のマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体が固定化されている検出部を有するイムノクロマトグラフィー用テストストリップ
＜６＞
マイコプラズマ・ニューモニエＰ３０タンパク質に対する抗体を用いた免疫学的検出方法におけるサンプル希釈液であって、ポリオキシエチレン・アルキルアミンを含む前記希釈液。
＜７＞
ポリオキシエチレンアルキルアミンと、マイコプラズマ・ニューモニエを含むサンプルとを接触させる工程を含む、マイコプラズマ・ニューモニエを免疫学的に検出するためのサンプル前処理方法。
　本発明は、ポリオキシエチレンアルキルアミン存在下、マイコプラズマ・ニューモニエＰ３０タンパク質に対する抗体を用いて免疫反応を行うことにより、マイコプラズマ・ニューモニエを高感度に検出できる。
本発明のテストストリップの模式構成図である。
（サンプル）
　本発明において、サンプルとは患者から採取した検体であって被検出対象であるマイコプラズマ・ニューモニエを含む可能性がある検体をいう。
　患者検体は、そのままサンプルとして用いてもよく、適宜サンプル希釈液によって希釈してサンプルとしてもよい。また、適宜希釈し濾過したものをサンプルとして用いてもよい。なお、サンプル希釈液は、他では検体希釈液、サンプル抽出液、サンプル展開液、サンプル浮遊液などと呼ばれることもあるが、いずれも同義で用いられる。
（ポリオキシエチレンアルキルアミン）
　本発明の免疫学的検出方法は、ポリオキシエチレンアルキルアミンの存在下で免疫反応を行うことを特徴とする。ポリオキシエチレンアルキルアミンは、以下の一般式で示され、弱陽イオン性だが、オキシエチレンの増加に伴い、非イオン性が強くなり、水に対する親和性が大きくなる（ＨＬＢが大きくなる)という性質を有する。
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
　本発明のポリオキシエチレンアルキルアミンとしては、水に対する溶けやすさを考慮し、ＨＬＢが５．０～１８．０程度が好ましく、６．０～１６．０がより好ましく、７．０～１２．０がよりいっそう好ましく、９．０～１１．０がもっとも好ましい。具体的には、アミート（登録商標、以下同じ。）１０２（ＨＬＢ６．３）、アミート１０５（ＨＬＢ９．８）、アミート１０５Ａ（ＨＬＢ１０．８）、アミート３０２（ＨＬＢ５．１）、アミート３２０（ＨＬＢ１５．４）（花王）のほか、リポノール（登録商標）シリーズ（ライオン）やブラウノンシリーズ（青木油脂工業）、イオネット（登録商標）ＥＰ－３００Ｓ（三洋化成）という商品名で販売されているものが挙げられる。
　免疫反応系におけるポリオキシエチレンアルキルアミンの濃度は、０．０１％～１０．０％が好ましく、０．１％～５％がさらに好ましく、０．２％～３％がよりいっそう好ましく、０．３～１．５％がもっとも好ましい。
　ポリオキシエチレンアルキルアミンを反応系に存在させる態様としては、免疫反応系に直接添加してもよいが、典型的には、後述するようにサンプル希釈液に含有させておき、マイコプラズマ・ニューモニエＰ３０タンパク質に対する抗体と接触させることにより免疫反応系に存在させる態様が挙げられる。
(サンプル希釈液）
　本発明のサンプル希釈液は、ポリオキシエチレンアルキルアミン含み、さらに緩衝液を含むものが好ましい。
　本発明のサンプル希釈液中のポリオキシエチレンアルキルアミンの濃度範囲は、０．０１％～１０．０％が好ましく、０．１％～５％がさらに好ましく、０．２％～３％がよりいっそう好ましく、０．３～１．５％がもっとも好ましい。
　本発明のサンプル希釈液に含まれる緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液など通常使用される緩衝液をあげることができる。本発明のサンプル希釈液は、上記化合物と緩衝液を含むものであればよく、上記化合物を含む緩衝液でもよく、さらに塩化ナトリウムなどの塩類、スクロースなどの安定剤や保存剤、プロクリン(登録商標)などの防腐剤等を含んでもよい。塩類は塩化ナトリウムなどのようにイオン強度の調整のために含ませるもののほか、水酸化ナトリウムなど緩衝液のｐＨを調整する目的で添加するものも含まれる。本発明のサンプル希釈液のｐＨは、６．０～１０．０の範囲が好ましく、７．０～９．０がより好ましく、７．５～８．５がよりいっそう好ましい。
　本発明のサンプル希釈液は、サンプルを希釈するための液であるから、マイコプラズマ・ニューモニエを含むサンプル（検体）をサンプル希釈液に添加して、サンプルを溶解、抽出、あるいは分散して希釈する役割を担っている。したがって、典型的には、テストストリップのサンプルパッドにサンプルを供給する時点でサンプルとサンプル希釈液は混合されている。しかし、このほかに、サンプルを直接あるいは他の本発明のサンプル希釈液以外の希釈液で希釈したものをサンプルパッドに供給し、同時にあるいは遅れて本発明のサンプル希釈液を前記サンプルパッドに供給する場合も本発明の検出方法に含まれる。
　本発明の免疫学的検出方法としては、免疫反応を利用する検出方法であればいずれでもよく、例えば、粒子凝集イムノアッセイ法であるラテックス免疫凝集法（以下、ＬＴＩＡ法という）、代表的なサンドイッチ免疫測定法であり標識イムノアッセイ法でもあるＥＬＩＳＡ法、イムノクロマトグラフィーを利用した検出方法等が挙げられるが、このうちでも特に、イムノクロマトグラフィーを利用した検出方法が望ましい。イムノクロマトグラフィーを利用した検出方法としては、フルースロー式とラテラルフロー式が挙げられるが、ラテラルフロー式のイムノクロマトグラフィーを利用した検出方法が簡便かつ迅速であり望ましい。
　前記ＬＴＩＡ法において本発明のサンプル希釈液を使う場合は、サンプルを本発明のサンプル希釈液で希釈した後、ラテックス試薬と混合することで免疫凝集反応を検出することができる。ラテックス試薬が、緩衝液を含む第一試薬とラテックス試薬を含む第二試薬からなる場合は、第一試薬として本発明の検体希釈液を使用することができる。
　また、本発明は、ポリオキシエチレンアルキルアミンと、マイコプラズマ・ニューモニエを含むサンプルとを接触させる工程からなるマイコプラズマ・ニューモニエを免疫学的に検出するためのサンプル前処理方法も提供する。
　典型的には、ポリオキシエチレン・アルキルアミンを検体希釈液に含有させ、当該検体希釈液とサンプルを混合することにより前処理を行うことができる。
（被検出物質）
　本発明の被検出物質はマイコプラズマ・ニューモニエである。本発明は、直接的には、マイコプラズマ・ニューモニエＰ３０タンパク質に対する抗体を用いて、マイコプラズマ・ニューモニエＰ３０タンパク質を検出することにより、マイコプラズマ・ニューモニエの存在を検出し、または定量する。
（イムノクロマトグラフィー用を利用した検出）
　本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップは、サンプルを不溶性メンブレン中を展開させることにより、サンプル中の被検出物質とコンジュゲートとの複合体を検出するテストストリップである。当該テストストリップは、（１）サンプル供給部（２）展開部（３）検出部、とを備えた多孔質体からなるメンブレンを有し、展開部の一部には、標識物質で標識された第一の抗体を含むコンジュゲートが溶出可能に保持され、さらに展開部の一部であってコンジュゲート保持部分より下流側に第二の抗体が固定化されている検出部を有する。
　本発明のポリオキシエチレンアルキルアミンは、前記サンプル希釈液に含まれている態様のほか、テストストリップを構成するパッドの一部に含浸させる態様もあり得る。例えば、サンプルパッド、サードパッド、コンジュゲートパッド、不溶性メンブレンなどである。また、本発明のポリオキシエチレンアルキルアミンは、フィルターチップに含浸される態様もあり得る。
　コンジュゲートは、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体が標識体に固定化されたものであり、コンジュゲートの存在様式としては、コンジュゲートパッドとして、あるいは、サンプルパッド、サードパッド、不溶性メンブレン以外の別のパッドに含浸された状態で存在してもよいし（タイプＡ）、サンプルパッドの一部にコンジュゲート部として存在してもよいし（タイプＢ）、さらには、テストストリップとは別に、検体と混合されるように個別のコンジュゲート試薬として存在してもよい（タイプＣ）。
　以下、コンジュゲートの存在様式が上記タイプＡのテストストリップについて説明する。
　サンプルの流れ方向の上流より下流に向かって、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、サードパッド、不溶性メンブレンの順に配置され、それぞれ上下の層と少なくとも一部が重複するように配置される。このような配置例のテストストリップを図１に示す。
　このようなテストストリップのサンプルパッドに、被検出物質を含有するサンプルが供給されると、被検出物質はサンプルパッドを通過して下流側のコンジュゲートパッドへと流れる。コンジュゲートパッドでは、被検出物質とコンジュゲートが接触して複合体（凝集体）を形成しながら当該パッドを通過する。その後、複合体はコンジュゲートパッドの下面に接触して配置された多孔質サードパッドを通過し、不溶性メンブレンへと展開される。
　不溶性メンブレンには、その一部に被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体が固定化されているため、該複合体がここで免疫反応により結合して固定化されることになる。固定化された複合体は、コンジュゲートに由来する吸光度、反射光、蛍光、磁気等を検出する手段により検出される。
　次に、コンジュゲートの存在様式がタイプＢのテストストリップについて説明する。
　上記タイプＡのテストストリップとの違いは、サンプルパッドとコンジュゲートパッドが一体になった点であり、つまり、サンプルパッドの一部にサンプル供給部およびコンジュゲート部が構成されている点である。
　上記サンプル供給部は、被検出物質を含有するサンプルを供給する部位であり、上記コンジュゲート部は、コンジュゲートを含有する部位であり、サンプル供給部がコンジュゲート部の上流側となる。
　次に、コンジュゲートの存在様式がタイプＣのテストストリップについて説明する。
　上記タイプＡのテストストリップとの違いは、コンジュゲートパッドが存在せず、コンジュゲートは個別のコンジュゲート試薬として存在する点である。例えば、フィルター中にコンジュゲートが内蔵されたフィルターチップが挙げられる。このようなフィルターチップを使って、サンプル希釈液及び被検出物質を通過させることでコンジュゲートと被検出物質が結合し、複合体（凝集体）を形成する。これをコンジュゲートパッドを有さないこと以外はタイプＡと同一の前記テストストリップに供給することで、被検出物質を検出することができる。
　コンジュゲートパッドやフィルターチップには、このほかに、本発明のポリオキシエチレンアルキルアミンを含ませることもできる。
（サンプルパッド）
　本発明に用いられるサンプルパッドとは、サンプルを受け入れる部位であり、パッドに成型された状態で液体のサンプルを吸収し、液体と検出対象物とが通り抜けることができるどんな物質及び形態をも含む。サンプルパッドに適した材料の具体例として、ガラス繊維（グラスファイバー）、アクリル繊維、親水性ポリエチレン材、乾燥紙、紙パルプ、織物等が含まれるが、これらに限定されない。好適には、グラスファイバー製パッドが用いられる。該サンプルパッドには、後述するコンジュゲートパッドの機能を併せ持たせることも出来る。また、サンプルパッドには、抗体固定化メンブレンにおける非特異的反応（吸着）を防止・抑制する目的で、通常使用されるブロッキング試薬を含ませることができる。
　サンプルパッドには、このほかに、本発明のポリオキシエチレンアルキルアミンを含ませることもできる。
（サードパッド）
　サードパッドは、試料の性状等により必要に応じて配置されることが望ましく、サンプル中の被検出物質とコンジュゲートの複合体を透過させることができるものであればいずれでもよい。
　また、本発明のサードパッドの平均孔径は、１～１００μｍが例示され、５～８０μｍが好ましく、１０～６０μｍがより好ましく、１５～５５μｍがさらに好ましく、２０～５０μｍが特に好ましく、２５～４５μｍが最も好ましい。
　サードパッドには、このほかに、本発明のポリオキシエチレンアルキルアミンを含ませることもできる。
（不溶性メンブレン）
　本発明に用いられる不溶性メンブレンは、被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体が固定化された少なくとも１つの検出部を有する。被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体の不溶性メンブレン担体への固定化は、従来公知の方法で実施することができる。ラテラルフロー式のイムノクロマト試薬の場合には、上記の抗体を所定の濃度で含有する液を調製し、ノズルから液を一定の速度で吐出しながら水平方向に移動させることのできる機構を有する装置などを用いて、上記液をライン状に不溶性メンブレン担体に塗布し、乾燥させることにより固定化させることができる。上記液の抗体の濃度は０．１～５ｍｇ／ｍＬが好ましく、０．５～２ｍｇ／ｍＬがさらに好適である。また、抗体の不溶性メンブレン担体への固定化量は、ラテラルフロー式の場合には上記の装置のノズルからの吐出速度を調節することによって最適化でき、０．５～２μＬ／ｃｍが好適である。
　なお、上記ラテラルフロー式のイムノクロマト試薬を用いた測定方法は、サンプルが毛細管現象により不溶性メンブレン担体に対して並行方向に移動するように展開する方式の測定方法である。
　また、上記の抗体を所定の濃度で含有する液は、緩衝液に抗体を添加することにより調製することができる。該緩衝液の種類としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液など通常使用される緩衝液をあげることができる。緩衝液のｐＨは６．０～９．５の範囲が好ましく、６．５～８．５がより好ましく、７．０～８．０がさらに好ましい。緩衝液には、さらに塩化ナトリウムなどの塩類、スクロースなどの安定剤や保存剤、プロクリン(登録商標)などの防腐剤等を含んでもよい。塩類は塩化ナトリウムなどのようにイオン強度の調整のために含ませるもののほか、水酸化ナトリウムなど緩衝液のｐＨを調整する目的で添加するものも含まれる。
　不溶性メンブレンに抗体を固定化した後、さらに、通常使用されるブロッキング剤を溶液あるいは蒸気状にして抗体を固定化した部位以外を被覆し、ブロッキングを行うこともできる。
　なお、不溶性メンブレンには、従来からイムノクロマト試薬で用いられているコントロール捕捉試薬を固定化してもよい。該コントロール捕試薬は、アッセイの信頼性を担保するための試薬であって、コンジュゲートパッドに含ませたコントロール試薬を捕捉するものである。例えば、コンジュゲートパッドに標識されたスカシ貝由来ヘモシアニン（以下、ＫＬＨという）をコントロール試薬として含む場合には、抗ＫＬＨ抗体などがコントロール捕捉試薬に該当する。コントロール捕捉試薬を固定化する位置は、アッセイ系の設計に適合するよう適宜選択することができる。
　不溶性メンブレンには、このほかに、本発明のポリオキシエチレンアルキルアミンを含ませることもできる。
　本発明で用いられる不溶性メンブレンを構成するメンブレンとしては、従来からイムノクロマト試薬の不溶性メンブレン担体として用いられている公知のメンブレンが使用できる。例えば、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン類、ガラス、セルロースやセルロース誘導体などの多糖類、セラミックス等からなる繊維から構成されるメンブレンがあげられる。具体的には、ザルトリウス社、ミリポア社、東洋濾紙社、ワットマン社などから市販されているガラス繊維ろ紙やセルロースろ紙などが挙げられる。中でも、ザルトリウス社、UniSart CN140が好ましい。また、この不溶性メンブレン担体の孔径と構造を適宜選択することにより、コンジュゲートとサンプル中の被検出物質との複合体が不溶性メンブレン担体中を流れる速度を制御することが可能である。
　上記イムノクロマトグラフィー用テストストリップは、プラスチック製粘着シートのような固相支持体上に配置させることが好ましい。該固相支持体は、サンプル及びコンジュゲートの毛管流を妨げない物質で構成する。また、イムノクロマトグラフィー用テストストリップを固相支持体上に接着剤等で固定化してもよい。この場合、接着剤の成分等においてもサンプル及びコンジュゲートの毛管流を妨げない物質で構成する。該イムノクロマトグラフィー用テストストリップは、イムノクロマトグラフィー用テストストリップの大きさ、サンプルの添加方法や添加位置、不溶性メンブレンの検出部の形成位置、シグナルの検出方法などを考慮した適当な容器（ハウジング）に格納・搭載して使用することができ、このように格納・搭載された状態を「デバイス」という。
（マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体）
　本発明のマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体とは、該タンパク質を特異的に検出できる抗体であればポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよく、このうちでもモノクローナル抗体が好ましい。
　マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体は、例えば、マイコプラズマ・ニューモニエ菌体から抽出したＰ３０タンパク質またはクローニングされたＰ３０タンパク質の遺伝子を大腸菌などの宿主で遺伝子工学的に発現させて抽出精製した組み換えＰ３０タンパク質、又はＰ３０タンパク質の一部を構成するポリペプチドを免疫用抗原として、常法に従って得ることができる。ポリクローナル抗体の場合は、前記免疫用抗原でマウスなどの動物を免疫した抗血清から得ることができ、モノクローナル抗体は、マウスなどの動物に免疫した後、この免疫された動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを細胞融合して得られた融合細胞をＨＡＴ含有培地で選択した後に増殖させて、Ｐ３０タンパク質を利用して、例えば、抗Ｐ３０タンパク質抗体産生株をスクリーニングすることにより得ることができる。
  本発明のマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体は、当該抗体と実質的に同等のマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体フラグメントおよび改変抗体も含む。抗体フラグメントとしてはＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖフラグメントなどが挙げられる。
　本発明のマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する第一の抗体である標識抗体と第二の抗体である固定化抗体は、それぞれ、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、少なくともいずれか一方がモノクローナル抗体である方が好ましく、両方がモノクローナル抗体である方がより好ましい。
　また、第一の抗体と第二の抗体は、Ｐ３０タンパク質に存在する異なるエピトープを認識する抗体であることが好ましい。
  Ｐ３０タンパク質は分子量３０ＫＤａの接着タンパク質の１つである。マイコプラズマ・ニューモニエの菌体においては、接着器官の先端部の細胞表面に局在しており、細胞膜内に埋没しているＮ末端と細胞膜外に存在するＣ末端を持つ膜貫通型タンパク質である。
　また、Ｃ末端側にはプロリンを多く含むアミノ酸配列の繰り返し構造が存在する。一般的にプロリンを含むアミノ酸配列からなる領域は、立体的な高次構造をとることが知られており、抗体の反応するエピトープとなり得ることが知られている。
  本発明のＰ３０タンパク質に対する抗体は、Ｐ３０タンパク質を特異的に認識できる抗体であればよく、モノクローナル抗体としては、Ｐ３０タンパク質の細胞外領域における、プロリンを多く含むアミノ酸配列の繰り返し構造からなる部分を認識するモノクローナル抗体が好ましい。
 　また、本発明のマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体は、市販の抗Ｐ３０モノクローナル抗体を用いてもよい。市販の抗Ｐ３０モノクローナル抗体の例としては、Ｍｅｒｉｄｉａｎ社のＣ０１９３９Ｍ、Ｃ０１９４０Ｍ、Ｃ０１９４１Ｍ、Ｃ０１９４２Ｍ、Ｃ０１９４３Ｍなどが挙げられる。
（抗Ｐ３０モノクローナル抗体の調製例）
　以下の試験に用いた抗Ｐ３０モノクローナル抗体は、当業者がモノクローナル抗体を製造するために通常行う方法（ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ、第２５６巻４９５頁（１９７５年）等）により得られた。
（標識体）
　本発明で用いられる標識体は、従来からイムノクロマトグラフィー用テストストリップに用いられている公知の標識体を用いることができる。例えば、金コロイド粒子や白金コロイド粒子などのコロイド状金属粒子、カラーラテックス粒子、磁性粒子、蛍光粒子などが好ましく、特に金コロイド粒子、カラーラテックス粒子が好ましい。
（コンジュゲート）
　本発明で用いられるコンジュゲートは、上記のような標識体に被検出物質であるマイコプラズマ・ニューモニエに対して免疫学的に反応する抗体が固定化されたものである。コンジュゲートは、金コロイド粒子に抗マイコプラズマ・ニューモニエＰ３０タンパク質モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体が固定化されたものが好ましい。
　被検出物質に対して免疫学的に反応する抗体を標識体へ固定化させる方法としては、物理吸着、化学結合等が挙げられ、物理吸着により固定化させるのが一般的である。
（キット）
　本発明のマイコプラズマ・ニューモニエの検出キットは、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を用いた検出試薬及びポリオキシエチレンアルキルアミンを含むサンプル希釈液を含むものであればよい。
　また、本発明のイムノクロマトグラフィーを利用したマイコプラズマ・ニューモニエ検出キットは、マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を用いたイムノクロマトグラフィー用テストストリップおよびポリオキシエチレンアルキルアミンを含むサンプル希釈液を含むものであればよい。
　本検出キットは、他に検出に必要な試薬、試験用チューブ、サンプル採取用の器具、取扱い説明書、テストストリップ格納用のハウジングなどを含んでもよい。
(その他)
　本明細書中、上流または下流という意味は、サンプルの流れる方向の上流側、下流側という意味で用いる。すなわち、本発明のテストストリップで上からサンプルパッド、コンジュゲートパッド、サードパッド、不溶性メンブレンが一部で重なるように積層されている場合、サンプルパッドがもっとも上流であり、不溶性メンブレンが下流ということになる。また、不溶性メンブレンの下流側端部が重なるように上にエンドパッドが積層されることがあるが、この場合、エンドパッドがもっとも下流である。
〔実施例１〕サンプル希釈液への界面活性剤の添加検討（１）
１．試験材料
（１）テストデバイス
　マイコプラズマ・ニューモニエＰ３０タンパク質に対するモノクローナル抗体を使用したイムノクロマトグラフィー用テストストリップを含むテストデバイスを製造した。　
　図１に、本発明のイムノクロマトグラフィー用テストストリップの模式構成図を示した。
　プラスチック製粘着シート（a）に不溶性メンブレン（b）を貼り、次いで、サードパッド(g)、コンジュゲートパッド（d)、サンプルパッド（e）を順に配置装着し、反対側の端には吸収パッド(ｆ)を配置装着した。コンジュゲートパッドには、金コロイドに抗Ｐ３０タンパク質モノクローナル抗体（表に示す標識抗体S08214R）を感作したコンジュゲートが含浸されており、不溶性メンブレンには、抗Ｐ３０タンパク質モノクローナル抗体（固定化抗体Ｓ０８２１０Ｒ、塗布濃度０．７５ｍｇ／ｍＬ、塗布量１．０μＬ／ｃｍ）、およびコントロール試薬（ヤギ抗マウスＩｇＧ、塗布濃度０．７５ｍｇ／ｍＬ、塗布量１．０μＬ／ｃｍ）が流れ方向に対して垂直にライン上に固定化されている。各パッドは、上下のパッドとその一部が接するように積層して配置される。抗Ｐ３０タンパク質モノクローナル抗体からなるラインをテストライン（ｃ１）、コントロール試薬からなるラインをコントロールライン（ｃ２）という。
　このように各構成要素を重ね合わせた構造物を一定幅に切断してイムノクロマトグラフィー用テストストリップを作製した。テストストリップを専用のプラスチック製ハウジングに格納・搭載し、イムノクロマトテストデバイス（図示せず）の形態にした。
（２）サンプル希釈液
　ポリオキシエチレンアルキルアミンを１．０％、ＮａＣｌを５０ｍＭとなるように２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に添加してサンプル希釈液を調整した。添加剤としてＢＳＡ０．２５％を添加した。
（３）サンプル
　ＮＢＲＣより受領し、凍結したマイコプラズマを遠心にて濃縮し、表中の倍率で生理食塩水により希釈したものを検体として用いた。各サンプル希釈液３００μＬに各検体１５μＬを懸濁し、サンプルとした。
２．試験方法
　テストデバイスにサンプル１２０μＬを滴下し、１５分後にテストラインの発色強度を「カラーチャート」という色見本を用いて以下の基準で目視で評価した。
　
＋：発色が見られる
±：発色が見られるが弱いあるいは非常に弱い
－：発色が一切見られない
３．試験結果
　結果を表１に示す。テストラインの発色強度を「ｍｙｃｏ」の列に、コントロールラインの発色強度を「ｃｏｎｔ」の列に記載した。限界希釈率以下（検出できる範囲の希釈率）の結果に網掛けを付した。後述する参考例と同様の試験において、比較的感度の高かったエマルゲン１０８（登録商標、以下同じ。）（０．５％）を使用した場合より本発明のサンプル希釈液を使用した場合に感度が高いかどうかを本発明の評価基準とした。
　本結果によれば、ポリオキシエチレンアルキルアミンを添加したサンプル希釈液を使用してマイコプラズマ・ニューモニエを検出した場合、エマルゲン（登録商標、以下同じ。）（１０８の検出限界は希釈率４０倍であったところ、本発明のアミート１０５は３２０倍でも検出が可能であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
〔実施例２〕サンプル希釈液への界面活性剤の添加検討（２）
　実施例１において、標識抗体をS08222Rに変えた以外は同様に感度評価試験を行った。
　結果を表２に示す。本結果によれば、エマルゲン１０８の検出限界は希釈率８０倍であったところ、本発明のアミート１０５は１２８０倍でも検出が可能であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
〔実施例３〕サンプル希釈液への界面活性剤の添加検討（３）
　実施例１において、標識抗体をS08224Rに変えポリオキシエチレンアルキルアミン２種の添加濃度を０．１％に変更した以外は同様に感度評価試験を行った。
　結果を表３に示す。本結果によれば、エマルゲン１０８の検出限界は希釈率８０倍であったところ、本発明のアミート１０５、アミート３２０は３２０倍でも検出が可能であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
〔実施例４〕サンプル希釈液への界面活性剤の添加検討（４）
　実施例１において、標識抗体をS08228Rに変えた以外は同様に感度評価試験を行った。
　結果を表４に示す。
　本結果によれば、エマルゲン１０８の検出限界は希釈率１６０倍であったところ、本発明のアミート１０５は６４０倍でも検出が可能であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
　以上、実施例１～４より、マイコプラズマ・ニューモニエＰ３０タンパク質に対するモノクローナル抗体のいずれの抗体を用いた場合も、本発明のポリオキシエチレンアルキルアミン存在下で免疫反応を行うことにより、マイコプラズマ・ニューモニエを高感度に検出することが可能となった。
〔参考例〕界面活性剤のスクリーニング
　上記実施例に先駆け、検出感度を上げる化合物探索のためノニオン性界面活性剤及びアニオン性界面活性剤について感度評価試験を行った。上記実施例１～４は検出下限を評価したが、本スクリーニングではテストラインの発色強度を評価した。
（１）試験方法
　実施例１と同じテストデバイスにサンプル１２０μＬを滴下し、１５分後にテストラインの発色強度を「カラーチャート」という色見本を用いて目視で評価した。サンプル希釈液は表５に示す組成の界面活性剤０．１％及び１．０％の２種の濃度で、ＮａＣｌを５０ｍＭとなるように２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に添加して調整した。添加剤としてＢＳＡ０．２５％を添加した。
　評価基準は、いずれかの界面活性剤濃度で、対照のエマルゲン１０８に対して発色強度の顕著な増強を認めた条件を◎、増強を認めた条件を○、低下あるいは発色を認めなかった条件を×として３段階で相対的に評価した。
（２）試験結果
　結果を表５に示す。本結果によれば、アニオン性界面活性剤はいずれも感度が悪く、検出が不能であり、ノニオン性界面活性剤ではポリオキシエチレンアルキルアミンがいずれも感度が高いことがわかった。本結果より、さらに複数のモノクローナル抗体においても検出感度が高いかどうかを確認し、検出可能な濃度範囲を調べるべく上記実施例にて試験を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  
 
　本発明によれば、マイコプラズマ・ニューモニエＰ３０タンパク質に対する抗体を用いて行う免疫反応をポリオキシエチレンアルキルアミンの存在下で行うことにより、マイコプラズマ・ニューモニエを高感度に検出できる。
（ａ）プラスチック製粘着シート
（ｂ）不溶性メンブレン
（ｃ１）テストライン
（ｃ２）コントロールライン
（ｄ）コンジュゲートパッド
（ｅ）サンプルパッド
（ｆ）吸収パッド
（ｇ）サードパッド 

Claims (7)

  1. マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を用いてマイコプラズマ・ニューモニエを免疫学的に検出する方法であって、
    ポリオキシエチレンアルキルアミンの存在下、免疫反応を行う前記検出方法。
  2. 免疫学的に検出する方法がイムノクロマトグラフィーを利用して検出する方法である請求項１に記載の検出方法。
  3. イムノクロマトグラフィーを利用して検出する方法が以下の（Ａ）～（Ｃ）の工程を含む請求項１又は２に記載の方法。
    （Ａ）マイコプラズマ・ニューモニエを含むサンプルと、ポリオキシエチレンアルキルアミンを含むサンプル希釈液を混合する工程
    （Ｂ）下記テストストリップのサンプル供給部に、前記（Ａ）で得られた混合物を供給する工程
    テストストリップ；
    少なくともサンプル供給部、展開部および検出部とを備えた多孔質体からなるメンブレンを有し、展開部の一部には、標識物質で標識された第一のマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を含むコンジュゲートが溶出可能に保持され、さらに展開部の一部であってコンジュゲート保持部分より下流側に第二のマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体が固定化されている検出部を有する
    （Ｃ）サンプル中のマイコプラズマ・ニューモニエとコンジュゲートの複合体を検出部において検出する工程
  4. 以下の構成（１）および（２）を含む、マイコプラズマ・ニューモニエ検出キット。
    （１）マイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を用いた検出試薬（２）ポリオキシエチレンアルキルアミンを含むサンプル希釈液
  5. 前記（１）のマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を用いた検出試薬が以下の構成（１）’である請求項４に記載の検出キット。
    （１）’少なくともサンプル供給部、展開部および検出部とを備えた多孔質体からなるメンブレンを有し、展開部の一部には、標識物質で標識された第一のマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体を含むコンジュゲートが溶出可能に保持され、
    さらに展開部の一部であって前記コンジュゲート保持部分より下流側に、第二のマイコプラズマ・ニューモニエのＰ３０タンパク質に対する抗体が固定化されている検出部を有するイムノクロマトグラフィー用テストストリップ
  6. マイコプラズマ・ニューモニエＰ３０タンパク質に対する抗体を用いた免疫学的検出方法におけるサンプル希釈液であって、ポリオキシエチレン・アルキルアミンを含む前記希釈液。
  7. ポリオキシエチレンアルキルアミンと、マイコプラズマ・ニューモニエを含むサンプルとを接触させる工程を含む、マイコプラズマ・ニューモニエを免疫学的に検出するためのサンプル前処理方法。
     
PCT/JP2019/030629 2018-08-06 2019-08-05 マイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的検出方法 WO2020031931A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17/264,749 US20210302426A1 (en) 2018-08-06 2019-08-05 Method for immunologically detecting mycoplasma pneumoniae
CN201980051975.8A CN112513638A (zh) 2018-08-06 2019-08-05 免疫学检测肺炎支原体的方法
EP19846491.9A EP3835788A4 (en) 2018-08-06 2019-08-05 METHOD FOR THE IMMUNOLOGICAL DETECTION OF MYCOPLASMA PNEUMONIAE

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018-147371 2018-08-06
JP2018147371A JP6426873B1 (ja) 2018-08-06 2018-08-06 マイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的検出方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020031931A1 true WO2020031931A1 (ja) 2020-02-13

Family

ID=64394761

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2019/030629 WO2020031931A1 (ja) 2018-08-06 2019-08-05 マイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的検出方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20210302426A1 (ja)
EP (1) EP3835788A4 (ja)
JP (1) JP6426873B1 (ja)
CN (1) CN112513638A (ja)
WO (1) WO2020031931A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113325180A (zh) * 2021-05-31 2021-08-31 无锡中德伯尔生物技术有限公司 一种检测农药残留的胶体金卡及其制备方法和应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014167439A (ja) 2013-02-28 2014-09-11 Asahi Kasei Corp マイコプラズマ・ニューモニアの検出方法
JP2014167447A (ja) * 2013-02-28 2014-09-11 Gc Corp 唾液の前処理液
CN104198703A (zh) * 2014-08-18 2014-12-10 湖北工业大学 人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒及其制备方法和应用
WO2015025968A1 (ja) * 2013-08-23 2015-02-26 株式会社ビーエル マイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的検出法およびキット
WO2015186812A1 (ja) * 2014-06-04 2015-12-10 田中貴金属工業株式会社 免疫学的測定試薬におけるプロゾーン現象の解消法
JP2016031353A (ja) * 2014-07-30 2016-03-07 株式会社 富山研究所 肺炎マイコプラズマ検出試薬及びその用途
JP2017009571A (ja) 2015-06-01 2017-01-12 田中貴金属工業株式会社 マイコプラズマ・ニューモニエ検出用免疫クロマト分析装置
JP2018077171A (ja) * 2016-11-10 2018-05-17 プリマハム株式会社 チョコレート試料中のアレルゲンの検出方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3163461B2 (ja) * 1992-10-19 2001-05-08 大塚化学株式会社 殺虫、殺ダニ剤組成物
KR20070012838A (ko) * 2004-05-19 2007-01-29 가부시끼가이샤 센단세메이가가꾸겐큐죠 Ｂ형간염 바이러스의 검출방법
US20060275841A1 (en) * 2004-12-20 2006-12-07 Martin Blankfard Assay method and apparatus with reduced sample matrix effects
JP5111389B2 (ja) * 2006-10-18 2013-01-09 協和メデックス株式会社 小粒子低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法
US9737593B2 (en) * 2008-03-19 2017-08-22 Yale University Carbon nanotube compositions and methods of use thereof
AU2014340568B2 (en) * 2013-10-22 2017-02-02 Aradigm Corporation Inhaled surfactant-modified liposomal formulations providing both an immediate and sustained release profile
KR102457440B1 (ko) * 2015-01-29 2022-10-21 타운즈 컴퍼니 리미티드 마이코플라즈마 뉴모니아의 면역학적 검출법 및 키트
EP3339862A4 (en) * 2015-08-17 2019-03-13 Sekisui Medical Co., Ltd. IMMUNOLOGICAL PROOF AND TEST STRIP FOR THIS
CN107513506B (zh) * 2016-06-17 2021-11-09 普莱柯生物工程股份有限公司 猪肺炎支原体、疫苗组合物及其应用
CN109154605A (zh) * 2016-07-13 2019-01-04 积水医疗株式会社 免疫层析检测方法
JP7084589B2 (ja) * 2016-10-31 2022-06-15 国立大学法人大阪大学 酸化高密度リポ蛋白質の測定方法
JP2022043359A (ja) * 2018-11-02 2022-03-16 積水メディカル株式会社 マイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的検出方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014167439A (ja) 2013-02-28 2014-09-11 Asahi Kasei Corp マイコプラズマ・ニューモニアの検出方法
JP2014167447A (ja) * 2013-02-28 2014-09-11 Gc Corp 唾液の前処理液
WO2015025968A1 (ja) * 2013-08-23 2015-02-26 株式会社ビーエル マイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的検出法およびキット
WO2015186812A1 (ja) * 2014-06-04 2015-12-10 田中貴金属工業株式会社 免疫学的測定試薬におけるプロゾーン現象の解消法
JP2016031353A (ja) * 2014-07-30 2016-03-07 株式会社 富山研究所 肺炎マイコプラズマ検出試薬及びその用途
CN104198703A (zh) * 2014-08-18 2014-12-10 湖北工业大学 人肺炎支原体金标银染免疫层析检测试剂盒及其制备方法和应用
JP2017009571A (ja) 2015-06-01 2017-01-12 田中貴金属工業株式会社 マイコプラズマ・ニューモニエ検出用免疫クロマト分析装置
JP2018077171A (ja) * 2016-11-10 2018-05-17 プリマハム株式会社 チョコレート試料中のアレルゲンの検出方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KOHLERMILSTEIN, NATURE, vol. 256, 1975, pages 495
See also references of EP3835788A4

Also Published As

Publication number Publication date
US20210302426A1 (en) 2021-09-30
JP2020024093A (ja) 2020-02-13
JP6426873B1 (ja) 2018-11-21
EP3835788A4 (en) 2022-03-16
EP3835788A1 (en) 2021-06-16
CN112513638A (zh) 2021-03-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7330945B2 (ja) 分析物検出の改善のためのアッセイ法
JP7260192B2 (ja) マイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的検出法およびキット
JP6168529B2 (ja) 多価抗原測定用コンジュゲート、これを用いた多価抗原測定用イムノクロマトテストストリップおよびイムノクロマト測定方法
EP3460475A1 (en) Immunochromatographic analysis device for detecting zika virus
JP6533206B2 (ja) マイコプラズマ・ニューモニエ検出用免疫クロマト分析装置
JP2011209140A (ja) ヒトｃ反応性タンパク質（ｃｒｐ）測定用イムノクロマト試薬
WO2015037635A1 (ja) インフルエンザウイルスの免疫測定における検体処理方法及び免疫測定法
JP7153545B2 (ja) イムノクロマトグラフィー試験片、並びに、それを用いる被験物質測定方法及びイムノクロマトグラフィー試験キット
WO2017078170A1 (ja) Ｃｋ１９に特異的なモノクローナル抗体およびこれを産生するハイブリドーマ、癌の検出キット、癌の検出方法および癌の転移の判定方法
JP2022505934A (ja) 差異的アイソタイプ検出のためのラテラルフローアッセイ
WO2020031931A1 (ja) マイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的検出方法
JP2017215284A (ja) イムノクロマトグラフィー試験装置
CN110780066A (zh) 用于检测含红细胞的样品中的对象物的免疫色谱用测试条、及使用该测试条的免疫色谱
WO2020091028A1 (ja) マイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的検出方法
EP4191244A1 (en) Test reagent with ameliorated signal reduction
EP3306319B1 (en) Test object detection method, and immunoassay instrument and monoclonal antibody for same
WO2020091029A1 (ja) マイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的検出方法
Manta et al. Formulation, development and sensitivity, specificity comparison of gold, platinum and silver nanoparticle-based HIV ½ and hCG IVD rapid test kit (Immune chromatographic test device)
US20220011306A1 (en) Immunochromatographic test strip and immunochromatographic detection kit
WO2022265105A1 (ja) イムノクロマト試験片およびイムノクロマトキット
JP6962834B2 (ja) モノクローナル抗体および非特異反応抑制剤
JP6943789B2 (ja) モノクローナル抗体および非特異反応抑制剤
WO2016194986A1 (ja) マイコプラズマ・ニューモニエ検出用免疫クロマト分析装置
DELIA USE OF DOT IMMUNOBINDING ASSAY FOR THE RAPID DIAGNOSIS OF HUMAN HYIDATIDOSIS
NZ724911A (en) Compositions and methods for identifying ehrlichia species

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19846491

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019846491

Country of ref document: EP

Effective date: 20210309