KR20070012838A

KR20070012838A - Ｂ형간염 바이러스의 검출방법

Info

Publication number: KR20070012838A
Application number: KR1020067024352A
Authority: KR
Inventors: 치하루 오우에; 노보루 마키; 다쓰지 기무라
Original assignee: 가부시끼가이샤 센단세메이가가꾸겐큐죠
Priority date: 2004-05-19
Filing date: 2005-05-19
Publication date: 2007-01-29
Also published as: EP1752768A1; ATE493659T1; EP1752768B1; US20090017443A1; WO2005111620A1; EP1752768A4; DE602005025626D1; US20100291546A1; CN1997895A; JPWO2005111620A1

Abstract

혈청중의 B형간염 바이러스(HBV) 항원을 검출 또는 정량하는 방법, 및 이러한 검출 및 정량에 이용되는 극히 간단하고 쉽고 조작성이 높은 검체 처리방법의 제공.

B형간염 바이러스(HBV)를 포함하는 검체를, (1)산성화제, 및 (2)단백질 변성제, 또는 알킬기 및 제3급 아민 또는 제4급 암모늄염을 분자중에 가지고 있는 양성(兩性) 계면활성제 또는 양이온 계면활성제를 함유하는 처리제로 처리하는 것에 의해, HBV항원의 유리와 HBV항원에 결합하는 항체의 파괴를 실시하는 것을 특징으로 하는 HBV 함유 검체의 처리방법.

Description

Ｂ형간염 바이러스의 검출방법{METHOD OF DETECTING HEPATITIS Ｂ VIRUS}

본 발명은, 혈액중의 B형간염 바이러스(이하, 'HBV'라고 한다.) 항원을 고감도로 검출 또는 정량하기 위한, HBV 함유 검체의 처리방법 및 상기 처리방법을 이용하는 HBV 항원의 검출 또는 정량 방법에 관한 것이다.

HBV는, 수혈 후 간염의 원인 바이러스로서 최초로 분류된 바이러스로서, 수술시의 수혈에 의해서 감염한다. 그 때문에, 수혈용 혈액의 스크리닝에 있어서, 혈액의 HBV 감염의 유무를 진단하는 것이 극히 중요하다.

이러한 HBV 감염의 진단법으로서는, 검체중에 존재하는 HBV에 대한 항체를 검출하는 항체검출법, HBV의 항원을 검출하는 항원검출법, 또는 HBV의 유전자를 검출하는 방법이 있다.

이러한 검출방법 중 HBV유전자의 검출방법에는, NAT(핵산증폭법)나 DNA 프로브법이 있고, 현재 광범위하게 임상현장에서 이용되고 있다. 또한, NAT 검사의 보급에 의해, HBV DNA량과 HBV 캐리어의 병상의 관련이 주목되어, 항바이러스제에 의한 치료 후의 모니터링에는 NAT 검사가 주로 이용되어 오고 있다.

PCR법 및 TMA법 등의 상기 NAT검사법은, 유전자 단편을 검출하기 위해서는 고감도인 검출방법이다. 그러나, 검체중에서 HBV 게놈DNA를 추출할 때, 용수법 (manual method)에 있어서 처리시간이 2시간이나 필요하고, 여러 차례의 조작공정을 포함하는 등 번잡하다. 덧붙여, 이와 같이 조작이 복잡하기 때문에, 콘테미네이션(contamination)의 기회가 증가하여, 가짜 양성(false positive) 검체가 생길 가능성을 증가시키고 있다. 또한, 안정된 정량치를 얻기 위해서는 숙련을 필요로 한다고 하는 문제도 있다. 근년, 자동화 기기의 개발에 의해, 콘테미네이션 대책이나 DNA 추출의 처리시간의 단축이 이루어져 왔지만, 여전히 고가의 기기를 필요로 하기 때문에, 검체를 다량 처리하는 시설 이외에는 일반적으로 보급되어 있지 않다. 게다가, DNA 프라이머가 표적 유전자와 일치해야 하기 때문에, 프라이머를 여러 종류 사용할 필요가 있어, 검사당의 비용이 면역측정법과 비교하여 높아진다고 하는 문제점이 있다.

HBV 유전자 검사에는 이러한 문제가 있기 때문에, 바이러스 항원 검출법이 주목되고 있다. 종래, HBV 항원검사에서는, 혈액 스크리닝을 위해서 HBs 항원검출법이 이용되고 있고, HBV의 증식 마커로서는 HBe 항원측정법이 범용되어 왔다.

이러한 항원검사에 더하여, HBV 코어항원(HBc항원)을 직접 검출하는 방법도 개발되었다. Usuda등(Journal of Virological Methods, 72, 95-103, 1998)은, HBV 코어(HBc)항원에 대해서 특이성을 갖는 모노클로널항체를 이용하여, 혈청중의 HBc항원을 검출하는 방법을 개발하여, 상기의 바이러스 게놈을 검출하는 NAT검사법과 같이 임상적 유용성을 갖는 것을 나타내었다. 이러한 HBc항원 검출계는, 검출과정에서 증폭처리조작이 가해지지 않기 때문에, 콘테미네이션에 대해 비교적 관용적이다.

그러나, 상기 방법에도 몇 가지의 점에서 문제가 남아 있다. 측정을 위한 검체처리의 공정이 번잡하고, 또한 시간이 걸리기 때문에 스크리닝, 및 모니터링 등의 용도에 이용하고자 했을 때에 문제가 된다. 즉, 검체(혈청)의 처리를 위해서, 바이러스 입자의 농축과 혈청성분의 제거를 위해서 HBs 폴리클로널 항체처리 (37℃, 2시간), 원심조작(10분간), 상청(supernatant)의 제거, 계면활성제 처리, 알칼리 처리(35분간), 중화제 첨가라고 하는 다단계 처리공정을 필요로 한다. 이러한 공정은, 매우 숙련을 필요로 하는 작업이기 때문에, 재현성을 얻기 위해서는 숙련도가 필요하고, 또한 최저 약 3시간의 처리시간이 필요하다. 또한 원심조작, 상청제거 등의 공정이 있기 때문에, 자동화가 곤란하고, 또한 동시 대량처리를 곤란하게 하여, 조작면에 있어서도 대량 처리를 필요로 하는 용도에 적합하지 않다.

또한 오시하라 등은, HBs 폴리클로널항체로 처리를 실시하지 않고, 알칼리처리, 프로나제(pronase) 처리, 비이온 계면활성제인 노니데트 P40(NP-40) 및 메르캅토에탄올의 첨가에 의해 HBc항원의 측정을 실시하는 방법을 개발하고 있다(일본 특허공개공보 평성 8-50133). 그러나, 이러한 방법도 감도가 낮고, HBV-DNA로서 2.2pg/ml의 검출감도이며, DNA의 양으로서는 10⁵∼10⁶카피(copies)/ml 정도라고 생각할 수 있다.

상기 HBc 항원검출법에 더하여, HBe항원과 HBc항원을 동시에 측정하는 HBV코어 관련항원(HBcr항원)의 측정법(국제공개 WO 02/14871 A1)이나, HBV 바이러스 유사 입자를 형성하는 HBV의 p22cr항원(HBV p22cr항원)의 측정법(PCT/JP03/11389)이 개발되어 오고 있다. 이러한 방법은 HBc항원의 측정보다 고감도이지만, 유전자 측정법과 비교하면 아직도 충분하다고는 할 수 없는 상황에 있다.

특허문헌 1 : 일본특허공개공보 평성8-50133호

특허문헌 2 : 국제공개공보 WO 02/14871 A1

특허문헌 3 : PCT/JP03/11389 명세서

비특허문헌 1 : Journal of Virological Methods, 72, 95-103, 1998

면역측정법은 조작이 간편하고 염가로 측정할 수 있지만, 증식 마커로서 이용되고 있는 현행의 HBe 항원측정법에서는, HBe 항체의 존재하에서는 면역복합체로서 존재하는 HBe항원을 측정할 수 없다. 또한, HBc 항원측정법은, HBV DNA량과 상관은 있지만, 상기와 같이 전처리가 번잡하고, 또한 감도부족 때문에 임상시험에 응용되고 있지 않다.

한편, HBV코어 관련항원의 측정이나 HBV p22cr항원의 측정에서는, 계면활성제와 열(56∼70℃)을 이용하여 검체의 전처리를 실시하여, 항체나 바이러스 입자를 파괴한 후에 측정하고 있다.

그러나, 이러한 방법에 있어서도, 검체를 오프-보드(off-board)로 처리할 필요가 있고, 완전 자동화는 곤란하다.

따라서, 본 발명의 과제는, B형간염의 스크리닝이나 B형 만성간염 환자의 치료에 있어서의 모니터링 등에 이용하기 위해, HBV 항체의 존재하에 있어서도 HBV코어 관련항원(HBe 및 HBc항원)이나 HBV p22cr항원 등을 정량하기 위한 전처리방법 및 그것을 이용한 측정방법을 제공하는 것에 있다. 즉, 보다 단시간에 간편한 전처리로, 자동화 등의 대량 처리시스템에 용이하게 적용 가능한 HBV 항원 검출계를 제공하는 것에 있다.

따라서, 본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해서 열심히 검토를 거듭한 결과, (a) 검체중의 HBV항원을 단시간의 간단한 조작만으로, 프로브를 이용한 검출에 적합한 상태로 하는 것이 가능한 HBV 함유 검체의 처리방법 및 (b) 검체중의 HBV항원의 검출을 위해서, 포착용 프로프나 검출용 프로브와 경합하는, 숙주 유래의 HBV항원에 대한 항체를 단시간에 간단한 처리에 의해, 동시에 불활성화시킬 수 있는 처리방법에 주목하였다. 또한, (c) HBV항원을 측정하기 위해, 검체의 산성화제에 의한 처리, 및 (d) 상기 처리에 더하여 계면활성제, 단백질변성제, 환원제의 처리에 의해, 검체중에 존재하는 HBV항원을, 바이러스입자 또는 면역복합체로부터 유리시킬 수 있고, 동시에 검체중에 존재하는 HBV에 대한 사람항체도 불활성화되고, 그리고, (e) 상기 처리법에 의해, 항체와 같은 프로브를 이용한 면역측정법에 최적인 검체를 제공할 수 있는 것을 발견하였다. 또한, (f) HBV항원을 포함하는 검체중의 HBV항원을 바이러스 입자로부터 유리하는 동시에, 검체중에 존재하는 HBV에 대한 사람항체도 불활성화하는 처리제에 의해 검체를 처리하는 공정을 제공하여, 상기 처리공정을 포함하는 HBV항원을 면역학적 측정법에 의해서 검출 및 정량하는 방법, 및 (g) 상기 처리제를 포함하는 HBV항원의 측정키트를 제공할 수 있는 것을 발견하여, 이러한 지견에 기초하여, 본 발명의 완성에 도달하였다.

이렇게 하여, 본 발명에 의하면, 다음의 1∼3이 제공된다.

1.HBV를 포함하는 검체를,

(1) 산성화제, 및

(2) 계면활성제 및/또는 단백질변성제

를 함유하는 처리제로 처리하는 것에 의해, HBV항원의 해리와 HBV항원에 결합하는 항체의 불활성화를 실시하는 것을 특징으로 하는 HBV 함유 검체의 처리방법.

2. HBV항원의 면역학적 검출방법으로서,

(1) 전항 1 기재의 HBV 함유 검체의 처리를 실시하는 공정, 및

(2) HBV항원에 결합하는 프로브를 이용하여 HBV항원을 검출하는 공정을 포함하는 HBV항원의 면역학적 검출방법.

3. HBV항원을 검출하기 위해서 검체를 처리하는 처리제중에 하기의 (1)의 산성화제 및 (2)의 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 물질을 포함하는 진단약 또는 진단약 키트.

(1) 산성화제.

(2) 알킬기 및 제3급 아민 혹은 제4급 암모늄염을 분자중에 가지고 있는 양성(兩性) 계면활성제, 알킬기 및 제3급 아민 혹은 제4급 암모늄염을 분자중에 가지고 있는 양이온 계면활성제, 비이온 계면활성제, 및 단백질 변성제가 제공된다.

또한, HBV 함유 검체의 처리방법의 바람직한 실시형태로서 다음의 1) 또는 2)를 들 수 있다.

즉,

1) HBV를 포함하는 검체를,

(1) 산성화제, 및

(2) 단백질 변성제, 알킬기 및 제3급 아민 혹은 제4급 암모늄염을 같은 분자중에 가지고 있는 양성(兩性) 계면활성제, 알킬기 및 제3급 아민 혹은 제4급 암모늄염을 같은 분자중에 가지고 있는 양이온 계면활성제, 또는 비이온 계면활성제의 어느 하나를 함유하는 처리제로 처리하는 것에 의해, HBV항원의 해리와 HBV항원에 결합하는 항체의 불활성화를 실시하는 HBV함유 검체의 처리방법.

2) HBV를 포함하는 검체를,

(1) 산성화제, 및

(2) 알킬기 및 제3급 아민 혹은 제4급 암모늄염을 같은 분자중에 가지고 있는 양성 계면활성제, 알킬기 및 제3급 아민 혹은 제4급 암모늄염을 같은 분자중에 가지고 있는 양이온 계면활성제, 단백질 변성제, 비이온 계면활성제, 또는 환원제의 어느 하나의 2종 이상의 조합을 함유하는 처리제

로 처리하는 것에 의해, HBV항원의 해리와 HBV항원에 대한 항체의 불활성화를 실시하는 것을 특징으로 하는 HBV 함유 검체의 처리방법.

발명의 효과

본 발명에 의하면, 항체 등의 프로브를 이용하여 항원을 검출하는 소위 면역학적 측정방법에 적합한 상태로, HBV의 바이러스 입자로부터 간편하게, 단시간에 바이러스항원을 유리시켜, HBV항원에 대한 항체를 불활성화하는 것이 가능해진다. 또한, 본 발명에 의한 방법에 의해서, HBV를 포함하는 검체를 처리하는 것에 의해, 항체 등의 프로브를 이용하여 항원을 검출하는 소위 면역학적 측정방법에 따라서 HBV항원을 간편하고 단시간으로, 한편 고감도로 검출 및 정량하는 것이 가능해진다. 또한 본 발명에 의하면, 산성화제에 더하여 계면활성제 등의 사용에 의해 산처리에 의한 침전 등의 문제를 해소하고, 단백질을 효율적으로 파괴하여, 간편하고 단시간에 바이러스 항원을 유리시켜, 현저하게 뛰어난 감도향상의 효과를 발휘하는 것이 가능하다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명에 관한 HBV항원 함유 검체의 처리방법에 있어서의 검체로서는, 전체혈액, 혈장, 혈청, 소변, 침, 뇌척수액 등의 생물학적 체액, 및 간조직 등을 들 수 있다.

HBV의 감염성 입자는 직경 42nm의 구조의 Dane입자라고 생각되고 있다. 그 외피의 리포단백질이 HBs 항원이며, 내부의 직경 27nm의 뉴클레오캡시드(코어입자)를 형성하는 단백질이 HBc항원이다. 그 밖에, HBV의 뉴클레오캡시드 모양의 입자를 형성하는 단백질로서 HBV p22cr 항원이 있지만, 이 분자가 코어모양 입자를 형성하고, 그 바깥쪽에 HBs항원을 가지고 있다고 생각할 수 있다.

B형간염의 진단은, HBs 항원의 검출 또는 HBe 항원의 검출에 의해 실시되는 것이 일반적이다. 그러나, 이것들은 감염시기나 감염입자의 양을 정확하게 반영하는 것은 아니다. 이 때문에, 바이러스입자 또는 바이러스 유사 입자를 형성하고 있는 HBc 항원, HB 코어관련 항원이나 HBV p22cr 항원을 측정하는 것이 필요하다.

검체중에서는 HBc항원, p22cr 항원은 바이러스입자를 형성하는 단백질로서 존재하고 있고, 또한 항HBV 항체에 의해 HBe항원 등과 면역복합체의 형성을 볼 수 있다. 이 중에서, HBc항원, HBe항원이나 HBV p22cr항원을 검출하기 위해서는, Ⅰ) HBV입자를 파괴하고, HBe항원이나 HBV p22cr항원을 HBV입자로부터 유리시킴과 함께 항원을 가능한 한 단분자화하고, Ⅱ) 숙주 유래의 HBV의 HBc항원, HBe항원에 대한 항체를 불활성화 또는 제거하고, Ⅲ) HBV항원에 대한 항체 이외의 다른 혈중성분과의 상호작용으로부터 HBc항원, HBe항원이나 HBV p22cr항원을 유리시키는 것이 필요하다. HBV항원에 대한 항체는, 원심조작이나 어피니티(affinity) 컬럼조작 등으로 제거할 수 있지만, 이 경우 처리공정이 증가하므로, 불활성화하는 것이 바람직하다고 생각할 수 있다.

검출계 중에서 한정된 검체량에 포함되어 있는 HBc항원, HBe항원이나 HBV p22cr항원을, HBV입자, HBV항원에 대한 항체, 다른 혈중성분 등으로부터 최대한 단분자상태로 유리시키는 것이, 프로브와 반응 가능한 항원 분자수를 증가시키게 된다. 단시간이고 간단하고 쉬운 검체처리에 의해, 항원을 최대한 단분자 상태로 유리시켜, 프로브와의 반응성을 높이는 것이 중요하다.

검체중에 존재하는 항체의 활성을 없애는 조건은, 알칼리 처리, 산처리 등이 알려져 있다. 혈청 등을 산처리하면, 일부의 혈청유래 단백질 등은 불가역적으로 변성하여, 경우에 따라서는 침전이나 백탁을 일으키는 것이 있다. 이 때문에, 검체의 산처리 후, 처리검체의 피페팅(pipetting) 조작에서는, 덩어리 등의 장해가 되는 것이 많고, 또한, 측정시에, 표적으로 하는 항원을 포착하는 항체 등의 프로브가 결합하고 있는 담체나 고상(固相)에, 변성 단백질 등이 엉킨 침전이 흡착하여, 가짜 양성을 나타내는 것이 있다. 덧붙여, 그러한 침전물안에 표적으로 하는 항원이 엉켜들어가 프로브와 결합 가능한 항원량이 감소하기 때문에, 감도가 저하한다고 하는 문제도 생긴다.

본 발명은, 산성화제에 다른 물질을 첨가하는 것에 의해서, 산처리에 의한 침전이나 백탁 등의 방지나, 가짜양성의 방지 및 감도의 상승을 달성할 수 있다.

여기서 산성화제로서는, 염산, 황산, 초산, 트리플루오로초산, 트리클로로초산 등이 적당하다. 특히, 산성화제 농도는, 처리시 농도로, 0.05N 이상 1N 이하가 바람직하고, 또한 0.25N∼1N이 바람직하다. 이 경우 산성화제를 가한 검체는 pH2.5 이하, 대부분의 검체에서 pH2.0 이하로 처리하고 있게 된다.

상기 산성화제에 첨가하는 처리제의 하나로서 계면활성제를 들 수 있다. 다종 다양한 계면활성제가 단백질의 고차구조를 파괴하는 작용을 가지는 것이 알려져 있고, 바이러스 입자막의 파괴, 항체의 변성, 불용성 단백질의 가용화 등의 효과가 있다. 그러나, 이러한 계면활성제의 존재하에서는, 표적으로 하는 항원의 구조 에피토프(epitope)도 파괴되고, 항원포착용 항체 등의 프로브와의 결합이 약해지고, 감도가 저하하는 것이 큰 문제가 된다.

또한, 한편으로 계면활성제의 변성작용은 가역적인 것이 많고, 희석이나 투석 등에 의해서 계면활성제 농도를 엷게 하는 것에 의해서 일시적으로 변성한 구조가 원래대로 돌아가는 경우가 있다. 이것은, 측정용 프로브와 경합하게 되버리는 검체 유래의 항체가 존재하게 되어, 결과적으로 감도 저하가 되는 것이 분명하다. 즉, 계면활성제의 첨가는, 이상과 같은 이면성을 갖고 있다. 또한 계면활성제는, 이들의 구조나 성질에 의해서 여러 가지로 분류된다. 예를 들면, 이온성 및 비이온의 계면활성제가 있고, 이온성 계면활성제로서는 또한 음이온, 양이온, 양성 계면활성제 등을 들 수 있다.

본 발명자들은, 산성화제와 계면활성제를 조합함으로써, 침전물 등의 산처리의 문제점, 검체중 항체의 재활성화 등의 계면활성제 처리의 문제점이 해소되어, HBV항원의 검출에 관해서 큰 감도 상승효과를 나타내는 것을 발견하였다.

특히 계면활성제 중에서, 알킬기 및 제3급 아민 혹은 제4급 암모늄염을 같은 분자중에 가지고 있는 양성(兩性) 계면활성제, 또는 알킬기 및 제3급 아민 혹은 제4급 암모늄염을 같은 분자중에 가지고 있는 양이온 계면활성제를 이용하는 것에 의해, 현저한 효과를 이루는 것을 발견하였다.

또한 산성화제와, 탄소수 12개 이상의 일본쇄(一本鎖) 알킬기 및 제3급 아민 혹은 제4급 암모늄염을 같은 분자중에 가지고 있는 양성(兩性) 계면활성제, 또는 탄소수 12개 이상의 일본쇄(一本鎖) 알킬기 및 제3급 아민 혹은 제4급 암모니아염을 같은 분자중에 가지고 있는 양이온 계면활성제를 조합하는 것에 의해, 확실히 현저한 효과를 얻을 수 있다.

또한, 산성화제와 상기 계면활성제로 이루어제는 처리제에, 트리톤(Triton) X100 등의 폴리옥시에틸렌이소옥틸페닐에테르류나, Tween20 등의 폴리옥시에틸렌소르비탄알킬에스테르류 등의 비이온 계면활성제의 첨가나, 요소, 티오요소 등의 단백질 변성제의 첨가나, 시스테인, 시스테아민, 디메틸아미노에탄티올, 디에틸아미노에탄티올, 디이소프로필아미노에탄티올, 디티오스레이톨 등의 환원제의 첨가가, 더욱 바람직한 것을 발견하였다.

즉 본 발명은, HBV를 포함하는 검체를, (1) 산성화제, 및 (2) 알킬기 및 제3급 아민 혹은 제4급 암모늄염을 같은 분자중에 가지고 있는 양성(兩性) 계면활성제, 또는 알킬기 및 제3급 아민 혹은 제4급 암모늄염을 같은 분자중에 가지고 있는 양이온 계면활성제, 비이온 계면활성제, 또한 단백질 변성제, 및 (3) 환원제를 함유하는 처리제로 처리하는 것에 의해, HBV항원의 유리와 HBV항원에 결합하는 항체의 불활성화를 실시하는 것을 특징으로 하는, HBV 함유검체의 처리방법을 제공한다.

알킬기 및 제3급 아민 또는 제4급 암모늄염을 같은 분자중에 가지고 있는 양성(兩性) 계면활성제로서는, N-도데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판술포네이트 (N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate), N-테트라데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판술포네이트(N-Tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate), N-헥사데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판술포네이트(N- Hexadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate), N-옥타데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판술포네이트(N-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate) 등이 적당하다.

또한, 알킬기 및 제3급 아민 또는 제4급 암모늄염을 같은 분자중에 가지고 있는 양이온 계면활성제로서는, 데실트리메틸암모늄 클로라이드 ((Decyltrimethylammonium Chloride), 도데실트리메틸암모늄 클로라이드, (Dodecyltrimethylammonium Chloride), 테트라데실트리메틸암모늄 클로라이드 (Tetradecyltrimethylammonium Chloride), 헥사데실트리메틸암모늄 클로라이드 (Hexadecyltrimethylammonium Chloride), 데실트리메틸암모늄 브로마이드 (Decyltrimethylammonium Bromide), 도데실트리메틸암모늄 브로마이드 (Dodecyltrimethylammonium Bromide), 테트라데실트리메틸암모늄 브로마이드 (Tetradecyltrimethyl ammonium Bromide), 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드 (Hexadecyltrimethylammonium Bromide), 라우릴 피리디늄 클로라이드(Lauryl pyridinium Chloride), 테트라데실 피리디늄 클로라이드(Tetradecyl pyridinium Chloride), 세틸 피리디늄 클로라이드(Cetyl pyridinium Chloride) 등이 적당하다.

이러한 알킬기 및 제3급 아민 혹은 제4급 암모늄염을 같은 분자중에 가지고 있는 양성(兩性) 계면활성제 또는 양이온 계면활성제의 처리시 농도는, 0.1% 이상 15% 이하가 바람직하고, 또한, 0.5%∼10%가 바람직하다.

산성화제, 및 알킬기 및 제3급 아민 혹은 제4급 암모늄염을 같은 분자중에 가지고 있는 양성 계면활성제 또는 양이온 계면활성제에 첨가하는 비이온 계면활성제로서는, Triton X100 등의 폴리옥시에틸렌이소옥틸페닐에테르류나 NP40 등의 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르류 또는 Tween80 등의 폴리옥시에틸렌소르비탄알킬에스테르류 등이 적당하고, 이들의 농도는, 처리시 농도로 1% 이상 7.5% 이하가 바람직하고, 또한 1% 이상 5% 이하가 바람직하다.

산성화제, 및 알킬기 및 제3급 아민 혹은 제4급 암모늄염을 같은 분자중에 가지고 있는 양성(兩性) 계면활성제 또는 양이온 계면활성제에 첨가하는 단백질 변성제로서는, 요소, 티오요소 등이 적당하고, 이들의 농도는, 처리시 농도로 0.5M 이상이 바람직하고, 또한 1M 이상 8M 미만이 바람직하지만, 용해성 등이 문제가 되지 않는 경우, 예를 들어 검체처리용 튜브에 미리 분말로 요소를 첨가해 두는 등의 경우는, 10M까지는 사용 가능하다.

산성화제, 및 알킬기 및 제3급 아민 혹은 제4급 암모늄염을 같은 분자중에 가지고 있는 양성 계면활성제 또는 양이온 계면활성제에 첨가하는 환원제로서는, 시스테인, 시스테아민, 디메틸아미노에탄티올, 디에틸아미노에탄티올, 디이소프로필아미노에탄티올, 디티오스레이톨 등이 적당하고, 그러한 농도는, 처리시 농도로 0.25mM 이상 1000mM 이하가 바람직하고, 또한 1.5mM 이상 200mM 이하가 바람직하다.

산성화제에 첨가하는 다른 물질로서는 상기와 같이, 요소 등의 단백질 변성제를 들 수 있다. 이러한 단백질 변성제는, 수소이온 결합을 약하게 하는 것에 의해, 단백질의 고차구조를 부분적으로 파괴하는 작용을 갖는 것이 알려져 있고, 바이러스 입자막의 파괴나 검체중의 표적 항원에 대한 항체를 변성시키는 것이 가능하다. 또한, 예를 들면 대장균에서 발현시킨 재조합 단백질을, 불용성 분획인 인클루젼 바디(inclusion body)로부터 가용화시키는 등, 불용성 침전물을 가용화시키는 효과를 갖고 있다. 그러나, 요소 등의 단백질 변성제의 존재하에서는, 표적으로 하는 항원의 구조 에피토프도 파괴되어, 항원 포착용 항체 등의 프로브와의 결합을 약하게 할 수 있어, 감도가 저하한다고 하는 난점도 있다.

또한, 한편으로 요소 등의 단백질 변성제의 변성 작용은 가역적인 것이 많고, 희석이나 투석 등에 의해서 단백질 변성제 농도를 엷게 하는 것에 의해서 일시적으로 변성한 구조가 원래대로 돌아가는 경우가 있다. 이것은, 측정용 프로브와 경합해 버리는 검체 유래의 항체가 존재하게 되어, 결과적으로 감도가 저하되는 것이 분명하다. 즉, 요소 등의 단백질 변성제의 첨가에는, 이상과 같은 이면성을 갖고 있다.

본 발명자들은, 산처리와 단백질 변성제처리를 조합하는 것에 의해, 침전물 등의 산처리의 문제점, 검체중 항체의 재활성화 등의 단백질 변성제처리의 문제점이 해소되는 것을 발견하여, 본 발명의 또 하나의 발명을 완성시키기에 이른 것이다.

본 발명자들은, 단백질 변성제의 하나인 요소를 처리시 1M 이상을 첨가하는 것에 의해서, 산처리에 의한 침전물의 형성을 크게 감소시키는 것을 발견하였다. 이 단백질 변성제로서는, 요소, 티오요소 등이 적당하다. 또한, 단백질 변성제 농도는, 처리시 농도로 1M 이상이 바람직하고, 또한 1.5M 이상 8M 이하가 바람직하다. 또한, 산성화제와 단백질 변성제로 이루어제는 처리제에, Triton X100 등의 폴리옥시에틸렌이소옥틸페닐에테르류나 Tween20 등의 폴리옥시에틸렌소르비탄알킬에스테르류 등의 비이온 계면활성제를 첨가하는 것에 의해, 감도 상승 등의 효과가 있는 것을 발견하였다. 또한 산성화제와 단백질 변성제로 이루어지는 처리제에 환원제를 첨가하는 것도 가능하다.

상술한 것을 정리하면, 본 발명은, B형간염 바이러스(HBV)를 포함하는 검체를, (1) 산성화제, 및 (2) 알킬기 및 제3급 아민 혹은 제4급 암모늄염을 같은 분자중에 가지고 있는 양성(兩性) 계면활성제 또는 알킬기 및 양이온 계면활성제, 혹은 단백질 변성제를 함유하는 처리제로 처리하는 것에 의해, HBV항원의 유리와 HBV항원에 결합하는 항체의 불활성화를 실시하는 것을 특징으로 하는, HBV 함유 검체의 처리방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명에 관한 HBV 함유 검체의 처리방법에 있어서의 처리온도는, 고온에서도 가능하지만, 바람직하게는 20℃∼50℃, 더욱 바람직하게는 25℃∼42℃이다.

또한, 본 발명에 있어서 산성화제와 조합하는 처리제 중, 계면활성제로 가장 바람직한 것은, 알킬기, 및 제3급 아민 또는 제4급 암모늄염을 같은 분자중에 가지고 있는 양성 계면활성제, 혹은 알킬기, 및 제3급 아민 또는 제4급 암모니아염을 같은 분자중에 가지고 있는 양이온 계면활성제이며, 그 외의 처리제로서는 단백질 변성제이다. 이 2개의 처리제에 비이온 계면활성제를 가하고, 여기에 환원제를 가하는 것에 의해, 처리 효과의 상승을 볼 수 있었다(실시예 4 참조). 이것은 처리제의 조합이, 처리 효과의 상승으로 연결되는 것을 나타낸 것이다. 예를 들면, 산성화제와 조합하는 처리제로서는, 알킬기와, 제3급 아민 또는 제4급 암모늄염을 같은 분자중에 가지고 있는 양성(兩性) 계면활성제, 알킬기와, 제3급 아민 또는 제4급 암모늄염을 같은 분자중에 가지고 있는 양이온 계면활성제, 단백질 변성제, 비이온 계면활성제, 환원제, 또는 음이온 계면활성제 등의 처리제가 있다. 이들 중 2종 이상의 처리제를 조합하여 산성화제와 동시에 처리하는 것에 의해, 효율적으로 HBV를 포함하는 검체를 처리하는 것이 가능하다.

본 발명에 관한 HBV항원의 면역학적 검출방법은, HBV 함유 검체를 산성화제와 계면활성제 및/또는 단백질 변성제를 함유하는 처리제와 접촉시키는 것에 의해, HBV항원의 해리와 HBV항원에 결합하는 항체의 불활성화를 실시하는 공정(제 1 공정)과, HBV항원에 결합하는 프로브를 이용하여 HBV항원을 검출하는 공정(제 2 공정)으로 이루어지는 것이다.

상기 제 2 공정에 있어서, 검출에 이용하는 프로브, 예를 들면 항체는 HBV항원에 특이적으로 결합하는 것이지만, 일정한 높은 친화성을 나타내는 것이면 좋다. 예를 들면, 상기 제 1 공정으로 처리된 검체중의 HBV코어 관련항원을 포착하는 프로브중 하나는, HB44, HB114, HB61 등의 모노클로널(monoclonal) 항체인 것이 바람직하다.

여기서 말하는 프로브란, 마우스, 래트, 기니아 피그, 토끼, 닭, 염소, 양, 소등의 실험동물을 면역하여 얻을 수 있는 폴리클로널 항체, 면역한 개체로부터 비장세포 등을 분리하여, 골수종(myeloma) 세포 등과 융합시키는 것에 의해서 얻을 수 있는 하이브리도마(hybridoma)가 생산하는 모노클로널 항체, 또는 비장세포, 혈중백혈구를 EB바이러스에 의해서 불멸화시킨 세포가 생산하는 모노클로널 항체, HBV에 감염되어 있는 사람, 침팬지 등이 생산하고 있는 폴리클로널 항체, 마우스, 사람 등의 면역글로불린(immunoglobulin)의 cDNA, 염색체 DNA로부터 얻을 수 있는 가변영역 유전자 단편, 또는 면역글로불린의 cDNA, 염색체 DNA의 일부와 인공적으로 제작한 배열을 조합하는 것에 의해서 구성되는 가변영역의 유전자 단편 등으로부터 유전자 조작에 의해서 구성되는, HBV항원에 높은 특이성, 친화성을 나타내는 분자이다.

본 발명에 관한 HBV항원의 면역학적 검출방법에 있어서, HBV항원은, 예를 들면, 상기와 같이 모노클로널 항체와의 항원항체반응에 의해 면역복합체가 된다. 이 면역복합체는, 2종의 항체에 의한 샌드위치법 등으로 형성된다. 이 면역 복합체중에 존재하는 표식효소를 발색법, 화학발광법에 의해, HBV항원의 존재를 시그널로서 검출할 수 있다. 또한, 형광물질을 직접 항체에 결합시키는 것 등에 의해, 면역복합체중에 형광물질을 주입시켜, 그 형광을 시그널로서 검출할 수도 있다.

또한, 본 발명은 상술의 면역학적 검출법을 이용하여, HBV의 감염을 진단하는 키트를 제공한다. 이 진단키트는, HBV를 포함하는 검체를 처리하는 처리제중에, 산성화제와 단백질 변성제 및/또는 계면활성제를 포함한다. 또한 키트에는, HBV의 항원에 결합하는, 항체와 같은 프로브를 포함하는 것이 바람직하다.

도 1은 검체 처리에 있어서 산성화제(염산) 농도에 의한 효과를 검토한 결과를 나타내는 도면이다.

[부호의 설명]

-▲- : HBV항원 양성 검체(#990277)

-△- : HBV항원 양성 검체(#990544)

-◆- : 정상인 혈청(Normal serum)

-□- : 정상인 혈장(Normal plasma)

이하, 실시예에 의해 본 발명에 대해서 구체적으로 설명한다. 무엇보다 본 발명은, 이러한 실시예 등에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

산성화제 농도 : HBV항원 음성검체 또는 HBV항원 양성검체(#990277, #990544, #990623, #990768) 100μl에, 각종 농도의 염산수용액 100μl를 첨가하고, 실온에서 10분간 인큐베이션을 실시하여, 그 100μl를 측정시료로서 이하에 기술하는 측정법을 이용하여 검토하였다.

96웰(well) 마이크로 플레이트(FluoroNunc Module, Maxisoap surface)에, 항HBV 코어 관련항원 모노클로널 항체(HB44, HB114, HB61을 2:1:1의 비율로 혼합)를 4μg/ml의 농도로 100μl를 가하여, 4℃에서 하룻밤 인큐베이트 하였다.

0.15M NaCl을 포함하는 10mM 인산완충액 pH7.3으로 2회 세정 후, 0.5% 카제인 나트륨을 포함하는 10mM 인산완충액 pH7.1을 350μl 가하여 2시간 인큐베이트하였다. 블로킹액 제거 후, 중화제를 포함하는 반응 완충액 100μl와 각각의 검체처리법으로 얻어진 측정시료를 각 웰에 가하여 교반하면서 실온에서 2시간 반응시켜, 0.05% Tween20을 포함하는 10mM 인산완충액 pH7.3(세정액) 350μl로 6회 세정하고, 또한 알칼리포스파타제(ALP) 표식한 모노클로널 항체(HB91와 HB110의 동량 혼합) 100μl를 첨가하고 실온에서 30분간 반응시켰다. 세정액으로 6회 세정하여, 기질용액(TROPIX, CDP-star with Emerald Ⅱ) 100μl를 가하여 20분간 인큐베이트하였다.

루미노미터(DIA-IATRON, Luminous CT-9000D)로 발광강도를 측정하여, 그 결과를 도 1에 나타낸다. 한편, 도 1에 나타내는 염산농도는, 검체(Sample)와 처리 제를 혼합 후의 처리시 농도로 나타내었다.

HBV항원 양성검체(#990277, #990544)는, 염산을 포함하지 않는 용액으로 실온 10분간 인큐베이션을 실시해도 거의 HBV코어관련 항원활성을 검출할 수 없었지만, 처리시의 염산농도 0.05N으로부터 코어관련 항원활성이 인정되어, 0.25∼1.0N에서 피크가 되었다. 또한, 염산 대신에 황산을 이용하여 검토했지만, 동일한 결과를 얻을 수 있었다.

실시예 2

산성화제 공존하에 있어서의 각종 계면활성제 농도 : HBV항원 음성검체 또는 HBV항원 양성검체(#990277, #990544, #990768) 100μl에, 각종 계면활성제를 용해한 1.0N 염산농도의 수용액을 100μl 첨가하고, 실온에서 10분간 인큐베이션을 실시하여, 그 100μl를 측정 시료로서 실시예 1에서 채용한 방법으로 검토하였다. 검토결과를 표 1∼표 5에 나타낸다. 또한, 각 표 중, 측정치의 하선부는 판정기준을 넘은 케이스인 것을 나타낸다.

표 1∼표 5에 의하면, 3예의 검체 중 적어도 일례가, 각각의 검체의 판정 기준보다 높은 반응성을 나타낸 계면활성제를 첨가효과가 있다고 판단하였다. 그 결과, 염산 또는 황산과 같은 산성화제와 함께 각종 계면활성제를 첨가하면, HBV항원 양성검체중의 코어관련 항원 면역활성이 크게 상승한 계면활성제가 인정되었다. 첨가효과가 인정된 것은, 알킬기와, 제3급 아민 혹은 제4급 암모늄염을 같은 분자중에 가지고 있는 양성 계면활성제, 또는 알킬기와, 제3급 아민 혹은 제4급 암모늄염을 같은 분자중에 가지고 있는 양이온 계면활성제였다.

또한, Triton X100나 Tween 20과 같은 비이온 계면활성제에도 첨가효과가 인정되었다. 음이온 계면활성제인 소듐도데실설페이트(Sodium dodecyl sulfate; SDS), 리튬도데실설페이트(Lithium dodecyl sulfate; LDS)는, 0.5% 이상의 농도로 검체와의 반응중에 백탁했지만, 중화제를 포함하는 반응완충액을 첨가한 후 용해하여, 효과를 확인할 수 있었다. CHAPS와 같은 스테로이드 골격을 갖는 계면활성제는, 반응성의 향상을 나타내지 않았다. 그 밖에, 소듐N-라우로일사코신(N-lauroyl sarcosine Na)나 데옥시콜산 등도 검토했지만, 산성화제와의 공존에서는 용해성이 충분하지 않았다.

산성화제에, 알킬기와, 제3급 아민 혹은 제4급 암모늄염을 같은 분자중에 가지고 있는 양성(兩性) 계면활성제, 또는 알킬기와, 제3급 아민 혹은 제4급 암모늄염을 같은 분자중에 가지고 있는 양이온 계면활성제를 첨가하는 것에 의해 측정감도의 상승이 인정되었다. 이 산성화제와 계면활성제의 처리제로부터 산성화제를 제외하고, 효과가 있었던 계면활성제만으로 처리를 실시했지만 측정감도는 크게 저하하였다. 이것으로부터 측정감도의 상승은 산성화제를 기초로 하여, 계면활성제를 첨가하는 것에 의해 크게 상승하는 것이라고 생각할 수 있었다.

[표 1]

[표 2]

[표 3]

[표 4]

[표 5]

실시예 3

산성화제 공존하에 있어서의 단백질 변성제 :

HBV항원 음성검체 또는 HBV항원 양성검체(#990277, #990544, #990768) 100μl에, 단백질 변성제의 하나인 요소를 1.0N 염산 수용액에 용해하여, 그 100μl를 첨가하고, 실온에서 10분간 인큐베이션을 실시하여, 그 100μl를 측정시료로서, 실시예 1에서 서술한 방법으로 검토하였다. 각각의 HBV항원 양성검체의 면역활성을, HBV항원 음성검체의 면역활성에 대한 비율(HBV항원 양성검체의 흡광도/HBV항원 음성검체의 흡광도)을 구하여 표 6에 나타내었다.

요소를 첨가하면, 산성화제만과 비교하여, 약 1.5∼3배로 상승하는 검체가 확인되었다. 또한, 산성화제만의 처리시에 있어서, 혈청단백질 등이 변성하여 침전이나 백탁을 일으키는 것이 있고, 피펫팅 조작의 장해나, 침전물이 큰 가짜 양성의 원인이 되는 것도 많다. 게다가 이러한 침전물중에 목적으로 하는 항원이 엉켜들어가는 것에 의한 감도의 저하도 생각할 수 있다. 요소 처리시 1M 이상 첨가하 는 것에 의해서, 이러한 침전물 형성을 크게 감소 시킬 수 있는 것이 판명되고, 특히 처리시 1.5M 이상 8M 이하의 첨가에서 보다 효과가 인정되었다. 요소는 약 10M 용액까지는 용해했지만, 보존조건에 의한 석출 등의 문제도 있기 때문에, 용액으로서 사용하는 경우, 처리시 농도는 처리액량과 검체량의 비에 의존해 간다.

[표 6]

실시예 4

산성화제, 단백질 변성제, 비이온 계면활성제, 알킬기와 제3급 아민 또는 제4급 암모늄염을 같은 분자중에 갖고 있는 양성 계면활성제의 공존하에 있어서의 환원제의 검토 :

HBV항원 음성검체(Normal plasma) 또는 3예의 HBV항원 양성검체(#990277, #990544, #990768) 100μl에, 1.0N 염산, 1.5M 요소, 5.0% Triton X100, 1.5% Cl6APS(N-헥사데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판술포네이트)를 포함하는 용액에 환원제인 디티오스레이톨, 시스테아민염산, 디에틸아미노에탄티올염산을 혼합한 용 액 100μl를 첨가하고, 실온에서 10분간 인큐베이션을 실시하여, 그 100μl를 측정시료로 하여, 실시예 1에서 서술한 방법을 이용하여 검토하였다(표 7).

여기서 이용한 환원제의 농도는, 검체의 처리시의 농도로 표시하였다. HBV항원 음성검체(Normal serum)에서는, 환원제를 첨가하더라도 거의 그 시그널의 변화는 인정받지 못했지만, HBV항원 양성검체 #990544에서는, 검체 처리시 5mM 이상의 환원제 농도로부터 시그널의 상승이 인정되어, 디에틸아미노에탄티올염산농도가 10mM에서 2예(#990544, #990768)의 검체에서 30% 이상의 상승이 인정되었다.

[표 7]

[산업상 이용가능성]

본 발명은, 혈중의 HBV항원을 고감도로 검출 또는 정량하기 위한, 간편하고 조작성이 높은 검체 처리방법 및 그것을 이용한 HBV의 검출 또는 정량방법을 제공하는 것으로, 혈액의 HBV감염의 유무를 진단하여, 수혈용 혈액의 스크리닝을 신속 하고 정확하게 실시할 수 있다. 또한, 진단약 키트를 제공할 수도 있고, HBV항원의 검출의 능률화에 기여하는 바 매우 크다.

Claims

B형간염 바이러스를 포함하는 검체를,

(1) 산성화제, 및

(2) 계면활성제 및/또는 단백질 변성제

를 함유하는 처리제로 처리하는 것에 의해, B형간염 바이러스 항원의 해리와, B형간염 바이러스 항원에 결합하는 항체의 불활성화를 실시하는 것을 특징으로 하는, B형간염 바이러스 함유 검체의 처리방법.
제 1 항에 있어서, 상기 계면활성제 및/또는 단백질 변성제에 환원제를 더 첨가하여 이루어지는, B형간염 바이러스 함유 검체의 처리방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 계면활성제가, 알킬기 및 제3급 아민 또는 제4급 암모늄염을 같은 분자중에 가지고 있는 양성 계면활성제, 알킬기 및 제3급 아민 또는 제4급 암모늄염을 같은 분자중에 가지고 있는 양이온 계면활성제, 및 비이온 계면활성제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 계면활성제인, B형간염 바이러스 함유 검체의 처리방법.
제 3 항에 있어서, 상기 계면활성제의 알킬기의 탄소수가 탄소수 12개 이상인, B형간염 바이러스 함유 검체의 처리방법.
제 1 항에 있어서, 상기 산성화제가, 염산, 황산, 초산, 트리클로로초산 또는 트리플루오로초산인, B형간염 바이러스 함유 검체의 처리방법.
제 4 항에 있어서, 상기 탄소수 12개 이상의 알킬기 및 제3급 아민 또는 제4급 암모늄염을 같은 분자중에 가지고 있는 양성 계면활성제가, N-도데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판술포네이트, N-테트라데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판술포네이트, N-헥사데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판술포네이트, 또는 N-옥타데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판술포네이트인, B형간염 바이러스 함유 검체의 처리방법.
제 4 항에 있어서, 상기 탄소수 12개 이상의 알킬기 및 제3급 아민 또는 제4급 암모늄염을 분자중에 가지고 있는 양이온 계면활성제가, 데실트리메틸암모늄클로라이드, 도데실트리메틸암모늄클로라이드, 테트라데실트리메틸암모늄클로라이드, 헥사데실트리메틸암모늄클로라이드, 데실트리메틸암모늄브로마이드, 도데실트리메틸암모늄브로마이드, 테트라데실트리메틸암모늄브로마이드, 헥사데실트리메틸암모늄브로마이드, 라우릴피리디늄클로라이드, 테트라데실피리디늄클로라이드, 또는 세틸피리디늄클로라이드인, B형간염 바이러스 함유 검체의 처리방법.
제 3 항에 있어서, 상기 비이온 계면활성제가 폴리옥시에틸렌이소옥틸페닐 에테르류, 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르류, 폴리옥시에틸렌소르비탄알킬에스테르류, Bridj35, 폴리옥시에틸렌도데실에테르, MEGA-10, 또는 데카노일-N-메틸글루카미드인, B형간염 바이러스 함유 검체의 처리방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단백질 변성제가, 요소 또는 티오요소인, B형간염 바이러스 함유 검체의 처리방법.
제 2 항에 있어서, 상기 환원제가, 시스테인, 시스테아민, 디메틸아미노에탄티올, 디에틸아미노에탄티올, 디이소프로필아미노에탄티올 또는 디티오스레이톨인 B형간염 바이러스 함유 검체의 처리방법.
B형간염 바이러스 항원의 면역학적 검출방법으로서,

(1) 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 B형간염 바이러스 함유 검체의 처리를 실시하는 공정, 및

(2) B형간염 바이러스 항원에 결합하는 프로브를 이용하여 B형간염 바이러스 항원을 검출하는 공정

을 포함하는 B형간염 바이러스 항원의 면역학적 검출방법.
B형간염 바이러스 항원을 검출하기 위해서, 검체를 처리하는 처리제중에 하기의 (1)의 산성화제 및 (2)의 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 물질을 포함하는 진단약 또는 진단약 키트.

(1) 산성화제.

(2) 알킬기 및 제3급 아민 또는 제4급 암모늄염을 분자중에 가지고 있는 양성 계면활성제, 알킬기 및 제3급 아민 또는 제4급 암모늄염을 분자중에 가지고 있는 양이온 계면활성제, 비이온 계면활성제, 및 단백질 변성제.
제 12 항에 있어서, 상기 (2)의 물질에 환원제를 더 첨가하여 이루어지는 진단약 또는 진단약 키트.