JP6637218B2 - 抗体を用いた標的核酸濃縮及び回収法 - Google Patents
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Description
[実施態様1]
核酸を濃縮する方法であって、下記工程(a)〜(c)が含まれる方法:
(a)蛋白質と核酸とが結合した蛋白質-核酸複合体を含む試料を提供する工程;
(b)前記試料と、前記蛋白質に特異的に反応する抗体と、前記抗体を吸着しうる担体と、を接触させる工程;及び
(c)前記担体を前記試料から回収し、前記担体上に、濃縮された核酸を得る工程。
[実施態様2]
(d)前記担体から前記濃縮された核酸を分離する工程を更に含む、実施態様1に記載の方法。
[実施態様3]
工程(b)において、前記担体として、前記抗体が前記担体に担持された抗体担持担体を接触させる、実施態様1又は2に記載の方法。
[実施態様4]
工程(d)において、前記抗体担持担体に免疫反応により吸着させた前記蛋白質-核酸複合体から核酸が脱着される、実施態様3に記載の方法。
[実施態様5]
工程(b)において、前記抗体と前記蛋白質-核酸複合体とが結合した抗体-蛋白質-核酸複合体が形成される、実施態様1〜4に記載の方法。
[実施態様6]
工程(d)において、前記担体に物理吸着により吸着させた前記抗体-蛋白質-核酸複合体から核酸が脱着される、実施態様5に記載の方法。
[実施態様7]
実施態様1〜6に記載の方法であって、
工程(a)の前、工程(a)において、又は工程(a)と工程(b)の間に、さらに下記工程(a')が含まれる方法:
(a')前記蛋白質-核酸複合体を含む試料に、界面活性剤を添加する工程。
[実施態様8]
前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、から選ばれる1以上である、実施態様7に記載の方法。
[実施態様9]
前記試料が生体試料、及び、病原微生物又はウイルスを含む試料、から選ばれる1以上である、実施態様1〜8に記載の方法。
[実施態様10]
前記生体試料が、動物細胞である、実施態様9に記載の方法。
[実施態様11]
前記生体試料が、血液、血漿、血清、尿、糞便、胆汁、膵液、鼻汁、鼻腔・咽頭拭い液から選ばれる1以上である、実施態様10に記載の方法。
[実施態様12]
前記病原微生物又はウイルスを含む試料が、病原微生物又はウイルスの培養物である、実施態様9に記載の方法。
[実施態様13]
前記ウイルスがインフルエンザウイルスである、実施態様9に記載の方法。
[実施態様14]
前記蛋白質が核蛋白質である、実施態様1〜13に記載の方法。
[実施態様15]
前記核蛋白質がヒストン、及び、ヌクレオカプシド蛋白質から選ばれる1以上である、実施態様14に記載の方法。
[実施態様16]
前記蛋白質-核酸複合体に特異的に反応する抗体が、核蛋白質を認識する抗体である、実施態様1〜15に記載の方法。
[実施態様17]
前記核蛋白質を認識する抗体が、抗ヒストン抗体、ヌクレオカプシド蛋白質を認識する抗体から選ばれる1以上である、実施態様16に記載の方法。
[実施態様18]
前記核酸が、メッセンジャーRNA (mRNA)を除く核酸である、実施態様1〜17に記載の方法。
[実施態様19]
前記核酸が、藻類DNA、藻類RNA、古細菌DNA、古細菌RNA、バクテリアDNA、バクテリアRNA、触媒活性DNA、環状DNA、連鎖状DNA、十字型DNA、真菌DNA、真菌RNA、蠕虫DNA、蠕虫RNA、遺伝子間DNA、アイソコア、マイクロRNA、腫瘍DNA、腫瘍RNA、核内RNA、植物DNA、植物RNA、原生動物DNA、原生動物RNA、組換えDNA、レトロエレメント、リボソームDNA、リボソームRN、サテライトDNA、サテライトRNA、転移RNA、非翻訳RNA、ウイルスDNA、及びウイルスRNAからなる群から選択される、実施態様1〜18に記載の方法。
[実施態様20]
前記蛋白質-核酸複合体は、当該タンパク質と当該核酸との間の水素結合によって形成されている、実施態様1〜19に記載の方法。
[実施態様21]
前記蛋白質-核酸複合体は、当該タンパク質と当該核酸との間の水素結合のみによって形成されている、実施態様1〜19に記載の方法。
[実施態様22]
前記蛋白質-核酸複合体は、当該タンパク質と当該核酸との間に共有結合を有しない、実施態様1〜21に記載の方法。
[実施態様23]
工程(d)において、前記蛋白質-核酸複合体を蛋白質分解酵素により処理する工程を含まない、実施態様1〜22に記載の方法。
[実施態様24]
前記蛋白質-核酸複合体を蛋白質分解酵素により処理する工程を含まない、実施態様1〜22に記載の方法。
[実施態様25]
0.0分以上、1.0分以上、2.0分以上、5.0分以上、10分以上、又は20分以上のソニケーション工程を含まない、実施態様1〜22に記載の方法。
[実施態様26]
0%以上、0.01%以上、0.02%以上、0.05%以上、0.1%以上、0.2%以上、0.5%以上、1.0%以上、2.0%以上、又は5.0%以上のホルムアルデヒドを使用しない、実施態様1〜22に記載の方法。
[実施態様27]
0単位以上、0.01単位以上、0.02単位以上、0.05単位以上、0.1単位以上、0.2単位以上、0.5単位以上、1.0単位以上、2.0単位以上、又は5.0単位以上のリボヌクレアーゼ(RNase) を使用しない、実施態様1〜22に記載の方法。
上記緩衝液としては、公知の塩化合物を含む緩衝液類を用いることが好ましい。具体的には、リン酸緩衝液(Phosphate buffered saline、PBS)、トリス緩衝液(トリス塩酸緩衝液、トリスとEDTAからなるTE緩衝液、トリスとホウ酸とEDTAからなるTBA緩衝液等)が例示できる。
抗インフルエンザウイルス(A及びB)モノクローナル抗体の作製
ヒトインフルエンザAウイルス(A/Panama/2007/99)の核蛋白質(ヌクレオカプシド蛋白質)の組換蛋白質 20μgを、等量の市販のフロイドのコンプリートアジュバント(Freund's Complete Adjuvant)と混合した。それぞれの混合物を、マウスに4〜8週間おきに3〜6回皮下免疫を行った。免疫したマウスより脾臓細胞を摘出し、ポリエチレングリコールを用いた常法により、ミエローマ細胞(SP/2)と細胞融合を行った。ヒトインフルエンザBウイルス(B/Shangdon/7/97)についても、ヒトインフルエンザAウイルスと同様の手順により細胞融合を行った。
本例では、先ずインフルエンザウイルスの培養液を、界面活性剤を含む試薬で処理した後、特異抗体を固定させた不溶性担体を接触させることで、インフルエンザウイルスのRNAを濃縮及び回収した。
ヒトインフルエンザウイルス株は以下の2種類を用いた。
・A/California/07/2009(H1N1)の培養液(6×106コピー/μL)
・B/Florida/4/2006の培養液(6×105コピー/μL)
上記培養上清1μLを、界面活性剤を含む試薬(20mM リン酸緩衝液、50mM塩化ナトリウム、0.5%エマルゲン120)100μLに添加し、混合後、室温で5分間放置した。
不溶性担体として、磁性粒子を用いた。DynaBeads Protein G(粒子径2.8μm、30mg/mL;ライフテクノロジーズ社;DynaBeads(登録商標) Protein G Immunoprecipitation Kit 製品番号:10007D)の磁性粒子懸濁液50μLを分取し、磁石で粒子を集めた後に上清を取り除いた。ついで、参考例で作製した抗インフルエンザウイルスA型モノクローナル抗体を30μg含む200μLのPBST(0.02%Tween20含むPBS)を加え、室温で30分撹拌し抗体を粒子に結合(固定化ともいう。)させ、抗体結合磁性粒子を作成した。該抗体結合磁性粒子をPBSTで洗浄後、抗原抗体反応に使用した。また、参考例で作製した抗インフルエンザウイルスB型モノクローナル抗体を30μg含む200μLのPBST(0.02%Tween20含むPBS)を加え、室温で30分撹拌し抗体を粒子に結合(固定化ともいう。)させ、抗体結合磁性粒子を作成した。該抗体結合磁性粒子をPBSTで洗浄後、抗原抗体反応に使用した。
上記処理サンプル液100μLを、該抗体結合磁性粒子と混合し、室温で10分間転倒混和することにより抗原抗体反応を行った。抗体による特異的な捕捉かどうか、言い換えると非特異結合か否か、を確認する為、抗体を結合させていない磁性粒子(抗体未結合磁性粒子)を用いて、同様の操作を行った。
磁性粒子を磁石で集めて上清を除いた後、市販のウイルスRNA精製キット(QIAamp Viral RNA Mini Kit:QIAGEN社)の手順に従って、磁性粒子に吸着しているRNAを精製し、最終的にNuclease-Free Water 60μLでRNAを溶出した。このようにして、RNA検体を得た。
抗体結合磁性粒子で捕捉したRNA量の確認は、精製RNAを鋳型に用いて、以下の試薬及び条件でリアルタイムRT-PCRにより確認した。
45℃で5分間逆転写反応を行った後、95℃で30秒間加温して逆転写酵素を失活させ、その後、95℃3秒間で熱変性、50℃で5秒間のアニーリング及びDNA伸長反応からなるPCR反応を、45サイクル繰り返した。
ヒトインフルエンザウイルスA/California/07/2009(H1N1)由来RNAの増幅と同様の工程を実施した。
以下にプライマー及びプローブの配列を記載する。なお、配列番号3及び6のTaqMan Probeは、サーモフィッシャーサイエンティフィック社にTaqMan MGBプローブ合成を委託し、該TaqMan Probeを得た。配列番号3及び配列番号6中の「Q」は「クエンチャー」を意味する。より詳細には、該クエンチャーはTm EnhancerであるMGB(Minor Groove Binder)構造とNon Fluorescent Quencherとを有する。 該クエンチャーの配列情報はサーモフィッシャーサイエンティフィック社の秘密情報であるため非開示であるが、当業者において、プローブ合成を合成業者に委託し該TaqMan MGBプローブを得ることは通常の手法である。その他の配列番号のプライマーは、ユーロフィンジェノミックス社に合成を委託し、該プライマーを得た。
配列番号1
Forward Primer
5'-CAGTACCAATGAACTGGCGACA-3'
Reverse Primer
5'-AGCTGGAATCAACAAGGATTTACC-3'
TaqMan Probe
5'-FAM- TGAATAGATCGCCAAAAT-Q-3'
配列番号4
Forward Primer
5'-AACACAAATTGAGGTGGGTC-3'
Reverse Primer
5'-CTTTCATAGCACTCYAGAATTCCTGC-3'
TaqMan Probe
5'-FAM-CAACCAATGCCACCATAAA-Q-3'
以下のサンプル処理工程以外は、実施例1と同様に行った。
<サンプルの処理>
ヒトインフルエンザウイルスA/California/07/2009(H1N1)培養上清1μLを、以下の様々な界面活性剤を含む試薬(PBSベース)100μLに添加し、混合後、室温で5分間放置した。
非イオン性界面活性剤として、0.5%エマルゲン120、0.5%エマルゲン430(花王社)、70mM MEGA8、30mM MEGA9(同仁化学研究所社)、陽イオン性界面活性剤として、0.5%コータミン86Pコンク(花王社)、陰イオン性界面活性剤として、0.5%コール酸ナトリウム(和光純薬社)、両性界面活性剤として、0.5%アンヒトール20BS、0.5%アンヒトール20N(花王社)、10mM CHAPS、10mM CHAPSO(同仁化学研究所社)を、PBSに添加して、ウイルスを処理した。
本例では、ヒト由来細胞株がアポトーシスを起こして放出されたDNAを含む培養液に、特異抗体を固定させた不溶性担体を接触させることで、ヒトDNAを濃縮及び回収した。
<ヒト由来細胞株>
ヒト由来細胞株は、EGFR遺伝子T790M変異を持つ非小細胞肺がん患者由来のNCI-H1975(ATCCより分譲、CRL-5908(商標))を用いた。培養は、先ず10%FCS(Fetal Calf Serum、牛胎児血清、fetal bovine serumともいう。)を含む無血清培地(RPMI1640)を用いて、37℃、5%CO2の条件で、培養細胞が培養フラスコの底に80%程度のコンフルエントになるまで培養後、EDTAを含むトリプシンで細胞を剥がした。
回収した細胞1×107個を、無血清培地(RPMI1640)10mLに懸濁し、そのまま37℃、5%CO2の条件で5日間静置した。その後、培養上清を遠心分離し、DNA濃縮用の培養液を得た。
DynaBeads Protein G(粒子径2.8μm、30mg/mL;ライフテクノロジーズ社;DynaBeads(登録商標) Protein G Immunoprecipitation Kit 製品番号:10007D)の磁性粒子懸濁液30μLを分取して磁石で粒子を集めた後に上清を取り除き、Histone H4 Polyclonal Antibody(16047-1-AP;proteintech社)を、20μg含む200μLのPBST(0.02%Tween20含むPBS)を加え、室温で30分撹拌し抗体を粒子に結合(固定化)させた。該抗体結合磁性粒子をPBSTで洗浄後、抗原抗体反応に使用した。
上記培養液200μLを、該抗体結合磁性粒子と混合し、室温で10分間転倒混和により抗原抗体反応を行った。抗体による特異的な捕捉かどうか、言い換えると非特異結合か否か、を確認する為、抗体を結合させていない磁性粒子(抗体未結合磁性粒子)を用いて、同様の操作を行った。
磁性粒子を磁石で集めて上清を除いた後、市販の核酸精製キット(QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit:QIAGEN社)の手順に従って、磁性粒子に吸着しているccfDNAを精製し、最終的にNuclease-Free Water 50μLでDNAを溶出した。このようにして、DNA検体を得た。
該抗体結合磁性粒子で捕捉したDNA中のEGFR遺伝子T790M変異検出は、以下の試薬を含む25μLの反応溶液を調製し、CFX96(バイオラッド社)にて2ステップのアレル特異的-PCRによる解析を行った。
98℃で30秒間熱変性した後、98℃で10秒間熱変性と60℃で30秒間アニーリング及びDNA伸長反応からなるPCR反応を、40サイクル繰り返した。
以下にプライマーの配列を記載する。配列番号7及び8のプライマーは、ユーロフィンジェノミックス社に合成を委託し、該プライマーを得た。
Forward Primer
5'- CCGTGCATCTCATCTTG-3'
Reverse Primer
5'- CTTTGTGTTCCCGGACATAGTC-3'
Claims (22)
- 核酸を濃縮する方法であって、下記工程(a)〜(c)が含まれる方法:
(a)ヌクレオカプシド蛋白質と核酸とが結合した蛋白質-核酸複合体を含む試料を提供する工程、ここで、前記蛋白質-核酸複合体は、当該ヌクレオカプシド蛋白質と当該核酸との間の水素結合によって形成されている、又は、当該ヌクレオカプシド蛋白質と当該核酸との間に共有結合を有しない;
(b)前記試料と、前記ヌクレオカプシド蛋白質に特異的に反応する抗体と、前記抗体を吸着しうる担体と、を接触させる工程;及び
(c)前記担体を前記試料から回収し、前記担体上に、濃縮された核酸を得る工程。 - (d)前記担体から前記濃縮された核酸を分離する工程を更に含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)において、前記担体として、前記抗体が前記担体に担持された抗体担持担体を接触させる、請求項1又は2に記載の方法。
- 工程(d)において、前記抗体担持担体に免疫反応により吸着させた前記蛋白質-核酸複合体から核酸が脱着される、請求項3に記載の方法。
- 工程(b)において、前記抗体と前記蛋白質-核酸複合体とが結合した抗体-蛋白質-核酸複合体が形成される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(d)において、前記担体に物理吸着により吸着させた前記抗体-蛋白質-核酸複合体から核酸が脱着される、請求項5に記載の方法。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法であって、
工程(a)の前、工程(a)において、又は工程(a)と工程(b)の間に、さらに下記工程(a')が含まれる方法:
(a')前記蛋白質-核酸複合体を含む試料に、界面活性剤を添加する工程。 - 前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、から選ばれる1以上である、請求項7に記載の方法。
- 前記試料が生体試料、及び、病原微生物又はウイルスを含む試料、から選ばれる1以上である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生体試料が、動物細胞である、請求項9に記載の方法。
- 前記生体試料が、血液、血漿、血清、尿、糞便、胆汁、膵液、鼻汁、鼻腔・咽頭拭い液から選ばれる1以上である、請求項10に記載の方法。
- 前記病原微生物又はウイルスを含む試料が、病原微生物又はウイルスの培養物である、請求項9に記載の方法。
- 前記ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項9に記載の方法。
- 前記核酸が、メッセンジャーRNA (mRNA)を除く核酸である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記蛋白質-核酸複合体は、当該タンパク質と当該核酸との間の水素結合によって形成されている、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記蛋白質-核酸複合体は、当該タンパク質と当該核酸との間の水素結合のみによって形成されている、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記蛋白質-核酸複合体は、当該タンパク質と当該核酸との間に共有結合を有しない、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(d)において、前記蛋白質-核酸複合体を蛋白質分解酵素により処理する工程を含まない、請求項2〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記蛋白質-核酸複合体を蛋白質分解酵素により処理する工程を含まない、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 0.0分以上、1.0分以上、2.0分以上、5.0分以上、10分以上、又は20分以上のソニケーション工程を含まない、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 0%以上、0.01%以上、0.02%以上、0.05%以上、0.1%以上、0.2%以上、0.5%以上、1.0%以上、2.0%以上、又は5.0%以上のホルムアルデヒドを使用しない、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 0単位以上、0.01単位以上、0.02単位以上、0.05単位以上、0.1単位以上、0.2単位以上、0.5単位以上、1.0単位以上、2.0単位以上、又は5.0単位以上のリボヌクレアーゼ(RNase) を使用しない、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
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