CN107922912B - 抗原特异性单克隆抗体制作方法 - Google Patents

抗原特异性单克隆抗体制作方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及具有靶抗原特异性单克隆抗体产生能力的细胞的分离方法，将包含抗体产生细胞的细胞群利用交联剂进行固定化处理(交联剂是具有细胞膜透过性的可逆交联剂)，将固定化处理后的细胞群利用表面活性剂进行细胞膜溶解处理，使该细胞群与标记靶抗原反应，在染色后的细胞群中分离出与标记靶抗原发生了反应的至少1个细胞。本发明还涉及靶抗原特异性单克隆抗体的制作方法，从利用该方法分离出的细胞中分离mRNA，制备cDNA，由制备出的cDNA制备抗原特异性单克隆抗体或其片段。本发明提供能够高精度地分离出具有靶抗原特异性单克隆抗体产生能力的至少1个细胞的方法以及能够使用由该方法分离出的细胞制作靶抗原特异性单克隆抗体的方法。本发明提供新型苏氨酸18磷酸化p53(pT18‑p53)特异性单克隆抗体和苏氨酸68磷酸化CHK2(pT68‑CHK2)特异性单克隆抗体。

Description

抗原特异性单克隆抗体制作方法
【技术领域】
本发明涉及具有靶抗原特异性单克隆抗体产生能力的细胞的分离方法和使用由该方法分离出的细胞的靶抗原特异性单克隆抗体的制作方法。
关联申请的相互参考
本申请要求2015年8月10日提交的日本专利申请2015-157859号的优先权，其全部记载作为公开内容特别援引于本文中。
【背景技术】
抗体是生物体防御的核心分子，在研究、诊断中一直被用作重要的工具。此外，近年来，将抗体用作药品的抗体药物作为新型的治疗药取得了显著的治疗效果。为了更快速更确实地获得能够用作药品等的新型抗体，有必要通过新技术的导入确立制作基础。
作为抗体医药的靶点的人蛋白质的功能性抗原表位大多数对小鼠的抗原性低。因此，这样的抗原即使被小鼠摄取，也不能引起充分的免疫反应，使用小鼠不容易获得针对这样的具有抗原性低的抗原表位的抗原的抗体。因此，要求开发出可由对人抗原显示出高免疫原性的小鼠以外的动物高效地获得抗体的技术。
另外，为了使用基因工程方法由免疫动物获得重组单克隆抗体，使用分离出单一的抗原特异性浆细胞的方法。作为用于分离出单一的抗原特异性浆细胞的方法，提出了利用由单一的浆细胞分泌的抗体的方法、利用在单一的浆细胞表面表达的抗体的方法。
在专利文献1中公开了浆细胞鉴定和分离用荧光探针以及使用了该探针的浆细胞的鉴定或分离方法。此外，在专利文献2中公开了由使用该方法分离出的浆细胞制造靶抗原特异性抗体的方法。
在非专利文献1中公开了利用单一细胞RT-PCR和表达载体克隆从单一人B细胞中有效地产生单克隆抗体(Efficient generation of monoclonal antibodies fromsingle human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning)的技术。
在非专利文献2中公开了从单一的人B细胞进行老鼠Ig基因的克隆和表达(Cloning and expression of murine IgGenes from single B cells)的技术。
在非专利文献3中公开了使用芯片系免疫斑点阵列迅速分离抗原特异性抗体分泌细胞(Rapid isolation of antigen-specific antibody-secreting cells using achip-based immunospot array)的技术。
专利文献1：WO2011/118579(PCT/JP2011/56831)
专利文献2：WO2012/133572(PCT/JP2012/058216)
非专利文献1：Thomas Tiller等，Journal of Immunological Methods 329(2008)112-124
非专利文献2：Thomas Tiller等，Journal of Immunological Methods 350(2009)183-193
非专利文献3：Jin A等，Nat Protoc.(2011)6(5)668-76.
非专利文献4：Kurosaw等，BMC Biol.(2012)10:80
非专利文献5：Isolation of full-size mRNA from cells sorted by flowcytometry(J Biochem Biophys Methods,1999)
非专利文献6：MARIS:Method for Analyzing RNAfollowing IntracellularSorting(PLOS one,2014)
专利文献1和2以及非专利文献1～6的全部记载作为公开内容特别援引于本文中。
【发明内容】
专利文献1中记载的方法是能够从各种动物中分离出浆细胞的方法。但是，本发明人研究的结果是，其难以高精度地分离出浆细胞中存在的抗原特异性浆细胞。因此，即使是利用该方法的专利文献2中记载的方法，也无法高效地制备靶抗原特异性抗体。
非专利文献1和2中记载的方法是使用了重组DNA技术的小鼠/人单克隆抗体制作方法。但是，该方法不能应用于小鼠和人以外的动物种。此外，该方法还存在无法筛选出抗原特异性克隆的问题。
非专利文献3中记载的方法是能够在小鼠、人中筛选出抗原特异性克隆的方法。但是，需要制作用于抗原特异性克隆的筛选的复杂装置，作为预处理，需要进行浆细胞的浓缩。
非专利文献4中记载的方法是能够从各种动物中筛选出抗原特异性克隆的方法。但是，由单一的细胞分泌的抗体和在膜上表达的抗体量是极微量的。因此，利用了通过标记抗原与这些抗体分子结合而得到的信号的抗原特异性浆细胞的分离方法在精度和灵敏度方面都还存在很多问题。因此，还具有在细胞群中的抗原特异性浆细胞的含量为0.01％以下的情况下无法筛选出高精度的抗原特异性克隆的问题。
因此，本发明的目的在于提供能够在不使用复杂方法的情况下由各种动物高精度地分离出具有靶抗原特异性单克隆抗体产生能力的至少1个细胞的方法；以及使用由该方法分离出的至少1个细胞，能够在不使用复杂方法的情况下由各种动物高精度地制作出靶抗原特异性单克隆抗体的方法。此外，本发明的目的还在于获得新型靶抗原特异性单克隆抗体。
【用于解决课题的手段】
已知在抗体产生细胞的细胞质中蓄积有与在膜上表达的抗体相比为1000倍以上的抗体(非专利文献4)。本发明人关注到这一点，并且推测出，在通过标记抗原与上述细胞质内的抗体结合而得到信号的情况下，所得到的信号与通过标记抗原与膜型抗体结合而得到的信号相比非常强。但是，实际上，为了使抗原作用于细胞质内所存在的抗体，推测需要进行例如使用交联剂的蛋白质的固定化、使用表面活性剂的膜透过处理等预处理。但是，推测这样的预处理非常可能引起细胞质内的蛋白质与mRNA的分子间交联、基于核酸酶的RNA分解。因此，由进行了使用交联剂的固定化和使用表面活性剂的膜透过以及使用标记抗原的染色的单一细胞进行mRNA提取、进而由提取的mRNA进行250bp以上长度的基因片段的扩增一直被认为是非常困难的(非专利文献5和6)。
在这样的状况下，本发明人为了突破上述非常困难的情况进行了各种研究。其中开发出了下述新方法，从而完成了本发明，在该方法中，由进行了使用可逆性交联剂的细胞固定、膜透过处理、使用标记抗原的染色的细胞群中鉴定、分离出抗原特异性浆细胞，由该细胞克隆出免疫球蛋白可变区基因，由此制作抗原特异性单克隆抗体。
本发明如下所述。
[1]一种具有靶抗原特异性单克隆抗体产生能力的细胞的分离方法，其包括下述步骤：
(1)将包含抗体产生细胞的细胞群利用交联剂进行固定化处理的步骤(固定化步骤)，其中，上述交联剂是具有细胞膜透过性的可逆交联剂；
(2)将固定化处理后的细胞群利用表面活性剂进行处理的步骤(细胞膜溶解步骤)；
(3)使进行了细胞膜溶解处理的细胞群与标记的靶抗原(以下称为标记靶抗原)进行反应的步骤(染色步骤)；
(其中，细胞膜溶解步骤(2)和染色步骤(3)可以依次实施、也可以并行地实施。)
(4)在经历了染色步骤的细胞群中分离出与标记靶抗原发生了反应的至少1个细胞的步骤(细胞分离步骤)。
[2]如[1]所述的方法，其中，上述交联剂为福尔马林或在间隔链中具有S-S键的二价交联剂。
[3]如[1]或[2]所述的方法，其中，上述表面活性剂为选自由非离子性表面活性剂、两性表面活性剂和离子性表面活性剂组成的组中的至少一种表面活性剂。
[4]如[1]或[2]所述的方法，其中，上述表面活性剂为非离子性表面活性剂。
[5]如[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，步骤(1)～(4)中的至少1个步骤在核糖核酸酶抑制剂的存在下实施。
[6]一种靶抗原特异性单克隆抗体的制作方法，其包括下述步骤：
(5)从利用[1]～[5]中任一项所述的方法分离出的至少1个细胞中分离mRNA、制备cDNA的步骤(cDNA制备步骤)；
(6)由通过cDNA制备步骤制备出的cDNA制备抗原特异性单克隆抗体或其片段的步骤(靶抗原特异性单克隆抗体制备步骤)。
[7]如[6]所述的方法，其中，至少步骤(5)在核糖核酸酶抑制剂的存在下实施。
[8]如[6]或[7]所述的方法，其中，上述mRNA的分离由所分离出的10个以下的抗体产生细胞进行。
[9]如[6]～[8]中任一项所述的方法，其中，在步骤(5)的cDNA制备中，作为cDNA合成中使用的第2次PCR的正义引物，使用具有目的免疫球蛋白的起始密码子周边的序列的引物。
[10]如[6]～[9]中任一项所述的方法，其中，步骤(5)中的mRNA分离包括对分离出的细胞进行脱交联处理。
[11]如[10]所述的方法，其中，在交联剂为福尔马林的情况下，上述脱交联处理为热处理。
[12]如[11]所述的方法，其中，上述热处理在蛋白酶的共存下进行，得到抗体基因的可变区基因片段。
[13]如[10]所述的方法，其中，在交联剂为在间隔链中具有S-S键的二价交联剂的情况下，上述脱交联处理为还原处理。
[14]一种苏氨酸18磷酸化p53(pT18-p53)特异性单克隆抗体，其具有下述γ链或κ链，该γ链具有由序列编号9表示的氨基酸序列作为可变区，该κ链具有由序列编号10表示的氨基酸序列作为可变区。
[15]一种苏氨酸18磷酸化p53(pT18-p53)特异性单克隆抗体，其包含下述γ链和κ链，该γ链具有分别具有由序列编号3～5表示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，该κ链具有分别具有由序列编号6～8表示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
[16]一种苏氨酸68磷酸化CHK2(pT68-CHK2)特异性单克隆抗体，其具有下述γ链或κ链，该γ链具有由序列编号17表示的氨基酸序列作为可变区，该κ链具有由列编号18表示的氨基酸序列作为可变区。
[17]一种苏氨酸68磷酸化CHK2(pT68-CHK2)特异性单克隆抗体，其包含下述γ链和κ链，该γ链具有分别具有由序列编号11～13表示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，该γ链具有分别具有由序列编号14～16表示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
根据本发明，能够在不受免疫所使用的动物种类的限制且不使用复杂方法的情况下高精度地分离出具有靶抗原特异性单克隆抗体产生能力的至少1个细胞(以下有时将分离出至少1个细胞表述为分离出细胞)，可提供能够通过使用此处分离出的细胞制作靶抗原特异性单克隆抗体的方法。其结果，本发明为利用现有技术难以制作的针对靶分子的抗体药品/诊断药的开发提供了新的可能性。根据本发明，可提供新型的苏氨酸18磷酸化p53(pT18-p53)特异性单克隆抗体和苏氨酸68磷酸化CHK2(pT68-CHK2)特异性单克隆抗体。
【附图说明】
图1A示出实施例1的(A)的荧光显微镜照片。
图1B示出实施例1的(B)的电泳图像。
图1C示出实施例1的(C)的FACS法的结果。
图1D示出实施例1的(D)的电泳图像。
图1E示出实施例1的(E)的扩增成功率。
图2A示出实施例2的(A)的FACS法的结果。
图2B示出实施例2的(B)的FACS法的结果。
图2C示出实施例2的(C)的电泳图像。
图2D示出实施例2的(D)的扩增成功率。
图3A示出实施例3的(A)的荧光显微镜照片。
图3B示出实施例3的(B)的FACS法的结果。
图3C示出实施例3的(C)的电泳图像。
图3D示出实施例3的(D)的利用ELISA法的特异性分析结果。
图3E示出比较例1的(A)的FACS法的结果。
图3F示出比较例1的(B)的电泳图像。
图3G示出比较例1的(C)的利用ELISA法的特异性分析结果。
图3H示出实施例3的(E)的免疫染色后的荧光显微镜照片。
图3I示出实施例3的(E)的免疫染色后的荧光显微镜照片。
图3J示出实施例3的(E)的蛋白质印迹法的结果。
图3K示出实施例3的(E)的蛋白质印迹法的结果。
图3L示出实施例3的(F)表面等离子共振SPR测定的结果。
图4A示出实施例4的(A)的FACS法的结果。
图4B示出实施例4的(B)的利用ELISA法的特异性分析结果。
图4C示出实施例4的(C)的荧光显微镜照片。
图4D示出实施例4的(D)的荧光显微镜照片。
图4E示出实施例4的(E)的表面等离子共振SPR测定的结果。
【具体实施方式】
本发明的具有靶抗原特异性单克隆抗体产生能力的细胞的分离方法包括下述(1)～(4)的步骤。
(1)将包含抗体产生细胞的细胞群利用交联剂进行固定化处理的步骤(固定化步骤)，其中，上述交联剂是具有细胞膜透过性的可逆交联剂；
(2)将固定化处理后的细胞群利用表面活性剂进行处理的步骤(细胞膜溶解步骤)；
(3)使进行了细胞膜溶解处理的细胞群与标记的靶抗原(以下称为标记靶抗原)进行反应的步骤(染色步骤)；
(其中，细胞膜溶解步骤(2)和染色步骤(3)可以依次实施、也可以并行地实施。)
(4)在经历了染色步骤的细胞群中分离出与标记靶抗原发生了反应的至少1个细胞的步骤(细胞分离步骤)。
此外，本发明的靶抗原特异性单克隆抗体的制作方法包括下述(5)和(6)。
(5)从利用上述本发明的细胞分离方法分离出的至少1个细胞中提取mRNA、制备cDNA的步骤(cDNA制备步骤)；
(6)由通过cDNA制备步骤制备出的cDNA制备抗原特异性单克隆抗体或其片段的步骤(靶抗原特异性单克隆抗体制备步骤)。
<靶抗原特异性单克隆抗体产生细胞的分离方法>
(1)固定化步骤
在固定化步骤中，利用交联剂对包含抗体产生细胞的细胞群进行固定化处理。该固定化处理是用于对抗体产生细胞中的抗体(例如IgG、IgA、IgM、IgD、IgE、IgY)和该抗体的mRNA进行固定化的处理。包括细胞的生物体的固定化已知有各种方法。在本发明中，通过对抗体产生细胞中的抗体及其mRNA进行固定化，在下一步骤的表面活性剂处理步骤中，抑制细胞中的抗体及其mRNA随着细胞膜的溶解而溶出。细胞中的抗体用于后段的使用标记靶抗原的抗体产生细胞的鉴定。因此，优选细胞中的抗体通过固定化在细胞膜溶解后仍能够留在细胞中，并优选固定化的抗体以能够与标记靶抗原反应的状态被固定化。另外，在细胞膜溶解后固定化于细胞内的抗体的mRNA在后续步骤中用于cDNA合成。优选：按照在cDNA合成前对固定化的抗体的mRNA进行脱固定化、固定化的抗体的mRNA通过脱固定化而成为可用于cDNA合成的状态的方式进行固定化；存在可对固定化的抗体的mRNA进行脱固定化的方法；优选能够容易地进行脱固定化。满足这样的条件的固定化处理为使用福尔马林或在间隔链中具有S-S键的二价交联剂的方法。详细内容在下文中叙述。
包含抗体产生细胞的细胞群可以通过用靶抗原对动物进行免疫并由免疫动物采集来得到。用靶抗原对动物进行免疫并由免疫动物采集包含抗体产生细胞的细胞群的方法分为以非人动物(Non-Human Animal)为对象的方法(以下称为NHA法)和以人(Human)为对象的方法(以下称为HU法)这两种方法。以非人动物为对象的NHA法包括：从非人动物采集来自淋巴液、淋巴组织、血细胞试样或骨髓的细胞，将所采集的来自淋巴液、淋巴组织、血细胞试样或骨髓的细胞在体外(in vitro)用靶抗原致敏；或者用靶抗原对非人动物进行免疫，从免疫建立后的动物中采集来自淋巴液、淋巴组织、血细胞试样或骨髓的细胞。利用NHA法能够采集包含与靶抗原特异性结合的非人动物的抗体产生细胞的细胞群。
以人为对象的HU法包括：由人采集来自淋巴液、淋巴组织、血细胞试样或骨髓的细胞，将所采集的来自淋巴液、淋巴组织、血细胞试样或骨髓的细胞在体外(in vitro)用靶抗原致敏；或者从具有针对靶抗原的抗体的人采集来自淋巴液、淋巴组织、血细胞试样或骨髓的细胞。利用HU法能够采集包含与靶抗原特异性结合的人的抗体产生细胞的细胞群。
<用靶抗原对非人动物进行的免疫>
以下对NHA法进行说明。
用靶抗原对非人动物进行免疫。本发明中，“非人动物”是指人以外的具有免疫系统的所有动物。作为这样的动物的示例，可以举出哺乳动物、鸟类等。作为哺乳动物的示例，可以举出类人猿、猴、狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、驴、骆驼、大羊驼、羊驼、驯鹿、水牛、牦牛、豚鼠、兔、水貂、小鼠、大鼠、沙鼠、仓鼠、叙利亚仓鼠、亚美尼亚仓鼠、雪貂、迷你猪、浣熊、负鼠、臭鼩、袋鼠、海豚等。作为鸟类，可以举出鸡、鹌鹑或鸵鸟等。
本发明中，“靶抗原”是指病毒、支原体、细菌、霉菌等微生物、贝类等冠轮动物、昆虫或甲壳类等蜕皮动物、脊椎动物等后口动物以及它们的构成物质、蛋白质、糖、脂质、复合糖质、核酸、天然低分子有机化合物、天然高分子有机化合物、人工低分子有机化合物、人工高分子有机化合物、金属络合物等。但是，并没有对靶抗原的种类进行限定的意图，这些只不过是例示。
非人动物的免疫所使用的靶抗原可以直接使用靶抗原，也可以将包含靶抗原的生物等直接、或者以死亡状态或其提取液的形式使用，或者还可以结合或混合适当的载体来使用。
从非人动物中采集来自淋巴液、淋巴组织、血细胞试样或骨髓的细胞，将所采集的来自淋巴液、淋巴组织、血细胞试样或骨髓的细胞在体外(in vitro)用靶抗原致敏。在体外(in vitro)用靶抗原对淋巴液等进行的致敏可以如下实施。从非人动物中采集作为抗原提呈细胞的树突细胞、T细胞、B细胞。接着，在试管中使抗原作用于树突细胞而被吞噬/消化，制作出具备抗原提呈能力的成熟树突细胞。向其中加入T细胞以及B细胞和白细胞介素2等细胞因子、poly(dI-dC)等免疫刺激剂，使得对抗原产生应答的B细胞在试管内增殖/分化，最终得到包含抗体产生细胞的细胞群。
本发明中，“用靶抗原对非人动物进行免疫”是指，使靶抗原与非人动物接触，在非人动物中表达针对靶抗原的免疫。针对靶抗原的免疫的表达方法没有特别限制，例如，可以通过将靶抗原给药或移植到非人动物中而对非人动物进行免疫。对于靶抗原的给药方法、移植方法也没有特别限制，作为给药方法，例如可以举出经气道给药、口服给药、皮下注射、静脉注射、肌肉注射、或者通过对非人动物的基因导入而使抗原在动物体内表达的方法等。或者，也可以通过使靶抗原与非人动物的皮肤接触而对非人动物进行免疫。
用靶抗原对非人动物进行的免疫进行至靶抗原所致的免疫在非人动物中建立为止。因此，使靶抗原与非人动物接触，直至靶抗原所致的免疫建立为止。靶抗原与非人动物接触的频率、期间、一次接触所使用的靶抗原的量可以根据免疫建立的容易度适当地确定。在非人动物中靶抗原所致的免疫是否已建立这一点可利用常规方法、例如从非人动物中采集血液并利用ELISA法对血清中所含有的抗体进行测定来确认。
<从免疫建立后的动物中的淋巴结等的采集>
从免疫建立后的动物中采集来自淋巴液、淋巴组织、血细胞试样或骨髓的细胞。本方法的目的是采集包含与靶抗原特异性结合的非人动物的抗体产生细胞的细胞群，因此，采集含有包含抗体产生细胞的细胞群的可能性高的来自淋巴液、淋巴组织、血细胞试样或骨髓的细胞。
淋巴液、淋巴组织、血细胞试样或骨髓例如可如下制备。向皮下、肌肉或足底注射抗原，经过约1个月以上后，以外科方式从非人动物中取出肿胀的淋巴液、淋巴组织。在立体显微镜下去除淋巴结所附带的组织后，用镊子破坏淋巴结的被膜，由此使淋巴结内部的细胞分散在PBS溶液(10mM磷酸盐缓冲液、120mM NaCl、2.7mM KCl、pH 7.6)中。血细胞试样使用将通过从免疫动物中进行肝素采血而得到的血液利用密度梯度离心法进行分离而得到的单核细胞。骨髓使用将从免疫动物中取出的股骨的两骨末端切断，使PBS溶液从插入在一个骨末端的注射针流入到骨髓中，由此从另一骨末端流出的骨髓细胞。如此能够采集包含抗体产生细胞的细胞群。
<利用交联剂进行的细胞固定化处理>
如上所述，将包含抗体产生细胞的细胞群利用作为交联剂的福尔马林或在间隔链中具有S-S键的二价交联剂进行处理，至少将抗体产生细胞中的抗体及其mRNA固定化。在为了将细胞中的抗体和mRNA固定化而对细胞进行例如使用戊二醛之类的交联剂的用于蛋白质的固定化的预处理时，构成细胞的蛋白质被固定化。但是，由于戊二醛为不可逆交联剂，因而细胞中的抗体和mRNA会发生变性。与之相对，本发明中使用的交联剂为具有细胞膜透过性的可逆交联剂(以下有时称为可逆性交联剂)。使用具有可逆性的交联剂，使得通过具有细胞膜透过性而能够将细胞中的抗体和mRNA固定化于细胞内，并且在作为后续步骤的由mRNA制备cDNA的阶段中使mRNA脱交联从而能够进行cDNA制备。作为这样的可逆性交联剂的示例，可以举出福尔马林、在间隔链中具有S-S键的二价交联剂等。作为在间隔链中具有S-S键的二价交联剂，例如可以举出二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(Dithiobis[succinimidyl propionate](DSP))等。
对所采集的包含抗体产生细胞的细胞群进行使用可逆性交联剂的处理时，细胞中的抗体及其mRNA以实质上不变性的状态(能够脱交联的状态)在细胞中被固定化。抗体以与标记靶抗原具有反应性的状态被固定化，抗体的mRNA能够在后续步骤中脱交联而用于cDNA的合成。固定化的程度根据可逆性交联剂的种类和浓度以及处理温度和时间而变化。通过根据所使用的抗体产生细胞的种类来改变可逆性交联剂的种类和浓度以及处理温度和时间，能够得到最佳的固定化状态。固定化例如可以设定为将所采集的包含抗体产生细胞的细胞群在例如0℃～30℃、优选0℃～10℃范围的温度下在包含1％～10％的可逆性交联剂的磷酸缓冲生理盐水(PBS)等水溶液中浸渍1分钟～60分钟(将所采集的包含抗体产生细胞的细胞群分散在含有可逆性交联剂的水溶液中)的条件。利用该条件，能够将抗体及其mRNA以良好的状态(实质上不变性的状态)进行固定化。如此得到的进行了固定化处理的细胞群优选通过离心等从溶液中分离，供于接下来的步骤。
(2)细胞膜溶解步骤
在细胞膜溶解步骤中，对于通过固定化步骤进行了处理的细胞群实施在细胞膜上开孔的溶解处理。具体而言，将通过固定化步骤进行了固定化处理的细胞群与含有表面活性剂的溶液混合。通过与含有表面活性剂的溶液混合，将细胞的细胞膜溶解，在细胞膜上开孔。该孔在接下来的步骤中使得标记靶抗原容易侵入到细胞内，并且在之后的步骤中使得从mRNA向cDNA的合成中的细胞内外的物质移动变得容易。该步骤中的细胞膜溶解只要在细胞膜上形成适于上述目的的孔即可，并且为能够提供下述状态的处理是适当的：尽管进行了细胞膜溶解，但维持了能够耐受之后的细胞鉴定和分离操作的程度的强度。因此，在本发明中使用表面活性剂。另外，表面活性剂的种类和浓度可以考虑上述目的适当地选择。
表面活性剂可以为选自由非离子性表面活性剂、两性表面活性剂和离子性表面活性剂组成的组中的至少一种表面活性剂。
作为非离子性表面活性剂，例如可以举出聚氧乙烯烷基醚系(Triton属于其中)、脂肪酸山梨糖醇酐酯系(Tween属于其中)、烷基聚葡糖苷系、脂肪酸二乙醇酰胺系、烷基单甘油醚系等。聚氧乙烯烷基醚系非离子性表面活性剂的具体例例如为Triton X-100(辛基苯酚聚(乙二醇醚)n，n约为10，HLB13.4～13.5)。脂肪酸山梨糖醇酐酯系非离子性表面活性剂的具体例例如为Tween 20(Polysorbate 20、单月桂酸聚氧乙烯山梨糖醇酐，HLB16.7)。Tween 20为聚山梨醇酯类的一种，聚山梨醇酯类是在山梨糖醇酐脂肪酸酯上缩合约20分子的环氧乙烷而成的。除了Tween20以外，还可以举出Tween40(Polysorbate 40，单棕榈酸聚氧乙烯山梨糖醇酐，HLB15.6)、Tween60(Polysorbate 60，单硬脂酸聚氧乙烯山梨糖醇酐，HLB14.9)、Tween65(Polysorbate 65，三硬脂酸聚氧乙烯山梨糖醇酐，HLB10.5)、Tween80(Polysorbate 80，油酸聚氧乙烯山梨糖醇酐，HLB15.0)、正十二烷基β-D-麦芽糖苷、洋地黄皂苷、皂角苷等。
作为两性表面活性剂，例如还可以举出CHAPS、3-(N,N-二甲基辛基铵基)丙烷磺酸、N-十二烷基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸、3-(N,N-二甲基十八烷基铵基)丙烷磺酸盐等。这些两性表面活性剂已知为不容易破坏蛋白质的立体结构的表面活性剂，与上述非离子性表面活性剂同样地能够用于膜的溶解。
作为离子性表面活性剂，可以使用选自由胆酸衍生物组成的组中的至少一种离子性表面活性剂。选自由胆酸衍生物组成的组中的至少一种离子性表面活性剂可以举出胆酸的碱金属盐(例如胆酸钠)等阴离子性表面活性剂、作为胆酸的衍生物(亚烷基羧基为修饰体)的异羟基洋地黄毒苷元等。这些离子性表面活性剂已知为不容易破坏蛋白质的立体结构的表面活性剂，与上述非离子性表面活性剂同样地能够用于膜的溶解。
根据表面活性剂的种类、细胞的种类、处理条件(温度和时间)的不同，表面活性剂的浓度可以设定为例如0.1％～5％的范围。在细胞膜上所开的孔的尺寸可以通过表面活性剂的种类和浓度、以及处理条件(温度和时间)而适当地控制。关于处理条件(温度和时间)，例如可以在0℃～30℃、优选在10℃～25℃范围的温度下在含有表面活性剂的溶液(例如磷酸缓冲水溶液等)中浸渍1分钟～60分钟。需要说明的是，如后所述，细胞膜溶解步骤可以在作为后续步骤的细胞群与标记靶抗原的反应步骤之前进行，也可以与细胞群与标记靶抗原的反应步骤并行地在相同的溶液内实施。
(3)染色步骤
在该步骤中，将在细胞膜溶解步骤中进行了溶解处理的细胞群与标记的靶抗原(标记靶抗原)混合，使细胞中的抗体与标记靶抗原反应。在并行地进行细胞膜溶解步骤与染色步骤的情况下，将通过固定化步骤得到的细胞群在相同的溶液内进行利用表面活性剂的处理以及与标记靶抗原的反应。
标记靶抗原中的靶抗原为包含与非人动物等的免疫中使用的靶抗原相同的表位的物质。因此，标记的靶抗原与免疫中使用的靶抗原可以是完全相同的物质，也可以是包含共同的表位的不同物质。
靶抗原的标记只要是能够确定与标记靶抗原反应的细胞且能够进行分离的标记，就可以没有特别限制地使用。作为这样的标记，例如可以举出荧光标记、磁珠标记等。对于荧光标记的种类没有特别限制。对靶抗原的标记操作可以根据所使用的标记的种类利用公知的方法适当实施。
通过细胞膜溶解步骤得到的细胞群与标记靶抗原的反应例如可以通过在磷酸缓冲生理盐水(PBS)等水溶液中使细胞群与标记靶抗原接触来实施。细胞群和标记靶抗原在水溶液中的浓度、温度、时间可以确认反应的进行来适当决定。关于处理条件(温度和时间)，例如可以在0℃～30℃、优选0℃～10℃范围的温度下在含有标记靶抗原的溶液(例如磷酸缓冲水溶液等)中浸渍1分钟～60分钟。
在对通过固定化处理得到的细胞群并行地进行细胞膜溶解处理以及与标记靶抗原的反应的情况下，例如在磷酸缓冲生理盐水(PBS)等水溶液中，在细胞膜溶解用的表面活性剂和标记靶抗原的共存下与上述细胞群接触。细胞群、表面活性剂和标记靶抗原在水溶液中的浓度、温度、时间可以确认反应的进行来适当决定。关于处理条件(温度和时间)，例如可以在0℃～30℃、优选0℃～10℃范围的温度下在含有表面活性剂和标记靶抗原的溶液(例如磷酸缓冲水溶液等)中浸渍1分钟～60分钟。
(4)细胞分离步骤
在步骤(4)中，将与标记靶抗原发生了反应的至少1个细胞分别以单一细胞的形式分离出来。首先，以标记靶抗原所具有的标记为记号来确定与标记靶抗原发生了反应的各个细胞，分别分离出所确定的单一细胞。
在本发明的方法中，在步骤(1)中，进行将细胞中的抗体及其mRNA固定化的处理，接下来，在步骤(2)中，利用表面活性剂来处理进行了固定化处理的细胞群，进行在细胞膜上开孔的处理。因此，产生针对靶抗原的抗体的细胞成为标记靶抗原容易经由细胞膜的孔侵入到细胞内的状态。标记靶抗原与被固定化且实施了细胞膜溶解处理的细胞内的抗体结合，能够确定标记靶抗原与细胞内的抗体进行了结合的细胞。对于标记靶抗原保留在细胞内的细胞而言，标记靶抗原与细胞内的抗体结合的可能性高，因此为抗体产生细胞的可能性高。
将以标记靶抗原所具有的标记为记号而确定的各个细胞分别以单一细胞的形式分离出来。所确定的各个抗体产生细胞的分离例如可以使用细胞分选仪来进行。利用细胞分选仪进行的单一的抗体产生细胞的分离可以使用公知的方法来实施。关于细胞的选择，可以将细胞以多个细胞的群体的方式选择、分离出来，但优选将细胞一个一个地分别选择、分离出来。此处所选择的细胞均是对靶抗原具有结合性的可能性高的细胞，但各细胞所具有的针对靶抗原的抗体不一定是相同的，可以预测到各抗体的抗原结合部位的氨基酸序列有所不同。因此，通过将细胞一个一个地分别选择、分离出来，并将各细胞一个一个地应用于后述的靶抗原特异性的抗体或抗体片段的制造方法，能够得到对同一靶抗原特异性结合的、不同的单克隆抗体。
<分离时的非特异性细胞的除去(选择)>
通过步骤(4)分离出的细胞为显示出与标记靶抗原的反应性的细胞的可能性高，因而为抗体产生细胞的可能性高。但是，实际上无法否定混入因非特异性染色(与标记靶抗原的反应)而被标记的细胞的可能性。因此，根据需要，也可以通过使用标记非靶抗原来除去(排除)非特异性染色细胞。例如，在实施例2中，通过在细胞染色液中加入作为非标记抗原的DsRed蛋白，将DsRed蛋白阳性细胞作为非特异性染色细胞而除外。另外，在实施例3中，通过在细胞染色液中加入非磷酸化肽，能够从非磷酸化肽阳性细胞中分离出磷酸化肽阳性细胞。
从抑制由细胞中取出的mRNA的分解、容易制备目的抗原特异性单克隆抗体或其片段的cDNA的方面考虑，优选上述步骤(1)～(4)中的至少1个步骤在核糖核酸酶抑制剂的存在下实施。作为核糖核酸酶抑制剂，例如可以举出DEPC(焦碳酸二乙酯，Diethylpyrocarbonate)、氧钒核糖核苷、针对核糖核酸酶A、核糖核酸酶B、核糖核酸酶C的抑制蛋白、抗核糖核酸酶抗体等。作为核糖核酸酶抑制剂的市售品，例如可以举出RNaseOUT(Life Technologies公司)、RNasin(R)(Promega公司)、核糖核酸酶抑制剂(来自猪肝脏)(Takara Bio公司)等。在核糖核酸酶抑制剂的存在下实施的步骤优选为上述步骤(1)～(4)的全部步骤，更具体而言，优选在各步骤中使用的含有细胞、抗体和抗原的各溶液中加入适量的核糖核酸酶抑制剂。核糖核酸酶抑制剂的适量可以根据核糖核酸酶抑制剂的种类、溶液的种类等适当确定。
另外，在步骤(3)中使用的标记靶抗原等材料也防止了核糖核酸酶的混入时，能够提高mRNA的回收率，更高效地制备出靶抗原特异性抗体。
<靶抗原特异性单克隆抗体的制作方法>
本发明的靶抗原特异性单克隆抗体的制作方法是包括由利用上述本发明的细胞分离方法得到的至少1个细胞经过下述(5)和(6)来制作靶抗原特异性单克隆抗体的方法。
(5)从利用上述本发明的细胞分离方法得到的至少1个细胞取出mRNA、制备cDNA的步骤(cDNA制备步骤)、
(6)由通过cDNA制备步骤制备的cDNA制备抗原特异性单克隆抗体或其片段的步骤。
利用该方法，能够制造对靶抗原显示出特异性结合性的抗体、或者对靶抗原显示出特异性结合性的抗体的片段(片段本身对靶抗原显示出特异性结合性)。
(5)cDNA制备步骤
在步骤(5)中，从利用上述本发明的细胞分离方法得到的至少1个细胞分离mRNA，由分离出的mRNA制备cDNA。
在mRNA的分离时，可以对通过步骤(1)被固定化的细胞中的mRNA进行脱固定化(脱交联)。脱固定化的方法可以根据步骤(1)中使用的可逆性交联剂的种类适当选择。在步骤(1)中使用的可逆性交联剂为福尔马林的情况下，可以通过对分离出的细胞进行加热来进行脱固定化，在加热时若使具有氨基的化合物共存，则脱固定化(脱交联)变得容易。作为具有氨基的化合物，例如可以举出三羟基甲基氨基甲烷、氨基酸、乙醇胺等。通过进行脱固定化，能够更高效地回收细胞中的mRNA，增加cDNA的回收量。热处理的条件可以考虑固定化的程度、具有氨基的化合物的种类和浓度以及mRNA的稳定性来适当选择。例如，可以通过在20℃～70℃下加热1分钟～120分钟来进行。脱固定化更优选通过在蛋白酶的共存下对分离出的细胞进行热处理来实施。热处理的条件和蛋白酶的用量可以考虑蛋白酶的种类和量、固定化的程度以及mRNA的稳定性来适当选择。例如，可以通过在40℃～60℃下加热1分钟～120分钟来进行。蛋白酶的用量可以设定为0.1μg/ml～100μg/ml的范围。蛋白酶例如为现有的蛋白酶即可，例如可以使用蛋白酶K等。通过在蛋白酶K的共存下进行加热处理，能够由分离出的细胞更高效地进行mRNA的脱固定化，得到抗体基因的可变区基因片段的比例增加。作为其结果，在后续步骤中，能够更高效地制备抗原特异性单克隆抗体。
在步骤(1)中使用的可逆性交联剂为二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)的情况下，可以通过利用β-巯基乙醇或硼氢化钠等还原剂对分离出的细胞进行处理来脱固定化。这种情况下，通过脱固定化，也能够更高效地回收细胞中的mRNA，增加cDNA的回收量。还原处理的条件可以考虑固定化的程度、还原剂的种类和浓度以及mRNA的稳定性来适当选择。例如，可以通过在20℃～70℃下加热1分钟～120分钟来进行。利用还原处理进行的脱固定化也可以合用利用蛋白酶的处理。
由至少1个细胞进行的mRNA的分离和cDNA的制备可以利用公知的方法来实施。例如，可以利用专利文献2或非专利文献4(Kurosawa等人的方法)中记载的方法来实施(专利文献2和非专利文献4的全部记载作为公开内容特别援引于本文中)。需要说明的是，从得到针对靶抗原的抗体的重链基因和轻链基因的方面考虑，mRNA的分离优选由分离出的1个抗体产生细胞进行。但是，mRNA的分离也可以由分离出的2个以上的抗体产生细胞进行，这种情况下，所分离出的mRNA为由各细胞得到的mRNA的混合物。例如，在由2个抗体产生细胞进行的情况下，重链基因和轻链基因各2对分别被克隆化。这种情况下，正确的重链基因和轻链基因的组合为50％，技术上能够达到正确的配对。但是，在由数目超过10个的抗体产生细胞采集的mRNA得到的重链基因和轻链基因的组合中，正确的组合的比例小于1％，虽然可能达到正确的组合，但效率降低。因此，mRNA的分离优选由分离出的10个以下的抗体产生细胞进行。
更具体而言，针对靶抗原的抗体mRNA的采集和由采集的mRNA制备cDNA的方法例如可以利用WO2009/091048(US2011/0020879A1(其全部记载作为公开内容特别援引于本文中)中记载的方法来进行。此外，所制备的cDNA可以根据需要进行克隆化。克隆化方法例如可以通过WO2009/110606、US2011/0117609A1(其全部记载作为公开内容特别援引于本文中)中记载的利用同源重组方法的克隆化方法来进行。此外，还可以进行所制备的cDNA的碱基序列的鉴定。cDNA的碱基序列的鉴定可以使用公知的DNA的碱基序列确定方法来实施。通过鉴定cDNA的碱基序列，能够对针对靶抗原的抗体基因进行鉴定。
但是，在本发明的方法中，cDNA合成中使用的第2次引物优选与上述公知的方法相比发生变更。在本发明的方法中，在至cDNA合成为止的步骤中，不可避免地产生mRNA的分解。因此，全长cDNA合成效率差，若进行通常的5’RACE PCR，则具有扩增出拖尾的条带的倾向(将作为实施例1的结果的图1E的10分钟的条带与未固定(unfixed)的条带比较。由10分钟的细胞扩增出的条带拖尾。作为实施例2的结果的图2C也是同样的)。
因此，在本发明中，为了仅扩增全长抗体基因，对于cDNA合成中使用的第2次引物，优选使用目的免疫球蛋白的起始密码子周边的序列作为第2次PCR的正义引物。例如，在实施例3(C)中，使用豚鼠免疫球蛋白的起始密码子周边的序列作为第2次PCR的正义引物。在免疫球蛋白的起始密码子周边的序列已知的情况下，可以由已知的信息或者进行高通量测序来获得在免疫动物(例如，在实施例3的情况下为豚鼠)中表达的免疫球蛋白基因的序列信息，基于所获得的序列信息进行制作。
(6)抗原特异性单克隆抗体制备步骤
在步骤(6)中，由通过cDNA制备步骤制备的cDNA制备抗原特异性单克隆抗体或其片段。由cDNA制备抗原特异性单克隆抗体或其片段可以利用公知的方法来实施。例如，可以使用利用WO2011/027808中记载的DNA片段的特异性制作方法制作出的抗体基因片段来进行(其全部记载作为公开内容特别援引于本文中)。另外，抗体或抗体片段的制备还可以参考专利文献2或非专利文献4(Kurosawa等人的方法)的记载。由本发明的方法得到的抗体为对靶抗原显示出特异性结合性的抗体，其片段为片段本身对靶抗原显示出特异性结合性的抗原结合性片段。作为抗原特异性抗体片段，例如可以举出Fab、F(ab’)2、Fab’、双体抗体(diabody)、单链抗体(例如scFv、dsFv)等。这些抗体片段在由通过步骤(5)克隆化得到的cDNA求出抗体基因的氨基酸序列和碱基序列的情况下，可以利用公知的方法适当制备。
从抑制由细胞取出的mRNA的分解、容易制备目的抗原特异性单克隆抗体或其片段的cDNA的方面考虑，上述步骤(5)优选在核糖核酸酶抑制剂的存在下实施。核糖核酸酶抑制剂的示例与上述步骤(1)～(4)是同样的。在核糖核酸酶抑制剂的存在下的实施优选在步骤(5)使用的各溶液中加入适量的核糖核酸酶抑制剂。核糖核酸酶抑制剂的适量可以根据核糖核酸酶抑制剂的种类、溶液的种类等适当确定。
本发明的(1)～(5)步骤中的至少一部分或全部可以在核糖核酸酶抑制剂的存在下进行的基础上，在核糖核酸酶活性抑制条件下进行；或者也可以在核糖核酸酶活性抑制条件下进行来代替核糖核酸酶抑制剂的使用。通过在这些条件下实施，能够提高mRNA的回收率，更高效地制备靶抗原特异性抗体。
核糖核酸酶活性抑制可以通过在例如冰中或冰上等冷却条件下实施实验操作来得到。
<靶抗原特异性单克隆抗体>
本发明包括苏氨酸18磷酸化p53(pT18-p53)特异性单克隆抗体。该单克隆抗体包括：具有下述γ链或κ链的苏氨酸18磷酸化p53(pT18-p53)特异性单克隆抗体，该γ链具有由序列编号9表示的氨基酸序列作为可变区，该κ链具有由序列编号10表示的氨基酸序列作为可变区；以及包含下述γ链和κ链的苏氨酸18磷酸化p53(pT18-p53)特异性单克隆抗体，该γ链具有分别具有由序列编号3～5表示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，该κ链具有分别具有由序列编号6～8表示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。任何一种抗体均可利用本发明的方法制备，在实施例3中有具体记载。
此外，本发明包括苏氨酸68磷酸化CHK2(pT68-CHK2)特异性单克隆抗体。该单克隆抗体包括：具有下述γ链或κ链的苏氨酸68磷酸化CHK2(pT68-CHK2)特异性单克隆抗体，该γ链具有由序列编号17表示的氨基酸序列作为可变区，该κ链具有由序列编号18表示的氨基酸序列作为可变区；以及包含下述γ链和κ链的苏氨酸68磷酸化CHK2(pT68-CHK2)特异性单克隆抗体，该γ链具有分别具有由序列编号11～13表示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，该κ链具有分别具有由序列编号14～16表示的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。任何一种抗体均可利用本发明的方法制备，在实施例4中有具体记载。
【实施例】
以下基于实施例更详细地说明本发明。但是，实施例为本发明的例示，并没有将本发明限定于实施例的意图。
实施例1
(A)使用2％多聚甲醛(PFA)、2％戊二醛(GA)、丙酮、乙醇或95％乙醇-5％乙酸，将附着于载玻片上的OKT10杂交瘤细胞在室温下进行10分钟固定(固定化)。
将细胞用含有0.1％TritonX-100的PBS(以下将含有0.1％TritonX-100的PBS记为PBST)进行清洗(细胞膜溶解)。
然后，利用Dylight594标记抗小鼠IgG抗体和Dylight488标记CD38进行染色(标记靶抗原反应)。
在多聚甲醛固定细胞中，观察到作为抗原的CD38与细胞内存在的抗体结合的状态。在利用其他固定液处理的细胞中，未观察到与CD38的结合。将结果示于图1A中。
(B)使用2％多聚甲醛将OKT10杂交瘤细胞在4℃进行20分钟固定(固定化)。
然后，将细胞用含有Dylight594标记抗小鼠IgG抗体和作为核糖核酸酶抑制剂的RNaseOUT 5μl的PBST 250μl进行细胞膜溶解和细胞内抗体的染色(细胞膜溶解和标记靶抗原反应)。
通过离心回收细胞(细胞分离)。
然后，以达到40个细胞/1μl的浓度的方式加入细胞溶解液(100mM Tris HCl(pH7.5)、500mM LiCl、1％十二烷基硫酸锂、5mM二硫苏糖醇)。由细胞的mRNA的提取以及cDNA合成按照Kurosawa等人的方法进行(Rapid production of antigen-specificmonoclonal antibodies from a variety of animals,BMC Biology 2012,10:80)(cDNA合成)。
即，将上述的细胞溶解液2.5μl(100个细胞的量)加入到结合有低聚dT25的磁珠(Dynabeads)3μg中，使细胞内的mRNA与磁珠结合。接着，将磁珠用3μl的mRNA清洗用溶液A(10mM Tris HCl(pH7.5)、0.15M LiCl、0.1％LiDS或50mM Tris HCl(pH8.3))、接着用3μl的mRNA清洗用溶液B(75mM KCl、3mM MgCl2、0.1％TritonX、0.5mM dNTP、5mM DTT、2单位核糖核酸酶抑制剂/μL)清洗1次后，进行cDNA合成。即，在清洗后的磁珠中加入cDNA合成用溶液(50mM Tris HCl(pH8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、0.1％Triton X-100、0.5mM dNTP、5mMDTT、2单位核糖核酸酶抑制剂/μL、10单位SuperScript III逆转录酶(Invitrogen)，在40℃反应1小时。将磁珠用3μl的TE溶液(10mM Tris HCl(pH7.5)、1mM EDTA、0.1％TritonX)清洗后，进行小鼠免疫球蛋白γ链恒定区基因的扩增。在磁珠中加入25μl的PCR反应溶液(引物1和2各10pmol、dNTP 10nmol、Takara Bio PrimeSTAR耐热性DNA聚合酶1U)，进行35个循环的94℃30秒-68℃40秒的反应。所使用的引物为5’-GTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGC-3’(序列编号1)和5’-ACGCTGCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAG-3’(序列编号2)
在多聚甲醛固定细胞中确认到免疫球蛋白重链恒定区基因片段的扩增。将结果示于图1B中。
(C)将1×106个杂交瘤细胞使用2％多聚甲醛在4℃固定10分钟至30分钟(固定化)。
通过离心分离回收细胞，向其中加入含有250μL的Dylight488标记抗小鼠IgG抗体和200单位的RNaseOUT的PBST，在4℃进行15分钟抗原抗体反应(细胞膜溶解和标记靶抗原反应)。
将标记抗小鼠IgG抗体用含有RNaseOUT的PBST稀释，于室温放置1小时后使用。将细胞用含有0.1μg/mL的DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)的PBS 3ml稀释，对其进行FACS。通过设定R1门和R2门而选择出单一细胞，通过设定R3门而选择出标记抗体与细胞内的免疫球蛋白结合的细胞(细胞分离)。将结果示于图1C中。
(D)将通过上述(C)得到的R3门内的细胞于含有磁珠3μg的细胞溶解液15μL、或者含有1μg/mL的蛋白酶K且含有磁珠3μg的细胞溶解液15μL中进行单个分选。含有蛋白酶K的细胞溶解液通过进一步在50℃加热1小时而进行由多聚甲醛形成的交联的脱交联反应。由细胞进行的全长免疫球蛋白可变区的扩增反应按照Kurosawa等人的方法(非专利文献4)进行。可知：通过对进行了短时间固定的细胞进行脱交联反应，能够由单一的杂交瘤细胞高效地扩增全长免疫球蛋白可变区。将结果示于图1D中。
(E)将上述(D)的结果汇总于图中。实验进行3次，示出平均值和标本标准偏差(N＝12)。将结果示于图1E中。
实施例2
将OKT10杂交瘤细胞和Jurkat细胞分别以1:100(1％)、1:1000(0.1％)、1:0,000(0.01％)、1:100,000(0.001％)的比例混合。将它们用2％多聚甲醛PBS溶液在4℃进行10分钟的固定(固定化)。
通过离心回收细胞，向其中加入250μl的染色液(含有抗小鼠IgG Dylight488、抗小鼠IgG Dylight650、0.1μg/ml的DsRed、200单位的RNaseOUT的PBST)，在冰上放置15分钟(细胞膜溶解和标记靶抗原反应)。
在本溶液中加入含有1μg/ml的DAPI的PBS溶液3ml，使用流式细胞仪进行OKT10杂交瘤细胞的分离。通过设定R1门(FSC vs SSC)和R2门(DAPI)来鉴定单一细胞群。进一步使用FL2道由单一细胞群中除去具有自身荧光的细胞以及受到非特异性染色的细胞(R3门)。在这些细胞中，将抗小鼠IgG Dylight488强阳性以及抗小鼠IgG Dylight650强阳性细胞鉴定为OKT10杂交瘤细胞(R4)(细胞分离)。
(A)图2A是将OKT10杂交瘤细胞和Jurkat细胞分别以1:100(1％)进行混合时的FACS图。
(B)图2B是100％、0.1％、0.01％、0.001％的混合比的FACS图。任何一种情况下，均在相当于杂交瘤细胞的R4门内确认到细胞。
(C)将R4门内的细胞于含有3μg的oligo-dT磁珠、1μg/ml的蛋白酶K的细胞溶解液15μl中进行单个细胞分选。使用实施例1(B)中记载的方法进行由细胞的RNA提取和cDNA合成，并且使用5‘RACE PCR进行V基因的扩增。将结果示于图2C和2D中。由72个细胞的溶解液进行了V基因的扩增，结果其扩增成功率在1％的混合比时为89％、在0.1％时为53％、在0.01％时为47％、在0.001％时为31％。
实施例3
(A)由p53磷酸化肽免疫豚鼠采集髂骨淋巴结，由其制备细胞混悬液。将细胞(1x107个)在4℃用2％多聚甲醛PBS溶液进行10分钟的固定(固定化)。
通过离心回收细胞，向其中加入250μl的染色液(含有抗豚鼠IgG Dylight650、磷酸化肽-链霉亲和素Dylight488、非磷酸化肽-链霉亲和素Dylight550、0.1μg/ml的DsRed和200单位的RNaseOUT的PBST)，在冰上放置15分钟，由此进行染色(细胞膜溶解和标记靶抗原反应)。
在本溶液中加入含有1μg/ml的DAPI的PBS 3ml溶液后，将一部分用荧光显微镜进行观察。将结果示于图3A中。
其结果，磷酸化p53特异性浆细胞被鉴定为抗豚鼠IgG强阳性、磷酸化肽-链霉亲和素强阳性、非磷酸化肽-链霉亲和素阴性。
p53特异性浆细胞被鉴定为抗豚鼠IgG强阳性、磷酸化肽-链霉亲和素强阳性、非磷酸化肽-链霉亲和素强阳性。
另外，非特异性浆细胞被鉴定为抗豚鼠IgG强阳性、磷酸化肽-链霉亲和素阴性、非磷酸化肽-链霉亲和素阴性。
(B)使用流式细胞仪对这些细胞进行分析，进行p53特异性浆细胞的分离。通过设定R1门(FSC vs SSC)和R2门(DAPI)，鉴定出单一细胞群。进一步利用FL2道由单一细胞群中除去具有自身荧光的细胞、受到非特异性染色的细胞、以及与非磷酸化肽反应的p53特异性浆细胞(R3门)。这些细胞中，将抗小鼠IgG强阳性、磷酸化肽强阳性细胞鉴定为磷酸化p53特异性浆细胞(R4)。与其他细胞相比，在R4门内出现的细胞关于磷酸化肽的结合具有100倍IgG的荧光强度、关于抗豚鼠抗体的结合具有10倍IgG的荧光强度。将结果示于图3B中。
(C)使用与实施例2同样的方法对R4门内的细胞进行单个细胞分选(细胞分离)。然后，利用与实施例1(B)相同的方法，使用分离出的5’RACE PCR进行V基因的扩增。将结果示于图3C中。由72个细胞的溶解液进行了V基因的扩增，结果其扩增效率为84％。
(D)由所得到的V基因按照Kurosawa等人的方法(非专利文献4)制作全长的重链、轻链免疫球蛋白基因，将其导入到293FT细胞中，由此制成重组抗体。使用ELISA法对所得到的抗体的特异性进行分析。将结果示于图3D中。93％(25/27)与磷酸化肽结合，其中68％(17/25)为磷酸化肽特异性的。
比较例1(非专利文献4的方法)
(A)由p53磷酸化肽免疫豚鼠的髂骨淋巴结制备细胞混悬液。将细胞(1x107个)在含有抗豚鼠IgG Dylight650、磷酸化肽-链霉亲和素Dylight488、非磷酸化肽-链霉亲和素Dylight550以及ER-tracker(内质网示踪染料)的PBS中混悬，在4℃放置30分钟，由此进行细胞的染色。
使用流式细胞仪对这些细胞进行分析，进行p53特异性浆细胞的分离。通过设定R1门(FSC vs SSC)，鉴定出单一细胞群。进一步利用FL2道由单一细胞群中除去具有自身荧光的细胞、受到非特异性染色的细胞、以及与非磷酸化肽反应的p53特异性浆细胞(R2门)。接着，通过选择ER-tracker强阳性的细胞来鉴定浆细胞(R3门)，在这些细胞中，将抗豚鼠IgG弱阳性、磷酸化肽阳性细胞鉴定为磷酸化p53特异性浆细胞(R4)。与其他细胞相比，在R4门内出现的细胞关于磷酸化肽的结合具有10倍的荧光强度，关于抗豚鼠抗体的结合仅有数倍程度的荧光强度。将结果示于图3E中。
(B)使用与实施例2同样的方法对R4门内的细胞进行单细胞分选(细胞分离)。然后，利用与实施例1(B)相同的方法，使用5‘RACE PCR进行V基因的扩增。将结果示于图3F中。由72个细胞的溶解液进行了V基因的扩增，结果其扩增效率为16％。
(C)利用与实施例3(D)相同的方法，由所得到的V基因制作全长的重链、轻链免疫球蛋白基因，将其导入到293FT细胞中，由此制成重组抗体。使用ELISA法对所得到的抗体的特异性进行分析的结果(参照图3G)，33％(9/27)与磷酸化肽结合，其中44％(4/9)为磷酸化肽特异性的。
将实施例3和比较例1的结果一览示于下表1中。本发明方法的效果的显著性明显。
【表1】
Figure BDA0001573531850000221
实施例3(续)
(E)为了制作苏氨酸18磷酸化p53(pT18-p53)特异性单克隆抗体，使用通过实施例3(D)得到的抗体克隆进行HEK293细胞的免疫染色。作为在通过依托泊苷处理而引起了DNA损伤的HEK293细胞的核中检测出特异性信号的抗体克隆，鉴定出了#23抗体。由#23抗体得到的信号在实施了λ磷酸酶处理的细胞中消失。将结果示于图3H中。此外，本信号在包含pT18的p53肽存在下消失，但在相邻的丝氨酸15和丝氨酸20被磷酸化的肽存在下不消失。将结果示于图3I中。另外，在蛋白印迹分析中，#23抗体在实施了依托泊苷处理的HEK293中检测出了50kDa的特异性条带。由#23抗体得到的信号在实施了λ磷酸酶处理的细胞中消失。将结果示于图3J中。此外，本信号在包含过量的pT18的p53肽存在下消失，但在相邻的丝氨酸15和丝氨酸20被磷酸化的肽存在下不消失。将结果示于图3K中。
(F)使用表面等离子共振SPR装置测定#23抗体对pT18-p53的亲和性。其结果，#23抗体对pT18-p53肽显示出0.20nM的结合常数KD。将结果示于图3L中。
(G)将#23抗体的γ链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列(序列编号3～5)和κ链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列(序列编号6～8)分别示于表2中。将#23抗体的γ链和κ链的可变区的氨基酸序列(序列编号9～10)示于表3中。
【表2】
CDR1 CDR2 CDR3
p53#23γ GFIFSSYA ISRSDSNR SRYRDYYALDI
p53#23κ QSLLHSNGKTY RVS FQNTHPPLT
【表3】
Figure BDA0001573531850000231
实施例4
(A)为了制作苏氨酸68磷酸化CHK2(pT68-CHK2)特异性单克隆抗体，由pT68-CHK2肽免疫豚鼠采集髂骨淋巴结，由其制备细胞混悬液。将细胞(1x107个)利用2％多聚甲醛PBS溶液在4℃进行10分钟的固定(固定化)。
通过离心回收细胞，向其中加入250μl的染色液(含有抗豚鼠IgG Dylight650、pT68-CHK2肽-链霉亲和素Dylight488、非磷酸化肽(UM-CHK2)-链霉亲和素Dylight550、0.1μg/ml的DsRed和200单位的RNaseOUT的PBST)，在冰上放置15分钟，由此进行染色(细胞膜溶解和标记靶抗原反应)。
在本溶液中加入含有1μg/ml的DAPI的PBS溶液3ml，进行细胞核的染色。
(B)使用流式细胞仪对这些细胞进行分析，进行pT68-CHK2特异性浆细胞的分离。通过设定R1门(FSC vs SSC)和R2门(DAPI)，鉴定出单一细胞群。进一步利用FL2道由单一细胞群中除去具有自身荧光的细胞、受到非特异性染色的细胞、以及与UM-CHK2肽反应的CHK2特异性浆细胞(R3门)。这些细胞中，将抗小鼠IgG强阳性、pT68-CHK2肽强阳性细胞鉴定为pT68-CHK2特异性浆细胞(R4)。与其他细胞相比，在R4门内出现的细胞关于pT68-CHK2肽的结合具有100倍IgG的荧光强度，关于抗豚鼠抗体的结合具有10倍IgG的荧光强度。将结果示于图4A中。
(C)使用与实施例2同样的方法对R4门内的细胞进行单个细胞分选(细胞分离)。然后，利用与实施例1(B)相同的方法，使用分离出的5’RACE PCR进行V基因的扩增，由所得到的V基因按照Kurosawa等人的方法(非专利文献4)制作全长的重链、轻链免疫球蛋白基因，将其导入到293FT细胞中，由此制成重组抗体。使用ELISA法对所得到的抗体的特异性进行分析。将结果示于图4B中。其中59％(10/17)为pT68-CHK2肽特异性的。
(D)使用所得到的抗体克隆进行HEK293细胞以及Hela细胞的免疫染色。#34抗体鉴定为在通过喜树碱处理而引起了DNA断裂的HEK293细胞的核中检测出特异性信号的抗体克隆。将结果示于图4C中。本信号在过量的pT68-CHK2肽存在下消失，但在UM-CHK2肽存在下不消失。此外，本信号在实施了λ磷酸酶处理的细胞中消失。将结果示于图4D中。由以上的结果明确了：#34抗体是能够特异性检测出第68位苏氨酸被磷酸化的内源性CHK2的抗体。
(E)使用表面等离子共振SPR装置测定#34抗体对pT68-CHK2的亲和性。其结果，#34抗体对pT68-CHK2肽显示出0.08nM的结合常数KD。将结果示于图4E中。
(F)将#34抗体的γ链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列(序列编号11～13)、κ链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列(序列编号14～16)分别示于表4中(序列编号)。将#34抗体的γ链和κ链的可变区的氨基酸序列(序列编号17～18)分别示于表5中。【表4】
CDR1 CDR2 CDR3
CHK2#34γ GFTFSNYF ISGDSSNI TRLMVVTHLDI
CHK2#34κ QSLLYSRNNKNL WAS WQGISAPNTG
【表5】
Figure BDA0001573531850000251
【工业实用性】
本发明在抗体制备的相关领域中有用。
【序列表自由文本】
序列编号1：PCR引物
序列编号2：PCR引物
序列编号3～5：pT18-p53特异性单克隆抗体的γ链的CDR1、CDR2和CDR3
序列编号6～8：pT18-p53特异性单克隆抗体的κ链的CDR1、CDR2和CDR3
序列编号9：pT18-p53特异性单克隆抗体的γ链可变区
序列编号10：pT18-p53特异性单克隆抗体的κ链可变区
序列编号11～13：pT68-CHK2特异性单克隆抗体的γ链的CDR1、CDR2和CDR3
序列编号14～16：pT68-CHK2特异性单克隆抗体的κ链的CDR1、CDR2和CDR3
序列编号17：pT68-CHK2特异性单克隆抗体的γ链可变区
序列编号18：pT68-CHK2特异性单克隆抗体的κ链可变区
序列表
<110> 国立大学法人富山大学(NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION UNIVERSITYOF TOYAMA)
<120> 抗原特异性单克隆抗体制作方法(Preparation of Antigen SpecificMonoclonal Antibody)
<130> 161461H
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
gtggaactca ggcgccctga ccagc 25
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
acgctgctga gggagtagag tcctgag 27
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 豚鼠(Cavia porcellus)
<400> 3
Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 豚鼠(Cavia porcellus)
<400> 4
Ile Ser Arg Ser Asp Ser Asn Arg
1 5
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 豚鼠(Cavia porcellus)
<400> 5
Ser Arg Tyr Arg Asp Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile
1 5 10
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 豚鼠(Cavia porcellus)
<400> 6
Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr
1 5 10
<210> 7
<211> 3
<212> PRT
<213> 豚鼠(Cavia porcellus)
<400> 7
Arg Val Ser
1
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 豚鼠(Cavia porcellus)
<400> 8
Phe Gln Asn Thr His Pro Pro Leu Thr
1 5
<210> 9
<211> 126
<212> PRT
<213> 豚鼠(Cavia porcellus)
<400> 9
Met Glu Leu Ala Leu Ser Trp Val Phe Leu Phe Thr Leu Leu Arg Gly
1 5 10 15
Val Gln Ala Glu Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Leu Ala Ser Gly Phe Ile Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Ser Ala Ile Ser Arg Ser Asp Ser Asn Arg Tyr Tyr Thr
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Gly Thr Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ser Arg Tyr Arg Asp Tyr Tyr Ala Leu Asp Ile
115 120 125
<210> 10
<211> 122
<212> PRT
<213> 豚鼠(Cavia porcellus)
<400> 10
Met Arg Ile Pro Val His Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Ile Thr
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser
20 25 30
Val Ser Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu His Trp Val Val His Lys
50 55 60
Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Met Ile Phe Arg Val Ser Asn Lys Tyr
65 70 75 80
Ser Gly Thr Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
85 90 95
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Gly Val Tyr Tyr
100 105 110
Cys Phe Gln Asn Thr His Pro Pro Leu Thr
115 120
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 豚鼠(Cavia porcellus)
<400> 11
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Phe
1 5
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 豚鼠(Cavia porcellus)
<400> 12
Ile Ser Gly Asp Ser Ser Asn Ile
1 5
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 豚鼠(Cavia porcellus)
<400> 13
Thr Arg Leu Met Val Val Thr His Leu Asp Ile
1 5 10
<210> 14
<211> 12
<212> PRT
<213> 豚鼠(Cavia porcellus)
<400> 14
Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Arg Asn Asn Lys Asn Leu
1 5 10
<210> 15
<211> 3
<212> PRT
<213> 豚鼠(Cavia porcellus)
<400> 15
Trp Ala Ser
1
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 豚鼠(Cavia porcellus)
<400> 16
Trp Gln Gly Ile Ser Ala Pro Asn Thr Gly
1 5 10
<210> 17
<211> 126
<212> PRT
<213> 豚鼠(Cavia porcellus)
<400> 17
Met Glu Leu Ala Leu Ser Trp Val Phe Leu Leu Phe Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Ala Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Tyr Phe Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Leu Ala Ala Ile Ser Gly Asp Ser Ser Asn Ile Lys Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Thr Arg Leu Met Val Val Thr His Leu Asp Ile
115 120 125
<210> 18
<211> 117
<212> PRT
<213> 豚鼠(Cavia porcellus)
<400> 18
Met Leu Leu Thr Val Leu Leu Trp Val Ser Gly Val Cys Gly Asp Ile
1 5 10 15
Val Met Thr Gln Ser Pro Val Ser Leu Ile Val Ser Pro Gly Glu Ser
20 25 30
Ala Thr Ile Arg Cys Gln Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Arg Asn
35 40 45
Asn Lys Asn Leu Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Thr Ser Gly Ile Pro Glu
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Gly Ala Gln Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Ile
100 105 110
Ser Ala Pro Asn Thr
115

Claims (11)

1.一种由分离出的至少1个细胞制造靶抗原特异性单克隆抗体的方法，其包括下述步骤：
(1)固定化步骤，其是将包含抗体产生细胞的细胞群利用交联剂进行固定化处理的步骤，其中，所述交联剂是具有细胞膜透过性的可逆交联剂；
(2)细胞膜溶解步骤，其是将固定化处理后的细胞群利用表面活性剂进行处理而将细胞膜溶解的步骤；
(3)染色步骤，其是使进行了细胞膜溶解处理的细胞群与标记的靶抗原进行反应而在细胞内染色的步骤，以下将该标记的靶抗原称为标记靶抗原，其中，细胞膜溶解步骤(2)和染色步骤(3)可以依次实施、也可以并行地实施；
(4)细胞分离步骤，其是在经历了染色步骤的细胞群中分离出与标记靶抗原发生了反应的至少1个细胞的步骤；
(5)cDNA制备步骤，其是通过对分离出的至少1个细胞进行脱交联处理而从分离出的至少1个细胞中分离mRNA、制备cDNA的步骤；以及
(6)靶抗原特异性单克隆抗体制备步骤，其是由通过cDNA制备步骤制备出的cDNA制备靶抗原特异性单克隆抗体或其片段的步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述交联剂为福尔马林或在间隔链中具有S-S键的二价交联剂。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述表面活性剂为选自由非离子性表面活性剂、两性表面活性剂和离子性表面活性剂组成的组中的至少一种表面活性剂。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述表面活性剂为非离子性表面活性剂。
5.如权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(1)～(4)中的至少1个步骤在核糖核酸酶抑制剂的存在下实施。
6.如权利要求1或2所述的方法，其中，至少步骤(5)在核糖核酸酶抑制剂的存在下实施。
7.如权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(5)的分离出的至少1个细胞为分离出的10个以下的细胞，所述mRNA的分离由分离出的10个以下的抗体产生细胞进行。
8.如权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤(5)的cDNA制备中，作为5’RACE PCR的第2次PCR的正义引物，使用具有目的免疫球蛋白的起始密码子周边的序列的引物。
9.如权利要求1或2所述的方法，其中，在交联剂为福尔马林的情况下，所述脱交联处理为热处理。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述热处理在蛋白酶的共存下进行，得到抗体基因的可变区基因片段。
11.如权利要求1或2所述的方法，其中，在交联剂为在间隔链中具有S-S键的二价交联剂的情况下，所述脱交联处理为还原处理。
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