KR102309517B1 - 표적 항원 발견, 표현형 선별 및 표적 세포 특이성 표적 에피토프를 규명하기 위한 그의 용도 - Google Patents
표적 항원 발견, 표현형 선별 및 표적 세포 특이성 표적 에피토프를 규명하기 위한 그의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 세포-표면 항원에 특이적으로 결합하는 결합 폴리펩티드(예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 단편)를 규명하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명의 방법은 일반적으로 결합 폴리펩티드의 다양한 종류로 이루어진 핵산-디스플레이 라이브러리를 세포의 외부 표면상에 제시된 세포-표면 항원과 접촉시키고; 상기 라이브러리로부터 상기 세포의 외부 표면 상의 세포-표면 항원에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 라이브러리 구성원을 단리함을 포함한다.
Description
관련 출원
본 출원은 "표적 항원 발견 및 표현형 선별"이란 표제하에 2013년 6월 28일자로 출원된 미국 가 출원 제 61/840,583 호와 관련된 우선권을 청구하며, 상기 출원의 내용은 전체가 본 발명에 참고로 인용된다.
결합 폴리펩티드, 예를 들어 항체 및 그의 단편은 치료제 및 진단제로서 상업적으로 중요하다. 결합 폴리펩티드에 대한 전통적인 선별 방법은 일반적으로 용해성 항원을 사용한다. 그러나, 몇몇 세포-표면 항원의 경우, 상기 항원상의 구조적 에피토프는 상기 항원이 원형질막으로부터 용해되는 경우 변경되어, 천연 항원을 인식할 수 있는 결합 폴리펩티드를 생성시키지 못한다. 따라서, 당해 분야에서는 천연 구조의 세포-표면 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 폴리펩티드에 대한 신규의 선별 방법이 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 세포-표면 항원에 특이적으로 결합하는 결합 폴리펩티드(예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 단편)를 규명하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명의 방법은 일반적으로 결합 폴리펩티드의 다양한 종류로 이루어진 핵산-디스플레이 라이브러리를 세포의 외부 표면상에 제시된 세포-표면 항원과 접촉시키고; 상기 라이브러리로부터 상기 세포의 외부 표면 상의 세포-표면 항원에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 라이브러리 구성원을 단리함을 포함한다. 본 발명의 방법 및 조성물은 표적 세포 표면 항원의 천연 형태에 결합하는 결합 폴리펩티드의 신속한 규명을 허용한다는 점에서 특히 유리하다. 이러한 방법 및 조성물은 또한 신규의, 치료학적으로 유용한 세포-유형 특이성 항원 또는 에피토프의 규명을 허용한다.
도 1은 본 발명의 예시적인 DNA 디스플레이 조성물 및 선별 방법의 도해이다.
도 2는 본 발명의 예시적인 DNA 디스플레이 조성물 및 선별 방법의 도해이다.
도 3은 본 발명의 방법에 사용되는 예시적인 표적 세포 선별 전략의 도해이다.
도 4는 본 발명의 방법에 사용되는 예시적인 병행되는 선별 및 심층 서열분석 전략의 도해이다.
도 5는 본 발명의 방법에 사용되는 예시적인 병행되는 선별 및 심층 서열분석 전략의 도해이다.
도 6은 본 발명의 방법에 사용되는 예시적인 병행되는 선별 및 심층 서열분석 전략의 도해이다.
도 7은 본 발명의 방법에 사용되는 예시적인 병행되는 선별 전략의 결과의 도해이다.
도 8은 본 발명의 방법을 사용하여 선택된 고 친화성 VH 분자의 FACS 기반 결합 분석의 결과를 나타내는 그래프를 도시한다.
도 9는 본 발명의 방법을 사용하여 선택된 VH 분자의 차별 결합을 나타내는 그래프를 도시한다.
도 10은 본 발명의 방법을 사용하여 선택된 VH 분자의 차별 결합을 나타내는 그래프를 도시한다.
도 2는 본 발명의 예시적인 DNA 디스플레이 조성물 및 선별 방법의 도해이다.
도 3은 본 발명의 방법에 사용되는 예시적인 표적 세포 선별 전략의 도해이다.
도 4는 본 발명의 방법에 사용되는 예시적인 병행되는 선별 및 심층 서열분석 전략의 도해이다.
도 5는 본 발명의 방법에 사용되는 예시적인 병행되는 선별 및 심층 서열분석 전략의 도해이다.
도 6은 본 발명의 방법에 사용되는 예시적인 병행되는 선별 및 심층 서열분석 전략의 도해이다.
도 7은 본 발명의 방법에 사용되는 예시적인 병행되는 선별 전략의 결과의 도해이다.
도 8은 본 발명의 방법을 사용하여 선택된 고 친화성 VH 분자의 FACS 기반 결합 분석의 결과를 나타내는 그래프를 도시한다.
도 9는 본 발명의 방법을 사용하여 선택된 VH 분자의 차별 결합을 나타내는 그래프를 도시한다.
도 10은 본 발명의 방법을 사용하여 선택된 VH 분자의 차별 결합을 나타내는 그래프를 도시한다.
I. 정의
본 발명에 사용되는 바와 같이, "핵산 디스플레이 라이브러리"란 용어는 비제한적으로, 예를 들어 미국특허 제 7,195,880; 6,951,725; 7,078,197; 7,022,479; 6,518,018; 7,125,669; 6,846,655; 6,281,344; 6,207,446; 6,214,553; 6,258,558; 6,261,804; 6,429,300; 6,489,116; 6,436,665; 6,537,749; 6,602,685; 6,623,926; 6,416,950; 6,660,473; 6,312,927; 5,922,545; 및 6,348,315 호, 및 WO2010/011944(이들은 모두 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)에 설명된 것들을 포함하여, 임의의 당해 분야에서 인정된 시험관내 무세포 표현형-유전자형 연결된 디스플레이를 지칭한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "항원"이란 용어는 결합 폴리펩티드에 의해 인식되는 분자를 지칭한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "에 특이적으로 결합하는"이란 용어는 항원에 적어도 약 1 x 10~6 M, 1 x 10-7 M, 1 x 10-8 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, 1 x 10-12 M 이상의 친화성으로 결합하고/하거나 표적에, 비특이성 항원에 대한 친화성보다 적어도 2배 초과의 친화성으로 결합하는 결합 분자(예를 들어 VH 또는 VL 도메인)의 능력을 지칭한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "항체"란 용어는 4개의 폴리펩티드 쇄, 디설파이드 결합에 의해 상호연결된 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄뿐만 아니라 이들의 다량체(예를 들어 IgM)를 포함하는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(약어 VH) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 상기 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(약어 VL) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 상기 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인(CL1)을 포함한다. 상기 VH 및 VL 영역을, 상보성 결정 영역(CDR)이라 칭하는 고가변성 영역들로 추가로 세분할 수 있으며, 이들 영역은 프레임워크 영역(FR)이라 칭하는, 보다 보존된 영역들과 함께 산재되어 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, 항체의 "항원-결합 부분"이란 용어는 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 천연의, 효소에 의해 수득할 수 있는, 합성 또는 유전적으로 조작된 폴리펩티드 또는 당단백질을 포함한다. 항체의 항원-결합 단편은 예를 들어 임의의 적합한 표준 기법, 예를 들어 단백질 분해 절단 또는 항체 가변 및 임의로 불변 도메인을 암호화하는 DNA의 조작 및 발현을 포함한 재조합 유전 공학 기법을 사용하여 완전 항체 분자로부터 유래될 수 있다. 항원-결합 부분의 비제한적인 예는 (i) Fab 단편; (ii) F(ab')2 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v) 단쇄 Fv(scFv) 분자; (vi) dAb 단편; 및 (vii) 항체의 고가변성 영역을 모방하는 아미노산 잔기들로 이루어지는 최소 인식 단위(예를 들어 단리된 상보성 결정 영역(CDR))를 포함한다. 다른 조작된 분자들, 예를 들어 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디 및 미니바디가 또한 "항원-결합 부분"이란 표현 내에 포함된다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "VH 도메인" 및 "VL 도메인"이란 용어들은 각각, FR(프레임워크 영역) 1, 2, 3 및 4 및 CDR(상보성 결정 영역) 1, 2 및 3을 포함하는 단일 항체 가변 중쇄 및 경쇄 도메인을 지칭한다(문헌[Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest. (NIH Publication No. 91-3242, Bethesda]을 참조하시오)
II. 세포 표면 항원
몇몇 태양에서, 본 발명은 세포-표면 항원에 특이적으로 결합하는 결합 폴리펩티드의 규명 방법을 제공한다.
세포의 표면상에 제시될 수 있는 임의의 항원, 예를 들어 비제한적으로 단백질, 글리칸, 및/또는 지질 항원을 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 항원은 천연 분자이다. 천연 항원의 적합한 비제한적인 예는 막관통 단백질(예를 들어 G-단백질 결합된 수용체) 및 GPI-고정된 단백질을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 항원은 비-천연 재조합 또는 합성 항원이다. 천연 항원의 적합한 비제한적인 예는 상이한 항원 분자들로부터의 부분들을 포함하는 키메릭 항원을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 항원의 정체는 본 발명의 방법을 수행하기 이전에 공지된다. 몇몇 실시태양에서, 상기 항원의 정체는 본 발명의 방법을 수행하기 이전에 공지되지 않는다.
본 발명의 방법에 사용되는 세포 표면 항원은 임의의 세포 또는 세포-유사 입자(예를 들어 지질 소포)상에 제시될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 세포는 상기 세포-표면 항원을 자연적으로 발현하는 세포 유형이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 세포는 상기 세포-표면 항원을 이종으로 발현하도록 조작된 재조합 세포이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 세포는 정상 세포의 질병-관련된 변이체(예를 들어 종양 세포)이다.
III. 결합 폴리펩티드
몇몇 태양에서, 본 발명은 세포-표면 항원에 특이적으로 결합하는 결합 폴리펩티드의 규명 방법을 제공한다.
임의의 유형의 결합 폴리펩티드, 예를 들어 비제한적으로 항체, 또는 그의 단편, 및 면역글로불린-유사 도메인을 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 적합한 면역글로불린-유사 도메인은 비제한적으로 피브로넥틴 도메인(예를 들어 문헌[Koide et al. (2007), Methods Mol. Biol. 352: 95-109](내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오), DARPin(예를 들어 문헌[Stumpp et al. (2008) Drug Discov. Today 13 (15-16): 695-701](내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오), 단백질 A의 Z 도메인(문헌[Nygren et al. (2008) FEBS J. 275 (11): 2668-76](내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오), 리포칼린(Lipocalin)(예를 들어 문헌[Skerra et al. (2008) FEBS J. 275 (11): 2677-83](내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오), 애필린(Affilin)(예를 들어 문헌[Ebersbach et al. (2007) J. Mol. Biol. 372 (1): 172-85](내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오), 애피틴(Affitin)(예를 들어 문헌[Krehenbrink et al. (2008). J. Mol. Biol. 383 (5): 1058-68](내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오), 애비머(Avimer)(예를 들어 문헌[Silverman et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23 (12): 1556-61](내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오), 피노머(Fynomer)(예를 들어 문헌[Grabulovski et al. (2007) J Biol Chem 282 (5): 3196-3204](내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오), 및 쿠니츠(Kunitz) 도메인 펩티드(예를 들어 문헌[Nixon et al. (2006) Curr Opin Drug Discov Devel 9 (2): 261-8](내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오)를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 결합 폴리펩티드는 항체 VH 또는 VL 도메인이다.
IV. 세포 표면 디스플레이 방법
몇몇 태양에서, 본 발명은 세포-표면 항원에 특이적으로 결합하는 결합 폴리펩티드의 규명 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 결합 폴리펩티드의 다양한 종류로 이루어진 핵산-디스플레이 라이브러리를 제1 세포 유형의 외부 표면상에 제시된 세포-표면 항원과 접촉시키고; (b) 상기 라이브러리로부터 상기 제1 세포 유형의 외부 표면 상의 세포-표면 항원에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 라이브러리 구성원을 단리하여, 상기 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 결합 폴리펩티드를 규명함을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 단계 (a)에 앞서, 상기 외부 표면상에 제시된 항원에 특이적으로 결합하지 않는 결합 폴리펩티드의 라이브러리를 사전-제거(pre-clear)하기 위해서, 상기 결합 폴리펩티드의 다양한 종류로 이루어진 핵산-디스플레이 라이브러리를 상기 항원을 제시하지 않는 제2 세포 유형과 접촉시킨다.
몇몇 태양에서, 본 발명은 세포-표면 항원에 특이적으로 결합하는 결합 폴리펩티드의 규명 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 결합 폴리펩티드의 다양한 종류로 이루어진 핵산-디스플레이 라이브러리를 세포-표면 항원을 발현하는 제1 세포 유형과 접촉시키고, 상기 라이브러리로부터 상기 제1 세포 유형에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 라이브러리 구성원을 단리하고; (b) 상기 결합 폴리펩티드의 다양한 종류로 이루어진 핵산-디스플레이 라이브러리를 상기 세포 표면 항원을 발현하지 않는 제2 세포 유형과 접촉시키고, 상기 라이브러리로부터 상기 제2 세포 유형에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 라이브러리 구성원을 단리하고; (c) 상기 제1 세포 유형에는 특이적으로 결합하지만 상기 제2 세포 유형에는 결합하지 않는 라이브러리 구성원을 선택하여, 상기 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 결합 폴리펩티드를 규명함을 포함한다.
본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 핵산-디스플레이 라이브러리는 예를 들어 미국특허 제 7,195,880; 6,951,725; 7,078,197; 7,022,479; 6,518,018; 7,125,669; 6,846,655; 6,281,344; 6,207,446; 6,214,553; 6,258,558; 6,261,804; 6,429,300; 6,489,116; 6,436,665; 6,537,749; 6,602,685; 6,623,926; 6,416,950; 6,660,473; 6,312,927; 5,922,545; 및 6,348,315 호, 및 WO2010/011944(이들은 모두 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)에 설명되어 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 다양한 종류로 이루어진 핵산-디스플레이 라이브러리는 DNA 디스플레이 라이브러리이다. 하나의 실시태양에서, 상기 핵산-디스플레이 라이브러리는 본 발명에 개시되거나 또는 WO2010/011944(내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)에 개시된 DNA 디스플레이 라이브러리이다.
몇몇 실시태양에서, 상기 DNA-디스플레이 라이브러리의 각 구성원은 개재된 DNA 링커를 통해 결합 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 암호화 서열에 연결된 상기 결합 폴리펩티드를 포함하며, 여기에서 상기 DNA 링커는 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함한다(예를 들어 도 1을 참조하시오). 임의의 제한 엔도뉴클레아제 부위를 사용할 수 있다. 하나의 특정한 실시태양에서, 상기 제한 엔도뉴클레아제 부위는 상기 DNA-디스플레이 라이브러리의 구성원들의 DNA 암호화 서열 중에 존재하지 않으며, 따라서 상기 라이브러리 구성원의 제한 엔도뉴클레아제 절단시 상기 DNA 암호화 서열의 절단을 피한다. 하나의 특정한 실시태양에서, 상기 제한 엔도뉴클레아제 부위는 Not1 부위이다.
몇몇 실시태양에서, 상기 단리된 라이브러리 구성원의 DNA 암호화 서열을 상기 연결된 결합 폴리펩티드로부터 물리적으로 분리시키는 것이 바람직하다. 임의의 물리적 분리 방법들을 사용할 수 있다. 상기 단리된 라이브러리 구성원이 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 DNA 링커를 포함하는 경우(예를 들어 도 1을 참조하시오), 상기 단리된 라이브러리 구성원의 제한 엔도뉴클레아제 절단에 의해 상기 물리적 분리를 성취할 수 있다. 생성된 유리된 DNA 암호화 서열을 임의의 당해 분야에서 인정된 방법, 예를 들어 원심분리에 의해 상기 세포/결합 폴리펩티드 복합체로부터 추가로 분리시킬 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 온전한 단리된 라이브러리 구성원을 상기 제1 및/또는 제2 세포 유형으로부터 물리적으로 분리시키는 것이 바람직하다. 임의의 물리적 분리 방법들을 사용할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 단리된 라이브러리 구성원을 상기 세포-표면 항원의 효소적 절단에 의해 상기 제1 또는 제2 세포 유형으로부터 분리시킨다. 상기 항원의 임의의 효소적 절단 방법, 예를 들어 프로테아제, 지질 및/또는 글리코시다제 효소적 절단을 사용할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 세포-표면 항원이 당지질 앵커에 의해 상기 세포 표면에 부착된 경우, 상기 단리된 라이브러리 구성원을 상기 당지질 앵커의 포스포리파제 절단에 의해 상기 제1 또는 제2 세포 유형으로부터 분리시킨다. 생성된 유리된 단리된 라이브러리 구성원을 임의의 당해 분야에서 인정된 방법, 예를 들어 원심분리에 의해 상기 제1 또는 제2 세포 유형으로부터 추가로 분리시킬 수 있다.
일단 상기 제1 및/또는 제2 세포 유형에 특이적으로 결합하는 라이브러리 구성원이 단리되었으면, 상기 분자의 DNA 암호화 서열을 결정할 수 있다. 따라서, 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 방법은 상기 단리된 라이브러리 구성원의 적어도 일부의 DNA 암호화 서열의 결정 단계를 추가로 포함한다. DNA 서열 결정에 대해 당해 분야에서 인정된 임의의 수단들을 사용할 수 있다. 하나의 특정한 실시태양에서, 상기 DNA 암호화 서열을 단일 분자, 심층 서열분석 기법(예를 들어 파이로서열분석(pyrosequencing))에 의해 결정한다. 단일 분자, 심층 서열분석 기법들은 당해 분야에 충분히 공지되어 있다(예를 들어 본 발명에 내용 전체가 참고로 인용된 US6,210,891에 개시된 것들을 참조하시오). 몇몇 실시태양에서, 상기 결합 폴리펩티드가 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 경우, CDR3 영역의 DNA 암호화 서열을 결정한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 제1 및 제2 세포 유형에 결합하는 라이브러리 구성원의 DNA 암호화 서열을 결정한다. 제1 세포 유형에는 특이적으로 결합하지만 제2 세포 유형에는 결합하지 않는 라이브러리 구성원은 상기 제1 세포 유형에 특이적인 항원에 특이적으로 결합하는 결합 폴리펩티드를 포함하는 것으로 간주된다.
일단 상기 세포-표면 항원에 특이적으로 결합하는 결합 폴리펩티드가 규명되었으면, 상기를 시험관내에서(예를 들어 세포 또는 무세포 발현 시스템에서) 또는 생체내에서(예를 들어 트랜스제닉 동물에서) 이종 발현시킬 수 있다. 따라서, 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 방법은 상기 규명된 결합 폴리펩티드를 시험관내에서(예를 들어 세포 또는 무세포 발현 시스템에서) 또는 생체내에서(예를 들어 트랜스제닉 동물에서) 이종 발현시키는 단계를 추가로 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 상기 항원의 정체는 본 발명의 방법을 수행하기 이전에 공지된다. 그러나, 상기 항원의 정체를 공지할 필요는 없다. 실제로, 몇몇 실시태양에서, 상기 항원의 정체는 본 발명의 방법을 수행하기 이전에 공지되지 않는다. 따라서, 상기 후자의 경우, 본 발명의 방법은 관심 세포 유형(예를 들어 종양 세포)의 표면상에 존재하는 신규의 항원 및 에피토프의 규명을 허용한다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 방법은 상기 세포 표면 항원에 결합시 기능성 내면화가 가능한 결합 폴리펩티드의 선택을 포함한다. 상기와 같은 결합 폴리펩티드는 표적 세포의 내부에 세포독성 약물의 전달을 허용하기 때문에 약물 접합체의 생성에 특히 유용하다. 기능성 내면화에 대한 임의의 선별 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 결합 폴리펩티드의 다양한 종류로 이루어진 핵산-디스플레이 라이브러리를 결합 폴리펩티드 내면화를 허용하는 조건(예를 들어 37 ℃에서 약 1 내지 2시간 동안)하에서 표적 세포와 접촉시킬 수 있다. 이어서 상기 세포를 세척하고 프로테아제 억제제의 존재하에서 세포 용해 완충제로 용해시킬 수 있다. 이어서 상기 내면화된 라이브러리 구성원을 에탄올 침전시키고 상기 DNA 암호화 서열을 PCR 증폭에 의해 농축시킬 수 있다.
본 발명에 개시된 방법을 임의의 표적 에피토프 발견 공정에 적용할 수 있다. 예를 들어, 표적 에피토프는 염증에 대한 귀소(homing) 도메인; 치료제에 대한 내성이 있거나 없는 1차 종양, 종양 세포주, 및 네오에피토프를 생성시킬 수 있는 임의의 돌연변이를 갖는 종양으로부터의 종양 특이성 표적 에피토프; 및 질병 특이성 기능부전을 매개하고 생물학적 치료법에 표적화되는 다른 질병 특이성 에피토프를 포함할 수 있다.
본 발명에 개시된 방법을 또한 환자에 대한 약물 치료 과정에 걸쳐 특정한 세포 표면 에피토프의 존재 또는 부재를 모니터하기 위한 생물마커 발견에 적용할 수 있다. 상기 생물마커 발견으로부터 유래한 항체를 또한 생물마커 검출을 위한 도구로서 사용할 수 있다.
추가로 또는 한편으로, 본 발명에 개시된 방법을 다른 종, 예를 들어 트랜스제닉 동물 및 동물 질병 모델에서 표적 또는 에피토프 발견에 적용할 수 있다.
V. 실시예
A. 요약
인간 공여자의 골수, 말초혈액 및 비장세포로부터 획득된 완전 인간 항체 VH 라이브러리를 제작하고 다수의 표적들에 대한 다수의 고 친화성 및 특이성 VH 결합제를 dsDNA 디스플레이 기술을 사용하여 규명하였다. 표적 세포 특이성 에피토프를 인간 VH 라이브러리 및 dsDNA 디스플레이 기술을 사용하는 생 세포(live cell) 선택 및 심층 서열분석에 의해 규명하였다. 병행된, 차별 선택 및 표적 세포 선택성 선택의 전략을 이들 방법에 적용하였다(도 4, 5, 6을 참조하시오). 모든 라운드에 걸친 모든 풀의 심층 서열분석으로부터 CDR3 빈도의 집계분석은 상기 VH 클론의 선택성을 예견하였다. 표적 세포 및 관련된 세포 유형에 선택적으로 결합하는 고 친화성 VH를 규명하였다.
B. 생 세포 에피토프 발견을 위한 라이브러리 조작 및 선택 방법
생 세포에 결합하는 라이브러리 구성원을 유효하게 회수하기 위한 2가지 방법이 개발되었다.
첫 번째 방법은 결합된 항체에 융합된 DNA의 제한 절단에 의해 생 세포로부터 결합제를 스트립핑(stripping)을 수반하였다. 상기 방법은 세포상의 모든 에피토프에 결합된 VH의 온전한 회수를 가능하게 한다. VH DNA 라이브러리의 C-말단을 NotI 제한 부위를 갖도록 조작하였다(도 1을 참조하시오). 고유 VH 프레임워크 중에는 NotI 부위가 존재하지 않으며 따라서 완전 길이 VH 결합제만을 후속 증폭을 위해 세포로부터 용리시킨다. 상기 NotI 제한 절단 완충제를 생 세포상에서 시험하였으며, 상기는 37 ℃에서 2시간까지의 배양에 생육성이었다. 상기 NotI 절단의 효율은 높았다. 4 ℃에서 1시간 동안 세포에의 상기 라이브러리의 결합에 이어서, 상기 세포를 세척하고 37 ℃에서 1시간 동안 NotI 완충제로 절단하고, 이어서 상기 세포를 회전(spin down)시키고, 상등액(결합된 VH DNA를 함유한다)을 PCR 증폭을 위해 수집하였다(도 1을 참조하시오).
두 번째 방법은 포스포리파제 C(PLC) 절단을 사용하여 생 세포로부터 VH 결합제를 클립핑하는(clip off) 것이다. 상기 방법은 임의의 GPI 고정된 막 단백질의 에피토프(즉 에피토프의 부분집합들)에 결합된 VH의 용리를 가능하게 한다. 상기 PLC 클리핑 효율은 대조용 분자를 사용한 FACS상에서 확인된 바와 같이, 높다. 4 ℃에서 1시간 동안 라이브러리를 세포와 배양 후에, 상기 세포를 세척하고 37 ℃에서 15분 동안 PLC와 배양하였다. 상기 세포를 후속으로 회전시키고, 상기 GPI 고정된 막 단백질의 세포외 도메인과 복합체를 이룬 융합 VH를 함유하는 상등액을 PCR 증폭시켰다(도 2를 참조하시오).
C. 표적 및 관련된/원치 않는 세포 유형 상에서의 병행 선택, 차별 선택 및 표적 세포 선택성 선택
마스터 고유 융합 라이브러리를 WO2010/011944(내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)에 설명된 프로토콜에 따라 생성시켰다. 첫 번째 선택 라운드 동안, 상기 정제된 융합 라이브러리를 모든 선택 부문에 대해 동일한 다양성을 갖는 다수의 라이브러리들로 동등하게 분할하였다(도 5를 참조하시오).
정상적인 공여자 또는 환자로부터 수득한 1차 세포를 표준 세포 생물학 프로토콜에 따라 신선하게 해동하거나 또는 세포 배양 플라스크로부터 단리하였다. 이어서 상기 세포를 37 ℃에서 완전 배지 중에서 1시간 동안 회수한 다음 얼음상에서 30분 동안 선택 완충제 중에서 차단시켰다. 상기 모든 선택을 얼음상에서 수행하여 항체 및 표적 내면화를 방지하였다.
병행 선택의 경우, 라이브러리들을 200 ul의 사전-차단된 스트렙트아비딘 비드 및 200 ul의 사전-차단된 hIgG-에폭시 비드로 실온에서 30분 동안 연속적으로 사전-제거하여 임의의 잘못 접히고 점착성인 라이브러리 구성원들을 제거하였다. 이어서 상기 사전-제거된 라이브러리를 얼음상에서 냉각시키고 세포를 사전-차단시키고 얼음상에서 1시간 동안 배양하였다.
표적 세포 선택성 선택의 경우, 얼음 상에서 1시간 동안 원치않는 및 밀접하게 관련된 세포 유형에 대해 사전-제거를 수행하여 임의의 비-선택성 결합제를 제거하고 이어서 표적 세포에 대해 상기 선택을 수행하였다.
선택 라운드 4에서, 차별 선택 방법을 표적 세포(세포에 대한 사전-제거의 존재 및 부재하에서)에 대한 선택 부문들에 적용하였다. 이 라운드에서, 라이브러리들을 다수의 튜브에 분할하고 각 세포 유형 및 상이한 질병 단계의 환자의 세포에 병행하여 결합시켰다. 이 전략은 심층 서열분석에 의한 표적 세포 대 다른 세포 유형의 직접 비교 및 질병 진행과 함께 발생하는 상이한 에피토프를 인식하는 결합제의 규명을 허용하였다(도 6을 참조하시오).
모든 선택 부문들에 대해서, 결합 후 세포를 10 ㎖의 결합 완충제로 세척하고 상술한 바와 같이 NotI 제한 절단을 수행하여 막 단백질에 대한 모든 결합제를 회수하거나 또는 PLC 클립핑을 수행하여 GPI 고정된 막 단백질에 대한 결합제를 회수하였다.
D. 표적 세포에 대한 선택성 결합제를 예견하는 심층 서열분석
각 선택 라운드 후에, 결합 풀을 PCR 증폭시켰다. 각 결합 풀의 HCDR3을, VH 단편의 프레임워크 3의 C-말단 및 프레임워크 4의 N-말단을 프라이밍하는 올리고를 사용하여 PCR에 의해 높였다. 이어서 개별적인 선택 라운드 및 부문으로부터 유래한 상기 HCDR3 단편들을 PCR에 의한 일루미나(Illumina) 서열분석에 사용되는 특이적인 DNA 바코드로 태그하였다. 상기 태그된 HCDR3을 모으고 Hi Seq 기술에 의한 고도의 자료처리 서열분석을 요청하였다. 표적 세포로부터의 4 라운드 결합 풀을 또한 DNA 바코드로 태그하고 454 서열분석을 위해 제출하여 완전 길이 VH 서열을 획득하였다.
상기 서열들을 서열분석 후 DNA 바코드를 근거로 디컨볼루션하였다(deconvoluted). 각 선택 라운드 및 선택 부문으로부터 유래한 수 백만개의 서열을, 상이한 라운드 및 선택 부문에서 존재하는 특정한 CDR3 서열의 빈도를 비교함으로써 집계분석하였다. 선택성 결합제의 규명에 사용되는 기준은 1) 대조용 또는 밀접하게 관련된 세포 유형이 아닌 표적 세포상에서, 초기 라운드에서부터 말기 라운드까지의 CDR3 서열의 비(specific) 농축; 2) 상이한 선택 라운드에서 표적 특이성 세포 유형상에서 보다 높은 빈도 및 대조용 또는 밀접하게 관련된 세포 유형상에서 낮은 빈도(도 7을 참조하시오); 및 3) 다른 표적 중에 존재하지 않는 서열 또는 데이터베이스 중 다른 프로그램으로부터의 세포 선택이었다. 이어서 일루미나 서열분석에 의해 규명된 선택성 클론을 상기 454 완전 길이 서열 정보를 근거로 합성하였다.
E. 생성, 정제 및 FACS 결합 분석
이어서 상기 결합 풀 및 합성된 VH를 pET22b 발현 벡터내로 서브클로닝하였다. 상기 VH를 표준 프로토콜을 사용하여 BL-21 이 콜라이에서 생성시키고 C-말단 His 태그를 통해 정제하였다. FACS 분석을 수행하여 상이한 세포 유형들에 대한 VH의 결합 및 선택성 및 상기 결합제의 EC50을 평가하였다. 고 친화성 및 선택성 VH 결합제를 상기 생 세포 선택 과정을 통해 규명하였다(도 8, 9 및 10을 참조하시오).
Claims (15)
- 세포-표면 항원에 특이적으로 결합하는 결합 폴리펩티드를 규명하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
(a) 결합 폴리펩티드의 다양한 무세포 DNA-디스플레이 라이브러리를 제1 세포 유형의 외부 표면 상에 제시된 세포-표면 항원과 접촉시키는 단계로서, DNA-디스플레이 라이브러리의 각 구성원이, 개재된 DNA 링커를 통해 결합 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 암호화 서열에 연결된 항체 VH 도메인을 포함하고, DNA 링커가 DNA-디스플레이 라이브러리 구성원의 암호화 서열 중에 존재하지 않는 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 단계;
(b) 라이브러리로부터 제1 세포 유형의 외부 표면 상의 세포-표면 항원에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 라이브러리 구성원을 단리하는 단계;
(c) DNA-디스플레이 라이브러리 구성원의 암호화 서열 중에 존재하지 않는 제한 엔도뉴클레아제 부위에서 제한 엔도뉴클레아제 절단에 의해, 단리된 라이브러리 구성원의 DNA 암호화 서열을 연결된 결합 폴리펩티드로부터 분리시키는 단계; 및
(d) 단리된 라이브러리 구성원의 적어도 일부의 DNA 암호화 서열을 결정하는 단계로서, CDR3 영역의 DNA 암호화 서열을 결정하는 단계. - 제1항에 있어서, 방법이 복수의 선택 라운드 각각에 대해 수행되는 것인, 방법.
- 제2항에 있어서, 단리된 라이브러리 구성원의 적어도 일부의 DNA 암호화 서열을 결정하는 단계가 다음을 포함하는, 방법:
(a) 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 결합 풀을 증폭시키는 단계;
(b) 결합 풀의 HCDR3 단편을, VH의 프레임워크 3의 C-말단 및 프레임워크 4의 N-말단에 대한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 높이는 단계;
(c) 증폭된 HCDR3 단편을 개별적인 선택 라운드에 특이적인 DNA 바코드로 태그하는 단계;
(d) 바코드로 태그된 HCDR3 단편을 서열분석하는 단계; 및
(e) DNA 바코드 서열을 근거로 HCDR3 단편 서열을 디컨볼루션(deconvolution)하여, 표적 세포상에서 초기 라운드로부터 말기 라운드까지 CDR3 단편의 비(specific) 농축이 존재할 때, 결합 폴리펩티드를 세포-표면 항원에 특이적으로 결합하는 것으로 규명하는 단계. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 폴리펩티드의 DNA-디스플레이 라이브러리가 고유 VH 라이브러리에서 유래한 것인, 방법.
- 제4항에 있어서, 결합 폴리펩티드의 DNA-디스플레이 라이브러리가 인간 고유 VH 라이브러리에서 유래한 것인, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 자연 발생적인 단백질, 글리칸, 지질, 또는 글리코포스파티딜이노시톨(GPI) 고정된 단백질인, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 세포 유형이 세포-표면 항원을 자연적으로 발현하는 세포인, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 세포 유형이 정상 세포의 질병-관련된 변이체인, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 세포 유형이 종양 세포인, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)에 앞서, 결합 폴리펩티드의 다양한 DNA-디스플레이 라이브러리가 외부 표면상에 세포-표면 항원을 제시하지 않는 제2 세포 유형으로 사전-제거(pre-clear)되는, 방법.
- 제10항에 있어서, 제1 세포 유형이 종양 세포이고; 임의로 제2 세포 유형이 정상세포인, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 세포 유형이 세포-표면 항원을 이종 발현하도록 조작된 재조합 세포인, 방법.
- 제12항에 있어서, 세포-표면 항원이 재조합 항원 또는 키메릭 항원인, 방법.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 복수의 선택 라운드가 2, 3, 또는 4회 선택 라운드를 포함하고; 임의로 복수의 선택 라운드가 4회 선택 라운드인, 방법.
- 제3항에 있어서, 서열분석이 심층 서열분석을 포함하고; 임의로 심층 서열분석이 파이로서열분석(pyrosequencing)인, 방법.
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