BR112015032557B1 - Método de identificação de um polipeptídeo de ligação que se liga especificamente a um antígeno da superfície celular - Google Patents

Abstract

MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO DE LIGAÇÃO QUE ESPECIFICAMENTE SE LIGA A UM ANTÍGENO DA SUPERFÍCIE CELULAR. A presente invenção refere-se a métodos e composições para a identificação de polipeptídeos de ligação (por exemplo, anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno) que especificamente se ligam a um antígeno da superfície celular. Os métodos da invenção geralmente compreendem o contato de uma biblioteca de exibição de ácido nucleico diversificada de polipeptídeos de ligação com um antígeno da superfície celular exposto na superfície exterior de uma célula de ligação; e o isolamento a partir da biblioteca de pelo menos um membro da biblioteca que se liga especificamente ao antígeno de superfície celular na superfície exterior da célula.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica a prioridade relacionada ao Pedido Provisório U.S. N°. 61/840.583, depositado em 28 de Junho de 2013, intitulada "Target Antigen Discovery and Phenotypic Screens", cujos conteúdos são aqui incorporados na sua totalidade.

ANTECEDENTES

[0002] Os polipeptídeos de ligação, tais como anticorpos e os seus fragmentos, são comercialmente importantes como agentes terapêuticos e de diagnóstico. Os métodos tradicionais de triagem para o polipeptídeo de ligação geralmente empregam antígenos solúveis. No entanto, para certos antígenos da superfície celular, os epítopos conformacionais sobre estes antígenos são alterados quando os antígenos são solubilizados a partir da membrana plasmática, o que resulta em uma falha na geração de polipeptídeos de ligação os quais podem reconhecer o antígeno nativo. Consequentemente, existe uma necessidade na técnica para novos métodos de triagem de polipeptídeos de ligação, os quais podem se ligar especificamente aos antígenos da superfície celular na sua conformação nativa.

SUMÁRIO

[0003] A invenção fornece métodos e composições para a identificação de polipeptídeos de ligação (por exemplo, anticorpos ou seus respectivos fragmentos de ligação ao antígeno) que especificamente se ligam a um antígeno da superfície celular. Os métodos da invenção geralmente compreendem o contato de uma biblioteca de visualização do ácido nucleico variegada de polipeptídeos de ligação com um antígeno da superfície celular exposto na superfície exterior de uma célula; e isolamento da biblioteca pelo menos um membro da biblioteca que se liga especificamente ao antígeno da superfície celular na superfície exterior da célula. Os métodos e composições da invenção são particularmente vantajosos pelo fato de que eles levam em conta a rápida identificação de polipeptídeos de ligação que se ligam nas formas nativas do antígeno da superfície da célula-alvo. Estes métodos e composições também levam em conta a identificação de novos antígenos ou epítopos específicos do tipo de célula terapeuticamente úteis.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0004] A Figura 1 é uma representação esquemática das composições de exibição de DNA exemplares e métodos de triagem da invenção.

[0005] A Figura 2 é uma representação esquemática das composições de exibição de DNA exemplares e métodos de triagem da invenção.

[0006] A Figura 3 é uma representação esquemática de estratégias exemplares empregadas de triagem de células-alvo nos métodos da invenção.

[0007] A Figura 4 é uma representação esquemática de estratégias exemplares empregadas de triagem paralela e de sequenciamento profundo nos métodos da invenção.

[0008] A Figura 5 é uma representação esquemática de estratégias exemplares empregadas de triagem paralela e sequenciamento profundo nos métodos da invenção.

[0009] A Figura 6 é uma representação esquemática de estratégias exemplares de triagem paralela e sequenciamento profundo empregadas nos métodos da invenção.

[0010] A Figura 7 é uma representação esquemática dos resultados das estratégias exemplares de triagem paralela empregadas nos métodos da invenção.

[0011] A Figura 8 representa um gráfico que mostra os resultados de um ensaio de ligação com base em FACS de moléculas VH de alta afinidade selecionadas, utilizando os métodos da invenção.

[0012] A Figura 9 representa gráficos que mostram a ligação diferencial de moléculas de VH selecionadas utilizando os métodos da invenção.

[0013] A Figura 10 representa gráficos que mostram a ligação diferencial de moléculas de VH selecionadas utilizando os métodos da invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA 1. Definições

[0014] Como aqui utilizado, o termo "biblioteca de exibição de ácido nucleico" refere-se a qualquer representação ligada ao genótipo- fenótipo livre de células in vitro reconhecida na técnica, incluindo, sem limitação, àquelas apresentadas, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos 7.195.880; 6.951.725; 7.078.197; 7.022.479; 6.518.018; 7.125.669; 6.846.655; 6.281.344; 6.207.446; 6.214.553; 6.258.558; 6.261.804; 6.429.300; 6.489.116; 6.436.665; 6.537.749; 6.602.685; 6.623.926; 6.416.950; 6.660.473; 6.312.927; 5.922.545 e 6.348.315, e na WO 2010/011944, que são todas aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

[0015] Como aqui utilizado, o termo "antígeno" refere-se à molécula reconhecida por um polipeptídeo de ligação.

[0016] Como aqui utilizado, o termo "especificamente se liga a" refere-se à capacidade de uma molécula de ligação (por exemplo, um domínio VH ou VL) de se ligar a um antígeno com uma afinidade de pelo menos cerca de 1 x 10~6 M, 1 x 10-7 M, 1 x 10-8 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, 1 x 10-12 M, ou mais, e/ou de se ligar a um alvo com uma afinidade que é pelo menos duas vezes maior do que a sua afinidade com relação a um antígeno não específico.

[0017] Como aqui utilizado, o termo "anticorpo" refere-se às moléculas de imunoglobulina compreendendo quatro cadeias de polipeptídeo, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) inter- conectadas pelas ligações de dissulfeto, assim como os seus multímeros (por exemplo, IgM). Cada cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada (abreviada VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada compreende três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve (abreviada VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante da cadeia leve compreende um domínio (CL1). As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes da complementaridade (CDRs), entremeadas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR).

[0018] Como aqui utilizado, o termo "parte de ligação ao antígeno" de um anticorpo inclui polipeptídeo ou glicoproteína de ocorrência natural, enzimaticamente obtido, sintético ou geneticamente planejado que se liga especificamente a um antígeno para formar um complexo. Os fragmentos de ligação ao antígeno de um anticorpo podem ser derivados, por exemplo, de moléculas de anticorpos completas utilizando quaisquer técnicas padrão adequadas tais como a digestão proteolítica ou técnicas de engenharia genética recombinante que envolve a manipulação e expressão do DNA que codifica os domínios variáveis e opcionalmente constantes do anticorpo. Exemplos não limitativos das partes de ligação ao antígeno incluem: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv (scFv) de cadeia simples; (vi) fragmentos dAb; e (vii) unidades de reconhecimento mínimas que consistem dos resíduos de aminoácido que imitam a região hipervariável de um anticorpo (por exemplo, uma região de determinação da complementaridade isolada (CDR)). Outras moléculas planejadas, tais como diacorpos, triacorpos, tetracorpos e minicorpos, também são incluídas dentro da expressão "parte de ligação ao antígeno".

[0019] Como aqui utilizados, os termos "domínio da VH" e "domínio da VL" referem-se aos domínios pesados e leves das variáveis de anticorpos individuais, respectivamente, compreendendo FR (regiões estruturais) 1, 2, 3 e 4 e CDR (regiões determinantes complementares) 1, 2 e 3 (ver Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest. (NIH Publication No. 91-3242, Bethesda)).

II. Antígenos da Superfície Celular

[0020] Em certos aspectos, a invenção fornece métodos de identificação de um polipeptídeo de ligação que especificamente se liga a um antígeno da superfície celular.

[0021] Qualquer antígeno que é capaz de ser exposto na superfície de uma célula pode ser empregado nos métodos da invenção, incluindo, sem limitação, antígenos de proteína, glicano e/ou lipídeo. Em certas modalidades, o antígeno é uma molécula que ocorre naturalmente. Exemplos não limitativos adequados de antígenos de ocorrência natural incluem proteínas da transmembrana (por exemplo, receptores acoplados à proteína G) e proteínas ancoradas a GPI. Em certas modalidades, o antígeno é um antígeno recombinante ou sintético de ocorrência não natural. Exemplos não limitativos adequados de antígenos de ocorrência natural incluem antígenos quiméricos compreendendo partes de diferentes moléculas de antígeno. Em certas modalidades, a identidade do antígeno é conhecida antes da pré-formação dos métodos da invenção. Em certas modalidades, a identidade do antígeno é desconhecida antes da pré-formação dos métodos da invenção.

[0022] Os antígenos da superfície celular empregados nos métodos da invenção podem ser expostos em qualquer célula ou partícula semelhante a célula (por exemplo, vesícula lipídica). Em certas modalidades, a célula é um tipo de célula que expressa naturalmente o antígeno da superfície celular. Em certas modalidades, a célula é uma célula recombinante que é planejada para expressar heterologamente o antígeno da superfície celular. Em certas modalidades, a célula é uma variante associada à doença de uma célula normal (e, g, uma célula tumoral).

III. Polipeptídeos de Ligação

[0023] Em certos aspectos, o invento fornece métodos de identificação de um polipeptídeo de ligação que se liga especificamente a um antígeno da superfície celular.

[0024] Qualquer tipo de polipeptídeo de ligação pode ser empregado nos métodos da invenção, incluindo, sem limitação, anticorpos ou seus fragmentos, e os domínios semelhantes a imunoglobulina. Os domínios semelhantes a imunoglobulina adequados incluem, sem limitação, domínios de fibronectina (ver, por exemplo, Koide et al. (2007), Methods Mol. Biol. 352: 95-109, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade), DARPin (ver, por exemplo, Stumpp et al. (2008) Drug Discov. Today 13 (15-16): 695701, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade), domínios Z da proteína A (ver, Nygren et al. (2008) FEBS J. 275 (11): 2668-76, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade), lipocalinas (ver, por exemplo, Skerra et al. (2008) FEBS J. 275 (11): 2677-83, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade), Affilins (ver, por exemplo, Ebersbach et al. (2007) J. Mol. Biol. 372 (1): 172-85, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade), Affitins (ver, por exemplo, Krehenbrink et al. (2008). J. Mol. Biol. 383 (5): 1058-68, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade), Avimers (ver, por exemplo, Silverman et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23 (12): 1556-61, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade), Fynomers, (ver, por exemplo, Grabulovski et al. (2007) J Biol Chem 282 (5): 3196-3204, que é aqui incorporado aqui por referência na sua totalidade), e peptídeos de domínio de Kunitz (ver, por exemplo, Nixon et al. (2006) Curr Opin Drug Discov Devel 9 (2): 261-8, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade). Em certas modalidades, o polipeptídeo de ligação é o domínio VH ou VL do anticorpo.

IV. Métodos de Apresentação da Superfície Celular

[0025] Em certos aspectos, a invenção fornece um método de identificação de um polipeptídeo de ligação que especificamente se liga a um antígeno da superfície celular, o método compreendendo: (a) colocar em contato uma biblioteca de exibição de ácido nucleico variegada de polipeptídeos de ligação com um antígeno da superfície celular apresentada na superfície exterior de um primeiro tipo de célula; e (b) isolar da biblioteca pelo menos um membro da biblioteca que se liga especificamente ao antígeno da superfície celular na superfície exterior do primeiro tipo de célula, identificando assim um polipeptídeo de ligação que especificamente se liga ao antígeno da superfície celular. Em certas modalidades, antes da etapa (a), a biblioteca de exibição de ácido nucleico variegada de polipeptídeos de ligação é colocada em contato com um segundo tipo de célula que não apresenta o antígeno exposto na superfície exterior, a fim de pré- limpar a biblioteca de polipeptídeos de ligação que especificamente não se ligam ao antígeno.

[0026] Em certos aspectos, o invento fornece um método de identificação de um polipeptídeo de ligação que se liga especificamente a um antígeno da superfície celular, o método compreendendo: (a) colocar em contato uma biblioteca de exibição de ácido nucleico variegada de polipeptídeos de ligação com um primeiro tipo de célula que expressa um antígeno da superfície celular, e isolar da biblioteca pelo menos um membro da biblioteca que especificamente se liga ao primeiro tipo de célula; (b) colocar em contato a biblioteca de exibição de ácido nucleico variegada de polipeptídeos de ligação com um segundo tipo de célula que não expressa o antígeno da superfície celular, e isolar da biblioteca pelo menos um membro da biblioteca que se liga especificamente ao segundo tipo de célula; e (c) selecionar os membros da biblioteca que especificamente se ligam ao primeiro tipo de célula, mas não no segundo tipo de célula, identificando assim um polipeptídeo de ligação que especificamente se liga ao antígeno da superfície celular.

[0027] As bibliotecas de exibição de ácido nucleico adequadas para uso nos métodos da invenção são apresentadas, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos 7.195.880; 6.951.725; 7.078.197; 7.022.479; 6.518.018; 7.125.669; 6.846.655; 6.281.344; 6.207.446; 6.214.553; 6.258.558; 6.261.804; 6.429.300; 6.489.116; 6.436.665; 6.537.749; 6.602.685; 6.623.926; 6.416.950; 6.660.473; 6.312.927; 5.922.545 e 6.348.315, e na WO 2010/011.944, que são todas aqui incorporadas por referência na sua totalidade. Em certas modalidades, a biblioteca de exibição de ácido nucleico variegada é uma biblioteca de exibição do DNA. Em uma modalidade, a biblioteca de exibição de ácido nucleico é uma biblioteca de exibição de DNA aqui descrita ou na WO 2010/011944, a qual é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

[0028] Em certas modalidades, cada membro da biblioteca de exibição de DNA compreende um polipeptídeo de ligação ligado através de um ligante de DNA interveniente a uma sequência de codificação de DNA que codifica o polipeptídeo de ligação, em que o ligante de DNA compreendendo um sítio de endonuclease de restrição (ver, por exemplo, a Figura 1). Qualquer sítio de endonuclease de restrição pode ser empregado. Em uma modalidade particular, o sítio de endonuclease de restrição não está presente na sequência de codificação do DNA de membros da biblioteca de exibição de DNA, evitando assim a clivagem da sequência de codificação de DNA após a digestão da endonuclease de restrição dos membros da biblioteca. Em uma modalidade particular, o sítio de endonuclease de restrição é um sítio Not1.

[0029] Em certas modalidades, é desejável separar fisicamente a sequência de codificação do DNA dos membros isolados da biblioteca a partir do polipeptídeo de ligação ligado. Quaisquer métodos de separação física podem ser empregados. Onde os membros isolados da biblioteca compreendem um ligante de DNA compreendendo um sítio de endonuclease de restrição (ver, por exemplo, a Figura 1), a separação física pode ser alcançada através da digestão da endonuclease de restrição dos membros isolados da biblioteca. As sequências de codificação do DNA liberadas resultantes podem ser ainda separadas dos complexos de polipeptídeo celulares/de ligação por qualquer método reconhecido na técnica, por exemplo, centrifugação.

[0030] Em certas modalidades, é desejável separar fisicamente os membros isolados intactos da biblioteca do primeiro e/ou segundo tipo de célula. Quaisquer métodos de separação física podem ser empregados. Em certas modalidades, os membros isolados da biblioteca são separados do primeiro ou segundo tipo de célula através da clivagem enzimática do antígeno da superfície celular. Quaisquer métodos de clivagem enzimática do antígeno podem ser empregados, por exemplo, clivagem enzimática da protease, lipídeo e/ou glicosidase. Em certas modalidades, onde o antígeno da superfície celular é ligado à superfície da célula por uma âncora de glicolipídeo, os membros isolados da biblioteca são separados do primeiro ou segundo tipo de célula através da clivagem de fosfolipase da âncora de glicolipídeo. Os membros da biblioteca isolados liberados resultantes podem ser ainda separados do primeiro ou segundo tipo de célula através de qualquer método reconhecido na técnica, por exemplo, centrifugação.

[0031] Assim que os membros da biblioteca que especificamente se ligam ao primeiro e/ou segundo tipo de célula forem isolados, a sequência de codificação de DNA destas moléculas pode ser determinada. Consequentemente, em certas modalidades, os métodos da invenção ainda compreendem a etapa de determinação da sequência de codificação de DNA de pelo menos uma parte dos membros isolados da biblioteca. Quaisquer meios reconhecidos na técnica para a determinação da sequência de DNA podem ser empregados. Em uma modalidade particular, a sequência de codificação de DNA é determinada através de técnicas de sequenciamento profundo da molécula isolada (por exemplo, pirossequenciamento). As técnicas de sequenciamento profundo de moléculas isoladas são bem conhecidas na especialidade (ver, por exemplo, aquelas descritas na US 6.210.891, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade). Em certas modalidades, onde os polipeptídeos de ligação são anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, a sequência de codificação de DNA da região de CDR3 é determinada. Em certas modalidades, as sequências de codificação de DNA do membro da biblioteca que se ligam ao primeiro e segundo tipos de célula são determinadas. Os membros da biblioteca que especificamente se ligam ao primeiro tipo de célula, mas não ao segundo tipo de célula, são considerados de compreender polipeptídeos de ligação que se ligam especificamente a um antígeno específico com relação ao primeiro tipo de célula.

[0032] Assim que um polipeptídeo de ligação que especificamente se liga ao antígeno da superfície celular foi identificado, pode ser expresso de modo heterólogo in vitro (por exemplo, nas células ou em um sistema de expressão livre de células) ou in vivo (por exemplo, num animal transgênico). Consequentemente, em certas modalidades, os métodos da invenção ainda compreendem a etapa de heterologamente expressar in vitro (por exemplo, nas células ou em um sistema de expressão livre de células) ou in vivo (por exemplo, num animal transgênico) o polipeptídeo de ligação identificado.

[0033] Em certas modalidades, a identidade do antígeno é conhecida antes da pré-formação dos métodos da invenção. No entanto, não é necessário conhecer a identidade do antígeno. De fato, em certas modalidades, a identidade do antígeno é desconhecida antes da pré-formação dos métodos da invenção. Assim, neste último caso, os métodos da invenção levam em conta a identificação de novos antígenos e epítopos presentes na superfície de um tipo de célula de interesse (por exemplo, uma célula tumoral).

[0034] Em certas modalidades, os métodos aqui descritos compreendem a seleção de polipeptídeos de ligação que são capazes da internalização funcional após a ligação com o antígeno da superfície celular. Tais polipeptídeos de ligação são particularmente úteis para a produção de conjugados de medicamento, porque eles levam em conta a liberação de um medicamento citotóxico no interior de uma célula-alvo. Qualquer metodologia para a triagem com relação à internalização funcional pode ser empregada. Por exemplo, a biblioteca de exibição de ácido nucleico variegada de polipeptídeos de ligação pode ser colocada em contato com as células-alvo em condições que levam em conta a internalização do polipeptídeo de ligação (por exemplo, durante cerca de uma a duas horas a 37°C). As células podem então ser lavadas e submetidas a lise com tampão de lise de células na presença de inibidores da protease. Os membros da biblioteca internalizados podem então ser precipitados com etanol e as sequências de codificação de DNA enriquecidas através da amplificação por PCR.

[0035] Os métodos aqui descritos podem ser aplicados a qualquer processo de descoberta do epítopo-alvo. Por exemplo, os epítopos- alvo podem incluir: domínios residentes para a inflamação; epítopos- alvo específicos do tumor de tumores primários com ou sem resistência ao tratamento, linhagens celulares tumorais, e tumores que abrigam quaisquer mutações que possam resultar em neoepítopos; e outros epítopos específicos da doença que servem como mediador do mau funcionamento específico da doença e são direcionados para a terapia biológica.

[0036] Os métodos aqui descritos também podem ser aplicados para a descoberta de biomarcadores para monitorar a presença ou ausência de epítopos particulares da superfície celular ao longo de um curso de um tratamento medicamentoso aos pacientes. Os anticorpos derivados da descoberta de biomarcadores também podem ser utilizados como ferramentas para a detecção de biomarcadores.

[0037] Adicional ou alternativamente, os métodos aqui descritos podem ser aplicados para direcionar ou descobrimento do epítopo em outras espécies, tais como em animais transgênicos e modelos de doenças animais.

V. Exemplificação A. Sumário

[0038] Uma biblioteca da VH do anticorpo totalmente humano obtida da medula óssea, sangue periférico e esplenócitos de doadores humanos foi construída e numerosos ligantes de alta afinidade e específicos da VH para múltiplos alvos foram identificados utilizando a tecnologia de exibição de dsDNA. Os epítopos específicos de célula- alvo foram identificados através da seleção de células vivas e análise de sequenciamento de profundo utilizando a biblioteca da VH humana e tecnologia de exibição dsDNA. Estratégias de seleções paralelas diferenciais e seleções seletivas da célula-alvo foram aplicadas nestes métodos (ver as Figuras 4, 5, 6). A tabulação da frequência de CDR3 a partir do sequenciamento profundo de todos os recursos através de todas as rodadas previu a seletividade dos clones de VH. As VHS de elevada afinidade foram identificadas as quais se ligam seletivamente às células-alvo e tipos de células relacionados.

B. Planejamento da biblioteca e métodos de seleção para o descobrimento do epítopo de células vivas

[0039] Dois métodos foram desenvolvidos para recuperar efetivamente os membros da biblioteca que se ligam às células vivas.

[0040] O primeiro método envolveu a extração de ligantes das células vivas através da digestão de restrição do DNA fundido com os anticorpos ligados. Este método permite a recuperação completa das VHs ligadas a todos os epítopos nas células. Um C-terminal da biblioteca de DNA da VH foi planejado para carregar um sítio de restrição Notl (ver a Figura 1). Não existe nenhum sítio Notl nas estruturas de VH simples e, portanto, apenas os ligantes de VH de comprimento total são eluídos a partir das células para a subsequente amplificação. O tampão de digestão de restrição Notl foi testado nas células vivas, e com até duas horas de incubação a 37°C as células eram viáveis. A eficiência da digestão NotI foi alta. Após a ligação da biblioteca às células durante uma hora a 4°C, as células foram lavadas e digeridas com tampão de NotI a 37°C durante uma hora, as células foram então centrifugadas, o sobrenadante (contendo DNA da VH ligado) foi coletado para a amplificação por PCR (ver a Figura 1).

[0041] O segundo método é cortar os ligantes de VH das células vivas utilizando a digestão de fosfolipase C (PLC). Este método permite a eluição das VHS que se ligam aos epítopos de qualquer proteína da membrana ancorada por GPI (isto é, um subconjunto de epítopos). A eficiência de corte por PLC é elevada, como validado em FACS com a molécula de controle. Após a incubação da biblioteca com as células durante uma hora a 4°C, as células foram lavadas e incubadas com a PLC a 37°C durante 15 minutos. As células foram subsequentemente centrifugadas e o sobrenadante, contendo a VH em fusão complexada com o domínio extracelular da proteína de membrana ancorada por GPI, foi amplificado por PCR (ver a Figura 2).

C. Seleções paralelas, seleções diferenciais e seleções seletivas de células-alvo no alvo e tipos de células relacionadas/indesejadas

[0042] A biblioteca de fusão simples principal foi produzida de acordo com o protocolo apresentado na WO 2010/011944 (que é aqui incorporada por referência na sua totalidade). Para a primeira rodada de seleção, a biblioteca de fusão purificada foi dividida igualmente em várias bibliotecas que carregam a mesma diversidade para todos as ramificações de seleção (ver a Figura 5).

[0043] As células primárias, obtidas a partir de doadores normais ou pacientes, foram descongeladas frescas ou isoladas de frascos de cultura de células, seguindo os protocolos de biologia celular padrão. As células foram então recuperadas durante uma hora em meio completo a 37°C seguido pelo bloqueio em tampão de seleção durante 30 minutos em gelo. Todas as seleções foram realizadas em gelo para evitar o anticorpo e a internalização alvo.

[0044] Para as seleções paralelas, as bibliotecas foram pré- purificadas com 200 μl de glóbulos de estreptavidina pré-bloqueados e 200 μl de glóbulos de hlgG-Epóxi pré-bloqueados durante 30 minutos na temperatura ambiente sequencialmente para remover qualquer má dobradura e membros da biblioteca pegajosos. As bibliotecas pré- purificadas foram depois esfriadas em gelo e submetidas às células pré-bloqueadas e incubadas em gelo durante uma hora.

[0045] Para as seleções seletivas de células-alvo, a pré-depuração foi executada em tipos de células indesejadas e intimamente relacionadas durante uma hora em gelo para remover quaisquer ligantes não seletivos e depois submetidos nas células-alvo.

[0046] Na rodada de seleção 4, métodos de seleção diferenciais foram aplicados às ramificações da seleção nas células-alvo (com e sem a pré-apuração sobre as células). Nesta rodada, as bibliotecas foram divididas em vários tubos e ligadas a cada tipo de célula e nas células do paciente de diferentes estágios das doenças em paralelo. Esta estratégia levou em conta a comparação direta das células-alvo versus outros tipos de células através da análise de sequenciamento profundo e identificação dos ligantes que reconhecem os epítopos diferentes que surgiram com a progressão da doença (ver a Figura 6).

[0047] Para todas as ramificações de seleção, após a ligação, as células foram lavadas com 10 ml de tampão de ligação e submetidas à digestão de restrição Notl para recuperar todos os ligantes na proteína da membrana ou corte por PLC para recuperar os ligantes nas proteínas da membrana ancoradas por GPI como acima descrito.

D. Análise de sequenciamento profundo para prever os ligantes seletivos nas células-alvo

[0048] Após cada rodada de seleção, as misturas de ligação foram amplificadas por PCR. O HCDR3 de cada mistura de ligação foi recuperado por PCR com a carga de oligos C-terminal da estrutura 3 e N-terminal da estrutura 4 de fragmentos da VH. Estes fragmentos HCDR3 derivados das rodadas de seleção individuais e ramificações foram então marcados com código de barras de DNA específico utilizados para o sequenciamento Illumina pela PCR. Os HCDR3 marcados foram reunidos e enviados para o sequenciamento de produção elevada com tecnologia Hi Seq. As misturas de ligação da rodada 4 a partir das células-alvo também foram marcadas com o código de barras de DNA e submetidas para sequenciamento 454 para obter as sequências da VH de comprimento total.

[0049] As sequências foram deconvoluídas com base no código de barras do DNA após o sequenciamento. Milhões de sequências derivadas de cada rodada de seleção e ramificação de seleção foram dispostas em forma de tabela através da comparação da frequência de uma sequência de CDR3 particular presente em diferentes rodadas e ramificações de seleção. Os critérios utilizados para a identificação de ligantes seletivos foram: 1) o enriquecimento específico de uma sequência de CDR3 da rodada mais no princípio até a rodada posterior sobre as células-alvo, não sobre os tipos de células de controle ou intimamente relacionadas; 2) frequência mais elevada sobre o tipo de célula específico do alvo e baixa sobre o tipo de célula de controle ou intimamente relacionada na rotada de seleção diferencial (ver a Figura 7); e 3) sequências não presentes em outras seleções alvos ou celulares de outros programas no banco de dados. Os clones seletivos identificados pelo sequenciamento de Ilumina foram então sintetizados com base na informação da sequência de comprimento completo 454.

E. Produção, purificação e ensaios de ligação FACS

[0050] As misturas de ligação e VHs sintetizadas foram então subclonadas em vetores de expressão pET22b. As VHs foram produzidas em células de E. coli BL-21 e purificadas através do C- terminal His tag utilizando protocolos padrão. O ensaio de FACS foi executado para avaliar a ligação e seletividade das VHs em diferentes tipos de células e a EC50 dos ligantes. Os ligantes da VH de alta afinidade e seletivos foram identificados através do processo de seleção de células vivas (ver as Figuras 8, 9 e 10).

Claims (17)

1. Método de identificação de um polipeptídeo de ligação que se liga especificamente a um antígeno da superfície celular, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) colocar em contato uma biblioteca de exibição de DNA variegada livre de células de polipeptídeos de ligação com um antígeno da superfície celular exibido na superfície exterior de um primeiro tipo de célula, em que cada membro da biblioteca de exibição de DNA compreende um domínio VH de anticorpo ligado através de um ligante de DNA interveniente a uma sequência de codificação de DNA que codifica o polipeptídeo de ligação, e em que o ligante de DNA compreende um sítio de endonuclease de restrição que não está presente na sequência de codificação de membros da biblioteca de exibição de DNA; (b) isolar da biblioteca pelo menos um membro da biblioteca que se liga especificamente ao antígeno de superfície celular na superfície externa do primeiro tipo de célula; (c) separar a sequência de codificação de DNA dos membros da biblioteca isolados do polipeptídeo de ligação ligado por digestão com endonuclease de restrição no sítio de endonuclease de restrição não presente na sequência de codificação dos membros da biblioteca de exibição de DNA; e (d) determinar a sequência de codificação de DNA de pelo menos uma porção dos membros da biblioteca isolados, em que a sequência de codificação de DNA da região CDR3 é determinada.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método é realizado para cada uma de uma pluralidade de rodadas de seleção; opcionalmente, em que a pluralidade de rodadas de seleção compreende 2, 3 ou 4 rodadas de seleção.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a determinação da sequência codificadora de DNA de pelo menos uma porção dos membros isolados da biblioteca compreende: (a) amplificar o conjunto de ligação por reação em cadeia da polimerase (PCR); (b) levantar fragmentos de HCDR3 do conjunto de ligação por PCR com iniciadores de oligonucleotídeo C-terminal da estrutura 3 e N-terminal da estrutura 4 de VH; (c) marcar os fragmentos de HCDR3 amplificados com um código de barras de DNA específico para a rodada individual de seleção; (d) sequenciar os fragmentos de HCDR3 marcados com um código de barras; e (e) deconvoluir sequências de fragmentos de HCDR3 com base em sequências de código de barras de DNA, identificando assim um polipeptídeo de ligação como aquele que se liga especificamente ao antígeno de superfície celular quando há enriquecimento específico de um fragmento de CDR3 de uma rodada anterior para uma rodada posterior em células alvo.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a biblioteca de exibição de DNA de polipeptídeos de ligação é derivada de uma biblioteca VH naive.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a biblioteca de exibição de DNA de polipeptídeos de ligação é derivada de uma biblioteca de VH naive humana.

6. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a sequência de codificação de DNA é determinada por sequenciamento profundo, opcionalmente em que o sequenciamento profundo é pirosequenciamento.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o antígeno é uma proteína, glicano ou lipídio de ocorrência natural.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o antígeno é uma proteína ancorada em glicofosfatidilinositol (GPI).

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o primeiro tipo de célula é uma célula que expressa naturalmente o antígeno de superfície celular.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o primeiro tipo de célula é uma variante associada à doença de uma célula normal.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o primeiro tipo de célula é uma célula tumoral.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de ligação é um anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o primeiro tipo de célula é uma célula viva.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que, antes da etapa (a), a biblioteca de polipeptídeos de ligação de exibição de DNA variegada é pré-limpa com um segundo tipo de célula que não exibe o antígeno de superfície celular em sua superfície externa.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o primeiro tipo de célula é uma célula tumoral; e opcionalmente em que o segundo tipo de célula é uma célula normal.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o primeiro tipo de célula é uma célula recombinante que é projetada para expressar de forma heteróloga o antígeno de superfície celular.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o antígeno de superfície celular é um antígeno recombinante ou um antígeno quimérico.