JP2012504415A - 改良rnaディスプレイ法 - Google Patents
改良rnaディスプレイ法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2012504415A JP2012504415A JP2011530178A JP2011530178A JP2012504415A JP 2012504415 A JP2012504415 A JP 2012504415A JP 2011530178 A JP2011530178 A JP 2011530178A JP 2011530178 A JP2011530178 A JP 2011530178A JP 2012504415 A JP2012504415 A JP 2012504415A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- mrna
- scfv
- antibody
- library
- antigen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54326—Magnetic particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1041—Ribosome/Polysome display, e.g. SPERT, ARM
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/534—Production of labelled immunochemicals with radioactive label
Abstract
Description
本願は、これによりその内容が参照によって本明細書に組み込まれている、2008年9月30日に出願された米国仮出願第61/101471号に基づく優先権を主張する。
本開示は、RNAディスプレイに関し、特に可溶性および細胞表面抗原の選別を可能にするRNAディスプレイ法に関する。
ほぼどのような構造的エピトープでもそれと高い特異性および親和性で結合し、リサーチツールとして、またFDAに認可された治療薬として日常的に使用される抗体を選別することができる。その結果、治療用および診断用モノクローナル抗体は、世界中で数十億ドル規模のマーケットを構成している。
本発明は、発現ライブラリーからscFv分子の確実な発現および選別を可能にする、インビトロRNAディスプレイの改良法を提供することによって上述の課題を解決する。本発明の方法は、scFv分子の発現および選別に特に適しているが、可溶性および細胞表面抗原の両方を含むあらゆるクラスのタンパク質のインビトロディスプレイにも都合が良い。
配列番号
本明細書に参照されているヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、次の配列番号を付与されている。
配列番号1−MAK195scFvタンパク質配列のアミノ酸配列。
配列番号2−Y61scFv短タンパク質配列のアミノ酸配列。
配列番号3−Y61scFv長タンパク質配列のアミノ酸配列。
配列番号4−Y61scFv Gene3タンパク質配列のアミノ酸配列。
配列番号5−D2E7scFv短タンパク質配列のアミノ酸配列。
配列番号6−D2E7scFv中タンパク質配列のアミノ酸配列。
配列番号7−D2E7scFv長タンパク質配列のアミノ酸配列。
配列番号8−17/9scFv短タンパク質配列のアミノ酸配列。
配列番号9−17/9scFv長タンパク質配列のアミノ酸配列。
配列番号10−MAK195scFvヌクレオチド配列の核酸配列。
配列番号11−Y61scFv短ヌクレオチド配列の核酸配列。
配列番号12−Y61scFv長ヌクレオチド配列の核酸配列。
配列番号13−Y61scFv Gene3PAヌクレオチド配列の核酸配列。
配列番号14−Y61scFv Gene3ヌクレオチド配列の核酸配列。
配列番号15−D2E7scFv短ヌクレオチド配列の核酸配列。
配列番号16−D2E7scFv中ヌクレオチド配列の核酸配列。
配列番号17−D2E7scFv長ヌクレオチド配列の核酸配列。
配列番号18−17/9scFv短ヌクレオチド配列の核酸配列。
配列番号19−17/9scFv長ヌクレオチド配列の核酸配列。
用語「抗体」は、モノクローナル抗体(完全長モノクローナル抗体等)、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、キメラ抗体、CDR移植抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、マウス抗体およびそれらの断片、例えば、抗体L鎖(VL)、抗体H鎖(VH)、単鎖抗体(scFv)、F(ab’)2フラグメント、Fabフラグメント、Fdフラグメント、Fvフラグメントおよび単領域抗体フラグメント(dAb)を含む。
本発明は、発現ライブラリーからscFv抗体分子の確実な発現および選別を可能にするインビトロRNAディスプレイの改良法を特徴とする。
本発明はその一態様において、改良インビトロRNAディスプレイスクリーニング法を特徴とする。概要方法は、次の通りである。
1種類以上のインビトロ抗体DNA発現ライブラリーが転写され、mRNAを生成する。どのようなインビトロ抗体発現ライブラリー(例えば、VH、VLまたはscFvライブラリー)も適切であるが、本発明の方法はscFvライブラリーに特によく適している。技術分野で認識されているどの転写方法も適切である。RNA転写後、DNAライブラリーテンプレートは除去される。この操作は、技術分野で認識されている任意の方法、例えばDNaseIによる消化を用いて行うことができる。
RNA/タンパク質融合体のライブラリーは、所望の標的とのインビトロ結合に対してスクリーニングされる。一般に、標的分子は、固体支持体、例えばアガロースビーズに結合する。一実施形態において、標的分子は固体基質と直接結合する。別の一実施形態において、標的分子は先ず修飾、例えばビオチン化され、続いて修飾標的分子は修飾を介して固体基質、例えばストレプトアビジン−M280、ニュートラアビジン−M280、SA−M270、NA−M270、SA−MyOne、NA−MyOne、SA−アガロースおよびNA−アガロースと結合する。他の実施形態において、固体支持体は、磁気ビーズ、例えばDynabeadsをさらに含む。このような磁気ビーズによって、固体支持体とそれに結合した任意のRNA/抗体融合体をアッセイ混合液から磁石を用いて分離できる。
本発明のライブラリーは、標的に結合できる任意の抗体断片から作製され得る。一実施形態において、抗体可変領域のライブラリーが作製される。これは、VHおよび/またはVL領域となることができる。別の一実施形態において、scFvライブラリーが作製される。
抗体核酸ライブラリーは、ペプチドアクセプター部分を含むよう修飾され得る。この操作は、核酸発現ライブラリーの個々のメンバーとその同系タンパク質産物との共有結合を容易にする。例えばその内容が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第5,643,768号、米国特許第5,658,754号、米国特許第7,195,880号および米国特許第6,951,725号に記載されている手段等、技術分野で認識されているペプチドアクセプターを核酸に結合する任意の手段が企図される。
本発明はその一態様において、本発明の発現ライブラリーをスクリーニングして所望の抗原と結合できる抗体を同定する方法を特徴とする。抗体の標的分子への結合に基づいて発現ライブラリーから抗体の選別を可能にする任意のインビトロまたはインビボスクリーニング法が企図される。
他に記載がなければ、実施例を通じて次の材料と方法が用いられた。
一般に、他に断りがなければ、本発明の実施において、化学、分子生物学、組換えDNA技術、免疫学(特に、例えば免疫グロブリン技術)および畜産業における従来の技法が用いられる。例えば、Sambrook、FritschおよびManiatis、Molecular Cloning:Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989);Antibody Engineering Protocols(Methods in Molecular Biology)、510、Paul、S.、Humana Pr(1996);Antibody Engineering:A Practical Approach(Practical Approach Series、169)、McCafferty、Ed.、Irl Pr(1996);Antibodies:A Laboratory Manual、Harlowら、C.S.H.L.Press、Pub.(1999);Current Protocols in Molecular Biology、eds.Ausubelら、John Wiley&Sons(1992)を参照。
mRNAディスプレイは、図2に示されている方法に従って行うことができる。この方法の特定の実施形態はより詳細に後述される。これら実施形態は、本発明の方法を説明することを目的としており、限定するものであると理解するべきでない。
ライブラリーDNAコンストラクトは、本技術分野で公知の抗体ライブラリー作製方法に従って設計することができる。一実施形態において、ライブラリーコンストラクトは、抗体断片、すなわち抗体L鎖断片(VL)または抗体H鎖断片(VH)をコードすることができる。例示的な実施形態において、ライブラリーコンストラクトは、単鎖可変断片(scFv)をコードすることができる。
一般に、mRNAディスプレイ抗体ライブラリーは、ビオチン化抗原に対して選別することができる。各標的に対する最良の抗原は、ケースバイケースの原則に従って決定するべきであるが、次の記載は一般的ガイドラインとして用いることができる。標的抗原は、通常十分に特徴付けられ、多型(SNPおよびハプロタイプ)および/または薬理遺伝学的解析によって決定されるような、関連または優性遺伝アイソタイプである。標的抗原はさらに適切な生物活性(天然の抗原と同等の)、十分な溶解度ならびに化学的および物理的特性を有することができ、ライブラリー選別すなわちスクリーニングおよび下流のバイオアッセイに十分な量を調製することができる。
ライブラリーDNAおよびその選別アウトプットは、PCRによって増幅することができる。PCR増幅は、本技術分野で公知の方法を用いて行うことができる。PCR反応液は通常、DNAテンプレート、反応バッファー、dNTP、増幅用プライマー、DNAポリメラーゼおよび水を含む。複数の反応チューブをマスターミックスから一度に調製し、増幅DNA収量を増加することができる。25サイクルのPCRによって通常十分な増幅がもたらされるが、より多くの産物を得るために35サイクルもの回数を用いてもよい。
産物が正確なサイズ(scFvは、ほぼ850bp、VHまたはVLライブラリーは、ほぼ500bp)であり、最小限の非特異的産物を含む場合、産物は転写反応に直接用いることができる。あるいは、産物は調製用アガロースゲルにおいて正確なサイズの特異的なバンドを切り出して精製することができる。DNA濃度は分光計で測定することができる。
ライブラリーDNAからRNAの転写は、本技術分野で公知の標準的な方法を用いて行うことができる。大量の反応容量を用いて、全ライブラリー多様性を標本抽出するのに十分なDNAテンプレートを転写することができる。例示的な一実施形態において、1×1013コピーのライブラリーテンプレートをRNA転写反応に用いることができる。RNA転写液は、通常5−10μgのPCR産物、反応バッファー、ATP、CTP、GTP、UTPおよびT7RNAポリメラーゼを含む。RNA転写反応は37℃で2時間から一晩の間行うことができる。選別の最初のラウンドの後、より短い時間を用いてもよいが、一晩の温置によって反応のRNA収量を最大化することができる。RNA転写の後、DNAテンプレートはDNaseI消化によって反応混合液から除去できる。
転写後、RNAはNAP−10カラムを用いて分画することができる。最大約1mLの転写反応液が、RNA精製のためNAP−10カラムに装填できる。カラムは、分画前にDEPC処理dH2Oを用いて平衡化することができる。RNAは、約1.5×反応容量のDEPC処理dH2O(例えば、500μLの転写反応液につき750μL)を用いてカラムから溶出できる。全溶出容量は、転写反応液の容量の約150%未満となることができる。さらに、またはあるいは、RNAはNAP−25カラムを用いて分画できる。
RNAサンプルのサイズおよび収量は、ゲル電気泳動を用いて、あるいは収集した画分におけるRNA濃度の260nmのOD(OD260)を測定することによって分析できる。例えば、scFv RNAのモル濃度は、次の通り計算できる。
[RNA](μM)=[RNA](mg/mL)×106/(850×330)
=OD260×希釈係数×40(μg/mL)×1000/(850×330)
RNA収量(nmol)=[RNA](μM)×容量(μL)/1000
RNA収量は、通常500μLの転写反応液につき約20nmol/mLの最高値に達する。
ペプチドアクセプター分子をその3’末端に備えるDNAリンカーは、UV架橋によって各RNA分子の3’末端と共有結合的ライゲーションを行う。リボソームA部位に入り込んで未完成ポリペプチド鎖のカルボキシル末端に共有結合できるペプチドアクセプターは、mRNA(遺伝子型)の、該mRNAによってコード化されたタンパク質(表現型)との共有結合的関連を最終的に可能にできる。次式を有する例示的なPEG6/10リンカーを用いることができる。
5’(ソラレンC6)2’OMe(UAGCGGAUGC)XXXXXXCC(ピューロマイシン)3’(配列番号20)
例示的な一実施形態において、全反応および精製の後、ほぼ約0.1%のインプットRNAをmRNAディスプレイ分子へと作製することができる。インビトロ翻訳は、当業者に知られた方法と試薬を用いて行われる。一実施形態において、scFvライブラリーを用いた翻訳反応は、約15mLの反応容量における約5nmolのRNAテンプレートと約10mLの網状赤血球ライセートを用いる。
翻訳反応後、300μLの翻訳反応混合液につき約100μLの2M KClおよび約20μLの1M MgCl2を添加し、約1時間室温または−20℃で一晩温置することができる。あるいは、1.5mlの翻訳反応混合液につき約500μLの2M KClおよび約100μLの1M MgCl2を添加し、約1時間室温または−20℃で一晩温置することができる。この操作は、mRNAテンプレート末端における休止リボソームを安定化し、DNAリンカー末端のピューロマイシンを休止リボソームのA部位に挿入し、これにより翻訳されたscFvタンパク質とそのmRNAテンプレートとを永続的に接続する。反応液が−20℃で一晩保存される場合、室温の温置は短縮できる。反応は、300μLまたは1.5mlの翻訳反応液につきそれぞれ約50μLまたは約250μLの0.5M EDTAを加えてリボソームを停止することによって終了できる。反応液は−20℃で保存できる。5−10μLアリコートを後のシンチレーション計数のため取り分けることができる。
このステップは、mRNAディスプレイ分子および残存RNAテンプレートを翻訳/融合反応液から精製するために含まれる。オリゴdT結合のため、全RNAテンプレートを捕集するのに必要な、前洗浄したオリゴdTセルロース量を概算するべきである。十分量のオリゴdT結合バッファーは、約1×最終濃度となるよう融合反応液に加えることができる。次に、前洗浄したオリゴdTセルロースが加えられ、反応液は1時間、4℃で回転することができる。反応液は、場合によって約1500rpm、5分間、4℃でスピンダウンすることができ、上清は廃棄される。オリゴdTセルロースビーズを移し、スピンカラムを用いて1×オリゴdT結合バッファーで約6回洗浄することができ、バッファーは通常、カラムを約1000rpm、10秒間スピンすることによって除去される。貫流液は廃棄してよいが、最後の洗浄液はシンチレーション計数のため取っておくことができる。塩濃度を低下させて溶出を容易にするため、最初のスラリー容量の1/10のdH2Oを乾燥オリゴdTビーズに添加し、即座に10秒間遠心分離して貫流液を廃棄することができる。mRNAディスプレイ分子(および遊離RNAテンプレート)は、ビーズにdH2Oを加えて5分間室温で温置することによって溶出できる。溶出液は、約4000rpm(以上)で20秒間スピンすることによって収集できる。溶出は通常1回繰り返し、溶出液を合わせる。5μLの溶出液をシンチレーション計数のため取り分けることができる。場合によって、オリゴdT精製効率は、NanoDrop分光装置の260nmのOD(OD260)によって評価することもできる。理論的に、全残存RNAテンプレートおよびmRNAディスプレイ分子がオリゴdTビーズによって回収される。5×FLAG結合バッファーが、約1×最終濃度になるよう溶出液に加えられる。サンプルは、次のFLAG精製ステップに進まない場合、−80℃で保存することができる。
・VH−Vκ scFvは約3μM
・VH−Vλ scFvは約2−3μM
・VHは約2μM
・Vκは約2μM、および
・Vλは約1μM
これらの数値は平均であり、生殖細胞系列の配列に基づいており、当業者であれば、ライブラリーが特定の配列へと濃縮するに従って、これらが選別ラウンドにわたって変化し得ることを理解できる。
このステップは、残存RNAテンプレートからmRNAディスプレイ分子を精製するよう設計されている。ライブラリーが抗原オフレート競合によってまたは抗原発現細胞によって選別される場合、このステップに進む必要はない。全mRNAディスプレイ分子の捕集に必要とされる、前洗浄された抗FLAG M2アガロースビーズの量を概算することができる。一実施形態において、ビーズの結合能力は、50%スラリー1mL当たり約6nmol融合タンパク質となることができる。結合と洗浄における操作に十分なビーズ容量を有するために、少なくとも約200μLの前洗浄されたビーズを用いることが推奨される。後述の例は、最初の翻訳反応液300μLに対するものである。
PROfusion分子回収%=(CPMアウトプット×容量アウトプット)/(CPMインプット×容量インプット)
選別は、ライブラリーの抗原への結合が平衡に達したときに目的の標的に特異的に結合する分子を濃縮するように設計される。ネガティブ選別(プレクリア)は、非特異的およびマトリックスバインダーを未処理scFvライブラリーから除去するのに必要となり得るが、単一のテンプレートから作製されたライブラリー、例えば単一scFvテンプレートに基づいて親和性成熟を行う、親和性成熟のために作製されたライブラリーが挙げられるがこれらに限定されない、を用いる場合省略することができる。標的フォーマットに依存して選別プロトコールは異なる。次に、ビオチン化標的を用いた使用のための例示的な選別プロトコールを記載する。このプロトコールは、他のフォーマットの標的抗原に適合するよう修正することができ、所望のアウトプットに応じてスケールアップまたはスケールダウンすることができる。
ストレプトアビジン(SA)磁気ビーズは、捕集のため用いることができ、通常使用前にプレブロッキングすることができる。SAビーズは、原瓶から1.5または2mLチューブに移して2mLの1×FLAG結合バッファーで2回洗浄することができる。ビーズは2mLの選別バッファーで(2時間から一晩)4℃で回転しながらブロッキングすることができる。プレクリアと選別捕集の両方に十分なビーズを調製することが重要である。プレブロッキングされたビーズは4℃で保存することができる。10pmolのビオチン化抗原につき約100μLのビーズが通常用いられるが、捕集ビーズ容量は、反応収量に対する遊離ビオチンの結合能力(例えば、ビーズ濃度が通常10mg/mlである場合、650−900pモル/mgビーズ)を考慮して計算するべきことを当業者であれば理解できる。
選別の第一ラウンドのため、ビオチン化標的(100nM)をプレクリアしたライブラリー全体に添加して、30℃で1時間回転することができる。後期選別ラウンドのため、抗原結合分子の回収が1%を超えることが予想される場合、プレクリアしたライブラリーは、2個の等量アリコートに分注することができる。ビオチン化抗原は一方のアリコートに加えることができ、他方のアリコートは「抗原無し」ネガティブコントロールとなることができる。あるいは、上述の通り、洗浄した第二のプレクリアビーズは、より「プレクリア」でないことになるが、「抗原無し」コントロールであると考えることができる。後期ラウンドにおける抗原濃度は、抗原結合分子の回収が5%を超える場合減少させることができる。特に、抗原濃度は、抗原が「粘着性」であるように思われ、顕著な回収が初期ラウンドで観察される場合、減少させるべきである。抗原濃度は、抗原結合分子の回収がバックグラウンドより(例えば、抗原無しコントロールに対して)顕著に高くなる場合、後期ラウンドで減少させてよい。ライブラリーと抗原との間の化学量論に注意して、特に抗原濃度が低い場合、ライブラリーPROfusion分子より少なくとも5倍モル過剰の抗原が含まれていることを確実にすることが重要である。
ライブラリー捕集用SAビーズのブロッキングに用いられている選別バッファーは、遠心分離と磁気選別によって除去することができる。抗原と結合したライブラリーは、プレブロッキングされたSAビーズ(バッファーから分離)、次に結合反応液へと移され、30℃で5−10分間回転した。捕集用SAビーズ量は、結合能力および選別に用いられている標的の濃度(上述を参照)に基づいて計算するべきである。SAビーズ量は、SAビーズバインダーを抑制するため標的濃度を下げる場合少なくするべきであるが、通常50μL以上のビーズが用いられる。
磁石を用いてSAビーズを捕集し、約1mLの選別バッファーで1分間洗浄することができる。このステップは、約5回繰り返すことができる(合計約6回)。洗浄回数を後期ラウンドで増やして、オフレート選別戦略を一部の標的に取り込むことができる。ビーズは、最後の1回は約1mLの逆転写に適切な1×バッファーで洗浄して磁石で捕集し、水(上で計算された捕集ビーズ容量の4分の1)に再懸濁することができる。
ラウンド3から始めて、最後の洗浄液およびビーズの約10−20%を計数する。計数を抑える可能性があるため、100μLより多いビーズを計数することは望ましくない。ライブラリー選別回収は次式に従って計算することができる。
選別回収%=100×CPM全ビーズ/CPM全インプット
別の一実施形態において、ライブラリー選別は、抗体Fc領域と結合した標的抗原(例えば、Fc融合タンパク質)に対して行うことができる。ネガティブ選別(プレクリア)は、未処理抗体ライブラリーから非特異的およびマトリックスバインダーを除去するために必要となり得るが、親和性成熟には省略してよい。選別特異性は、標的抗原をヒトIgG1とマウスIgG2aの両方と融合することによって改善することができる。ライブラリー選別においてFc融合タンパク質中に異なるFc領域を有することによって、Fc領域特異的なライブラリーバインダーを同定するリスクを最小限に抑えることができる。この操作はまた、ライブラリーバインダーを2種類の異なる磁気ビーズ(プロテインGおよび抗マウスIgG)によってプルダウンすることもでき、これによりさらに抗プロテインGまたは抗−抗マウスIgGバインダーを回収する可能性を低減させることができる。標的Fc融合タンパク質は、ビオチン化し、本明細書に記載されている方法か上述第13節の方法のいずれかによって選別することができる。抗体VH領域の特定部位(例えば、ヒトVH3ファミリー生殖細胞系列の配列に由来するVH)との交差反応のため、プロテインA磁気ビーズがFc融合タンパク質標的に対する選別に適さない可能性を留意するべきである。scFv−PROfusion分子と結合する抗原のプルダウンに適切な磁気ビーズは、DynabeadsプロテインG、Dynabeads全マウスIgGおよび他のヒトまたはマウスIgGに利用可能なDynabeads M−280を含むが、これらに限定されるものではない。一般に、プロテインGビーズの結合能力は、プロテインA/G磁気ビーズ100μLにつき約25μgのヒトIgG1(ほぼ167pmol)であると考えられる。
DynabeadsプロテインGまたはDynabeads全マウスIgG(標的抗原がマウスFc融合タンパク質である場合)は、捕集のため用いることができ、通常使用前にプレブロッキングされる。ライブラリーのプレクリアと選別に必要とされるDynabeadsの量は計算することができる。Dynabeadsは、原瓶から1.5または2mL微量遠心チューブへと移してバッファーを除去することができる。ビーズは1mLの選別バッファーで(2時間から一晩)4℃、または1時間室温でブロッキングすることができる。プレクリアと選別捕集の両方に十分なビーズを調製することが重要である。
選別の第一ラウンドのため、ビオチン化標的(100nM)をプレクリアしたライブラリー全体に添加して、30℃で1時間回転することができる。後期選別ラウンドのため、抗原結合分子の回収が1%を超えることが予想される場合、プレクリアしたライブラリーは、2個のアリコートに分注することができる(ライブラリーの計数に応じて、50/50から80/20)。ビオチン化抗原が一方のアリコート(全体の50−80%)に添加され、他方のアリコートは「抗原無し」ネガティブコントロールとなることができる。あるいは、上述の通り、洗浄された第二のプレクリアビーズも、より「プレクリア」でない場合を除き「抗原無し」コントロールであると考えることができる。抗原が「粘着性」であると思われ、初期ラウンドで顕著な回収が観察される場合、抗原濃度は低減させてよい。さらに、抗原結合分子の回収がバックグラウンド(抗原無しコントロール)よりも顕著に高くなる場合、抗原濃度は後期ラウンドで低減させてよい。ライブラリーと抗原との間の化学量論に注意して、特に抗原濃度が低い場合、ライブラリーPROfusion分子に対して少なくとも5倍モル過剰の抗原が含まれていることを確実にすることが重要である。
ライブラリー捕集用Dynabeadsのブロッキングに用いられている選別バッファーは、遠心分離と磁気選別によって除去することができる。抗原結合ライブラリーは、プレブロッキングされたDynabeads(バッファーから分離)へと移され、続いて結合反応液へと移されて30℃で20分間回転することができる。捕集に用いられているDynabeadsの量は、上述の通りビーズの結合能力と、選別に用いられている標的抗原濃度に基づいて計算することができる。ビーズバインダーのプルダウンを避けるため、標的抗原濃度が低い場合、Dynabeadsの量は低く抑えるべきである(なお、500μgまたは50μl以上であること)。
Dynabeads(商標)は、非結合ライブラリーから遠心分離や磁気選別によって分離することができる。上清は1mLチップで除去することができるが、相互汚染をなくすため各ライブラリー選別チューブにつき1本の新しいフィルターチップを用いることができる。新しいピペットチップを用いて、Dynabeads(商標)を約1mLの選別バッファーで洗浄することができ、Dynabeads(商標)は、穏やかなピペッティングによってまたはチューブを複数回反転することによって再懸濁することができる。チューブは、次のライブラリーを処理している間にビーズの分離のために磁気ホルダーに戻すことができる。全ライブラリーを洗浄した後、上清は1mLチップ(相互汚染をなくすため、各ライブラリー選別チューブにつき1本の新しいフィルターチップを用いる)で除去することができる。このステップは、5回の洗浄を繰り返すことができる。Dynabeads(商標)は、上述の通り1mLの1×First Strandバッファー(SuperScript II、Invitrogen)で2回洗浄することができる。最後の洗浄において、ライブラリーの1/10は、必要に応じてライブラリー回収を決定する計数のため別個のチューブに取り分けることができる。Dynabeads(商標)は、磁気分離によって捕集することができ、約100μlの洗浄バッファーはバックグラウンド計数のため取り分けることができる。Dynabeads(商標)は、上で計算された捕集ビーズ容量の1/4の水に再懸濁することができる。
上述の第13節(E)に記載されている通りに行うことができる。
オフレート選別と平衡選別との間の大きな差は、FLAG精製の前に先ずライブラリーが選別抗原と結合することである。FLAG精製後、オフレート競合においてPROfusion分子から非結合になった任意の前結合抗原が競合分子と置き換わるように、ライブラリーは過剰量の競合抗原または抗体(例えば、競合抗原が利用できない場合)と温置することができる。競合分子と結合したPROfusion分子が次の回収ステップで回収されないという点において、競合分子は前結合抗原と異なる。これらは、非修飾抗原または異なるフォーマットの抗原となることができる。抗体もまた競合分子となり得るが、通常抗体は抗原ほど効率的な競合分子ではなく、その効率はライブラリーの抗原に対する親和性が高くなるにつれ減少する。適切な競合期間を特定するため、選別のちょうど前にライブラリーのオフレートを決定することは都合が良い。この期間は、数時間から数週間の範囲に及ぶ。
PROfusion分子を翻訳し、上述の通りオリゴdTによって精製することができる。オリゴdT精製ライブラリーは、5×FLAG結合バッファーを加えて1×最終濃度にする(単純に、ライブラリー容量の25%を加える)ことによって平衡化することができる。十分に高い濃度になるよう抗原(ビオチン化またはFc融合)が加えられ、30℃で30分間回転して抗原−抗体結合を飽和させることができる。PROfusion分子は、上述の通り抗FLAG M2アガロースによって精製することができる。FLAG精製したPROfusionライブラリーは氷上に維持するべきだが、凍結してはならないことに留意することが重要である。上述の通り、十分な量の捕集ビーズをプレブロッキングすることが重要である。
前記ステップから回収されたライブラリー量を計算してそのモル濃度を決定することができる。これは、最大量のライブラリー結合抗原を表し、オフレート競合に必要とされる量(500×から1000×)の計算に用いることができる。
回収%=100×(CPMビーズ/CPMインプット)×10
1000倍モル過剰の競合分子(例えば、非修飾抗原または抗体)が、FLAG精製PROfusionライブラリーに加えられ、より良いオフレートを備えるクローンを選別するための十分な淘汰圧をかけることのできる所定の期間約30℃で回転することができる。氷上でライブラリーを約1−2分間冷却して、ビーズ捕集前にオフレート減速する。
ライブラリー捕集用Dynabeadsのブロッキングに用いられている選別バッファーは、遠心分離および磁気選別によって除去することができる。抗原結合ライブラリーはプレブロッキングされたDynabeads(バッファーから分離)へと移し、4℃で約20分間回転することができる。
Dynabeadsは、遠心分離および磁気選別によってライブラリーから収集することができる。上清は、1mLチップ(上述の通り、相互汚染を避けるため各ライブラリー選別チューブにつき1本の新しいフィルターチップを用いる)で除去することができる。
最後の洗浄液およびビーズの10−20%を計算することができる。100μLを超えるビーズの使用は計数を抑えるため、避けることが望ましい。ライブラリー選別回収は、次式を用いて計算することができる。
選別回収%=100×CPM全ビーズ/CPM全インプット
逆転写は、SuperScript II逆転写酵素(Invitrogen(商標))を用いて行うことができる。各反応液の容量は、選別後のビーズ容量に従ってスケールアップすることができる。アウトプットは、適切なプライマー対を用いた逆転写(RT)によって分析することができる。例えば、「Ckリバース」または「Ck5−FLAGA20Rev」プライマーはκライブラリーに対して用いることができ、「CJLリバース」または「CL5FLAGA20Rev」プライマーはλライブラリーに対して用いることができ、「Lib−GS−Rev」または「VH−GSFLAGA20−Rev」プライマーはヒトPBMC VHライブラリーに対して用いることができる。
最終容量200μLの反応液に対し、RT反応は次の通り設定することができる。
ビーズ(水に懸濁) XμL
dH2O 108μLとする
10μMリバースプライマー 2μL
10mM dNTP 10μL
65℃、5分間温置し、氷上で冷却する。次の試薬を加える。
5×First Strandバッファー 40μL
0.1M DTT 20μL
RNaseOUT 10μL
細胞表面抗原に対する場合と可溶性ビオチン化抗原に対する場合との間のPROfusionライブラリー選別の大きな差は、PROfusion分子のmRNA部分が、cDNAの相補性によって細胞性RNase分解から保護され、従ってライブラリー選別前にcDNAに逆転写される必要があることである。逆転写反応は、オリゴdT精製後のライブラリー容量に応じてFLAG精製の前または後に行うことができる。scFv分子の鎖内ジスルフィド結合を保存するため、還元剤DTTは逆転写またはライブラリー選別前のどのステップにも含まれるべきではないことに留意することが重要である。
一実施形態において、選別の第一ラウンドに適切な最初の10mlの翻訳容量を用いることができるが、次の手順はより少量の翻訳反応に容易に適用できることに留意するべきである。
オリゴdT精製したライブラリーは、ライブラリー容量の1/4の5×PBSを加えることによって最終濃度1×PBSに平衡化することができる。全PROfusion分子の捕集に必要な抗FLAG M2アガロースビーズ量を概算することができる(例えば、ビーズの結合能力を50%スラリー1mL当たり約6nmol融合タンパク質であると概算)。結合および洗浄における操作に十分なビーズ容量を有するために、200μL未満の前洗浄ビーズを用いることは勧められない。大口径ピペットチップを用いて抗FLAG M2アガロースを新しいチューブに移すことができる。ビーズをスピンダウン(1500rpm、1分間)してバッファーを除去することができる。保存バッファーに含まれているどれ程微量の界面活性剤も除去するため、ビーズを1mlのPBSで2−3回洗浄することができる。オリゴdT精製したライブラリーは、1×PBSにおいて洗浄した抗FLAG M2アガロースビーズに移して、4℃で1時間から一晩回転することができる。
場合によるステップとして、抗FLAG M2アガロースビーズは、1500rpm、1分間4℃でスピンダウンして上清を廃棄することができる。1×PBSを用いてビーズをBio−Rad(商標)ミニスピンカラムまたはInvitrogen(商標)微量遠心スピンカラムに移し、続いてバッファーは1000rpmで10秒間スピンすることによって除去できる。Invitrogen(商標)カラムは、より高速(例えば、10,000RPMが可能)でスピンすることができる。ビーズは、500−600μLの1×PBSによって4回洗浄することができ、PBSはカラムを通してスピンすることができる。ビーズは、500−600の1×RT First Strandバッファー(DTT無し)によって2回洗浄することができる。貫流液は廃棄することができるが、シンチレーション計数のため最後の洗浄液を取り分けることが望ましい。
PROfusion分子は、100μg/mL FLAGペプチドの1:20希釈のRNaseOUTを含有するFirst Strandバッファー(DDT無し)中溶液を450μL(より少量のM2アガロース容量には230μLを用いてよいことに留意)加え、続いて混合液を10分間室温で温置することによって溶出することができる。溶出液は、3000rpm以上で20秒間スピンすることによって収集できる。このステップは、1回繰り返すことができ、次に両方の溶出液から得られたライブラリーをプールすることができる。
5−10μLの溶出アウトプットおよび最後の洗浄液から得られた100μLをベータカウンターで計数する。PROfusion分子の回収%は、次の通りに計算することができる(10−30%以上の回収が予想されることに留意)。
=(CPMアウトプット×容量アウトプット)/(CPMインプット×容量インプット)
上述の第16節に記載されているプライマーを用いることができる。
X=10×S×F/C
X=10×(10×10−12×6×1023)×(5×10−4)/(1×104)=3×106
細胞密度は血球計算板またはコールターカウンターによって計数することができ、十分な細胞を遠心分離チューブに移すことができる。細胞は、1500rpm、4℃でスピンダウンし、1mLの氷冷PBSに非常に穏やかに再懸濁することができる。細胞懸濁液は1.7mLねじ蓋付き微量遠心チューブに移すことができる。細胞をピペッティングによって剪断しないよう注意する。細胞は、1500rpmでスピンダウンしてPBSを除去することができる。PBSによる洗浄ステップは、もう1回繰り返すことができる。ステップ13.3.3から得られたライブラリーは、穏やかに再懸濁した細胞に即座に添加するべきである。次にチューブは、氷水ウォーターバスに浸して約60分間攪拌することができる。細胞を1500rpmでスピンダウンし、第二のプレクリアまたは抗原選別のための細胞の新しいチューブにライブラリーを移すことができる。
抗原選別に必要な細胞数を計算する。これは、上で計算された通りのライブラリープレクリア用と同数である。細胞数(X)は、いくつかの数値、すなわち抗原発現細胞表面における抗原のコピー数(C)、選別のためのライブラリーサイズ(S=モル数×6×1023)および標的抗原と結合するライブラリーの画分(F)から計算される。これは、次式によって概算して、10倍過剰の標的抗原またはプレクリア能力を可能にする。
X=10×S×F/C
抗原発現細胞の密度は、血球計算板またはコールターカウンターによって計数することができ、十分な抗原発現細胞を遠心チューブに移すことができる。細胞は、1500rpm、4℃でスピンダウンし、細胞を非常に穏やかに1mLの氷冷PBSに再懸濁することができる。細胞懸濁液は、1.7mLねじ蓋付き微量遠心チューブに移すことができる。細胞をピペッティングによって剪断しないよう注意する。細胞を1500rpmでスピンダウンしてPBSを除去し、PBSでもう1回洗浄を繰り返す。精製および/またはプレクリアしたライブラリーを即座に用いて、細胞を穏やかに再懸濁することができる。チューブは氷水のウォーターバスに浸し、2時間回転することができる。1500rpmでスピンダウンし、上清を廃棄する。細胞は1mLのPBSで4回洗浄し、1500rpmでスピンダウンして上清を廃棄することができる。細胞は、500μLのPBSに再懸濁することができる。必要に応じて、細胞と最後の洗浄液の20%までを計数する。
5μLのRNaseH(2U/μL)を再懸濁した細胞に加え、37℃で20分間温置することができる。この操作はRNAを消化し、細胞表面からcDNAを遊離させる。細胞を1500rpmで30秒間スピンダウンし、上清を新しいチューブに移すことができる。ここに至って細胞を廃棄することができる。5μLのRNaseA(20mg/ml)を上清に加え、37℃で30分間温置することができる。この操作は、選別過程において破砕された細胞に由来する可能性のあるあらゆる細胞性RNAを分解する。分解されたRNAは後に透析によって除去することができ、これによってPCRによるライブラリー増幅への干渉を防ぐことができる。上清に等量のフェノール/CHCl3/イソアミルアルコール(25:24:1)を加え、30秒間ボルテックスにかける。下層の有機相は、Phase Lock Gel Heavy2mlチューブ(Eppendorf)において、最高速度で5分間遠心分離することによって上層の水相から分離することができる。上層の水相を新しいチューブに移し、フェノール/CHCl3/イソアミルアルコール(25:24:1)で1回、CHCl3で1回抽出を繰り返すことができる。CHCl3抽出後の上層の水相は、Mini Dialysis Kit、8kDa cut−off、2mL(GE healthcare)へと移し、一晩4℃で4リットルのdH2Oに対して透析することができる。
ラウンド3から始めて、最後の洗浄液と細胞の10−20%を計数する。
選別回収%=100×CPM全細胞/CPM全インプット
逆転写は、ライブラリーから捕集した材料を用いて行うことができる。本技術分野で公知の試薬およびプロトコールが、逆転写反応の実施に適切である。選別後のビーズ容量に応じて、反応液の容量はスケールアップまたはダウンすることができる。
第一および第二ラウンドの選別アウトプットのため、cDNA(RT反応由来の上清)は8kDaカットオフを用いて水に対して透析することができ、cDNA全量をPCRテンプレートとして用いることができる。後期ラウンドの選別アウトプットのため、通常cDNAの10%をPCRテンプレートとして用いることができ、通常透析は必要とされない。ラウンド1および2のアウトプットのために(全RT産物を用いて)、反応は1mLのPCR容量において行うことができるが、一方後期ラウンド由来のアウトプットのために反応容量はスケールダウンすることができる。100μL反応溶液のためのアリコートはマスターミックスから作製するべきである。ライブラリーDNAテンプレート増幅のための例示的なPCR反応液を下の表7に示す。
95℃ 2分間
95℃ 20秒間
55℃ 10秒間 20サイクル*
70℃ 15秒間
70℃ 30秒間
4℃ 永続的に維持する
*注記:通常、KODホットスタートDNAポリメラーゼを用いて18−20サイクルの増幅を行うことができるが、十分量のライブラリーDNAの増幅には13サイクルもの回数でも良好に行うことができる。追加的な増幅サイクルによって様々なサイズの非特異的産物がより顕著となる可能性があり、産物はゲル精製が必要となり得る。可能であれば、増幅サイクル数よりもDNAテンプレートインプットの増加が有用となり得る。
スペクトラタイピングPCRは、ライブラリーまたはその選別アウトプットにおけるVH CDRサイズ分布の解析に用いることができる。これは選別の進行と共にライブラリーの多様性を評価するのに有用なツールである。最初の数ラウンドのライブラリー選別アウトプットと選別前のライブラリーは十分に多様でなければならず、CDR3サイズ分布はガウス分布に近似する。
cDNAテンプレート 2.0μL
dH2O 18.1μL
5×GoTaq Flexi反応バッファー 6.0μL
25mM MgCl2 1.8μL
10mM dNTP 0.6μL
5’フォワードプライマー(10μM) 0.6μL
3’リバースプライマー(10μM) 0.6μL
GoTaq Flexi DNAポリメラーゼ 0.3μL
全容量 30.0μL
サーマルサイクルのプログラム
94℃ 2分間
94℃ 20秒間
55℃ 20秒間 30サイクル
72℃ 30秒間
72℃ 5分間
4℃ 永続的に維持する
PCR後、10μLの産物を2%アガロースゲルにロードし、反応が成功したことを確認することができ、残りの産物は、ROX標識DNAサイズマーカーと共にシーケンサーでスペクトラタイピング電気泳動のための配列決定コアファシリティーに付すことができるが、これは恐らく標識色素が異なるためDNA産物のサイズを通常3bp過小評価する。
5’−FR3(27bp)−VH CDR3−FR4(35bp)−3’
VH CDR3のサイズは、Rox色素サイズマーカーによって決定された見かけ上のDNA産物のサイズから、次の計算によって推定される。
サイズVH CDR3=(サイズ見かけ上のDNA産物サイズ−60)/3
式中、60=(62両末端のフレームワーク−13’突出+3DNAマーカー過小評価)
10×化学ライゲーションバッファー
Tris、pH7 250mM
NaCl 1M
リン酸塩ベースバッファー
PBS 1×
BSA 1mg/mL
サケ精子DNA 0.1mg/mL
TritonX−100 0.025%
酵母tRNA(場合による、使用前に添加) 20ng/mL
HEPES 50mM
NaCl 150mM
BSA 1mg/mL
サケ精子DNA 0.1mg/mL
TritonX−100 0.025%
酵母tRNA(場合による、使用前に添加) 20ng/mL
Tris−HCl、pH8.3 250mM
KCl 375mM
MgCl2 15mM
FLAGペプチド 25mg
選別バッファー 5mL
1mLのアリコートを作製し、−20℃で保存する。
50×FLAGストック溶液 1mL
選別バッファー 49mL
1mLのアリコートを作製し、−20℃で保存する。
2.5gのオリゴdTセルロースを50mLチューブ内で計量する。
25mLの0.1N NaOHを添加し、混合する。
1500rpmで3分間スピンダウンし、上清を捨てる。
オリゴdTセルロースを25mLの1×オリゴdT結合バッファーで洗浄する。
1500rpmで3分間スピンダウンし、上清を捨てる。
もう3回洗浄を繰り返し、上清のpHを測定する。
pHは洗浄バッファーと同じでなければならない(ほぼpH8.5)。
最終容量が25mLになるよう1×オリゴdT結合バッファーを加えることによってオリゴdTセルロースを再懸濁する。これは約50%スラリーとなることができる。
前洗浄したセルロースビーズを4℃で保存する。
最終濃度=100mg/mL=1nmol RNA結合能力。
25mLのM2アガロースビーズを50mLチューブに移す。
Beckman遠心分離機において5分間1000rpmでビーズをスピンダウンし、アスピレーションによって上清を除去する。
ビーズを等量の10mMグリシン、pH3.5に再懸濁することによって洗浄する。
Beckman遠心分離機において5分間1000rpmでビーズをスピンダウンし、アスピレーションによって上清を除去する。
1カラム容量の1×FLAG結合バッファーに再懸濁する。
Beckman遠心分離機において5分間1000rpmでスラリーをスピンダウンし、アスピレーションによって上清を除去する。
洗浄を3回繰り返す。
1カラム容量の1×結合バッファー(1mg/mL BSAと100mg/mLサケ精子DNAを含む)に再懸濁する。
1時間または一晩、4℃で転倒混和する。
必要に応じて2mL画分のアリコートを作製し、4℃で維持する。
機能的mRNA−scFv分子の証明
4種の公知の抗体を用いて、機能的mRNA−scFv分子が提示され、それらそれぞれの抗原と結合できることを証明した。D2E7(ヒト抗hTNF)、Y61(ヒト抗hIL−12)、17/9(マウス抗−HA)およびMAK195(マウス抗hTNF)。下の表9に示されているプライマーを用いたプラスミドDNAのPCRによって、MAK−195scFvを作製した。
翻訳反応を改善するためのmRNAディスプレイ技術の最適化
好ましい一実施形態において、ライブラリーサイズは1×1012である。ライブラリーサイズの12倍をカバーするため、約20pmolの融合タンパク質(例えば、1.2×1013)が選別に必要とされる。FLAG精製に続いて行われる回収は、通常約30%である。従って、FLAG精製にインプットするため、約60pmolの融合タンパク質がオリゴdT精製の後に必要とされる。一実施形態において、オリゴdT精製の後、100pmolのRNAにつき約1.2pmolの融合タンパク質が得られる。この実施形態において、60pmolの融合タンパク質を得るために約5nmolのRNA(ライブラリーサイズの3000倍に及ぶ)が必要とされる。この計算が、融合mRNAディスプレイ分子の約20−30%だけが機能的である(選別後に回収できる)との観察を考慮に入れていないことに留意。
scFv選別のためのmRNAディスプレイ技術の最適化−スペーサー長
scFvタンパク質とmRNA末端の間の長いスペーサー長がscFvフォールディングおよび機能を改善させることは、以前から提案されていた(Hanesら(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(10):4937−42を参照)。従って、mRNA−scFv分子の機能および収量におけるscFvとリンカーアニーリング部位との間のスペーサー長の影響を調査した(図6を参照)。短い、中程度のおよび長い3’スペーサーを備える3種類の異なるD2E7scFvコンストラクトと、Y61および17/9scFvのための2種類の短いおよび長いスペーサーコンストラクトを作製した(D2E7スペーサーコンストラクトは図8を参照)。図7に示されている結果は、より長いスペーサーは、抗原結合に評価されるようなmRNA−scFV分子の機能に測定可能な利点をもたらさないことを示す。さらに、より長いスペーサー長は、mRNA−scFvの収量を顕著に低減させた(図7参照)。より長いスペーサーはRNA収量も低かった。短いスペーサーは6nmol RNAを生じ、中程度のスペーサーは3.4nmol RNAを生じ、長いスペーサーは1.7nmolを生じた。従って、一実施形態において、より短いスペーサーがscFvライブラリー構築に好ましい。
scFvタンパク質のフォールディングおよび機能を改善するためのmRNAディスプレイ技術の最適化−システイン残基における化学修飾の省略
本技術分野におけるメッセンジャーRNAディスプレイ技術は、シアニル化をもたらす2−ニトロ−5−チオシアナト安息香酸による、またはスルフヒドリル基と共有結合するN−エチルマレイミドによる、望ましくないシステインジスルフィド結合の形成を防ぐためのフリーのシステイン残基の化学キャッピング反応を含む。このキャッピング反応は、フリーのシステイン残基のランダム架橋に起因する潜在的なタンパク質誤フォールディングを取り除くが、本発明は、予見できない物理的または化学的特性に起因するその将来的な製造可能性を損なう可能性のある抗体内フリーシステインの人為的な保護を取り除く。ライブラリー選別においてscFvのIg領域フォールディングに必要とされる4個のシステインを超えるどの余分のフリーのシステインも活発に保護されないように、化学キャッピングのステップは削除される。
scFvタンパク質フォールディングおよび機能を改善するためのmRNAディスプレイ技術の最適化−同時翻訳タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性要求
イソメラーゼかシャペロンのいずれかの活性またはその両方によって、PDIがより良いタンパク質機能および分泌に寄与することが示唆されてきた(Shustaら、Nat Biotechnol 16(8):773−7;Smithら、Biotechnol Bioeng 85(3):340−50を参照)。2個のIg領域内ジスルフィド結合は全scFv配列によってコード化されており、一方はVHに、他方はVL領域に存在する。同時翻訳タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)活性が、適切なジスルフィド結合のインビトロ形成に重要であることが示唆されてきた(Ryabovaら、Nat Biotechnol 15(1):79−84を参照)。本技術分野におけるmRNAディスプレイのプロトコールは、翻訳反応液に(PDI)を含むことを定める。
scFvタンパク質フォールディングおよび機能を改善するためのmRNAディスプレイ技術の最適化−反応からジチオスレイトールの除去
ジチオスレイトール(DTT)は、タンパク質凝集を最小限に抑え、タンパク質の酸化を抑制するよう酵素反応に一般に導入される還元剤である。これはまた、mRNAscFv分子のインビトロ翻訳ステップに続く逆転写(RT)反応に通常用いられる。これを含有することによって、PDI活性によって形成されたscFv分子における2個の鎖内ジスルフィド結合を抑制できるため、DTTのscFv抗原結合機能における潜在的な効果を調査した(図11参照)。DTTが存在することによって、RT後の17/9scFvの抗原結合活性が顕著に失われ、これは図11に示されている17/9機能のPDI活性依存と矛盾しない。RTからDTTが除かれると17/9の大部分の抗原結合活性が保存されたため、この抗原結合活性の損失はRT反応それ自身が原因ではない。さらに、結果から、17/9scFvのcDNAはDTT無しでmRNAから確かに逆転写されたことがPCRによって示され、これはDTTがRT反応に必須でないことを示唆する(データ無し)。
scFvタンパク質フォールディングおよび機能を改善するためのmRNAディスプレイ技術の最適化−抗原選別におけるRNaseインヒビターの含有
RTによる二本鎖mRNA−cDNAの形成は、抗原結合のためのmRNA−scFv分子を準備し、RNA分解を防止してRNA二次構造を抑制すると考えられる。抗原による選別の後、cDNAはmRNAのアルカリ加水分解によって回収することができ、PCRの増幅テンプレートとなる。抗原選別前のRTにおけるDTTのscFv機能に対する潜在的な影響を避けるため、選別後の増幅のためのmRNAを保護するために代替法を用いることが必要とされる。
17/9scFvのライブラリー選別
本明細書に記載されているmRNAディスプレイ法を用いた数ラウンドの選別によってmRNA−scFv分子を濃縮できることを証明するため、重複PCRによって25の多様性を有するscFvライブラリーを構築した。scFvライブラリーを作製するため、17/9、D2E7、2SD4、Y61およびMAK195の等量のVHおよびVL断片を混合し、25の最大多様性を有するscFvライブラリーに合わせ、上述の通りに用いた。次にこのライブラリーからビオチン化HAタグペプチドによって17/9scFvを選別した。選別後、クローニングおよびコロニーPCRによって17/9の濃縮を検査した。1ラウンドのmRNA−scFv選別の前と後で17/9scFvを定量した結果を、図18に示す。1ラウンドのHAペプチドに対する選別の後、選別アウトプットから回収された全scFv配列は、17/9scFvの配列であった。
mRNAディスプレイ技術は、異なる親和性を有するscFvバインダーを識別するために用いることができる
mRNAディスプレイ技術、すなわち上述の技術が、異なる親和性を有するscFvバインダーを識別するために用いることができるか決定するため、D2E7と2SD4のキメラを作製した。2SD4は、TNFαに対して低い親和性(遊離タンパク質としてKDほぼ200nM)を示す、D2E7scFvの前駆体である。図19はキメラを示す。
mRNA−scFv分子の耐熱性
mRNA−scFv分子の耐熱性を決定するため、本明細書に記載されているようにD2E7−scCkおよびY61−scCkを翻訳して、mRNA−scFvフォーマットに精製した。次に、mRNA−scFv分子を抗原選別前に様々な温度で30分間温置した。抗原選別後の正規化回収率を図21に示す。
本願を通じて引用されている可能性のあるあらゆる引用文献(参考文献、特許、特許出願およびウエブサイト)の内容は、そこに引用されている参考文献のように、いかなる目的においてもこれによりその内容全体が参照によって本明細書に特に組み込まれている。本発明の実施において、他に断りがない限り、本技術分野においてよく知られている従来の細胞培養と分子生物学の技法が用いられている。
本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく他の特定の形態に具体化することができる。従って上述の実施形態は、本明細書の記載に本発明を限定するものではなくむしろ説明のためのものであることをあらゆる点で考慮するべきである。従って本発明の範囲は、上述の説明によってではなくむしろ添付の特許請求の範囲によって示され、従って特許請求の範囲における均等の意義および範囲内のあらゆる変更を本明細書に包含することを目的とする。
Claims (40)
- (a)ピューロマイシンまたはそのアナログを3’末端に、ソラレンC6を5’末端に有する一本鎖核酸リンカーと架橋し、5’scFvおよび3’スペーサー配列をコードするmRNAを含む、ピューロマイシンまたはそのアナログと架橋した単鎖Fv(scFv)mRNA分子を提供するステップ、
(b)標識の存在下、標識ピューロマイシン架橋scFv mRNA/タンパク質分子が形成されるような条件下で、ピューロマイシン架橋scFv mRNAをインビトロ翻訳するステップ、
(c)標識ピューロマイシン架橋scFv mRNA/タンパク質分子を精製するステップ、
(d)精製された標識ピューロマイシン架橋scFv mRNA/タンパク質分子を少なくとも1種類の抗原を用いた抗原選別に付すステップおよび
(e)精製された標識ピューロマイシン架橋scFv mRNA/タンパク質分子を、親和性に基づいた磁気ビーズを用いて回収するステップ
を含む、scFv抗体RNAディスプレイライブラリーをスクリーニングする方法。 - (g)抗原選別の後、scFv mRNAを逆転写してcDNAを作製するステップをさらに含む、請求項1の方法。
- (h)cDNAを増幅するステップをさらに含む、請求項2の方法。
- 標識が放射性標識である、請求項1の方法。
- 標識が35Sメチオニンまたはシステインである、請求項4の方法。
- 3’スペーサー配列が約0から約200アミノ酸を含む、請求項1の方法。
- 3’スペーサー配列が約16アミノ酸を含む、請求項1の方法。
- 3’スペーサー配列がアフィニティータグを含む、請求項1の方法。
- 核酸リンカーが、5’から3’へと、
ソラレンC6、
配列UAGCGGAUGC(配列番号20)を含む2’OMeリボヌクレオチド、
6個のトリエチレングリコールまたはPEG−150部分、
2個のデオキシシチジン残基および
ピューロマイシン
を含む、請求項1の方法。 - scFv mRNA分子がUVAによってDNAリンカーと光架橋される、請求項1の方法。
- scFv mRNA分子がT7、SP6およびT3からなる群から選択された5’プロモーターを含む、請求項1の方法。
- scFv mRNA分子がタバコモザイクウイルス5’非翻訳領域を含む、請求項1の方法。
- 標識ピューロマイシン架橋scFv mRNA/タンパク質分子がオリゴdTクロマトグラフィーによって精製される、請求項1の方法。
- 標識ピューロマイシン架橋scFv mRNA/タンパク質分子が抗FLAG M2モノクローナル抗体アガロースビーズを用いて精製される、請求項1の方法。
- 標識ピューロマイシン架橋scFv mRNA/タンパク質分子が、オリゴdTクロマトグラフィーおよび抗FLAG M2モノクローナル抗体アガロースビーズによって精製される、請求項1の方法。
- 抗原がビオチン化ペプチド、タンパク質またはハプテンである、請求項1の方法。
- 抗原がヒト免疫グロブリン結晶化可能フラグメント(Fc)との融合タンパク質である、請求項1の方法。
- 抗原がマウス免疫グロブリン結晶化可能フラグメント(Fc)との融合タンパク質である、請求項1の方法。
- 抗原がビオチン化ペプチド、タンパク質またはハプテンである、請求項1の方法。
- 抗原が細胞集団である、請求項1の方法。
- 抗体が抗IL−12抗体である、請求項1の方法。
- 抗体が抗HA抗体である、請求項1の方法。
- 抗体がマウス抗体である、請求項1の方法。
- 抗体がヒト抗体である、請求項1の方法。
- 抗体がヒト化抗体である、請求項1の方法。
- ピューロマイシン架橋scFv mRNAのインビトロ翻訳が、GSSH/GSHの存在下でさらに行われる、請求項1から24のいずれか一項の方法。
- ピューロマイシン架橋scFv mRNAのインビトロ翻訳がタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)の存在下でさらに行われる、請求項26の方法。
- ピューロマイシン架橋scFv mRNAのインビトロ翻訳がジチオスレイトールの不在下でさらに行われる、請求項1から24のいずれか一項の方法。
- ピューロマイシン架橋scFv mRNAのインビトロ翻訳がジチオスレイトールの不在下でさらに行われる、請求項27の方法。
- mRNAキャッピングステップを含まない、請求項1の方法。
- 精製ステップの前にインビトロ逆転写ステップを含まない、請求項1の方法。
- ステップ(a)から(g)の内いずれかの前、間または後にRNaseインヒビターが添加される、請求項1の方法。
- 前記精製ステップが、ジチオスレイトール不在下におけるcDNA作製のためのmRNAの逆転写を含む、請求項1の方法。
- cDNAが約pH=8.0−約pH=10.0のアルカリ加水分解によって溶出される、請求項2または33の方法。
- cDNAが熱によって溶出される、請求項2または33の方法。
- cDNAが約pH=3.0−約pH=6.0の酸によって溶出される、請求項2または33の方法。
- cDNAがポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される、請求項33の方法。
- ポリメラーゼ連鎖反応が耐熱性DNAポリメラーゼを用いる、請求項37の方法。
- ポリメラーゼ連鎖反応がPlatinum HiFiおよびKODからなる群から選択された増幅酵素を用いる、請求項37の方法。
- ビーズが、ストレプトアビジン−M280、ニュートラアビジン−M280、SA−M270、NA−M270、SA−MyOne、NA−MyOne、SA−アガロースおよびNA−アガロースからなる群から選択される、請求項1の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US10147108P | 2008-09-30 | 2008-09-30 | |
US61/101,471 | 2008-09-30 | ||
PCT/US2009/059057 WO2010039850A1 (en) | 2008-09-30 | 2009-09-30 | Improved method of rna display |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2012504415A true JP2012504415A (ja) | 2012-02-23 |
JP5968624B2 JP5968624B2 (ja) | 2016-08-10 |
Family
ID=42073857
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011530178A Active JP5968624B2 (ja) | 2008-09-30 | 2009-09-30 | 改良rnaディスプレイ法 |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8916504B2 (ja) |
EP (1) | EP2342562B1 (ja) |
JP (1) | JP5968624B2 (ja) |
KR (1) | KR20110076906A (ja) |
CN (1) | CN102227638B (ja) |
AU (1) | AU2009298499A1 (ja) |
BR (1) | BRPI0919426A2 (ja) |
CA (1) | CA2737035A1 (ja) |
ES (1) | ES2434850T3 (ja) |
HK (1) | HK1159250A1 (ja) |
IL (1) | IL211551A (ja) |
MX (1) | MX2011003381A (ja) |
NZ (1) | NZ591544A (ja) |
RU (1) | RU2011117210A (ja) |
TW (1) | TW201024731A (ja) |
WO (1) | WO2010039850A1 (ja) |
ZA (1) | ZA201102120B (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014142020A1 (ja) * | 2013-03-13 | 2014-09-18 | 国立大学法人東京大学 | 核酸リンカー |
KR20160102958A (ko) * | 2013-06-28 | 2016-08-31 | 엑스-바디 인코포레이티드 | 표적 항원 발견, 표현형 선별 및 표적 세포 특이성 표적 에피토프를 규명하기 위한 그의 용도 |
Families Citing this family (30)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2002231736A1 (en) | 2000-12-22 | 2002-07-08 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. | Use of repulsive guidance molecule (rgm) and its modulators |
WO2007039256A2 (de) * | 2005-09-30 | 2007-04-12 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Bindungsdomänen von proteinen der repulsive guidance molecule (rgm) proteinfamilie und funktionale fragmente davon sowie deren verwendung |
EP2033971A1 (de) * | 2007-09-06 | 2009-03-11 | Abbott GmbH & Co. KG | Bone Morphogenetic Protein (BMP)-bindende Domänen von Proteinen der Repulsive Guidance Molecule (RGM) Proteinfamilie und funktionale Fragmente davon sowie deren Verwendung |
US8962803B2 (en) * | 2008-02-29 | 2015-02-24 | AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG | Antibodies against the RGM A protein and uses thereof |
CA2722466A1 (en) * | 2008-04-29 | 2009-11-05 | Tariq Ghayur | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
CA2725666A1 (en) * | 2008-06-03 | 2009-12-10 | Abbott Laboratories | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
AU2009256250B2 (en) * | 2008-06-03 | 2013-05-30 | Abbvie Inc. | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
NZ590074A (en) * | 2008-07-08 | 2012-12-21 | Abbott Lab | Prostaglandin e2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
AU2010242840B2 (en) * | 2009-05-01 | 2014-04-17 | Abbvie Inc. | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
UY32808A (es) * | 2009-07-29 | 2011-02-28 | Abbott Lab | Inmunoglobulinas como dominio variable dual y usos de las mismas |
KR20140015139A (ko) * | 2009-10-15 | 2014-02-06 | 애브비 인코포레이티드 | 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도 |
UY32979A (es) | 2009-10-28 | 2011-02-28 | Abbott Lab | Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas |
CN102656190A (zh) * | 2009-12-08 | 2012-09-05 | 雅培股份有限两合公司 | 用于在视网膜神经纤维层变性治疗中使用的针对rgm a蛋白质的单克隆抗体 |
CA2807014A1 (en) | 2010-08-03 | 2012-02-09 | Abbvie Inc. | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
TW201211252A (en) * | 2010-08-26 | 2012-03-16 | Abbott Lab | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
EP2686349B1 (en) | 2011-03-15 | 2020-12-09 | X-Body, Inc. | Antibody screening methods |
EP3318880B1 (en) | 2011-05-17 | 2020-12-16 | Bristol-Myers Squibb Company | Improved methods for the selection of binding proteins |
UY34558A (es) | 2011-12-30 | 2013-07-31 | Abbvie Inc | Proteínas de unión específicas duales dirigidas contra il-13 y/o il-17 |
IL305223A (en) | 2012-01-27 | 2023-10-01 | Abbvie Inc | The composition and method for the diagnosis and treatment of diseases related to the degeneration of nerve cells |
AU2013337775B2 (en) | 2012-11-01 | 2017-03-30 | Abbvie Inc. | Anti-VEGF/DLL4 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
CN105324396A (zh) | 2013-03-15 | 2016-02-10 | 艾伯维公司 | 针对IL-1β和/或IL-17的双重特异性结合蛋白 |
EP3102245B1 (en) | 2014-02-05 | 2021-09-08 | Molecular Templates, Inc. | Methods of screening, selecting, and identifying cytotoxic recombinant polypeptides based on an interim diminution of ribotoxicity |
US10093733B2 (en) | 2014-12-11 | 2018-10-09 | Abbvie Inc. | LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins |
CN107614014B (zh) * | 2015-05-28 | 2022-07-12 | 生物辐射实验室股份有限公司 | 亲和配体及其相关方法 |
TW201710286A (zh) | 2015-06-15 | 2017-03-16 | 艾伯維有限公司 | 抗vegf、pdgf及/或其受體之結合蛋白 |
AU2017271601A1 (en) | 2016-05-27 | 2018-12-13 | Abbvie Biotherapeutics Inc. | Bispecific binding proteins binding an immunomodulatory protein and a tumor antigen |
KR20230174295A (ko) * | 2017-11-20 | 2023-12-27 | 난트바이오 인코포레이티드 | mRNA 디스플레이 항체 라이브러리 및 방법 |
CN113710801A (zh) * | 2019-02-22 | 2021-11-26 | 爱普思隆分子进化工程株式会社 | 一种使用cDNA展示的新型免疫PCR方法 |
WO2022087804A1 (zh) * | 2020-10-27 | 2022-05-05 | 北京寻因生物科技有限公司 | 一种嘌呤霉素连接子及其在体外核酸展示肽合成中的应用 |
WO2022104001A1 (en) | 2020-11-13 | 2022-05-19 | Bristol-Myers Squibb Company | Expanded protein libraries and uses thereof |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002500514A (ja) * | 1997-05-28 | 2002-01-08 | ベイブレイアム インスティテュート | タンパク質のin vitroディスプレイ及び進化のための選択粒子としてのリボソーム複合体 |
JP2003505094A (ja) * | 1999-07-27 | 2003-02-12 | フィロス インク. | ペプチドアクセプターの連結法 |
JP2006141348A (ja) * | 2004-11-24 | 2006-06-08 | Zoegene Corp | 標的物質と相互作用するドメインポリペプチドの選抜取得方法および構造モチーフ配列の同定方法並びに分子設計方法 |
JP2007191477A (ja) * | 2005-12-22 | 2007-08-02 | Cellfree Sciences Co Ltd | 風疹ウイルスタンパク質の製造方法 |
Family Cites Families (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5310652A (en) * | 1986-08-22 | 1994-05-10 | Hoffman-La Roche Inc. | Reverse transcription with thermostable DNA polymerase-high temperature reverse transcription |
US5401650A (en) * | 1990-10-24 | 1995-03-28 | The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Cloning and expression of biologically active α-galactosidase A |
US5922545A (en) * | 1993-10-29 | 1999-07-13 | Affymax Technologies N.V. | In vitro peptide and antibody display libraries |
US8207093B2 (en) * | 1997-01-21 | 2012-06-26 | The General Hospital Corporation | Selection of proteins using RNA-protein fusions |
US6927025B1 (en) * | 1997-09-03 | 2005-08-09 | Biovation Limited | Methods for protein screening |
US6914128B1 (en) * | 1999-03-25 | 2005-07-05 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing |
CA2374085C (en) * | 1999-05-14 | 2015-12-29 | Genentech, Inc. | Tumour treatment with anti-erbb2 antibodies |
US6830902B1 (en) * | 1999-07-02 | 2004-12-14 | Invitrogen Corporation | Compositions and methods for enhanced sensitivity and specificity of nucleic acid synthesis |
US7264932B2 (en) * | 1999-09-24 | 2007-09-04 | Applera Corporation | Nuclease inhibitor cocktail |
ES2253358T3 (es) * | 2000-03-31 | 2006-06-01 | Cambridge Antibody Technology Limited | Mejoras en la visualizacion del ribosoma. |
JP4963142B2 (ja) * | 2000-12-14 | 2012-06-27 | 学校法人慶應義塾 | 遺伝子型と表現型の対応付け分子とその構成要素、および対応付け分子の製造方法と利用方法 |
ES2615362T3 (es) * | 2001-07-27 | 2017-06-06 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Adhesinas de meningococos |
CA2484930A1 (en) * | 2002-05-06 | 2003-11-13 | The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Identification of novel broadly cross-reactive neutralizing human monoclonal antibodies using sequential antigen panning of phage display libraries |
US20040067532A1 (en) | 2002-08-12 | 2004-04-08 | Genetastix Corporation | High throughput generation and affinity maturation of humanized antibody |
CA2504481A1 (en) * | 2002-10-30 | 2004-05-21 | Pointilliste, Inc. | Systems for capture and analysis of biological particles and methods using the systems |
AU2004296376B2 (en) * | 2003-12-05 | 2010-03-04 | Bristol-Myers Squibb Company | Inhibitors of type 2 vascular endothelial growth factor receptors |
US8822191B2 (en) * | 2004-02-04 | 2014-09-02 | Novo Nordisk A/S | Methods of refolding mammalian glycosyltransferases |
US7662926B2 (en) * | 2004-09-02 | 2010-02-16 | Genentech, Inc. | Anti-Fc-gamma receptor antibodies, bispecific variants and uses therefor |
GB0500099D0 (en) * | 2005-01-05 | 2005-02-09 | Cambridge Antibody Tech | Methods and means relating to protein variants |
US20070218478A1 (en) * | 2005-12-16 | 2007-09-20 | Affymetrix, Inc. | Methods for fragmentation and analysis of nucleic acid |
AR059900A1 (es) * | 2006-03-17 | 2008-05-07 | Genentech Inc | Anticuerpos anti-tat226 e inmunoconjugados |
WO2007109254A2 (en) * | 2006-03-17 | 2007-09-27 | Biogen Idec Ma Inc. | Stabilized polypeptide compositions |
US7749957B2 (en) * | 2006-04-06 | 2010-07-06 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Clay-binding peptides and methods of use |
WO2007136835A2 (en) * | 2006-05-19 | 2007-11-29 | Codon Devices, Inc | Methods and cells for creating functional diversity and uses thereof |
-
2009
- 2009-09-30 US US12/570,931 patent/US8916504B2/en active Active
- 2009-09-30 EP EP09818450.0A patent/EP2342562B1/en active Active
- 2009-09-30 TW TW098133223A patent/TW201024731A/zh unknown
- 2009-09-30 CA CA2737035A patent/CA2737035A1/en not_active Abandoned
- 2009-09-30 WO PCT/US2009/059057 patent/WO2010039850A1/en active Application Filing
- 2009-09-30 CN CN200980147651.0A patent/CN102227638B/zh active Active
- 2009-09-30 NZ NZ591544A patent/NZ591544A/xx not_active IP Right Cessation
- 2009-09-30 KR KR1020117007259A patent/KR20110076906A/ko active IP Right Grant
- 2009-09-30 RU RU2011117210/15A patent/RU2011117210A/ru unknown
- 2009-09-30 MX MX2011003381A patent/MX2011003381A/es active IP Right Grant
- 2009-09-30 AU AU2009298499A patent/AU2009298499A1/en not_active Abandoned
- 2009-09-30 JP JP2011530178A patent/JP5968624B2/ja active Active
- 2009-09-30 BR BRPI0919426A patent/BRPI0919426A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2009-09-30 ES ES09818450T patent/ES2434850T3/es active Active
-
2011
- 2011-03-03 IL IL211551A patent/IL211551A/en active IP Right Grant
- 2011-03-22 ZA ZA2011/02120A patent/ZA201102120B/en unknown
- 2011-12-21 HK HK11113810.8A patent/HK1159250A1/xx not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002500514A (ja) * | 1997-05-28 | 2002-01-08 | ベイブレイアム インスティテュート | タンパク質のin vitroディスプレイ及び進化のための選択粒子としてのリボソーム複合体 |
JP2003505094A (ja) * | 1999-07-27 | 2003-02-12 | フィロス インク. | ペプチドアクセプターの連結法 |
JP2006141348A (ja) * | 2004-11-24 | 2006-06-08 | Zoegene Corp | 標的物質と相互作用するドメインポリペプチドの選抜取得方法および構造モチーフ配列の同定方法並びに分子設計方法 |
JP2007191477A (ja) * | 2005-12-22 | 2007-08-02 | Cellfree Sciences Co Ltd | 風疹ウイルスタンパク質の製造方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 15, JPN6015004163, 1997, pages 79 - 84, ISSN: 0002997541 * |
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014142020A1 (ja) * | 2013-03-13 | 2014-09-18 | 国立大学法人東京大学 | 核酸リンカー |
JP6020865B2 (ja) * | 2013-03-13 | 2016-11-02 | 国立大学法人 東京大学 | 核酸リンカー |
US10294472B2 (en) | 2013-03-13 | 2019-05-21 | The University Of Tokyo | Nucleic acid linker |
KR20160102958A (ko) * | 2013-06-28 | 2016-08-31 | 엑스-바디 인코포레이티드 | 표적 항원 발견, 표현형 선별 및 표적 세포 특이성 표적 에피토프를 규명하기 위한 그의 용도 |
JP2016529884A (ja) * | 2013-06-28 | 2016-09-29 | エックス−ボディ インコーポレイテッド | 標的細胞に特異的な標的エピトープの同定のための、標的抗原探索、表現型スクリーニングおよびそれらの使用 |
US10370651B2 (en) | 2013-06-28 | 2019-08-06 | X-Body, Inc. | Target antigen discovery, phenotypic screens and use thereof for identification of target cell specific target epitopes |
KR102163529B1 (ko) | 2013-06-28 | 2020-10-12 | 엑스-바디 인코포레이티드 | 표적 항원 발견, 표현형 선별 및 표적 세포 특이성 표적 에피토프를 규명하기 위한 그의 용도 |
KR20200127232A (ko) * | 2013-06-28 | 2020-11-10 | 엑스-바디 인코포레이티드 | 표적 항원 발견, 표현형 선별 및 표적 세포 특이성 표적 에피토프를 규명하기 위한 그의 용도 |
KR102309517B1 (ko) | 2013-06-28 | 2021-10-07 | 엑스-바디 인코포레이티드 | 표적 항원 발견, 표현형 선별 및 표적 세포 특이성 표적 에피토프를 규명하기 위한 그의 용도 |
US11414784B2 (en) | 2013-06-28 | 2022-08-16 | X-Body, Inc. | Target antigen discovery, phenotypic screens and use thereof for identification of target cell specific target epitopes |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2342562A1 (en) | 2011-07-13 |
ES2434850T3 (es) | 2013-12-17 |
ZA201102120B (en) | 2011-12-28 |
TW201024731A (en) | 2010-07-01 |
AU2009298499A1 (en) | 2010-04-08 |
CA2737035A1 (en) | 2010-04-08 |
CN102227638A (zh) | 2011-10-26 |
MX2011003381A (es) | 2011-04-21 |
EP2342562B1 (en) | 2013-09-18 |
IL211551A (en) | 2014-06-30 |
KR20110076906A (ko) | 2011-07-06 |
JP5968624B2 (ja) | 2016-08-10 |
CN102227638B (zh) | 2015-05-20 |
EP2342562A4 (en) | 2012-03-21 |
BRPI0919426A2 (pt) | 2015-12-15 |
NZ591544A (en) | 2013-01-25 |
HK1159250A1 (en) | 2012-07-27 |
WO2010039850A1 (en) | 2010-04-08 |
US20100105569A1 (en) | 2010-04-29 |
IL211551A0 (en) | 2011-05-31 |
US8916504B2 (en) | 2014-12-23 |
RU2011117210A (ru) | 2012-11-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5968624B2 (ja) | 改良rnaディスプレイ法 | |
JP2012504416A (ja) | 改良抗体ライブラリー | |
US6620587B1 (en) | Ribosome complexes as selection particles for in vitro display and evolution of proteins | |
Dreier et al. | Ribosome display: a technology for selecting and evolving proteins from large libraries | |
WO2016011364A1 (en) | Methods and compositions to identify, quantify, and characterize target analytes and binding moieties | |
EP0975748A1 (en) | Methods dor identifying nucleic acid molecules encoding (poly)peptides that interact with target molecules | |
JP6943376B2 (ja) | Dna結合タンパク質の結合領域の近傍に所望のdna断片を挿入する方法 | |
He et al. | Eukaryotic ribosome display with in situ DNA recovery | |
JPWO2016159211A1 (ja) | 試験管内淘汰及び分子間相互作用解析用高速光架橋型共用リンカー、そのリンカーを用いた試験管内淘汰方法 | |
Kiguchi et al. | Clonal array profiling of scFv-displaying phages for high-throughput discovery of affinity-matured antibody mutants | |
KR102309517B1 (ko) | 표적 항원 발견, 표현형 선별 및 표적 세포 특이성 표적 에피토프를 규명하기 위한 그의 용도 | |
JP6478392B2 (ja) | 核酸リンカー | |
Taussig et al. | ARM complexes for in vitro display and evolution of | |
JP2008515419A (ja) | 抗体ライブラリーをスクリーニングする方法 | |
JP2019149985A (ja) | 連結核酸断片の製造方法、連結核酸断片、及び連結核酸断片から構成されるライブラリ | |
WO2022121899A1 (zh) | 一种特异性结合Strep-Tag II标签的抗体及其应用 | |
Bouda | Characterizing the Role of MTERF3 in Mitochondrial Ribosome Assembly | |
US20090099033A1 (en) | In vitro screening and evolution of proteins | |
EP3049558A1 (en) | Method and kit for generating high affinity binding agents | |
Kierny | Generating Recombinant Affinity Reagents by Phage-and Ribosome-Display | |
CN106520777A (zh) | 一种单链抗体及其在特异性检测正平行型g‑四链体中的应用 | |
WO2005035751A1 (ja) | 高機能性タンパク質の迅速、高効率な選択法、それによって得られる高機能性タンパク質、およびその製造方法と利用方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20120927 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20130701 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130822 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140325 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140625 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150203 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20150430 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150731 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20150901 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160104 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20160223 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160405 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160411 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160607 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20160706 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5968624 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |