MX2011003381A - Metodo mejorado para despliegue de arn. - Google Patents

Metodo mejorado para despliegue de arn.

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MX2011003381A
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Yuliya A Kutskova
John E Memmott
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Abbott Lab
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Abstract

La presente invención, presenta métodos mejorados para despliegue de ARN in vitro, para permitir una expresión y selección confiable de moléculas de anticuerpo scFv a partir de bibliotecas de expresión. Los métodos mejorados, implican en parte, el uso de condiciones de reducción leves, las cuales favorecen el enlace de disulfuro de intra-cadena scFv y, por lo tanto, corrigen el pliegue de las moléculas de anticuerpo scFv. Aunque particularmente adecuados para expresión y selección de moléculas de anticuerpo scFv, los métodos de la presente invención, también son útiles para despliegue de ARN in vitro de todas las clases de proteína.

Description

MÉTODO MEJORADO PARA DESPLIEGUE DE ARN Solicitudes Relacionadas La presente solicitud reclama la prioridad de la Solicitud Provisional Norteamericana No. 61/101471, presentada el 30 de septiembre de 2008, cuyos contenidos están incorporados a la presente invención como referencia.
Campo de la Invención La presente descripción se refiere al despliegue de ARN, y particularmente a métodos de despliegue de ARN que permiten la selección de antígenos solubles y de superficie celular.
Antecedentes de la Invención Los anticuerpos pueden ser seleccionados de modo que enlacen con alta especificidad y afinidad casi a cualquier epítope estructural, y se utilizan en forma rutinaria como herramientas de investigación y como terapéuticos aprobados por FDA. Como resultado, los anticuerpos monoclonales terapéuticos y de diagnóstico constituyen un mercado de varios billones de dólares a nivel mundial.
Los métodos clásicos para inmunizar animales para obtener anticuerpos, son lentos e incómodos. Como consecuencia, se han desarrollado métodos para la selección ex vivo de un anticuerpo para una molécula objetivo deseada, utilizando bibliotecas de anticuerpo sintéticos. En algunos métodos, se despliegan bibliotecas de anticuerpos, o fragmentos de los mismos en la superficie de un organismo (por ejemplo, un bacteriófago, virus, célula de levadura, célula de bacteria o célula de mamífero) y el organismo se selecciona para la expresión del anticuerpo deseado. En otros métodos, se expresan bibliotecas de anticuerpo y se seleccionan en un sistema in vitro libre de células. En dicho sistema, el llamado despliegue de ARN, las proteínas o péptidos expresados son enlazados en forma covalente o a través de Interacción no covalente ajustada a su mARN de codificación para formar moléculas de fusión de ARN/proteína. El componente de proteína o péptido de una fusión de ARN/proteína puede ser seleccionado para enlazar a un objetivo deseado, y la identidad de la proteína o péptido determinada mediante secuenciación del componente de mARN de codificación adherido.
Los sistemas de despliegue de ARN in vitro actuales, aunque buenos para expresar dominios variables de anticuerpo simple, son ineficientes para expresar anticuerpos de dominio múltiple, tal como moléculas de anticuerpo de cadena simple (scFv). Esto se debe principalmente a las condiciones de reacción de los sistemas de expresión de in vitro actuales y a la tendencia de perder el cADN scFv de longitud total de la biblioteca a través de la amplificación repetida de PCR.
Por consiguiente existe la necesidad en la técnica de métodos de despliegue in vitro mejorados para seleccionar anticuerpos scFv contra un objetivo deseado.
Breve Descripción de la Invención La presente invención soluciona los problemas anteriores, proporcionando métodos mejorados para despliegue de ARN in vitro, que permiten la expresión y selección confiable de moléculas scFv a partir de bibliotecas de expresión. Aunque particularmente adecuados para la expresión y selección de moléculas scFv, los métodos de la presente invención también sirven para el despliegue in vitro de todas las clases de proteína, incluyendo tanto antígenos solubles como de superficie celular.
Por consiguiente la presente invención tiene varias ventajas que incluyen, pero no se limitan a, proporcionar métodos de despliegue ARN in vitro mejorados que sean más simples y menos tardados en llevarse a cabo, que los métodos descritos anteriormente. Además, los métodos de la presente invención permiten la expresión funcional mejorada de proteínas que contienen enlaces de disulfuro intra-cadena, por ejemplo, moléculas de anticuerpo scFv.
En un aspecto, la presente invención proporciona un método para clasificar una biblioteca de despliegue de ARN de anticuerpo scFv, en donde el método comprende los pasos de (a) proporcionar una puromicina o análogo del mismo, una molécula de mARN scFv reticulada, comprendiendo la molécula un mARN que codifica la secuencia espaciadora 5'scFv y 3', en donde la molécula es reticulada para un enlazador de ácido nucleico de hebra simple, comprendiendo el enlazador una puromicina, o análogo del mismo, en un extremo 3' y un Psoralen C6 en el extremo 5'; (b) traducir in vitro el mARN scFv reticulado con puromicina en la presencia de una etiqueta, en la presencia de GSSG (glutationa oxidada)/GSH (glutationa reducida) y PDI (isomerasa de disulfuro de proteína) y en la ausencia de ditiotreitol bajo condiciones de modo que se forme la molécula de proteína/mARN scFv reticulada con puromicina etiquetada; (c) purificar la molécula de proteína/mARN scFv reticulada con puromicina etiquetada; (d) someter la proteína/mARN scFv reticulada con puromicina a selección de antígeno con al menos un antígeno; y (e) recuperar las moléculas y la proteína/mARN scFv reticulada con puromicina etiquetada utilizando cuentas magnéticas a base de afinidad.
En una modalidad, el método comprende además el paso de (g) transcribir en forma inversa el mARN scFv después de selección de antígenos para elaborar un cADN. En otra modalidad, el método comprende además el paso de (h) amplificar el cADN.
En una modalidad, la etiqueta es una etiqueta radioactiva, tal como, por ejemplo, 35S metionina o cisteína.
En una modalidad, la secuencia espaciadora 3' comprende de aproximadamente 0 hasta aproximadamente 200 aminoácidos, por ejemplo, de aproximadamente 16 aminoácidos, y/o el espaciador 3' comprende una etiqueta de afinidad.
En una modalidad, el enlazador comprende, de 5' a 3': Psoralen C6, 2'0Me ribonucleótidos que comprenden la secuencia UAGCGGAUGC (SEQ ID NO: 20), seis porciones de Trietilenglicol o PEG-150, dos residuos de cisteína y puromicina.
En una modalidad, la molécula de mARN scFv es fotoreticulada para el enlazador ADN mediante UVA. En otra modalidad, la molécula de mARN scFv comprende un promotor 5' seleccionado del grupo que consiste en T7, SP6, y T3. En una modalidad particular, la molécula de mARN scFv comprende una región no traducida 5' de virus de mosaico de tabaco.
En una modalidad, la molécula de proteína/mARN scFv reticulada con puromicina etiquetada es purificada mediante cromatografía oligo-dT. En otra modalidad, la molécula de proteína/mARN scFv reticulada con puromicina etiquetada es purificada utilizando cuentas de agarosa de anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2. Aún en otra modalidad, la molécula de proteína/mARN scFv reticulada con puromicina etiquetada es purificada mediante cromatografía de oligo-dT y cuentas de agarosa de anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2.
En una modalidad, el antígeno es un péptido, proteína, o hapteno biotinilado. En otra modalidad, el antígeno es una proteína de fusión con un fragmento de inmunoglobulina humano cristalizable (Fe) o con un fragmento de inmunoglobulina de múrido cristalizable (Fe), o el antígeno es una población de células. En una modalidad particular, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención es un anticuerpo anti-IL-12, un anticuerpo anti-hemaglutinina (anti-HA), anticuerpo de múrido, o un anticuerpo humano.
En una modalidad, la traducción in vitro del mARN scFv reticulado con puromicina se lleva a cabo en la presencia de GSSH/GSH.
En una modalidad, el método no comprende un paso de tapa con sello de mARN. En otra modalidad, el método no comprende un paso de transcripción inversa in vitro antes del paso de purificación. Aún en otra modalidad, el inhibidor RNase es agregado antes, durante, o después de cualesquiera los pasos de (a) a (g). En una modalidad, el paso de purificación comprende transcripción inversa del mARN en la ausencia de ditiotreitol (DTT) para producir cADN.
En ciertas modalidades, el cADN es eluido mediante hidrólisis alcalina en aproximadamente un pH de 8.0 a pH = 10.0. Como alternativa, el cADN es eluido mediante calentamiento suficiente para desnaturalizar los híbridos de ADN:ARN, mediante ácido en un pH de aproximadamente 3.0 hasta aproximadamente 6.0, o mediante digestión RNase.
En una modalidad, el cADN se amplifica mediante reacción de cadena de polimerasa. En una modalidad, la reacción de cadena de polimerización emplea una polimerasa de ADN termoestable o una polimerasa de ADN seleccionada del grupo que consiste en Platinum HiFi o KOD.
En otra modalidad, las cuentas se seleccionan del grupo que consiste en estreptavidin-M280, neutravidin-M280, SA-M270, NA-M270, SA-MyOne, NA-MyOne, SA-agarosa, y NA-agarosa.
Se podrán apreciar otras características y ventajas de la presente invención, a partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones adjuntas.
Breve Descripción de las Figuras La figura 1, ilustra un esquema general de la tecnología de despliegue de mARN-scFv en algunas modalidades de la presente invención.
La figura 2, ilustra un esquema general de la tecnología de despliegue mARN-scFv en otras modalidades de la presente invención.
La figura 3, muestra una ilustración general de una construcción de ADN de biblioteca.
La figura 4a, ilustra los resultados que muestran que el scFv funcional puede ser generado como moléculas mARN-scFv.
La figura 4b, ilustra modelos de moléculas scFv libres y moléculas mARN-scFv.
La figura 5, ilustra resultados que muestran que el scFv adherido en el formato de la molécula mARN-scFv, es funcionalmente equivalente a la molécula scFv libre.
La figura 6, ilustra las tres construcciones D2E7 mARN-scFv con diferentes longitudes de espaciador 3'.
La figura 7, ilustra resultados que muestran que la longitud más corta del espaciador, mejoró el enlace mARN-scFv a antígenos y el rendimiento de las moléculas de anticuerpo mARN-scFv.
La figura 8, ilustra las secuencias de los espaciadores Ck 3' de longitud corta, media y larga D2E7 (SEQ ID NOS 42-44, respectivamente en orden de aparición).
La figura 9a, ilustra las construcciones 17/9 mARN-scFv con longitudes de espaciador cortas y largas.
La figura 9b, ilustra resultados que muestran una longitud más corta del espaciador, mejoró el enlace de la molécula 17/9 mARN-scFv al antígeno objetivo y la producción de moléculas de anticuerpo mARN-scFv.
La figura 10, ilustra resultados que muestran que la actividad PDI, fue requerida para ciertas funciones.
La figura 11, ¡lustra resultados que muestran que la presencia de DTT durante la transcripción inversa inhibió el enlace de 17/9 scFv al antígeno hemaglutinina (HA).
La figura 12, ilustra resultados de la electroforesis de gel de agarosa que muestran que DTT no altera significativamente el proceso de transcripción inversa.
La figura 13, ilustra los resultados de electroforesis de gel de agarosa de diferentes condiciones RT con y sin DTT y RNaseOUT™ tanto antes como después de la selección.
La figura 14, ilustra los resultados de electroforesis de gel de agarosa que muestran la recuperación de la secuencia Phylos 40 VH cuando se transcribió en forma inversa ya sea antes o después de la selección en comparación con la preselección RT y la elución alcalina de cADN (columna izquierda).
La figura 15, ilustra resultados de electroforesis de gel de agarosa que muestran que el inhibidor RNase conservó la recuperación de la plantilla ARN mediante transcripción inversa después de la selección de antígenos.
La figura 16, ilustra los resultados de una comparación de lado por lado de un espaciador largo CL y corto CL en la presencia o ausencia de RNaseOUT™.
La figura 17, ilustra los resultados de electroforesis de gel de agarosa que muestran la comparación lado por lado de la recuperación de une espaciador largo-CL y corto-CL en la presencia o ausencia de RNaseOUT™.
La figura 18, ilustra resultados de electroforesis de gel de agarosa que cuantifican 17/9 scFv antes y después de una vuelta de selección mARN-scFv.
La figura 19, muestra una ilustración general de las quimeras entre D2E7 y 2SD4.
La figura 20a, ilustra el porcentaje de recuperación después del enlace de antígenos entre las diferentes quimeras, que muestran que se puede utilizar la tecnología de despliegue de ARN para diferenciar enlazadores con diferente afinidad.
La figura 20b, ilustra el porcentaje normalizado de recuperación después de la selección de antígenos, que muestra que se puede utilizar tecnología de despliegue de ARN para diferenciar enlazadores con diferente afinidad.
La figura 21, ilustra la termoestabilidad de las moléculas mARN-scFv.
La figura 22, ilustra resultados de electroforesis de gel de agarosa que muestran que el ARN puede ser recuperado después de tratamiento a altas temperaturas de las moléculas mARN-scFv.
La figura 23, ilustra las construcciones mARN-scFv Y61 con longitudes de espaciador cortas y largas, así como la construcción PF-y61 scGene3 que comprende una cola poli-A en el enlazador de ADN entre m ARN y la proteína scFv.
La figura 24, ilustra un esquema general para la tecnología de despliegue mARN-scFv en otras modalidades de la presente invención.
Descripción Detallada de la Invención Números de identificación de secuencias A las secuencias de nucleótido y aminoácidos referidas en la presente especificación, se les ha proporcionado los siguientes números de identificación de secuencia: SEC ID NO:1 - Secuencia de aminoácido de la secuencia de proteína MAK195 scFv.
SEC ID NO:2 - Secuencia de aminoácido de secuencia de proteína corta Y61 scFv.
SEC ID NO: 3 - Secuencia de aminoácido de secuencia de proteína larga Y61 scFv.
SEC ID NO:4 - Secuencia de aminoácido de secuencia de proteína Y61 scFv Gene3.
SEC ID NO: 5 - Secuencia de aminoácido de secuencia de proteína corta D2E7 scFv.
SEC ID NO: 6 - Secuencia de aminoácido de secuencia de proteína media D2E7 scFv.
SEC ID NO:7 - Secuencia de aminoácido de secuencia de proteína larga D2E7 scFv.
SEC ID NO: 8 - Secuencia de aminoácido de secuencia de proteína corta 17/9 scFv.
SEC ID NO:9 - Secuencia de aminoácido de secuencia de proteína larga 17/9 scFv.
SEC ID NO: 10 - Secuencia de ácido nucleico de secuencia de nucleótido MAK195 scFv.
SEC ID NO: 11 -Secuencia de ácido nucleico de secuencia de nucleótido corta Y61 scFv.
SEC ID NO: 12 - Secuencia de ácido nucleico de secuencia de nucleótido larga Y61 scFv.
SEC ID NO: 13 - Secuencia de ácido nucleico de secuencia de nucleótido Y61 scFv Gene3PA.
SEC ID NO: 14 - Secuencia de ácido nucleico de secuencia de nucleótido Y61 scFv Gene3.
SEC ID NO: 15 - Secuencia de ácido nucleico de secuencia de nucleótido corta D2E7 scFv.
SEC ID NO: 16 - Secuencia de ácido nucleico de secuencia de nucleótido medio D2E7 scFv.
SEC ID NO: 17 - Secuencia de ácido nucleico de secuencia de nucleótido larga D2E7 scFv.
SEC ID NO: 18 Secuencia de ácido nucleico de secuencia de nucleótido corta 17/9 scFv.
SEC ID NO: 19 - Secuencia de ácido nucleico de secuencia de nucleótido larga 17/9 scFv .
Con el objeto de que la presente invención pueda ser comprendida más fácilmente, primero se definirán algunos términos.
I. Definiciones El término "anticuerpo" incluye anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud total), anticuerpos policlonales, anticuerpos mu Itiespecíf icos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, anticuerpos de múrido y fragmentos de los mismos, por ejemplo, una cadena ligera de anticuerpo (VL), una cadena ligera de anticuerpo (VH), un anticuerpo de cadena simple (scFv), un fragmento F(ab')2, un fragmento Fab, un fragmento Fd, un fragmento Fv, y un fragmento de anticuerpo de dominio simple (dAb).
El término "biblioteca de anticuerpo" se refiere a una pluralidad de moléculas de ADN o ARN que contienen un cuadro de lectura abierta (ORF), que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo. También incluye una pluralidad de proteínas de anticuerpo y moléculas de fusión de ácido nucleico/anticuerpo expresadas a partir de las moléculas de ADN o ARN.
El término "dominio variable de cadena pesada" se refiere al ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada de anticuerpo, y al producto de proteína de dicho ácido nucleico.
El término "dominio variable de cadena ligera" se refiere al ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de anticuerpo y al producto de proteína del ácido nucleico.
El término "etiqueta epítope" se refiere a una secuencia de aminoácido reconocida en forma específica a través de un anticuerpo que se adhiere química o genéticamente a una molécula para permitir su detección, a través del anticuerpo, por ejemplo, etiqueta FLAG, etiqueta HA, etiqueta Myc o etiqueta T7.
El término "secuencias de no anticuerpo" se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico o aminoácido que aparece en las bibliotecas de anticuerpo de la presente invención, que no son parte de la secuencia del anticuerpo original. Dichas secuencias, incluyen, por ejemplo, etiquetas de epítope.
El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN o elementos genéticos necesarios para la expresión de una secuencia de codificación enlazada en forma operable en un organismo receptor en particular o al sistema de expresión ¡n vi tro. Dichas secuencias son bien conocidas en la técnica. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotos, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de enlace de ribosoma. Las células eucarióticas se conocen por utilizar promotores, señales de poliadenilación y aumentadores. Por ejemplo, el ácido nucleico se "enlaza en forma operable" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor aumentador se enlaza en forma operable a una secuencia de codificación si afecta la transcripción de la secuencia, o un sitio de enlace de ribosoma se enlaza en forma operable a una secuencia de codificación, si se coloca para facilitar la traducción. En forma general, el término "enlazado en forma operable" significa que las secuencias de ADN que están enlazadas son contiguas. Sin embargo, los aumentadores no tienen que ser contiguos.
El término "enlace específico" o "que enlaza específicamente a" se refiere a la capacidad que tiene una molécula de enlace de enlazar a un objeto con una afinidad de al menos 1 x 1 O"6 M, 1 x 10"7 M, 1 x 1CT8 M, 1 x 0"9 M, 1 x 1CT10 M, 1 x 10"11 M, 1 x 10"12 M, o menos, y/o enlazar a un objetivo con una afinidad que es al menos dos veces más que su afinidad para un antígeno no específico.
El término "objetivo" se refiere a un antígeno o epítope reconocido por un anticuerpo. Los objetivos incluyen cualesquiera péptidos, proteínas, sacáridos, ácidos nucleicos, u otras moléculas, incluyendo moléculas pequeñas para las cuales se puede generar un antígeno específico. En una modalidad, los anticuerpos son contra una proteína humana, por ejemplo, TNFa, IL- 2, IL18, IL-1 a o I L- 1 ß .
Una "sustitución de aminoácido conservadora", es una en la cual se reemplaza un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en la técnica.
El término "despliegue de ARN" o "despliegue de ARN" se refiere a una técnica in vitro en donde las proteínas o péptidos expresados se enlazan en forma covalente o a través de interacción no covalente ajustada a su mARN de codificación para formar moléculas de "fusión de ARN/proteína". El componente de proteína o péptido de una fusión de ARN/proteína puede seleccionarse para enlazar a un objetivo deseado y la identidad de la proteína o péptido determinada mediante la secuenciación del componente de mARN de codificación adherido. Dichos métodos son bien conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en las Patentes Norteamericanas Nos. 7,195,880; 6,951,725; 7,078,197; 7,022,479, 6,518,018; 7,125,669; 6,846,655; 6,281,344; 6,207,446; 6,214,553; 6,258,558; 6,261,804; 6,429,300; 6,489,116; 6,436,665; 6,537,749; 6,602,685; 6,623,926; 6,416,950; 6,660,473; 6,312,927; 5,922,545; y 6,348,315; cada una de las cuales está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia.
El término "anticuerpo de cadena simple" o "scFv" se refiere a una parte de enlace de antígeno de una región variable de cadena ligera, y a una parte de enlace de antígeno de una región variable de cadena pesada, unidas, utilizando métodos recombinantes, a través de un enlazador sintético que les permite elaborarse como una cadena de proteína simple en la cual las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv (scFv) de cadena simple; ver por ejemplo las Publicaciones de Bird y asociados, (1988) Science 242:423-426; y Huston y asociados, (1988) Proc. Nati. Acad. ScL U.S. A 85:5879-5883).
El término "porción funcional" se refiere a cualquier entidad biológica o química que imparta funcionalidad adicional a una molécula, a la cual se adhiere.
El término "seleccionar" se refiere a dividir sustancialmente una molécula procedente de otras moléculas en una población. Tal como se utiliza en la presente invención, un paso de "selección" proporciona al menos un enriquecimiento de 2 veces preferentemente, 30 veces, más preferentemente, 100 veces, y, lo más preferentemente 1000 veces de una molécula deseada relativa a moléculas no deseadas en una población después del paso de selección. Tal como se indica en la presente invención, se puede repetir un paso de selección cualquier número de veces, y se pueden combinar diferentes tipos de pasos de selección en un método determinado.
El término "secuencia de paso" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que origina que un ribosoma haga lento o detenga su rango de traducción.
El término "soporte sólido" se refiere a, sin limitación, a cualquier columna (o material de columna), cuenta, tubo de prueba, plato de microtitulación , partícula sólida (por ejemplo, agarosa o sefarosa), microchip (por ejemplo, silicón, silicón-vidrio o pedazo de oro) o membrana (por ejemplo, la membrana de un liposoma o vesícula) a la cual se puede enlazar un complejo de afinidad, ya sea directa o indirectamente (por ejemplo, a través de otros intermediarios de la parte de enlace, tal como otros anticuerpos o Proteína A), o en el cual se puede incrustar un complejo de afinidad (por ejemplo, a través de un receptor o canal).
El término "región enlazadora" se refiere a una región de ácido nucleico que conecta las secuencias de ácido nucleico que codifican los dominios de anticuerpo VH y VL en un gen de anticuerpo scFv. Una región enlazadora, está en-cuadro con las secuencias de ácido nucleico que codifican el anticuerpo VH y VL, de modo que se forma un cuadro de lectura abierta continuó que contiene regiones VH, VL y enlazadoras. El término también se refiere a la región que conecta VH y VL en una proteína scFv.
El término "aceptor de péptido", se refiere a cualquier molécula con la capacidad de ser agregada al C-término de una cadena de proteína en crecimiento, a través de la actividad catalítica de la función de transferasa de peptidilo ribosomal. Normalmente, dichas moléculas contienen (i) una poción de nucleótido o tipo nucleótido (por ejemplo, puromicina y análogos de la misma), (ii) una porción de aminoácido o tipo aminoácido (por ejemplo, cualesquiera de los 20 D- o L-aminoácidos o cualquier análogo de aminoácido) de los mismos (por ejemplo, tirosina de O-metilo o cualesquiera de los análogos descritos en la Publicación de Ellman y asociados, Meth. Enzymol. 202:301, 1991), y (iii) un enlace entre dos (por ejemplo, un enlace de éster, amida o cetona en la posición 3' o, menos preferentemente, la posición 2'); preferentemente, este enlace no perturba significativamente la estructura del anillo de la conformación de ribonucleótido natural. Además, este término comprende sin limitación, una molécula aceptora de péptido que se enlaza covalentemente (ya sea directa o indirectamente a través de la intervención de la secuencia de ácido nucleico) a la secuencia de codificación de proteína, así como a una que se une a la secuencia que codifica la proteína a través de algunos medios no covalentes, por ejemplo, a través de hibridación utilizando una segunda secuencia de ácido nucleico que enlaza en o cerca del extremo 3' de la secuencia que codifica la proteina, y que por sí misma se enlaza a una molécula aceptora de péptido.
II. Revisión General La presente invención presenta métodos mejorados de un despliegue de ARN in vitro que permite la expresión y selección confiable de moléculas de anticuerpo scFv procedentes de las bibliotecas de expresión.
Los métodos de despliegue de ARN generalmente implican la expresión de una biblioteca de proteínas o péptidos, en donde las proteínas o péptidos expresados se enlazan covalentemente o a través de interacción no covalente ajustada a su mARN de codificación para formar moléculas de fusión de ARN/proteína. El componente de proteína o péptido de una fusión de ARN/proteína se puede seleccionar para enlazar a un objetivo deseado, y la identidad de la proteína o péptido determinado mediante secuenciación del componente de mARN de codificación adherido. Los métodos actuales de despliegue de ARN no son óptimos para la expresión de anticuerpo scFv, ya que se llevan a cabo diversos pasos bajo condiciones de reducción, lo cual evita la formación de un enlace de disulfuro intra-cadena scFv y por lo tanto, el enlace correcto de las moléculas de anticuerpo scFv. Los métodos actuales hacen uso adicionalmente cualesquiera de los fragmentos de anticuerpo VH o VL en el proceso de selección.
La presente invención resuelve este problema técnico llevando a cabo el ensayo de despliegue de ARN in vitro bajo condiciones de reducción leve, que favorecen un enlace de disulfuro intra-cadena scFv y por lo tanto corrigen la multiplicación de las moléculas de anticuerpo scFv. Utilizando el formato scFv en lugar de los dominios variables simples (por ejemplo, un dominio pesado variable simple (VH)) también se elimina la necesidad de identificar un dominio ligero variable compatible (VL) necesario para la conversión del dominio VH seleccionado en un anticuerpo IgG total.
Por consiguiente, aunque particularmente adecuados para la expresión y selección de moléculas de anticuerpo scFv, los métodos de las presente invención también son útiles para despliegue de ARN in vitro de todas las clases de proteína.
Los métodos de la presente invención también proporcionan un protocolo para llevar a cabo el despliegue de ARN. Esto se logra, en parte, evitando el paso tardado de transcribir en forma inversa el mARN en una fusión de ARN-proteína in cADN antes de la selección con un objetivo.
III: Método de Clasificación de Desplieque-ARN in vitro En un aspecto, la presente invención presenta métodos mejorados de clasificación de despliegue-ARN in vitro. 1 ) Formación efe Fusiones de ARN/Proteína Una o más bibliotecas de expresión de ADN de anticuerpo in vitro, se transcriben para generar mARN. Cualquier biblioteca de expresión de anticuerpo in vitro es adecuada (por ejemplo, bibliotecas VH, VL o scFv), sin embargo, los métodos de la presente invención son particularmente adecuados para bibliotecas scFv. Cualesquiera métodos reconocidos en la técnica para transcripción son adecuados. Después de la transcripción de ARN, se eliminan las plantillas de la biblioteca de ADN. Esto se puede lograr utilizando cualquiera métodos reconocidos en la técnica, por ejemplo, mediante digestión con Dnase I.
Después de la eliminación de ADN, se adhiere un aceptor de péptido al extremo 3'del mARN de la biblioteca. Esto se puede lograr utilizando cualesquiera métodos reconocidos en la técnica. En una modalidad, se utiliza un enlazador que comprende 5' (Psoralen C6) 2'OMe(U AGC GGA UGC) XXX XXX CC (Puromicina) 3' (SEQ ID NO: 20), (en donde X es un Trietilen glicol o PEG-150 y CC es un esqueleto de ADN estándar). El enlazador se deja enlazar primero al extremo 3' de la biblioteca de mARN a través de emparejamiento de bases complementarios. Posteriormente el enlazador es reticulado al mARN mediante activación UV de la molécula Psoralen C6.
Después de la adición del aceptor de péptido, la biblioteca de mARN se traduce posteriormente en un sistema in vitro. Son adecuados cualesquiera métodos reconocidos en la técnica de la traducción in vitro, por ejemplo, para el lisado de reticulocito de conejo. Sin embargo, para permitir una formación correcta de un enlace de disulfuro intracadena en moléculas scFv, se agrega una isomerasa de disulfuro de proteína (PDI) a la reacción de traducción in vitro y/o la reacción se lleva a cabo bajo condiciones de oxidación leve. En algunas modalidades, se agrega a la reacción de traducción in vitro un agente de oxidación leve (por ejemplo, GSSG/GSH, por ejemplo 100mM GSSG/10m GSH). En otra modalidad, los agentes de reducción (por ejemplo, ditiotreitol (DTT)) son omitidos de la reacción de traducción in vitro.
Se pueden agregar uno o más aminoácidos etiquetados, o derivados de los mismos, al sistema de traducción in vitro, de modo que el aminoácido etiquetado quede incorporado en el anticuerpo resultante, Está contemplado cualquier aminoácido etiquetado reconocido en la técnica, por ejemplo, un aminoácido radioetiquetado, por ejemplo, metionina o cisteína etiquetada- 35S Durante la reacción de traducción in vitro, las moléculas de mARN quedan enlazadas en forma covalente a sus productos de proteína a través del aceptor de péptido (por ejemplo, puromicina) fusionado al extremo 3'. Estas moléculas de fusión de ARN/proteína son purificadas fuera de la mezcla de reacción de traducción in vitro. Están contemplados cualesquiera métodos reconocidos para la separación de moléculas de fusión ARN/proteína de una mezcla de reacción. En una modalidad, las proteínas de fusión de ARN/proteína se separan mediante cromatografía utilizando una resina de polidesoxitimidina (polydT). En otra modalidad, las proteínas de fusión de anticuerpo de ARN se separan enlazando a un anticuerpo específico para un epítope presente en el componente de anticuerpo de la proteína de fusión ARN/proteína. El epítope puede ser una etiqueta de secuencia de aminoácido, por ejemplo etiquetas FLAG o HA, incorporadas en la secuencia de aminoácido del componente de anticuerpo de la proteína de fusión de anticuerpo-ARN , por ejemplo, en el N-terminal, C-terminal o en el enlazador de región variable interna.
Las fusiones de ARN/proteína de la presente invención, implican el uso de ARN descubierto. En una modalidad preferida, todos los reactivos que contactan las fusiones de ARN/proteína son tratados con reactivo de inhibidor RNase, por ejemplo, RNaseOUT™, tARN de levadura, SUPERaseln™, RNasin®, y otros inhibidores RNase conocidos en la técnica. 2) Clasificación de Anticuerpos para un Objetivo Deseado La biblioteca de fusiones de ARN/proteína se clasifica para enlace in vitro a un objetivo deseado. En general, las moléculas objetivo son enlazadas a un soporte sólido, por ejemplo, cuentas de agarosa. En una modalidad, la molécula objetivo se enlaza directamente a un substrato sólido. En otra modalidad, la molécula objetivo se modifica primero, por ejemplo, se biotinila, posteriormente la molécula objetivo modificada está enlazada a través de la modificación a un substrato sólido, por ejemplo, estreptavidina-M280, neutravidina-M280, SA-M270, NA-M270, SA-MyOne, NA-MyOne, SA-agarosa y NA-agarosa. En otras modalidades, el soporte sólido incluye además cuentas magnéticas, por ejemplo Dynabeads. Dichas cuentas magnéticas permiten la separación del soporte sólido, y cualquier fusión ARN/anticuerpo enlazada, de una mezcla de ensayo utilizando un magneto.
Después del enlace de las fusiones ARN/proteína, el soporte sólido se lava una o más veces para eliminar las fusiones de ARN/proteína enlazadas, y posteriormente se amplifica el ARN. En una modalidad, el mARN que está asociado físicamente con un anticuerpo o pluralidad de anticuerpos se amplifica para producir más mARN. Cualquier método reconocido en la técnica de la réplica de ADN está contemplado, por ejemplo, utilizando una enzima de replicasa de ARN. En otra modalidad, el mARN que está asociado físicamente con un anticuerpo o pluralidad de anticuerpo se puede transcribir en un cADN antes de ser amplificado mediante PCR. El conjunto amplificado por PCR, puede ser sometido a una o más vueltas de clasificación para enriquecer los anticuerpos de afinidad más alta.
Adicionalmente o en forma alternativa, las fusiones de ARN/proteína pueden ser eluidas del soporte sólido antes de la amplificación del componente de ácido nucleico. Está contemplado cualquier método de elución reconocido en la técnica. En una modalidad, las fusiones de ARN/proteína son eluidas utilizando condiciones alcalinas, por ejemplo, utilizando un pH de aproximadamente 8.0 a 10.0. En otra modalidad, las fusiones de ARN/proteína son eluidas utilizando condiciones de ácido, por ejemplo, utilizando un pH de aproximadamente 3.0 a 6.0. En una modalidad, las fusiones de ARN/proteína no son eluidas antes de la amplificación del componente de ácido nucleico, sino más bien las fusiones de ARN/proteína se agregan directamente a la mezcla de reacción de amplificación.
Además, o en forma alternativa el conjunto de ácidos nucleicos amplificado por PCR puede ser secuenciado utilizando métodos de secuenciación de molécula simple, para determinar las secuencias nucleicas de cada molécula de ARN/proteína seleccionada. En una modalidad, se puede lograr la amplificación PCR utilizando una prueba de alta fidelidad-lectura de polimerasa, por ejemplo, la polimerasa de ADN termoestable KOD1 de Thermococcus kodakaraensis o la polimerasa de ADN Taq Platinum de Alta Fidelidad (Invitrogen).
En forma adicional o alternativa, las secuencias de ácido nucleico pueden ser amplificadas bajo condiciones que dan como resultado la introducción de mutaciones en el ADN amplificado, introduciendo de esta forma una diversidad adicional en las secuencias de ácido nucleico seleccionadas. Este conjunto mutado de moléculas ADN, puede ser sometido a vueltas adicionales de clasificación.
IV. Construcción de Biblioteca Las bibliotecas de la presente invención se pueden generar a partir de cualquier fragmento de anticuerpo con la capacidad de enlazar a un objetivo. En otra modalidad, se generan bibliotecas de dominios variables de anticuerpo. Éstos pueden ser dominios VH y/o VL. En otras modalidades, se generan bibliotecas scFv.
Las bibliotecas de la presente invención también pueden incluir secuencias de ácido nucleico de anticuerpo que codifican regiones fuera de las regiones variables, por ejemplo, una región constante o fragmento de la misma, o una región de articulación.
Las bibliotecas de ácido nucleico de la presente invención pueden comprender ARN, ADN o híbridos que contienen tanto elementos ARN como ADN.
Ligadura de Ácido Nucleico a Aceptores de Péptido Las bibliotecas de ácido nucleico de anticuerpo pueden ser modificadas para contener una porción aceptora de péptido. Esto puede facilitar la unión covalente de un miembro individual de las bibliotecas de expresión de ácido nucleico a sus productos de proteina de cognato. Cualesquiera medios reconocidos en la técnica para la unión- de un aceptor de péptido a un ácido nucleico están contemplados, incluyendo los métodos descritos por ejemplo en la Patente Norteamericana No. 5,643,768, Patente Norteamericana No. 5,658,754, Patente Norteamericana No. 7,195,880 y Patente Norteamericana No. 6,951,725, cuyos contenidos están incorporados a la presente invención como referencia.
En un aspecto, la presente invención presenta métodos novedosos y composiciones para la unión de un aceptor de péptido a bibliotecas de ácido nucleico. En una modalidad, se puede sintetizar una molécula de enlace que comprende una molécula Psoralen C6 y una molécula aceptora de péptido, en donde la molécula Psoralen C6 y una molécula aceptora de péptido se fusionan a una secuencia de ácido nucleico, en donde la secuencia de ácido nucleico es complementaria a las secuencias en el extremo 3' de la biblioteca de ácido nucleico. Dichas moléculas de enlace pueden enlazar, a través de emparejamiento de base complementario al extremo 3' de clones de la biblioteca de ácido nucleico. Psoralen C6 es sensible a luz ultravioleta (UV) y reticulará el enlazador a los clones de la biblioteca de ácido nucleico, enlazando en forma covalente de esta manera el aceptor de péptido a los clones de la biblioteca de ácido nucleico. En otra modalidad, la porción de ácido nucleico de la molécula enlazadora puede contener nucleótidos modificados, por ejemplo, ribonucleótidos de metoxi 2 de primera (2'OMe). En otra modalidad, la molécula enlazadora comprende además un enlazador de Trietilénglicol o PEG-150 que separa la región de ácido nucleico que contiene la molécula Psoralen C6, y una molécula aceptora de péptido. En una modalidad, el enlazador puede comprender, de 5' a 3': Psoralen C6, 2'OMe) ribonucleótidos que comprenden la secuencia UAGCGGAUGC (SEQ ID NO: 20), seis porciones Trietilen glicol o PEG-150, dos residuos de citidina y puromicina. Dichos enlazadores pueden ser sintetizados en forma acostumbrada, por ejemplo, a través de TriLink BioTechnologies, Inc.
V. Métodos de Clasificación General En un aspecto, la presente invención presenta métodos para clasificar las bibliotecas de expresión de la presente invención, para identificar anticuerpos con la capacidad de enlazar a un objetivo deseado. Se contempla cualquier método de clasificación in vitro o in vivo que permita la selección de un anticuerpo de una biblioteca de expresión, con base en el enlace de anticuerpo a una molécula objetivo.
En una modalidad, se pueden clasificar las bibliotecas de expresión de la presente invención utilizando un despliegue enlazado por fenotipo-genotipo libre de células in vitro reconocido. Dichos métodos son conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en las Patentes Norteamericanas Nos. 7,195,880; 6,951,725; 7,078,197; 7,022,479, 6,518,018; 7,125,669; 6,846,655; 6,281,344; 6,207,446; 6,214,553; 6,258,558; 6,261,804; 6,429,300; 6,489,116; 6,436,665; 6,537,749; 6,602,685; 6,623,926; 6,416,950; 6,660,473; 6,312,927; 5,922,545; y 6,348,315. Estos métodos implican la transcripción de proteína in vitro a partir de un ácido nucleico, de tal forma que la proteína sea asociada físicamente o enlazada al ácido nucleico del cual se origina. Mediante la selección de una proteína expresada con una molécula objetivo, el ácido nucleico que codifica la proteína también es seleccionado.
Para mejorar la expresión de proteínas scFv, los ensayos de clasificación in vitro referenciados anteriormente pueden requerir la adición o eliminación de ciertos reactivos. En una modalidad, se pueden agregar enzimas de isomerasa de disulfuro de proteína al sistema de expresión in vitro para mejorar la producción de moléculas scFv funcionales. En otra modalidad, se puede agregar un agente de oxidación leve (por ejemplo, GSSG/GSH, por ejemplo 100mM GSSG/10mM GSH) a una mezcla de reacción de traducción in vitro de las proteínas svFc para permitir la formación de enlace de disulfuro intracadena en las regiones VH y VL de la molécula scFv. En otra modalidad, se pueden eliminar los agentes de reducción (por ejemplo, ditiotreitol (DTT)) de la mezcla de reacción de traducción in vitro de la scFV.
En otra modalidad, se pueden agregar uno o más aminoácidos etiquetados o derivados de los mismos, al sistema de traducción in vitro de modo que el aminoácido etiquetado quede incorporado en el anticuerpo resultante. Cualquier aminoácido etiquetado reconocido está contemplado, por ejemplo, un aminoácido radioetiquetado, por ejemplo, metionina o cisteína etiquetada-S.
En una modalidad, los ensayos de clasificación in vitro de la presente invención requiere que después de la selección in vitro de un anticuerpo o pluralidad de anticuerpos, el mARN que está asociado físicamente con el anticuerpo o pluralidad de anticuerpos, pueda ser transcrito en forma inversa para generar la codificación cADN del anticuerpo o pluralidad de anticuerpos. Se contempla cualquier método adecuado para transcripción inversa, por ejemplo, transcripción inversa transmitida por enzimas, por ejemplo, transcriptasa inversa de virus de leucemia de múrido Moloney.
Los métodos de clasificación empleados en la presente invención pueden requerir la amplificación del ácido nucleico que codifica anticuerpos que enlazan específicamente a un objetivo deseado. En una modalidad, el mARN que está asociado físicamente con un anticuerpo o pluralidad de anticuerpo puede ser amplificado para producir más mARN. Se contempla cualquier método reconocido en la técnica para réplica de ARN, por ejemplo, utilizando una enzima de replicasa ARN. En otra modalidad, el mARN que está asociado físicamente con un anticuerpo o pluralidad de anticuerpos puede ser transcrito primero en forma inversa en cADN antes de ser amplificado mediante PCR. En una modalidad, se puede lograr la amplificación PCR utilizando una polimerasa de lectura-prueba, alta fidelidad, por ejemplo, la polimerasa de ADN termoestable KOD1 de Thermococcus kodakaraensis o la polimerasa de ADN Taq Platinum de Alta Fidelidad (Invitrogen). En otra modalidad, se puede llevar a cabo amplificación PCR bajo condiciones que introducen mutaciones en el ADN amplificado, por ejemplo, PCR propenso a error.
En otra modalidad, las bibliotecas de expresión de la presente invención se pueden clasificar mediante el despliegue en la superficie de una célula, virus o bacteriófago y someterse a selección utilizando moléculas objetivo inmovilizadas. Métodos adecuados de clasificación se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 7,063,943; 6,699,658; 6,423,538; 6,696,251; 6,300,065; 6,399,763; 6,114,147 y 5,866,344.
Los métodos de clasificación empleados en la presente invención pueden requerir la introducción de una diversidad en la biblioteca de anticuerpo introduciendo sustituciones y/o eliminaciones de nucleico que pueden dar como resultado una o más sustituciones de aminoácido y/o eliminaciones en las moléculas de anticuerpo expresadas. Se contemplan cualesquiera métodos de mutagénesis reconocidos en la técnica, por ejemplo, mutagénesis aleatoria, mutagénesis (en camino) y mutagénesis "mediante vista". Dicha mutagénesis de un anticuerpo se puede lograr utilizando por ejemplo, PCR propenso a error, cepas "mutantes" de levadura o bacterias o la incorporación de cambios de ácido nucleico aleatorios o definidos durante la síntesis ab inito de todo o parte de un anticuerpo. En una modalidad, se puede crear una biblioteca de moléculas de anticuerpo en donde se mutan en forma aleatoria uno o más aminoácidos. En otra modalidad, se puede crear una biblioteca de moléculas de anticuerpo en donde uno o más aminoácidos son mutados a uno o más aminoácidos predeterminados.
Los métodos de clasificación empleados en la presente invención también pueden requerir que se incremente la rigurosidad del ensayo de clasificación de enlace-objetivo, para seleccionar anticuerpos con afinidad mejorada para el objetivo. Se pueden considerar cualesquiera métodos reconocidos en la técnica para incrementar la rigurosidad de una interacción de objetivo-anticuerpo. En una modalidad, se pueden variar una o más de las condiciones de ensayo (por ejemplo, la concentración de sal del amortiguador necesario), para reducir la afinidad de las moléculas de anticuerpo para el objetivo deseado. En otra modalidad, la longitud del tiempo permitida para que los anticuerpos se enlacen a un objetivo deseado, puede ser reducida. En otra modalidad, se puede agregar un paso de enlace competitivo al ensayo de interacción de objetivo-anticuerpo. Por ejemplo, los anticuerpos se puede permitir que primero enlacen a un objetivo inmovilizado deseado. Posteriormente se puede agregar una concentración específica de objetivo no inmovilizada que sirve para competir para enlazar con el objetivo inmovilizado, de modo que los anticuerpos con la menor afinidad para el antígeno, sean eluidos del objetivo inmovilizado dando como resultado un enriquecimiento de anticuerpos con afinidad de enlace de antígeno mejorada. La rigurosidad de las condiciones de ensayo puede incrementarse en forma adicional, incrementando la concentración del objetivo no inmovilizado que se agrega al ensayo.
Los métodos de clasificación de la presente invención también pueden requerir múltiples vueltas de selección para enriquecer uno o más anticuerpos con un enlace objetivo mejorado. En una modalidad, en cada vuelta de selección se pueden introducir mutaciones de aminoácido adicionales en los anticuerpos utilizando métodos reconocidos en la técnica. En otra modalidad, en cada vuelta de selección, se puede incrementar la rigurosidad del enlace al objetivo deseado, para seleccionar anticuerpos con afinidad incrementada para un objetivo deseado.
Los métodos de clasificación de la presente invención pueden requerir la purificación de las proteínas de fusión de anticuerpo-ARN a partir de los componentes de un sistema de traducción in vitro. Esto se puede lograr utilizando cualquier método de separación reconocido en la técnica. En una modalidad, las proteínas de fusión de anticuerpo-ARN pueden ser separadas mediante cromatografía utilizando una resina de polidesoxitimidina (polydT). En otra modalidad, las proteínas de fusión de anticuerpo-ARN pueden ser separadas mediante cromatografía utilizando un anticuerpo específico para un epítope presente en el componente de anticuerpo de la proteína de fusión de anticuerpo-ARN. El epítope puede ser una etiqueta de secuencia de aminoácido, por ejemplo, etiquetas FLAG, Myc, o HA, incorporadas en la secuencia de aminoácido del componente de anticuerpo de la proteína de fusión de anticuerpo-ARN, por ejemplo, en el N-terminal, C-terminal o en el enlazador de región variable interna.
La selección de anticuerpos de las bibliotecas de la presente invención, puede requerir el uso de moléculas objetivo inmovilizadas. En una modalidad, la molécula objetivo se enlaza directamente a un substrato sólido, por ejemplo, cuentas de agarosa. En otra modalidad, la molécula objetivo se modifica primero, por ejemplo, se biotinila, posteriormente la molécula objetivo modificada se enlaza a través de la modificación a un soporte sólido, por ejemplo, estreptavidina-M280, neutravidina- M280, SA-M270, NA-M270, SA-MyOne, NA-MyOne, SA-agarosa y NA-agarosa.
EJEMPLIFICACIÓN DE LA INVENCIÓN A lo largo de los ejemplos, se utilizaron los siguientes materiales y métodos a menos que se manifieste de otra manera.
Materiales y Métodos En general, la práctica de la presente invención se emplea, a menos que se indique de otra manera, técnicas convenientes de química, biología molecular, tecnología de ADN recombinante, inmunología (especialmente, por eje>mplo, tecnología de inmunoglobulina), y conservación de animales. Ver, por ejemplo, la Publicación de Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Protocolos de Ingeniería de Anticuerpos (Métodos en Biología Molecular), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Ingeniería de Anticuerpos: Método Práctico (Serie de Método Práctico, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Anticuerpos: Manual de Laboratorio, Harlow y asociados, C.S.H.L. Press, Pub. (1999); Protocolos Actuales en Biología Molecular, eds. Ausubel y asociados, John Wiley & Sons (1992).
Protocolo de despliegue de mARN para scFv Se puede llevar a cabo el despliegue de mARN de acuerdo con el método mostrado en la figura 2. A continuación se describirán con mayor detalle, modalidades particulares de este método. Estas modalidades están proyectadas para ilustrar los métodos de la presente invención, y no deben construirse como limitantes. 1. Diseño de Plantillas de Biblioteca de Anticuerpo Se pueden diseñar construcciones de ADN de biblioteca de acuerdo con los métodos de generación de biblioteca de anticuerpo conocidos en la técnica. En una modalidad, las construcciones de biblioteca pueden codificar fragmentos de anticuerpo, es decir, fragmentos de cadena ligera de anticuerpo (VL) o fragmentos de cadena pesada de anticuerpo (VH). En una modalidad de ejemplo, las construcciones de biblioteca pueden codificar fragmentos variables de cadena simple (scFV). 2. Preparación de Antígeno Objetivo Generalmente, la biblioteca de anticuerpo de despliegue de mARN puede ser seleccionada contra antígeno biotinilado. Aunque se debe de terminar el mejor antígeno para cada objetivo en una base de caso por caso, se pueden utilizar las siguientes consideraciones como un lineamiento general. Un antígeno objetivo normalmente es bien caracterizado, y es el isotipo genético relevante o dominante, tal como se determina mediante polimorfismo (SNP y haplotipo) y/o análisis farmacogenético. Un antígeno objetivo puede adicionalmente tener bioactividad razonable (en comparación con un antígeno nativo), buena solubilidad y buenas propiedades químicas y físicas, y se puede preparar en cantidades suficientes para selecciones de biblioteca o clasificaciones y bioensayos de corriente descendente. 3. Preparación de ADN de Biblioteca El ADN de biblioteca y sus producciones de selección se pueden amplificar mediante PCR. Se puede llevar a cabo amplificación de PCR utilizando métodos conocidos en la técnica. Las reacciones PCR normalmente contienen una plantilla ADN, amortiguador de reacción d NTP, cebadores utilizados para amplificación, polimerasa de ADN y agua. Los tubos de reacción múltiple pueden ajustarse en forma simultánea de una mezcla maestra para un rendimiento de ADN amplificado, incrementado. 25 ciclos de PCR, normalmente proporcionan suficiente amplificación, pero se pueden utilizar tantos como 35 ciclos para ganar más productos. 4. Purificación de ADN de Biblioteca SI los productos tienen el tamaño correcto (-850 pb para scFv, -500 pb para biblioteca VH o VL) y contienen productos no específicos mínimos, los productos pueden ser utilizados directamente en la reacción de transcripción. Como alternativa, los productos se pueden purificar en un gel de agarosa de preparación, cortando la banda específica del tamaño correcto. La concentración de ADN puede medirse en un espectro fotómetro. 5. Transcripción de ARN La transcripción de ARN de un ADN de biblioteca puede llevarse a cabo utilizando métodos estándar conocidos en la técnica. Se puede utilizar un volumen de reacción grande para transcribir plantillas de ADN suficientes, para mostrar la diversidad de toda la biblioteca. En una modalidad de ejemplo, se pueden utilizar 1 x 1013 copias de las plantillas de biblioteca en la reacción de transcripción de ARN. Una transcripción de ARN normalmente contiene 5 a 10 de producto PCR, amortiguador de reacción ATP, CTP, GTP, UTP y polimerasa de T7 ARN. La reacción de transcripción de ARN puede correrse a una temperatura de 37°C entre 2 horas hasta toda la noche. Se pueden utilizar tiempos más cortos después de las vueltas de selección iniciales, sin embargo, las incubaciones durante la noche pueden maximizar el rendimiento de ARN de la reacción. Después de la transcripción de ARN, las plantillas ADN pueden ser eliminadas de la mezcla de reacción mediante digestión DNase I. 6. Purificación de ARN Mediante Cromatografía de Columna NAP Después de la transcripción, el ARN puede ser fraccionado utilizando una columna NAP-10. Se pueden cargar hasta aproximadamente 1 ml_ de la reacción de transcripción en una columna NAP-10 para purificación de ARN. La columna puede ser equilibrada utilizando dH20 tratado con DEPC antes del fraccionado. El ARN puede ser eluido de la columna utilizando aproximadamente 1.5X del DEPC tratado con dH20 del volumen de reacción (por ejemplo 750 µ?_ por 500 µ?_ de reacción de transcripción). El volumen de elución total puede ser menor aproximadamente a 150% del volumen de reacción de transcripción. El ARN puede ser fraccionado en forma adicional o alternativa utilizando una columna NAP-25. 7. Control de Calidad y Cuantificación de ARN El tamaño y rendimiento de muestras ARN puede analizarse utilizando electroforesis de gel, o como alternativa midiendo el OD en 260 nm (??2ß?) de concentración de ARN en fracciones recolectadas. Por ejemplo, se puede calcular la concentración molar del scFv ARN como se indica a continuación: [ARN] (µ?) = [ARN] (mg/mL) x 106 / (850 x 330) = OD260 x factor de dilución x 40 (pg/mL) x 1000 / (850 x 330).
Rendimiento de ARN (nmol) = [ARN] (µ ) x Volumen (µ?_) / 1000 El rendimiento de ARN normal alcanza un máximo en aproximadamente 20 nmol/mL por 500 µ!_ de reacción de transcripción. 8. Ligadura de ARN al Enlazador Un enlazador de ADN que contiene una molécula aceptora de péptido en su extremo 3' puede ser ligada covalentemente a los extremos 3' de cada molécula de ARN mediante reticulación UV. El aceptor de péptido, el cual puede ingresar al sitio ribosomal A y acoplarse covalentemente al término carboxilo de la cadena de polipéptido nasciente, finalmente puede permitir la asociación covalente del mARN (genotipo) a la proteína codificada por este mARN (fenotipo). Se puede utilizar un enlazador PEG6/10 de ejemplo el cual tiene la siguiente fórmula: 5' (Psoralen C6) 2'OMe(U AGC GGA UGC) XXX XXX CC (Puromicina) 3' (SEQ ID NO: 20).
La modificación de Psoralen C6 5' es sensible a la luz y funciona para crear un enlace covalente entre el enlazador y el mARN mediante reticulación UV. Una región de esqueleto 2"OMe(U AGC GGA UGC) (SEQ ID NO: 20) se endurece para el sitio de endurecimiento de enlazador 3' para la secuencia FLAG en mARN (ver figura 1). En la secuencia anterior, X denota el "espaciador 9" conocido alternativamente como Trietilen glicol o PEG-150. Este espaciador ha sido optimizado para proporcionar flexibilidad para la inserción de puromicina en el sitio de ribosoma eucariótica A. CC comprende un esqueleto de ADN estándar. Una modificación de puromicina 3' se inserta en el sitio de ribosoma A para crear un enlace estable entre el enlazador y el péptido naciente. El coeficiente de extinción para el enlazador aquí descrito puede ser de aproximadamente 147.7 OD26o/pmol. Ya que este enlazador es sensible a la luz, las soluciones que contienen este enlazador deben ser protegidas de la luz.
Para vueltas iniciales de selecciones de biblioteca, se puede recomendar una reacción de ligadura a gran escala (aproximadamente 5 nmol o aproximadamente 3.1 x 1015 de moléculas de ARN transcritas) para muestrear toda la diversidad de una biblioteca de anticuerpo na'i've con una diversidad estimada de aproximadamente 1012 - 1013. Esta cantidad ARN puede asegurar que se incorporen suficientes plantillas en las reacciones de traducción para producir -10 pmol de moléculas de despliegue de mARN funcional. En las últimas vueltas, se puede reducir la entrada de ARN hasta aproximadamente 0.5 nmoles por selección. En una modalidad de ejemplo, una reacción de ligadura ARN puede contener los siguientes componentes: ARN, agua, amortiguador de ligadura químico y enlazador de PEG6/puromicina (1 mM). En una modalidad de ejemplo, el volumen de reacción total es de aproximadamente 100 µ?_. En una modalidad preferida, la proporción molar de enlazador/ARN puede ser mayor aproximadamente a 1.5. En una modalidad, la concentración de enlazador final en la reacción es de aproximadamente 15 µ?, y la concentración ARN en la reacción puede fluctuar de aproximadamente 3 a 10 µ? (= 0.3 a 1 nmol de entrada de ARN). Como una referencia, un scFv ARN 850 nt en 1 mg/mL = 3.56 µ?, y la concentración de ligadura máxima que se puede lograr puede ser de aproximadamente 3.16 µ? (aproximadamente 0.32 nmoles).
La reacción de endurecimiento (que endurece el enlazador para el ARN transcrito) se puede llevar a cabo en un ciclador térmico. En una modalidad preferida, la reacción de endurecimiento puede llevarse a cabo incubando muestras a una temperatura de 85°C durante aproximadamente 30 segundos, posteriormente a una temperatura de aproximadamente 4°C, utilizando un rango de elevación de aproximadamente 0.3°C por segundo. Posteriormente las reacciones pueden mantenerse a una temperatura de aproximadamente 4°C.
La ligadura del ARN/enlazador endurecido puede lograrse mediante reticulación UV. Esto se puede llevar a cabo utilizando cualquier método conocido para un experto en la técnica. En una modalidad, los tubos de reacción se pueden colocar en la parte superior de un paquete de congelador congelado y colocarse directamente debajo de una lámpara UV portátil de longitud de onda larga (aproximadamente 365 nm) y reticularse durante aproximadamente 15 minutos en la oscuridad. La eficiencia de ligadura típica es de aproximadamente 50 a 90%. Generalmente no se requiere purificación. Los productos de ligadura pueden almacenarse a una temperatura de -80°C. 9. Reacción de traducción En una modalidad de ejemplo, se pueden elaborar aproximadamente -0.1% de ARN de entrada en moléculas de despliegue de mARN después de todas las reacciones y purificaciones. La traducción in vitro se lleva a cabo utilizando métodos y reactivos conocidos para un experto en la técnica. En una modalidad, la reacción de traducción utilizando la biblioteca scFv utiliza aproximadamente 5 nmoles de plantilla de ARN con aproximadamente 10 mL de Usado de reticulocito en un volumen de reacción de aproximadamente 15 mL.
En la preparación para la reacción de traducción, se pueden preparar soluciones de GSSG/GSH (glutationa oxidada/glutationa reducida) en una concentración final de aproximadamente 100 mM GSSG/ 0 mM GSH. Se prepara PDI disolviendo el polvo PDI en dH20 para alcanzar una concentración de aproximadamente 1 unidad/pL. La solución PDI se puede almacenar a una temperatura de -20°C.
Una reacción de traducción de ejemplo puede establecerse como se indica a continuación: ARN (100 a 120 pmol/300 pL o 500-600 pmol/1.5 mi) X X dH20 a 73.7 a 370 ML Mezcla maestra de aminoácido (Met") 15 75 pL 100 mM GSSG/10 mM GSH 3.3 16.5 ML PDI (1 U/pL) 6 30 ML [35S]Metionina 2 10 pL Lisado de reticulocito 200 1000 pi¬ Volumen total 300 1500 ul¬ Las reacciones de traducción se pueden incubar en un baño de agua a una temperatura de 30°C durante 1 a 2 horas, y la formación de fusión de ARN/proteína se debe llevar a cabo sin retraso. Se puede observar una disminución significativa en el rendimiento de la fusión ARN/proteína cuando el volumen de traducción excede 3 mL; en consecuencia, se puede preparar una mezcla maestra de la reacción de traducción si el volumen de reacción es mayor a 3 mL, y posteriormente dividirse en pequeñas alícuotas. 10. Formación de Fusión ARN/Proteína Después de la reacción de traducción, se pueden agregar aproximadamente 100 pL 2M de KCI y aproximadamente 20 pide 1M MgCI2 por cada 300-µ?_ de la mezcla de reacción de traducción, e incubarse durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente, o a una temperatura de -20°C durante la noche. Como alternativa, se pueden agregar aproximadamente 500 pL de 2M KCI y aproximadamente 100 pL de 1 M MgCI2 por cada 1.5 mi de la mezcla de reacción de traducción, e incubarse durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente, o a una temperatura de -20°C durante la noche. Esto estabiliza los ribosomas pausados al final de las plantillas de mARN y permite que la puromicina al final del enlazador de ADN, ingrese a los sitios A de los ribosomas pausados, los cuales enlazan permanentemente las proteínas scFV traducidas a sus plantillas mARN. La incubación a temperatura ambiente se puede acortar si la reacción se almacena a una temperatura de -20°C durante la noche. La reacción se puede terminar agregando aproximadamente 50 µ?_ o aproximadamente 250 µ!_ de 0.5 M EDTA por 300 µ?_ o 1.5 mi de reacción de traducción, respectivamente, para interrumpir los ribosomas. Las reacciones se pueden almacenar a una temperatura de -20°C. Se puede eliminar una alícuota de 5 a 10 µ?_ para conteo de centelleo posterior. 11. Purificación de Fusión ARN/Protelna Mediante Oligo-dT Celulosa Este paso se incluye para purificar las moléculas de despliegue de mARN y las plantillas de ARN restantes de la reacción de traducción/fusión. Para el enlace oligo-dT, la cantidad de oligo-dT celulosa lavada previamente necesita para capturar todas las plantillas de ARN, debe ser estimada. Se puede agregar un volumen suficiente de amortiguador de enlace oligo-dT a la reacción de fusión para alcanzar aproximadamente una concentración final de 1X. Posteriormente se puede agregar la oligo-dT celulosa lavada previamente, y las reacciones se rotan durante 1 hora a una temperatura de 4°C. Las reacciones pueden girarse opcionalmente en aproximadamente 1500 rpm durante 5 minutos a una temperatura de 4°C, y se desecha el sobrenadante. Las cuentas de oligo-dT celulosa pueden ser transferidas y lavadas aproximadamente 6 veces con amortiguador de enlace 1X Oligo-dT utilizando columnas giratorias y el amortiguador se elimina normalmente girando las columnas en aproximadamente 1000 rpm durante 10 segundos.
Se puede desechar el flujo, aunque el último lavado puede guardarse para el conteo de centelleo. Para reducir la concentración de sal y facilitar la elución, se puede agregar 1/10 del volumen de pasta inicial de dH20 a las cuentas de oligo-dT secas, que se pueden centrifugar inmediatamente durante 10 segundos, y se puede desechar el flujo. Se pueden eluir las moléculas de despliegue de mARN (y las plantillas de ARN libres), agregando dH20 e incubando durante 5 minutos a temperatura ambiente. El eluato se recolecciona girando en aproximadamente 4000 rpm (o mayor) durante 20 segundos. La elución normalmente se repite una vez, y se combinan los eluatos. Se puede eliminar 5 µ?_ del eluato para conteo de centelleo. Opcionalmente, también se puede evaluar la eficiencia de la purificación olido-dT mediante OD en 260 nm (OD26o) en una máquina de espectrofotómetro NanoDrop. Todas las plantillas de ARN restantes y las moléculas de despliegue de mARN son recuperadas teóricamente a través de las cuentas oligo-dT. Se agrega amortiguador de enlace 5X FLAG a los eluatos para alcanzar una concentración final de aproximadamente 1X. Las muestras se pueden almacenar una temperatura de -80°C si no se procede al siguiente paso de purificación FLAG.
Se puede calcular la recuperación oligo-dT como se indica a continuación. Aproximadamente 5 pL de entrada (de la reacción de fusión), aproximadamente 100 µ? del último lavado, y aproximadamente 5 µ?_ de salida (eluato de la purificación oligo-dT). El último lavado se utiliza para evaluar el grado del lavado, y los otros dos conteos se utilizan para calcular la recuperación de la fusión ARN/proteína de la entrada de la plantilla ARN original. Rendimiento de fusión de ARN/proteína (pmol) = (CPMsauda x VolumensaMda x 5 µ? x Volumeniisado)/[CPIvlentrada x Vo I u ir) e n e n t r a d a x (# de iTietionina en el producto). Esta fórmula asume una concentración de metionina de 5-µ? en el lisado de reticu locito , y todos los volúmenes utilizados en el cálculo expresado como µ?_. Para las vueltas de selección anteriores, el rendimiento de las moléculas de despliegue mARN normalmente es de 0.5 a 2%, pero puede incrementar a 10% en las últimas vueltas. Por ejemplo, el número de vueltas tempranas de metionina en la biblioteca PROfusion puede ser: • Aproximadamente 3 µ? para VH-VK SCFV, • Aproximadamente 2 a 3 µ? para VH-VA scFv, • Aproximadamente 2 µ? para VH, • Aproximadamente 2 µ? para VK, y · Aproximadamente 1 µ para VA.
Estos números son promedios y se basan en las secuencias de línea germinal, y un experto en la técnica podrá apreciar que pueden cambiar en las vueltas de selección conforme la biblioteca es enriquecida hacia secuencias específicas. 12. Purificación de Fusión de ARN/Proteína mediante Agarosa anti-FLAG M2 Este paso se diseñó para purificar las moléculas de despliegue de mARN de las plantillas de ARN restantes. No es necesario proceder a este paso, si la biblioteca será seleccionada mediante competición fuera de rango de antígeno o mediante células que expresan antígenos. La cantidad de cuentas de agarosa anti-FLAG M2 lavadas previamente necesarias para capturar todas las moléculas de despliegue de mARN, puede ser estimada. En una modalidad, la capacidad de enlace de las cuentas puede ser de aproximadamente 6 nmol de proteína de fusión por mL de pasta al 50%. Para tener un suficiente volumen de cuentas para manipulación durante el enlace y lavado, se recomienda etiquetar al menos aproximadamente 200 de cuentas pre-lavadas. El ejemplo proporcionado a continuación es para una reacción de traducción inicial de 300-µ?.
Purificación FLAG: se puede utilizar una punta de pipeta de perforación ancha para transferir 300 µ? de agarosa anti-FLAG M2 lavada previamente a la salida purificada con oligo-dT, que posteriormente se puede girar durante 1 hora a una temperatura de 4°C. La incubación con agarosa anti-FLAG M2 puede continuar durante la noche. La agarosa anti-FLAG M2 puede ser girada opcionalmente en aproximadamente 1500 rpm en una centrifugadora durante aproximadamente 1 minuto a una temperatura de 4°C, y el sobrenadante puede ser desechado. Se pueden lavar las cuentas anti-FLAG de aproximadamente 5 a 6 veces con aproximadamente 500 a 700 µ?_ de amortiguador de enlace 1X FLAG utilizando columnas giratorias (por ejemplo Columna Microcentrifuge Spin Invitrogen™) y centrifugarse en aproximadamente 1000 rpm durante 10 segundos para cada lavado (se debe observar que la columna Invitrogen™ puede ser girada a velocidades mayores, por ejemplo aproximadamente 10,000 rpm). Se puede desechar el flujo. Las cuentas pueden ser lavadas adicionalmente 2 veces con 700 µ?_ de Amortiguador de Selección (ver más adelante) mediante centrifugación en aproximadamente 1000 rpm durante 10 segundos. El último lavado puede ser guardado para conteo de centelleo. Las moléculas de despliegue de mARN pueden ser eluidas agregando aproximadamente 400 pL 100 pg/mL de péptido FLAG (en Amortiguador de Selección) e incubando durante 5 minutos a temperatura ambiente. El eluato puede ser recolectado girando en aproximadamente 3000 rpm (o mayor si es posible) durante 20 segundos. El paso de elución puede ser repetido una o más veces agregando aproximadamente 400 pL 100 pg/mL de péptido FLAG. Se puede combinar ambos eluatos, y se puede eliminar aproximadamente 5 pL para conteo de centelleo. Este volumen de péptido FLAG puede ser suficiente para una elución de hasta aproximadamente 1 mL de pasta al 50% y puede cortarse a la mitad (200 pL) si se utiliza menos pasta y/o si se desea una concentración de fusión de ARN/proteína mayor. Para evitar la degradación del ARN durante el almacenamiento y selección de antígeno, se puede agregar una cantidad adecuada de inhibidor RNase conocido en la técnica (por ejemplo, 1 a 2 U/µ?. RNAseOUT y 0.02 pg/mL de tARN de levadura) a la biblioteca de despliegue mARN purificado. Se almacenan las muestras a una temperatura de -80°C si no se procede al siguiente paso de selección de antígeno.
Para cuantificar la recuperación FLAG, se cuentan en un contador beta aproximadamente 5 µ[_ de salida de elución y aproximadamente 100 µ!_ del último lavado. Se puede esperar una recuperación de 10 a 30% o mayor, y se puede calcular de acuerdo con la siguiente fórmula: % de recuperación de molécula PROfusion = (CPMsai¡da x Volumensai¡da)/(CPM entrada x Volumenentrada) 13. Selección de Biblioteca mediante Antigenos Biotinilados La selección está diseñada para enriquecer las moléculas que enlazan específicamente a un objetivo de interés, cuando el enlace de la biblioteca a un antígeno alcanza el equilibrio. Puede ser necesaria una selección negativa (pre-clara) para eliminar los enlazadores de matriz y no específicos de una biblioteca scFv en aire, pero se pueden omitir si se utiliza una biblioteca elaborada de una plantilla simple, por ejemplo, pero sin limitarse a, bibliotecas elaboradas para maduración de afinidad, haciendo la maduración de afinidad con base en una plantilla scFV simple. Dependiendo del formato objetivo, varía el protocolo de selección. El siguiente es un protocolo de selección de ejemplo para utilizarse con objetivos biotinilados. Este protocolo puede ser modificado para acomodar antígenos objetivo en otros formatos, y se puede escalar hacia arriba o hacia abajo dependiendo de la salida deseada.
A. Preparaciones antes de la selección Se pueden utilizar cuentas magnéticas de estreptavid i na (SA) para captura, y normalmente son bloqueadas previamente antes del uso. Se pueden transferir cuentas SA de la botella original a tubos de 1.5 ó 2 mL, y lavarse dos veces con 2 mL de amortiguador de enlace 1X FLAG. Las cuentas pueden ser bloqueadas con 2 mL de amortiguador de selección (2 horas durante la noche) a una temperatura de 4°C con rotación. Es importante preparar las suficientes cuentas para capturas tanto pre-claras como de selección. Las cuentas bloqueadas previamente pueden ser almacenadas a una temperatura de 4°C. Normalmente se utilizan aproximadamente 100 pL de cuentas por cada 10 pmol de antígeno biotinilado, pero un experto en la técnica podrá apreciar que se debe calcular el volumen de cuenta de captura en virtud de la capacidad de enlace de la biotina libre (por ejemplo, 650 a 900 pmoles/mg, en donde la concentración de cuentas normalmente es de 10 mg/ml) en forma relativa al rendimiento de reacción.
Se pueden bloquear previamente tubos de microfuga de 1.5 ml_ o 2 mL con amortiguador de enlace 1X FLAG durante aproximadamente 1 hora durante la noche. Se pueden utilizar tubos pre-bloqueados para todos los pasos de selección y de pre-aclarado. Normalmente, se necesitan cuatro tubos por cada muestra: 2 para pre-aclarado, 1 para las cuentas, y 1 para la selección.
Se pueden obtener resultados óptimos aclarando previamente la biblioteca. Se puede agregar a las cuentas la biblioteca de despliegue mARN purificada FLAG (separadas del amortiguador) utilizando un volumen de cuenta SA igual a la mitad del volumen de captura. Las cuentas pueden ser giradas a una temperatura de 30°C durante aproximadamente 30 minutos. Se puede separar la biblioteca de despliegue mARN aclarada previamente de las cuentas utilizando un magneto, y se puede repetir una vez más el pre-aclarado. Las segundas cuentas SA pre-aclaradas pueden ser lavadas y contadas tal como se describe anteriormente para determinar si es alto el fondo. Esto también puede servir como un control negativo "Sin antígeno".
B. Selección de Biblioteca: Enlace Para las primeras vueltas de selección, se puede agregar un objetivo biotinilado (100 nM) a la biblioteca aclarada previamente completa, y girarse a una temperatura de 30°C durante 1 hora. Para vueltas de selección posteriores cuando se espera que la recuperación de las moléculas de enlace de antígeno excedan 1%, la biblioteca aclarada previamente puede ser dividida en 2 alícuotas iguales. El antígeno biotinilado puede agregarse a una alícuota, y la otra puede servir como el control negativo "Sin antígeno". Como alternativa, las segundas cuentas pre-aclaradas lavadas también pueden considerarse como un control "sin antígeno", tal como se observó anteriormente, aunque estas cuentas tendrán un menor "pre-aclarado". La concentración de antígeno en las últimas vueltas puede caer cuando la recuperación de las moléculas de enlace de antígeno excede el 5%. En particular, se debe reducir la concentración de antígeno si el antígeno parece ser "pegajoso", y se observa una recuperación significativa en las vueltas tempranas. Se puede reducir la concentración de antígenos en las últimas vueltas cuando la recuperación de las moléculas de enlace de antígeno se vuelve significativamente mayor que el fondo (por ejemplo, en forma relativa a un control sin antígeno). Es importante poner atención en la estequiometría entre la biblioteca y el antígeno para asegurar que exista al menos un exceso molar de 5 veces de antígeno con respecto a las moléculas de PROfusion de la biblioteca, especialmente en una menor concentración de antígeno.
C. Selección de Biblioteca: Captura El amortiguador de selección utilizado para bloquear las cuentas SA para la captura de biblioteca, se puede eliminar mediante centrifugación y separación magnética. La biblioteca de enlace de antígeno puede transferirse a las cuentas SA bloqueadas previamente (separadores de amortiguador) y posteriormente a la reacción de enlace, y girarse a una temperatura de 30°C durante 5 a 10 minutos. La cantidad de cuentas SA para captura debe calcularse con base en la capacidad y la concentración objetivo utilizada en la selección (ver anteriormente). La cantidad de cuentas SA debe disminuirse cuando se disminuye la concentración objetivo para evitar los enlazadores de la cuenta SA, aunque normalmente se utiliza no menos de 50 pL de cuentas.
D. Selección de biblioteca: Lavado Las cuentas SA pueden ser recolectadas utilizando un magneto, y lavarse con aproximadamente 1 mL de amortiguador de selección durante 1 minuto. Este paso puede repetirse aproximadamente 5 veces (aproximadamente 6 veces en total). El tiempo de lavado puede incrementar en las últimas vueltas para incorporar la estrategia de selección fuera de rango para algunos objetivos. Las cuentas pueden ser lavadas una última vez con aproximadamente 1 mL de amortiguador 1X adecuado para transcripción inversa, recolectarse con un magneto, y volverse a suspender en agua (una cuarta parte del volumen de cuenta de captura calculado anteriormente).
Como otro ejemplo, se puede utilizar Dynabeads™ (I nvitrogen), pero un experto en la técnica apreciará que puede ser igualmente adecuadas otras cuentas. Las Dynabeads™ pueden ser separadas de la biblioteca no enlazada mediante centrifugación y separación magnética. El sobrenadante puede ser eliminado con una punta 1 ml_, utilizando una nueva punta filtrada para cada tubo de selección de biblioteca, para eliminar la contaminación cruzada. Las Dynabeads™ pueden ser lavadas con 1 mL de amortiguador de selección, y suspendidas nuevamente mediante pipeteado suave o mediante inversión de los tubos varias veces. Los tubos pueden ponerse nuevamente en el sujetador magnético para la separación de cuentas, mientras que se procesa la siguiente biblioteca. Una vez que todas las bibliotecas son lavadas, se puede eliminar el sobrenadante mediante una punta 1 mL utilizando una nueva punta filtrada para cada tubo de selección de biblioteca, para eliminar la contaminación cruzada. Repetir durante cinco lavados. Se pueden lavar las Dynabeads™ dos veces con 1 mL de amortiguador 1X First Strand (Superscript II, Invitrogen) tal como se describió anteriormente. En el último lavado, si se desea se eliminan 1/10 de la biblioteca a un tubo separado para conteo, para determinar la recuperación de la biblioteca. Se pueden capturar Dynabeads™ mediante separación magnética y se pueden guardar aproximadamente 100 pl de amortiguador de lavado para conteo de fondo. Se pueden volver a suspender en agua Dynabeads™, utilizando ¼ del volumen de cuenta de captura como se calculó anteriormente).
E. Selección de Biblioteca: Conteo y Cálculo de Recuperación Comenzando a partir de la Vuelta 3, contar aproximadamente 10 a 20% del último lavado y las cuentas. No es aconsejable contar más de 100 µ?_ de cuentas, ya que se pueden extinguir los conteos. Se puede calcular la recuperación de selección de la biblioteca de acuerdo con la siguiente fórmula: % de recuperación de selección = 100 x CPMCuentas Totales/CPMEntrada Total 14. Selección de Biblioteca de Equilibrio mediante proteínas de fusión En otra modalidad, se puede llevar a cabo selección de biblioteca para antígenos objetivo que hayan sido fusionados a un dominio de anticuerpo Fe (por ejemplo, proteínas de fusión Fe). Puede ser necesario una selección negativa (pre-aclarado) para eliminar los enlazadores de matriz y no específicos de la biblioteca de anticuerpo na'íve, pero se pueden omitir para maduración de afinidad. Se puede mejorar la especificidad de selección fusionando antígenos objetivo tanto para I g G 1 humano como lgG2a de ratón. Al tener diferentes dominios Fe en las proteínas de fusión Fe durante la selección de biblioteca, se puede minimizar el riesgo de identificar enlazadores de biblioteca específicos para la región Fe. Esto también permite que el enlazador de biblioteca sea extraído mediante dos diferentes cuentas magnéticas (proteína G y IgG anti-ratón) reduciendo de esta forma adicionalmente la oportunidad de recuperación de enlazadores IgG anti-proteína G o anti-anti-ratón. La proteína de fusión Fe objetivo también puede ser biotinilada, y seleccionada ya sea a través del método aquí descrito o a través del método descrito anteriormente en la sección 13. Se deberá observar que las cuentas magnéticas de proteína A pueden no ser adecuadas para selección contra objetivos de proteína de fusión Fe debido a la reactividad cruzada de ciertas porciones del dominio VH de anticuerpo (por ejemplo, VH originado de las secuencias de línea germinal de la familia VH3 humana). Las cuentas magnéticas adecuadas para extraer moléculas de scFv-PROfusion de enlace de antígeno incluyen, pero no se limitan a, Proteína G Dynabeads, IgG de ratón Dynabeads, y otras Dynabeads M-280 disponibles para IgGs de humano o de ratón. En general, se considera que la capacidad de las cuentas de proteína G es de aproximadamente 25 pg de I g G 1 humano (-167 pmol) por 100 µL· de cuentas magnéticas de proteína A/G.
A. Preparaciones antes de la selección Se puede utilizar para captura la Proteína G de Dynabeads o IgG de ratón Dynabeads (si el antígeno objetivo es una proteína de fusión Fe de ratón) y normalmente se bloquean antes de su uso. La cantidad de Dynabeads necesaria para pre-aclarado y selección de biblioteca puede ser calculada. Las Dynabeads pueden ser transferidas de la botella original a tubos de microfuga de 1.5 ó 2 ml_ y a un amortiguador de eliminación. Las cuentas pueden ser bloqueadas con amortiguador de selección 1 mL (2 horas durante la noche) a una temperatura de 4°C, o 1 hora a temperatura ambiente. Es importante preparar suficientes cuentas tanto para las capturas de selección como de pre-aclarado.
Se pueden bloquear previamente tubos de microfuga de 1.5 mL ó 2 mL con amortiguador de selección durante 1 hora durante la noche, y los tubos bloqueados previamente deben ser utilizados para todos los pasos de selección de biblioteca y pre-aclarado.
Se puede agregar una biblioteca de scFv PROfusion purificada-FLAG a las cuentas pre-bloqueadas (separadas del amortiguador), se puede utilizar un volumen de Dynabead (proteína G o IgG de ratón pan) igual a la mitad del volumen de captura (tal como se calculó anteriormente), y la reacción girarse a una temperatura de 30°C durante 30 minutos. La biblioteca de fusión pre-aclarada puede ser separada de las cuentas con un magneto, y el pre-aclarado repetirse una vez más. Las segundas Dynabeads aclaradas previamente pueden ser lavadas y contadas tal como se describió anteriormente para determinar si es alto el fondo. Esto también puede servir como un control negativo "sin antígeno".
B. Selección de biblioteca: enlace Para las primeras vueltas de selección, se puede agregar objetivo biotinilado (100 nM) a toda la biblioteca pre-aclarada, y girarse a una temperatura de 30°C durante 1 hora. Para las vueltas de selección posteriores, cuando la recuperación de las moléculas de enlace de antígeno esperadas excede el 1%, la biblioteca pre-aclarada puede ser dividida en dos alícuotas (de 50/50 a 80/20 dependiendo de los conteos de biblioteca). En antígeno biotinilado puede agregarse a una alícuota (50 a 80% del total), en tanto que las otras alícuotas pueden servir como el control negativo "sin antígeno". Como alternativa, las segundas cuentas pre-aclaradas lavadas también se pueden considerar como un control "sin antígeno" tal como se observó anteriormente, excepto que tendrán un "pre-aclarado menos". La concentración de antígeno puede reducirse si el antígeno parece ser "pegajoso" y se observa una recuperación significativa en las vueltas tempranas. Además, se puede reducir la concentración de antígeno en las últimas vueltas cuando la recuperación de las moléculas de enlace de antígeno se vuelve significativamente más alta que el fondo (sin control de antígeno). Es importante poner atención a la estequiometria entre la biblioteca y el antígeno para asegurar que exista un exceso de antígeno molar de al menos 5 con respecto a las moléculas de PROfusion de biblioteca, especialmente en bajas concentraciones de antígeno.
C. Selección de biblioteca: Captura El amortiguador de selección utilizado para bloquear las Dynabeads para captura de biblioteca, puede ser eliminado mediante centrifugación y separación magnética. La biblioteca enlaza por antígeno puede ser transferida a las Dynabeads bloqueadas previamente (separadas de amortiguador), y posteriormente a la reacción de enlace, y girarse a una temperatura de 30°C durante 20 minutos. La cantidad de Dynabeads utilizada puede ser calculada tal como se describió anteriormente con base en la capacidad de la cuenta, y la concentración de antígeno objetivo utilizado en la selección. Para evitar la demolición de los enlazadores de las cuentas, la cantidad de Dynabeads debe ser reducida (pero no a menos de 500 pg ó 50 µ?) cuando se reduce la concentración de antígeno objetivo .
D. Selección de biblioteca: Lavado Las Dynabeads™ se pueden separar de la biblioteca no enlazada mediante centrifugación y separación magnética. El sobrenadante puede ser eliminado con una punta 1 mL, y se puede utilizar una nueva punta filtrada para cada tubo de selección de biblioteca para eliminar la contaminación cruzada. Se pueden utilizar nuevas puntas de pipeta para lavar las Dynabeads™ con aproximadamente 1 mL de amortiguador de Selección, y las Dynabeads™ pueden ser suspendidas nuevamente mediante pipeteado suave o mediante inversión de los tubos varias veces. Los tubos pueden colocarse nuevamente sobre el sujetador magnético para la separación de las cuentas, mientras que se procesa la siguiente biblioteca. Después de que todas las bibliotecas son lavadas, el sobrenadante puede ser eliminado con una punta 1 ml_ (se utiliza una nueva punta filtrada por cada tubo de selección de biblioteca para eliminar la contaminación cruzada). Este paso puede ser repetido durante cinco lavados. Las Dynabeads™ pueden ser lavadas dos veces con 1 mL de 1X de amortiguador First Strand (Superscript II, Invitrogen) tal como se describió anteriormente. En el último lavado, se pueden remover 1/10 de la biblioteca de un tubo separado para conteo, para determinar, si se desea, la recuperación de la biblioteca. Las Dynabeads™ pueden ser capturadas mediante separación magnética y se pueden guardar aproximadamente 100 µ? del amortiguador de lavado para conteo de fondo. Las Dynabeads™ pueden ser suspendidas nuevamente en agua, utilizando ¼ del volumen de la cuenta de captura tal como se calculó anteriormente).
E. Selección de Biblioteca: Conteo Se puede llevar a cabo tal como se describe en la sección 3 (E) anterior. 15. Selección de biblioteca fuera de rango mediante competición de antígeno La mayor diferencia entre las selecciones fuera de rango y las selecciones en equilibrio, es que la biblioteca enlaza al antígeno de selección primero antes de la purificación FLAG. Después de la purificación FLAG, la biblioteca puede ser incubada con una cantidad en exceso de antígenos competidores o anticuerpos (por ejemplo, cuando no están disponibles antígenos competidores), de modo que cualquier antígeno enlazado previamente que se desenlace de las moléculas PROfusion durante la competición fuera de rango, es reemplazado por los competidores. El competidor es distinto al antígeno enlazado previamente en cuanto a que las moléculas PROfusion enlazadas por competidor pueden no ser recuperadas en el paso de recuperación subsecuente. Pueden ser antígenos no modificados o antígenos en un formato diferente. Aunque los anticuerpos también pueden ser competidores, normalmente no son competidores tan eficientes como el antígeno, y su eficiencia disminuye conforme incrementa la afinidad de la biblioteca al antígeno. Es conveniente que se determine el fuera de rango de la biblioteca, justo antes de la selección, con el objeto de identificar la duración de la competición adecuada. Esta duración puede fluctuar de varias horas a varias semanas.
A: Biblioteca de pre-carga con antígeno biotinilado o proteína de fusión Fe Las moléculas PROfusion pueden ser traducidas y purificadas mediante oligo-dT tal como se describe anteriormente. La biblioteca purificada oligo-dT puede ser equilibrada agregando amortiguador de enlace 5X FLAG a una concentración final de 1X (agregar simplemente el 25% del volumen de la biblioteca). Se pueden agregar antígenos (biotinilados o fusión Fe) a una concentración lo suficientemente alta y girarse a una temperatura de 30°C durante 30 minutos para saturar el enlace de anticuerpo-antígeno. Las moléculas PROfusion pueden ser purificadas mediante agarosa anti-FLAG M2 tal como se describió anteriormente. Es importante observar que se debe mantener en hielo, pero no congelarse una biblioteca de PROfusion purificada-FLAG . Es importante bloquear previamente cantidades suficientes de cuentas de captura tal como se describió anteriormente.
B: Determinar la concentración de competidor y recuperación de biblioteca de línea de base La cantidad de biblioteca es recuperar el paso anterior se puede calcular para determinar su concentración molar. Esto representa la cantidad máxima de antígeno enlazado por biblioteca y se puede utilizar para calcular las cantidades necesarias (500x a 1000x) para la competición fuera de rango.
Se pueden agregar cuentas pre-bloqueadas al 10% a una alícuota al 10% de la biblioteca de PROfusion enlazada con antígenos y girarse durante aproximadamente 20 minutos a una temperatura de aproximadamente 4°C. Las cuentas pueden ser lavadas 5 veces con 1 mL de Amortiguador de Selección tal como se describió anteriormente. Las cuentas pueden ser contadas para determinar el porcentaje de biblioteca de PROfusion enlazado mediante antígenos antes de la selección fuera de rango, como se indica a continuación: % de recuperación = 100 x (CPMCuentas / CPMEntrada) x 10 C: Selección de Biblioteca: Competición Se puede agregar un exceso molar de competidor de 1000 veces (por ejemplo, antígeno o anticuerpo no modificado) a una biblioteca PROfusion purificada-FLAG y girarse a una temperatura de aproximadamente 30°C durante una duración determinada previamente, la cual aplicará una suficiente presión de selección para seleccionar los clones con mejores fuera de rango. Se enfría la biblioteca sobre hielo durante aproximadamente 1 a 2 minutos para ser lento el fuera de rango antes de la captura de la cuenta.
D: Selección de biblioteca : Captura El amortiguador de selección utilizado para bloquear las Dynabeads para capturar biblioteca puede eliminarse mediante centrifugación y separación magnética. La biblioteca enlazada con antígeno puede ser transferida a Dynabeads bloqueadas previamente (separadas de amortiguador) y girarse a una temperatura de 4°C durante aproximadamente 20 minutos.
E: Selección de biblioteca: Lavado Las Dynabeads pueden ser recolectadas mediante centrifugación y separación magnética de la biblioteca. El sobrenadante puede ser eliminado con una punta 1 mL (utilizando una nueva punta filtrada para cada tubo de selección de biblioteca para eliminar la contaminación cruzada, tal como se describió anteriormente).
Las cuentas pueden ser lavadas dos veces con aproximadamente 1 ml_ de amortiguador 1X First Strand (Superscript II, Invitrogen) tal como se describió anteriormente. En el último lavado, se pueden eliminar 10% a 20% de biblioteca a un tubo separado de conteo, para determinar la recuperación de la biblioteca si así se desea. Se pueden capturar las Dynabeads™ mediante separación magnética y se pueden guardar aproximadamente 100 µ? del amortiguador de lavado para el conteo de fondo. Las cuentas pueden suspenderse nuevamente en agua (¼ del volumen de la cuenta de captura tal como se calculó anteriormente).
F: Selección de biblioteca: Conteo y Cálculo de recuperación 10% a 20% del último lavado y las cuentas pueden ser contadas. Es aconsejable evitar utilizar más de 100 µ? de cuentas, ya que pueden extinguir los conteos. Se puede calcular la recuperación de selección de biblioteca utilizando la siguiente fórmula: % de recuperación de selección = = 100 x CP c_entas Totales/CPMEntrada Total 16. Transcripción inversa de salidas de selección de biblioteca Se puede realizar la transcripción inversa con Transcriptasa Inversa Superscript II (Invitrogen™). El volumen de cada reacción puede escalarse de acuerdo con el volumen de la cuenta después de la selección. Las salidas pueden ser analizadas mediante transcripción inversa (RT) con pares cebadores adecuados. Por ejemplo, se pueden utilizar cebadores "Inverso Ck" o "Ck5-FLAGA20 Rev" para bibliotecas kappa, se pueden utilizar cebadores "Inverso CJL" o "CL5FLAGA20 Rev" para bibliotecas lambda, y se pueden utilizar cebadores "Lib-GS-Rev" o "VH-GSFLAGA20-Rev" para la biblioteca PBMC VH humana.
El cebador de transcripción inversa debe tener al menos la misma secuencia de extremo 5' que el cebador inverso PCR subsecuente, para evitar que se dejen cebadores residuales de la reacción de transcripción inversa, creando productos de amplificación que tengan diferentes secuencias de extremo 3'. Esto es especialmente importante si se utilizan cebadores más cortos "Inverso Ck", "Inverso CJL", o "Lib-GS-Rev" para RT debido a que cualquier cantidad residual de esos cebadores puede participar en la siguiente PCR y crear productos que carezcan de la cola poli-A.
Tabla 1: Cebadores de oligonucleótido utilizados amplificación de salida de selección de biblioteca Condiciones de reacción RT de ejemplo Para una reacción con un volumen final de 200 µ?_, se puede establecer una reacción RT como se indica a continuación: Cuentas (en agua) X µ?_ dH2° a 108Ml_ 10 µ? de cebador inverso 2 µ!_ 10 mM dNTP 10 µ?_ Incubar a una temperatura de 65 °C durante 5 minutos, enfriar sobre hielo. Agregar: 5x de Primer Amortiguador de Hebra 40 µ?_ 0.1 M DTT 20 ML RNaseOUT 10 µ?_ La reacción se puede incubar a una temperatura de 42°C durante 2 minutos antes de agregar 10 µ?_ de transcriptasa inversa Superscript II. La reacción se puede dividir en alícuotas de 100 iL e incubarse a una temperatura de 42°C durante 50 minutos con agitación ocasional. Posteriormente los tubos pueden ser incubados a una temperatura de 95°C durante 5 minutos después de la reacción. Las cuentas pueden ser aisladas y el sobrenadante puede ser transferido a tubos nuevos. Normalmente las muestras pueden ser reunidas si proceden de la misma salida de selección. Las cuentas se suspenden nuevamente en agua (mitad del volumen RT). Los tubos pueden ser incubados a una temperatura de 95°C durante 5 minutos después de la reacción y las cuentas pueden capturarse a través de un magneto, y el sobrenadante puede reunirse con el sobrenadante transferido previamente. Esto representa la plantilla de cADN para amplificación PCR de las salidas de selección. 17. Selección de biblioteca contra antígeno de superficie celular Las distinciones mayores entre la selección de biblioteca PROfusion contra los antígenos de superficie celular y los antígenos biotinilados solubles, son que las porciones de mARN en las moléculas PROfusion están protegidas de las degradaciones de RNase celulares mediante complementación cADN y por lo tanto necesitan ser transcritas en forma inversa en cADN antes de las selecciones de biblioteca. La reacción de transcripción inversa puede llevar a cabo antes o después de la purificación FLAG dependiendo del volumen de la biblioteca después de la purificación de oligo-dT. Es importante observar que el agente de reducción DTT no debe ser incluido en la transcripción inversa, o cualquier paso previo a la selección de biblioteca, con el objeto de conservar los enlaces de disulfuro de intracadena de la molécula scFv.
A: Preparación de biblioteca después de purificación oligo dT En una modalidad, se puede utilizar un volumen de traducción inicial de 10 mi adecuado para la primera vuelta de selección, pero se debe observar que se pueda adaptar fácilmente la siguiente metodología para reacciones de traducción más pequeñas.
Las moléculas de PROfusion pueden ser traducidas y purificadas mediante oligo dT tal como se describió anteriormente. La biblioteca purificada debe ser recuperada en un volumen dH20 igual o menor al volumen de Usado reticulado utilizado para traducción. El último amortiguador de lavado, de entrada y 10 µ? de la biblioteca pueden ser contados para determinar el rendimiento y el porcentaje de recuperación tal como se describió anteriormente.
B: Enlace de FLAG La biblioteca purificada-oligo dT puede ser equilibrada a una concentración final de 1X PBS, agregando ¼ de un volumen de biblioteca 5X PBS. Se puede estimar la cantidad de cuentas de agarosa anti-FLAG M2 necesaria para capturar todas las moléculas de PROfusion (por ejemplo, estimando la capacidad de enlace de las cuentas en aproximadamente 6 nmol de proteína de fusión por mL de la pasta al 50%). Con el objeto de tener un suficiente volumen de cuenta para manipulación durante el enlace y lavado, es aconsejable utilizar menos del 200 L de las cuentas pe-lavadas. Se puede utilizar una punta de pipeta de perforación ancha para transferir agarosa anti-FLAG M2 a un tubo nuevo. Las cuentas pueden ser giradas (1500 rpm durante 1 minuto) y el amortiguador eliminado. Las cuentas pueden ser. lavadas dos a tres veces con 1 mi de PBS para eliminar cualquier cantidad residual de detergente presente en el amortiguador de almacenamiento. La biblioteca purificada oligo-dT puede ser transferida en 1X PBS a las cuentas de agarosa anti-FLAG M2 lavadas, y girada a una temperatura de 4°C durante 1 hora hasta durante la noche.
C: Lavado FLAG Como un paso opcional, las cuentas de agarosa anti-FLAG M2 pueden ser giradas en 1500 rpm durante 1 minuto, a una temperatura de 4°C y el sobrenadante desechado. Se puede utilizar 1X PBS para transferir cuentas en una columna Bio-Rad™ Mini-spin o columna Invitrogen™ M icrocentrifuge Spin Column, y posteriormente el amortiguador puede ser eliminado girando en 1000 rpm durante 10 segundos. La columna Invitrogen™ puede ser girada a una mayor velocidad (por ejemplo, es posible 10,000 RPM). Las cuentas pueden ser lavadas 4X a través de 500 a 600 pL de 1 X PBS y el PBS girado a través de la columna. Las cuentas pueden ser lavadas 2X por 500 - 600 1 X RT del primer amortiguador de hebra (sin DTT). El flujo puede ser desechado, pero es aconsejable guardar el último lavado para conteo de centelleo.
D: Elución FLAG Se pueden eluir moléculas PROfusion agregando 450 pL (observar que 230 pL puede ser utilizado para volúmenes de agarosa M2 más pequeños) de 100 pg/mL de péptido FLAG en el Primer Amortiguador de Hebra (sin DDT) que contiene RNaseOUT en una dilución 1:20, y posteriormente incubar la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente. El eluato puede ser recolectado girando en 3000 rpm o más rápido durante 20 segundos. Este paso puede ser repetido una vez, y posteriormente las bibliotecas de ambas eluciones pueden ser reunidas.
E: Cálculo de recuperación FLAG Se cuentan 5 a 10 pL de salida de elución y 100 pL del último lavado en un contador beta. El % de recuperación de molécula PROfusion puede ser calculado como se indica a continuación (observarse una recuperación de 10% ó 30%, o mayor, es la esperada): = (CPMsaMda x VolumensaMda) / (CPMentrada x Volumenentrada) F: Transcripción Inversa Se pueden utilizar los cebadores descritos en la sección 16 anterior.
Condiciones de la reacción Biblioteca PROfusion purificada 445 µ?_ 890 µ?_ 10 µ? de cebador inverso 5 µ?. 10 µ? 10 mM dNTP 25 µ?_ 50 µ?_ Superscript II 25 uL 50 µ?_ Volumen total 500 µ?_ 1000 pL La reacción se puede incubar a una temperatura de 37°C durante 1 hora, con o sin agitación. La biblioteca puede ser equilibrada para selección contra antígenos de superficie celular como se indica a continuación. Una vez que se ha completado la reacción de transcripción inversa, se pueden agregar 5 M NaCI a la mezcla de reacción a 75 mM (15.3 µ? a 1 mL y 7.6 a 500 pL de reacción). Se puede agregar 1X PBS adicional a la biblioteca si existe la necesidad de incrementar el volumen. Se puede agregar a la biblioteca antes de la selección el siguiente reactivo de bloqueo.
Concentración final BSA, 50 mg/ml 21 µ?_ 1 mg/ml ADN de esperma de salmón, 10 mg/ml 10.5 µ?_ 0.1 mg/ml Se puede requerir un paso de pre-aclarado para la selección de biblioteca na'ive, pero se puede omitir si se utiliza una biblioteca elaborada de una sola plantilla, por ejemplo, una biblioteca elaborada para maduración de afinidad.
Se deberá confirmar que las células utilizadas para el pre-aclarado de biblioteca (células de antígeno-naíve) no tienen expresión de antígeno objetivo en la superficie celular a través de citometría de flujo o análisis de manchado Western. Por ejemplo, esto pueden ser las células de origen utilizadas para generar las líneas de célula estable que expresan antígenos, lo cual presenta una situación en donde la única diferencia de proteína de superficie conocida entre las células utilizadas para el pre-aclarado y para la selección, debe ser el propio antígeno objetivo.
Los números de células necesarios para pre-aclarar la biblioteca deben ser calculado. Este es el número de células antígeno-naíve necesarias para pre-aclarar la biblioteca, y es el mismo número de la selección de biblioteca. Se calcula el número de células (X) de varios números: copias de antígenos o superficie de células que expresan antígenos (C), tamaño de biblioteca para selección (S = moles x 6 x 1023), y fracción de biblioteca que enlazará al antígeno objetivo (F). Puede calcularse rigurosamente a través de esta fórmula para permitir un exceso de antígeno objetivo o potencia de pre-aclarado de 10 veces : X = 10 x S x F / C Por ejemplo, se supone que un antígeno en particular tiene un número de copias de superficies celulares estimado de 1 x 104, y en una biblioteca de anticuerpo na'íve 10 pmol menos de 0.05% (5 x 10~4) de la biblioteca puede ser recuperada mediante enlace de antígenos o adhesión de fondo. El número de células necesarias para el pre-aclarado y la selección es X = 10 x (10 x 10"12 x 6 x 1023) x (5 x 10"4) / (1 x 104) = 3 x 106 En la práctica, el número de células debe ser de 5 x 106 o más para asegurar que el pelet celular pueda ser apreciado después del peletizado.
G: Pre-aclarar la biblioteca Se puede contar la densidad celular mediante hemocitómetro o contador Coulter y se pueden transferir células suficientes a un tubo de centrifugación. Las células pueden ser giradas en 1500 rpm a una temperatura de 4°C, y re-suspendidas en forma muy suave en 1 ml_ de PBS enfriado con hielo. La suspensión celular puede ser transferida a un tubo de microfuga con la parte superior de tornillo 1.7 mL. Se debe tener cuidado de no cortar las células con el pipeteado. Las células pueden ser giradas en 1500 rpm y el PBS eliminado. El paso de lavado con PBS puede ser repetido una vez más. La biblioteca del paso 13.3.3 debe ser agregada inmediatamente a las células re-suspendidas en forma suave. Posteriormente los tubos pueden ser sumergidos en un baño de hielo-agua, agitados durante aproximadamente 60 minutos. Las células pueden ser giradas en 1500 rpm y la biblioteca transferida a un nuevo tubo de células para un segundo pre-aclarado o para selección de antígenos.
H: Selección de biblioteca contra células que expresan antígeno Calcular el número de células necesarias para la selección de antígeno. Este es el mismo número que para la biblioteca de pre-aclarado, tal como se calculó anteriormente. El número de células (X) es calculado de diversos números: copias de antígenos en la superficie celular que expresa antígenos (C), tamaño de biblioteca para selección (S = moles x 6 x 1023), y fracción de biblioteca que enlazará al antígeno objetivo (F). Puede ser calculado en forma rigurosa a través de esta fórmula para permitir un exceso de antígeno objetivo o potencia de pre-aclarado de 10 veces: X = 10 x S x F / C I: Selección de biblioteca Se puede contar la densidad de células que expresan antígenos mediante hemocitómetro o contador Coulter, y se pueden transferir suficientes células que expresan antígenos a un tubo de centrifugación. Las células pueden ser giradas en 1500 rpm a una temperatura de 4°C, y las células se re-suspendieron muy suavemente en 1 mL de PBS enfriado con hielo. La suspensión celular puede ser transferido a un tubo de microfuga con tapa de tornillo 1.7 mL. Se debe tener cuidado de no cortar las células por el pipeteado. Se giraron las células en 1500 rpm y se eliminó el PBS y se repitió el lavado con PBS una vez más. La biblioteca purificada y/o pre-aclarada puede ser utilizada inmediatamente para re-suspender suavemente las células. Los tubos pueden ser sumergidos en un baño de hielo-agua, y girados durante 2 horas. Se giró en 1500 rpm y se desecho el sobrenadante. Las células pueden ser lavadas 4 veces con 1 mL PBS, giradas en 1500 rpm y el sobrenadante desechado. Las células pueden ser re-suspendidas en 500 pL de PBS. Si se desea, se cuenta hasta el 20% de las células y el último lavado.
J: Recuperación de salida de biblioteca Se pueden agregar 5 pL de RNase H (2 U/pL) a las células re-suspendidas e incubarse a una temperatura de 37°C durante 20 minutos. Esto digerirá el ARN y liberará cADN de la superficie celular. Las células pueden ser giradas en 1500 rpm durante 30 segundos y el sobrenadante es transferido a un nuevo tubo. Ahora las células pueden ser desechadas. Se puede agregar 5 pL de RNase A (20 mg/ml) al sobrenadante e incubarse a una temperatura de 37°C durante 30 minutos. Esto degrada cualquier ARN celular que pueda haber venido de las células rotas durante el proceso de selección. El ARN degradado puede ser eliminado mediante diálisis posterior, y de esta forma se evita la interferencia con la amplificación de biblioteca mediante PCR. Se le agrega al sobrenadante un volumen igual de fenol/CHCI3/isoamilalcohol (25:24:1 ) y se vortiza durante 30 segundos. Se puede separar la fase orgánica inferior de la fase acuosa superior mediante centrifugación en un tubo de 2 mi de Phase Lock Gel Heavy (Eppendorf) a una velocidad máxima de 5 minutos. La fase acuosa superior puede ser transferida a un tubo nuevo y repetir la estación una vez más con fenol/CHCI3/isoamilalcohol (25:24:1) y una vez mediante CHCI3. La fase acuosa superior después de la extracción CHCI3 puede ser transferida a un Equipo de Miní Diálisis, corte 8 kDa, 2 mL (GE healthcare) y dializado durante la noche a una temperatura de 4°C contra 4 litros de dH20.
K: Conteo y cálculo de recuperación de selección de biblioteca Comenzando a partir de la Vuelta 3 contar de 10% a 20% del último lavado y las células. % de recuperación de selección = 100 x CPMCéiuias totales/CPMsalida total 18. Reamplificación de ADN de Biblioteca mediante RT-PCR Se puede llevar a cabo transcripción inversa utilizando el material capturado de la biblioteca. Los reactivos y protocolos conocidos en la técnica son adecuados para llevar a cabo la reacción de transcripción inversa. El volumen de la reacción puede ser escalado hacia arriba o hacia abajo de acuerdo con el volumen de cuentas después de la selección.
Los cebadores utilizados para transcripción inversa pueden ser cualesquiera secuencias complementarias inversas adecuadas localizadas en la región invariable del extremo 3' de la biblioteca de anticuerpos, y puede ser el mismo o 3' adicional al cebador inverso que será utilizado en una PCR de amplificación subsecuente.
Una reacción de transcripción inversa de ejemplo contiene las cuentas de la selección de biblioteca (en agua), cebador inverso, y dNTP. Las reacciones se incuban a una temperatura de 65°C durante aproximadamente 5 minutos y se enfriaron en hielo. Posteriormente se agregan en forma típica a la reacción el primer amortiguador de síntesis de hebra, aproximadamente 0.1M DTT, y el inhibidor RNase. Las reacciones de transcripción inversa se incuban en aproximadamente 42°C durante 2 minutos antes de agregar la enzima de transcriptasa inversa. Las reacciones se incuban en aproximadamente 42°C durante 50 minutos con agitación ocasional. Posteriormente las reacciones se incuban en 95°C durante 5 minutos. Posteriormente las cuentas son recolectadas mediante un magneto, y el sobrenadante es transferido a tubos nuevos, el cual se reúne si procede de la misma salida de selección. Las cuentas son re-suspendidas en agua (la mitad del volumen RT), y se incuban en tubos a una temperatura de 95°C durante 5 minutos. Las cuentas son recolectadas nuevamente utilizando un magneto, y el sobrenadante es reunido con el sobrenadante transferido previamente. Esto contiene la plantilla de cADN para amplificación PCR de la salida de selección. Después de PCR, se carga 10-DL del producto PCR en un gel de agarosa al 2% para confirmar que la reacción fue exitosa. 19. PCR para amplificación de plantilla de ADN de la biblioteca Para la salida de selección de la primera y segunda vueltas, se puede dializar el cADN (sobrenadantes de las reacciones RT) contra agua utilizando un corte de 8 kDa y se puede utilizar toda la cantidad de cADN como una plantilla PCR. Para salidas de selección de las últimas vueltas, normalmente se puede utilizar el 10% de cADN como una plantilla para PCR, y normalmente la diálisis no es necesaria. Se pueden llevar a cabo reacciones en volúmenes de 1 mL PCR para las salidas de la vuelta 1 y 2 (utilizando todos los productos RT), mientras que los volúmenes de reacción pueden ser escalados hacia abajo para las salidas de las últimas vueltas. Se deben elaborar alícuotas de reacciones 100 µ?_ de una mezcla maestro. En la tabla 7 que se encuentra más adelante, se muestra una reacción PCR de ejemplo para amplificación de plantilla de biblioteca ADN.
Tabla 2: Reacción PCR de ejemplo para amplificación de plantilla de biblioteca ADN Plantilla ADN XpL Agregar dH20 a 740 µ?_ Amortiguador 10X KOD 100 µ?_ MgS04 (25 mM) 60 µ? 10 mM dNTP 20 µ?_ Cebador de avance 5' (10 µ?) 30 µ? Cebador de retroceso 3'(10 µ?) 30 µ? Polimerasa de ADN KOD Hot Start 20 iL Volumen total 1000 µ?_* En una modalidad de ejemplo, se utilizaron reacciones de 1 mL PCR para las salidas de la vuelta 1 y 2, y se utilizaron 0.5 mL de las reacciones para las salidas de las últimas vueltas. Se deben elaborar de una mezcla maestra alícuotas de reacciones 100 pL. Las condiciones de reciclado térmico de ejemplo para la amplificación de plantilla de ADN de la biblioteca de muestran en la tabla que se encuentra más adelante.
Tabla 3: Reacción PCR alternativa de ejemplo para amplificación de plantilla de biblioteca cADN Plantilla cADN X µ?.
Agregar dH20 a 790 µ?_ Amortiguador de polimerasa de ADN 10X High 100 µ?_ Fidelity Taq MgS04 (50 mM) 40 µ? 10 mM dNTP 20 µ? Cebador de avance 5' (10 µ?) 20 µ?_ Cebador de retroceso 3'(10 µ?) 20 µ? Polimerasa de ADN de High Fidelity Taq 10 µ?_ Volumen total 1000 µ?_ En una modalidad de ejemplo, se utilizaron reacciones 1 mL de PCR para la salida de la vuelta 1 y 2, y se utilizaron 0.5 mL de las reacciones para las salidas de las últimas vueltas. Las alícuotas de las reacciones 100-mL deben ser elaboradas de una mezcla maestra. Las condiciones de reciclado térmico de ejemplo para la amplificación de la plantilla de ADN de la biblioteca se muestran en la tabla 8 que se encuentra más adelante.
Tabla 4: Otra reacción PCR alternativa de ejemplo para amplificación de ADN Plantilla ADN X µ?_ Agregar dH20 a 660 µ?_ Amortiguador 10X KOD 100 µ?_ MgS04 (25 mM) 60 µ?_ 2 mM dNTP 100 µ?_ Cebador de avance 5' (10 µ?) 30µ?_ Cebador de retroceso 3'(10 µ?) 30 µ?_ Polimerasa de ADN KOD Hot Start 20 µ?_ Volumen total 1000 \iL* Condiciones de reciclado térmico para amplificación de plantilla de ADN de la biblioteca 95°C 2 minutos i 95°C 20 segundos ] 55°C 10 segundos } 20 ciclos* 70°C 15 segundos J i 70°C 30 segundos i 4°C Mantener todo el tiempo *Nota: normalmente se pueden utilizar 18 a 20 ciclos de amplificación con la Polimerasa de ADN KOD Hot Start AND, sin embargo, un cantidad tan baja como 13 ciclos, pueden tener éxito en amplificar una cantidad suficiente de ADN de la biblioteca. Los productos no específicos de diversos tamaños pueden ser mejor apreciados con ciclos de amplificación adicionales, y el producto puede necesitar ser purificado con gel. Si es posible, puede ser de ayuda incrementar la entrada de la plantilla ADN en lugar del número de ciclos de amplificación.
Tabla 5: Condiciones de reciclado térmico para amplificación de plantilla de ADN de la biblioteca 94°C 2 minutos 94°C 20 segundos ] 55°C 10 segundos r 25 ciclos* 68°C 1 minuto J 68°C 5 minutos 4°C Mantener todo el tiempo *Nota: normalmente 25 ciclos proporcionan suficiente amplificación pero se puede incrementar tanto como a 35 para ganar más productos. Los productos no específicos de varios tamaños pueden ser mejor apreciados con ciclos de amplificación adicionales, y puede ser necesario que el producto sea purificado con gel. Si es posible, puede ser de ayuda incrementar la entrada de la plantilla ADN en lugar del número de ciclos de amplificación.
Después de PCR, se confirma el tamaño del producto PCR, por ejemplo, mediante electroforesis de gel de agarosa. Si los productos tienen el tamaño correcto (~ 850 bp para scFv, ~ 500 bp para biblioteca VH o VL) y están presentes los productos no específicos mínimos, los productos generalmente pueden ser utilizados ya sea directamente en la reacción de transcripción de la siguiente vuelta, o después de la purificación con una columna de giro (por ejemplo, Equipo de Purificación Qiagen™ QIAquick PCR). En algunos casos, puede ser necesario que los productos PCR sean purificados con gel. Si se utiliza purificación con gel para productos PCR, separar todos los productos restantes en un gel de agarosa de preparación y cortar la banda específica para la extracción de gel. La cuantificacion del ADN purificado con gel puede ser engañosa, ya que el EtBr residual en el ADN tiende a interferir con la absorbencia UV. Un paso de lavado más extenso durante la extracción de gel, puede ayudar a aliviar esta interferencia. Si es posible, se debe medir la concentración de ADN en un espectrofotómetro, ya que los trazos del escaneo UV son muy diferentes entre una muestra de ADN limpia y un ADN con EtBr residual. Este protocolo se repite subsecuentemente para llevar a cabo múltiples vueltas de selección.
A: PCR de spectradigitación VH CDR3 Se puede utilizar PCR de spectradigitación para analizar las distribuciones de tamaño de VH CDR3 en la biblioteca, o sus salidas de selección. Es una herramienta útil evaluar la diversidad de la biblioteca, así como el progreso de las selecciones. Las pocas vueltas iniciales de las salidas de la selección de biblioteca y la biblioteca antes de la selección, deben ser muy diversas y la distribución del tamaño CDR3 aproximarse a una distribución Gausiana.
Tabla 6: Cebadores PCR Spectradigitación Preparación de PCR Spectradigitación Plantilla ADN 2.0 µ? dH20 18.1 µ?.
Amortiguador 5X GoTaq Flexi 60 µ?_ 25 mM MgS04 1.8 µ? 10 mM dNTP 0.6 pL Cebador de avance 5' (10 µ?) 0.6 µ?_ Cebador de retroceso 3'(10 µ?) 0.6 µ? Polimerasa de ADN GoTaq Flexi 0.3 µ?.
Volumen total Se utiliza polimerasa de ADN Promega GoTaq en esta preparación, pero puede ser sustituida por las polimerasas de ADN termo estable de otras fuentes. La concentración Mg2+ final es de 1.5 mM.
Programa de reciclado térmico 94°C 2 minutos 94°C 20 segundos l 55°C 20 segundos r 30 ciclos 72°C 30 segundos J i 72°C 5 minutos i 4°C Mantener siempre B: Spectradigitación de electroforesis de análisis Después de PCR, se pueden cargar 10 µ?_ de producto en un gel de agarosa al 2% para confirmar el éxito de la reacción, y el producto restante puede ser presentado a una instalación de centro de secuenciación para spectradigitación de electroforesis en una máquina de secuenciación, junto con un marcador de tamaño de ADN etiquetado-ROX , el cual generalmente sub-estima el tamaño del producto de ADN mediante 3-bp, posiblemente debido a la diferencia en las tintas de etiqueta.
El producto de ADN purificado tiene la siguiente organización: 5'-FR3 (27 bp)-VH CDR3-FR4 (35 bp)-3' El tamaño de VH CDR3 es deducido del tamaño del producto de ADN aparente, tal como se determina mediante marcador de tamaño de tinta Rox a través del siguiente calculo: TamañOvH = (TamañOTa maño de producto de aparente - 60) / 3 En donde 60 = (62Estructura en ambos extremos "I 3' Un sobresaliente + 3 s u b e st i m a d o de marcador de 16. Reactivos de Ejemplo y Composiciones de Amortiguador Amortiguador de Ligadura Química 10X Tris, pH 7 250 mM NaCI Amortiguador de enlace Oligo-dT 2X 3X Tris, pH 8 200 300 mM NaCI 2 3 M Tritón X-100 0.01 0.15% Amortiguador de Enlace FLAG 1X 5X Amortiguador a base de fosfato PBS 1X 5X Tritón X-100 0.025 0.125% Amortiguador a base de HEPEs alternativo HEPES 50 250 mM NaCI 150 750 mM Tritón X-100 0.025 0.125% Amortiguador der selección Amortiguador a base de fosfato PBS 1X BSA 1 mg/ml ADN de esperma de salmón 0.1 mg/ml Tritón X-100 0.025% tARN de levadura (opcionalmente, agregar antes de 20 ng/ml utilizarse) Amortiguador a base de HEPES alternativo HEPES 50 mM NaCI 150 mM BSA 1 mg/ml Tritón X-100 0.1 mg/ml ADN de esperma de salmón 0.025% tARN de levadura (opcionalmente, agregar antes de 20 ng/ml utilizarse) Primer amortiguador de hebra Tris-HCI, pH 8.3 250 mM KCI 375 mM MgCI2 15 mM Solución de reserva 50X FLAG Péptido FLAG 25 mg Amortiguador de selección 5 mi Elaborar alícuotas de 1 mi almacenado a temperatura de -20°C Solución de elución FLAG Solución de reserva 50X FLAG 1 mi Amortiguador de selección 49 mi Elaborar alícuotas de 1 mi almacenado a temperatura de - 20°C Preferentemente de celulosa Oligo-dT Pesar 2.5 de celulosa de oligo-dT en un tubo de 50 mi.
Agregar 25 mi de 0.1 N NaOH y mezclar.
Girar en 1500 rpm durante 3 minutos, desechar el sobrenadante.
Lavar la celulosa oligo-dT con 25 mi de amortiguador de enlace 1X de Oligo- dT.
Girar en 1500 rpm durante 3 minutos, desechar el sobrenadante.
Repetir el lavado 3 veces más y medir el pH del sobrenadante.
El pH debe ser el mismo del amortiguador de lavado (~pH 8.5) Resuspender la celulosa oligo-dT a un volumen final de 25 mi agregando amortiguador de enlace 1X Oligo-dT. Esta puede ser una pasta aproximadamente al 50%.
Almacenar las cuentas de celulosa pre-lavadas en 4°C.
Concentración final = 100 mg/mL = 1 nmol capacidad de ARN Preparación de agarosa anti-FLAG M2 Transferir 25 mi de cuentas de agarosa M2 en un tubo de 50 mi Girar las cuentas durante 5 minutos en 1000 rpm en una centrifugadora Beckman y eliminar el sobrenadante mediante aspirado.
Lavar resuspendiendo las cuentas en un volumen igual de 10 mM de glicina, pH 3.5 Girar las cuentas durante 5 minutos en 1000 rpm en una centrifugadora Beckman y eliminar el sobrenadante mediante aspirado.
Resuspender con un volumen de columna de amortiguador de enlace 1X FLAG.
Girar la pasta durante 5 minutos en 1000 rpm en una centrifugadora Beckman y eliminar el sobrenadante mediante aspirado.
Repetir el lavado 3 veces Resuspender con un volumen de columna de amortiguador de enlace 1X (que contiene 1 mg/ml BSA y 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón) Rebotar durante 1 hora o durante la noche a una temperatura de 4°C.
Elaborar alícuotas en fracciones de 2 mi si se desea y mantener una temperatura de 4°C.
EJEMPLO 1 DEMONSTR ACIÓ DE MOLÉCULAS MARN-SCFV FUNCIONALES Se utilizaron cuatro anticuerpos conocidos para demostrar que se pueden desplegar moléculas de mARN-scFv funcionales y enlazar a su antigeno respectivo: D2E7 (anti-hTNF humano), Y61 (anti-h I L- 12 humano), 17/9 (anti-HA de ratón), y MAK195 (anti-hTNF de ratón). Se generó el MAK-195 scFv mediante el PCR a partir del ADN de plásmido utilizando los cebadores mostrados en la tabla 9 que se encuentra más adelante.
Tabla 7: Cebadores de Oligonucleótidos Utilizados para la Construcción de Construcciones de MAK195 mARN-scFv Cebadores Secuencias T7- TAATACGACTCACTATAGGGACAATTACTATTTACAATTACACCAT MAK195VH- GGAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGG (SEC ID NO: 22) Fwd MAK195VhGS- CGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCA Rev CCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTCC (SEC ID NO: 23) MAK195VLGS- GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGAT Fwd CGGACATTGTGATGACCCAGTCTC (SEC ID NO: 24) GATGGTGCAGCCACCGTACGTTTTATTTCCAACTTTGTCCCCGAG (SEC ID NO: 25) Se generó un scFv anti-HA 17/9 (ver la Publicación de Schulze-Gahmen y asociados, (1993) J. Mol. Biol. 234(4): 1098-118) mediante PCR, utilizando los siguientes cebadores, con base en las secuencias de proteína A31790 y B31790 descargada de la base de datos de NCBF (ver tabla 10 que se encuentra más adelante).
Tabla 8: Cebadores de Oligonucleótido Utilizados para la Construcción de Construcciones 17/9 mARN-Scfv Cebadores Secuencias T7TMVUTR-17/9 GGACAATTACTATTTACAATTACACCATGGAAGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCG VH-1 Fwd GCGATCTGGTGAAACC (SEC ID NO: 26) 17/9 VH-2 Rev GCTGCTAAAGCTAAAGCCGCTCGCCGCGCAGCTCAGTTTCAGGCTGCCGCCCG GTTTCACCAGATCGCCG (SEC ID NO: 27) 17/9 VH-3 Fwd GGCTTTAGCTTTAGCAGCTATGGCATGAGCTGGGTGCGCCAGACCCCGGATAAA CGCCTGGAATGGGTGG (SEC ID NO: 28) 17/9 VH-4 Rev GCCTTTCACGCTATCCGGATAATAGGTATAGCCGCCGCCGTTGCTAATGGTCGC CACCCATTCCAGGCGT (SEC ID NO: 29) 17/9 VH-5 Fwd CCGGATAGCGTGAAAGGCCGCTTTACCATTAGCCGCGATAACGCGAAAAACACC CTGTATCTGCAGATG (SEC ID NO: 30) 17/9 VH-6 Rev GTTCGCGGCGCGCGCAATAATACATCGCGCTATCTTCGCTTTTCAGGCTGCTCAT CTGCAGATACAGGGT (SEC ID NO: 31) 17/9 VH-7 Fwd ATTGCGCGCGCCGCGAACGCTATGATGAAAACGGCTTTGCGTATTGGGGCCAGG GCACCCTGGTGACCGT (SEC ID NO: 32) 17/9 VH-8 GS Rev CGATCCGCCACCGCCGCTGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCCGCGCTCA CGGTCACCAGGGTGCCC (SEC ID NO: 33) GS-17/9VL-Fwd 1 AGCGGCGGTGGCGGATCGGATATTGTGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAC CGTGACCGCGGGCGAAA (SEC ID NO: 34) 7/9 VL-2 Rev TGTTTGCCGCTGTTAAACAGGCTCTGGCTGCTGGTGCAGCTCATGGTCACTTTTT CGCCCGCGGTCACGG (SEC ID NO: 35) 17/9 VL-3 Fwd GTTTAACAGCGGCAAACAGAAAAACTATCTGACCTGGTATCAGCAGAAACCGGG CCAGCCGCCGAAAGTG (SEC ID NO: 36) 17/9 VL-4 Rev CGGTAAAGCGATCCGGCACGCCGCTTTCGCGGGTGCTCGCCCAATAAATCAGCA CTTTCGGCGGCTGGCC (SEC ID NO: 37) 17/9 VL-5 Fwd TGCCGGATCGCTTTACCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTA GCAGCGTGCAGGCGGA (SEC ID NO: 38) 17/9 VL-6 Rev AAAGGTCAGCGGGTTGCTATAATCGTTCTGGCAATAATACACCGCCAGATCTTCC GCCTGCACGCTGCTA (SEC ID NO: 39) 17/9 VL-7 Fwd AGCAACCCGCTGACCTTTGGCGGCGGCACCAAACTGGAACTGAAACGTACGGTG Rev GCTGCACCATCTGTCT (SEC ID NO: 40) 17/9 VL-8 FLAG TTAAATAGCGGATGCCTTGTCGTCGTCGTCCTTGTAGTCGATGAAGACAGATGGT Rev GCAGCCACC(SEC ID NO: 41) Se recuperó 17/9 de la secuencia de anticuerpo de la base de datos de NCBI utilizando los números de acceso A31790 y B31790.
Las construcciones de ADN para estos scFv fueron transcritas in vitro y posteriormente traducidas mediante lisado de reticulocito de conejo ya sea como mARN-scFv (la proteína fue adherida a mARN a través de un enlazador con modificación de puromicina) o como scFv libre (la proteína no se adhirió al mARN). Ambos tipos de moléculas fueron codificadas y sometidas a ensayos de demolición mediante antígenos biotinilados correspondientes (ver figura 4).
Los datos en la figura 4 muestran que el m-ARN-scFv funcional (enlazado al antígeno biotinilado) puede ser demolido mediante cuentas magnéticas de una estreptavidina, a pesar de un menor porcentaje de recuperación fue scFv libre. Los experimentos adicionales mostraron que esta diferencia se debe simplemente al ARN pesado sujeto al scFv. La degradación de RNase de la parte de ARN de la molécula mARN-scFv restauró la recuperación scFv mediante antígeno al mismo nivel que el del scFv libre (ver figura 5).
EJEMPLO 2 OPTIMIZACIÓN DE TECNOLOGÍA DE DESPLIEGUE DE MARN PARA MEJORAR LA REACCIÓN DE TRADUCCIÓN En una modalidad preferida, el tamaño de la biblioteca es de 1 x 1012. Se requieren aproximadamente 20 pmol de la proteína fusionada (por ejemplo, 1.2 x 1013) para la selección con el objeto de cubrir 12 veces el tamaño de la biblioteca. La recuperación después de la purificación FLAG normalmente es de aproximadamente 30%. Por consiguiente aproximadamente 60 pmol de la proteína fusionada se necesita después de la purificación Oligo-dT para ingresar en la purificación FLAG. En una modalidad, se obtienen aproximadamente 1.2 pmol de proteína fusionada por 100 pmol de ARN después de purificación Oligo-dT. En esta modalidad, son necesarios aproximadamente 5 nmol de ARN (la cual cubre el tamaño de la biblioteca 3000 veces) para obtener 60 pmol de la proteína fusionada. Se debe observar que este cálculo no toma en cuenta la observación de que únicamente son funcionales del 20% al 30% de las moléculas de despliegue de mARN fusionadas (se pueden recuperar después de la selección).
Debido a la cantidad antes mencionada de la proteína fusionada necesaria para los pasos subsecuentes del método de despliegue de ARN, se optimizo la reacción de traducción para maximizar la recuperación de proteína. Se evaluó la variación de la cantidad inicial de la entrada de ARN en la reacción de traducción después de la purificación FLAG. Se evaluó la recuperación de proteína midiendo el porcentaje de metionina S35 incorporando durante la reacción de traducción, y calculando la proporción de proteína pmol (salida) a pmol de ARN (entrada). Las cantidades de entrada de ARN probadas, así como la recuperación de proteína resultante, se muestran en la tabla 12. Tal como se demuestra a través de este análisis, una entrada de ARN inferior, conduce sorprendentemente a un mayor porcentaje de recuperación de proteína.
Tabla 9: Relaciones de Entrada ARN y Recuperación Proteína La reacción de traducción se llevó a cabo utilizando diferentes cantidades de la mezcla libre de aminoácidos para determinar el efecto en la recuperación de proteína. Las cantidades relativas de partida de las mezclas de aminoácidos probadas, así como la recuperación de proteína resultante, se muestran en la Tabla 13. La entrada de ARN en cada caso fue de 50 pmol. Tal como se demuestra a través de este análisis, el incremento del aminoácido disminuye en la eficiencia de traducción.
Tabla 10: Relación Entre una Concentración de Aminoácido y Recuperación de Proteína También se probaron diferentes cantidades en metionina "fría" (por ejemplo, no radiactiva) para su efecto en la eficiencia de traducción. Las diferentes concentraciones de metionina fría que fueron probadas, así como si la recuperación de proteína resultante se muestran en la tabla 14. La entrada de ARN en cada caso fue de 50 pmol. Tal como se demuestra a través de este análisis, el incremento de la entrada de metionina fría no conduce a un incremento en la eficiencia de traducción.
Tabla 11: Relación Entre la Concentración en Metionina Fría y la Recuperación de Proteína Concentración de Metionina Después de purificación FLAG Fría % de Met incorporado pmol proteína/pmol ARN 5 µ? 1.00% 1.31/50 = 2.6% 17.5 µ? 0.23% 1.15/50 = 2.3% 30 µ? 0.20% 1.52/50 = 3.0% 42.5 µ? 0.15% 1.58/50 = 3.2% La entrada de ARN y la concentración de aminoácido por consiguiente deben tomarse en consideración, cuando se planean la reacción de la traducción para el despliegue de mARN. Aunque la disminución de la entrada ARN en cada reacción pueden mejorar la recuperación de proteína, también puede impactar el tamaño de la biblioteca. Una reacción de traducción de ARN de ejemplo que puede ser útil en la práctica del método de despliegue de mARN de la presente invención se muestra en la tabla 15.
Tabla 12: Reacción de Traducción de ARN de Ejemplo EJEMPLO 3 OPTIMIZACIÓN DE TECNOLOGÍA DE DESPLIEGUE DE MARN PARA SELECCIÓN SCFV - LONGITUD DE ESPACIADOR Se ha propuesto anteriormente que una longitud de espaciador larga entre la proteína scFv y el extremo de mARN, mejora la multiplicación y función de scFv (ver la Publicación de Hanes y asociados, (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94(10):4937-42). Por consiguiente, se investigó (ver figura 6) el efecto de la longitud del espaciador entre scFv y el sitio de endurecimiento del enlazador en la función y rendimiento de la molécula mARN-scFv. Se elaboraron (ver figura 8 para construcciones de espaciador D2E7) tres diferentes construcciones D2E7 scFv con espaciadores 3' cortos, medios y largos y dos construcciones espaciadoras cortas y largas para Y61 y 17/9 scFv. Los resultados, como se ilustra en la figura 7, muestran que un espaciador más largo no proporciona una ventaja medible en la función de la molécula mARN-scFV tal como se evalúa mediante enlace de antígeno. Además, la longitud de espaciador más larga redujo significativamente el rendimiento de mARN-scFv (ver figura 7). Los rendimientos de ARN también son inferiores con un espaciador más largo: el espaciador corto produjo 6 nmol de ARN; el espaciador medio produjo 3.4 nmol de ARN; y el espaciador largo produjo 1.7 nmol. Por lo tanto, en una modalidad, se prefiere un espaciador corto para la construcción de biblioteca scFv.
Se llevó a cabo también la comparación de diferentes espaciadores y enlazadores utilizando tres diferentes construcciones Y61 (ver figura 23). Los resultados, mostrados más adelante en la tabla 16, muestran que los rendimientos de ARN también son menores con un espaciador más largo.
Además, no hubo diferencia en las purificaciones de molécula mARN ni enlace de antígeno moviendo la cola poli-A del propio mARN (Y61 -scGene3pA) al enlazador de ADN entre mARN y la proteína scFv (Y61 -scGene3), ya que la proteína scFv es idéntica entre estas dos construcciones tal como se muestran SEC ID NO: 10 y SEC ID NO:4, respectivamente.
Tabla 13: Comparación de Diferentes Espaciadores y Enlazadores Tal como se muestra más adelante, 17/9 requiere PDI durante la traducción para que sea funcional, y DTT en la reacción de transcripción inversa antes de la selección, mostró afectar su enlace de antígeno. Como estos resultados indican, son esenciales enlaces de disulfuro para la función de 17/9, y esto hace a 17/9 un buen candidato para investigar los requerimientos de longitud de espaciador. La figura 9 muestra que aunque una longitud del espaciador más larga no mejora el enlace de la molécula mARN-scFv al antígeno, reduce su rendimiento.
EJEMPLO 4 OPTIMIZACIÓN DE LA TECNOLOGÍA DE DESPLIEGUE DE MARN PARA MEJORAR LA MULTIPLICACIÓN Y FUNCIÓN DE PROTEÍNA SCFV - OMISIÓN DE MODIFICACIÓN QUÍMICA EN RESIDUOS DE CISTEÍNA La tecnología de despliegue de ARN mensajero en la técnica, incluye una reacción tapado con sello química en residuos de cisteína libre para evitar la formación de enlaces de disulfuro de cisteína indeseable mediante ácido 2-nitro-5-tiocianatobenzoico, lo cual dio como resultado una cianilación, o mediante N-etilmaleimida, el cual enlaza covalentemente al grupo de sulfihidrilo. Aunque esta reacción de tapado con sello elimina el desdoblamiento de proteína potencial originado por la reticulación aleatoria de residuo de cisteína libre, la presente invención elimina la conservación artificial de la cisteína libre dentro de un anticuerpo, lo cual puede ser un perjuicio para su futura capacidad de fabricación debido a las propiedades físicas o químicas impredecibles. El paso de tapado con sello químico fue eliminado de modo que, cualquier cisteína libre extra más allá de cuatro cisteínas recibidas para la multiplicación del dominio scFv Ig, no se conserva activamente durante la selección de biblioteca.
EJEMPLO 5 OPTIMIZACIÓN DE TECNOLOGÍA DE DESPLIEGUE DE MARN PARA MEJORAR LA MULTIPLICACIÓN Y FUNCIÓN DE PROTEÍNA SCFV - REQUERIMIENTO DE UNA ACTIVIDAD ISOMERASA DE DISULFURO DE PROTEÍNA DE CO- TRADUCCIÓN Se ha sugerido que PDI contribuye a una mejor función en secreción de proteína, ya sea mediante isomerasa o actividad chaperona, o mediante ambas (ver Publicación Shusta y asociados, Nat Biotechnol 16(8):773-7; Smith y asociados, Biotechnol Bioeng 85(3): 340-50). Se codifican dos enlaces de disulfuro intradominio Ig a través de cada secuencia scFv, una en el dominio VH y la otra en el dominio VL. Se ha sugerido que es crucial una actividad de isomerasa de disulfuro de proteína co-traducción (PDI) para la formación de enlace de disulfuro in vitro adecuada (ver la Publicación de Ryabova y asociados , Nat Biotechnol 15(1 ): 79-84). Los protocolos de despliegue de mARN en la técnica, han estipulado la inclusión de (PDI) en la reacción de traducción.
Se utilizaron D2E7, Y61, y 17/9 scFv para probar su requerimiento de actividad PDI en el sistema de despliegue mARN. Los resultados mostraron que dos de los scFv (D2E7 y 17/9) pueden no enlazar a su antígeno cognato sin PDI durante su generación, en tanto que Y61 parece no ser afectado (ver figura 10). Se concluyó que en un nivel de biblioteca de anticuerpo grande, la alta diversidad puede requerir actividad PDI para asegurar una función scFv máxima.
La recuperación y funcionalidad de D2E7 scFv traducido con o sin PDI adicional agregado, también fue probada. La reacción de traducción incluyó un tubo de lisado (200 µ?), 100 pmol de ARN espaciador corto de D2E7 y PDI y GSSG/GSH. La traducción sin PDI excluyó PDI y GSSG/GSH. La proteína traducida fue recuperada con purificación FLAG, y se cuantificó la cantidad de recuperación. Posteriormente se llevó a cabo enlace/recuperación de antígeno con 50 mM de TNFa biotinilado y entradas iguales por cada uno, 100000 cpm. Los resultados se muestran más adelante en la tabla 17.
Tabla 14: Pruebas D2E7 scFv +/- PDI Los resultados que muestran que Y61 no requiere PDI durante la traducción para funcionalidad, tal como se muestra más adelante en la tabla 18.
Tabla 15: Y61 -Sccl-Corta no Requiere PDI Durante Traducción Para Funcionalidad Los resultados muestran que 17/9 requiere PDI durante la traducción para funcionalidad tal como se muestra más adelante en la tabla 19.
Tabla 16: Requiere 17/9 Durante la Traducción PDI Para Funcionalidad EJEMPLO 6 OPTIMIZACIÓN DE TECNOLOGÍA DE DESPLIEGUE DE MARN PARA MEJORAR LA MULTIPLICACIÓN Y FUNCIÓN DE PROTEÍNA SCFV - ELIMINACIÓN DE DITIOTREITOL DE LA REACCIÓN Ditiotreitol (DTT) es un agente de reducción comúnmente introducido a reacciones enzimáticas para minimizar la agregación de proteína y la oxidación de proteína reducida. También se utiliza normalmente en la reacción de transcripción inversa (RT) después del paso de traducción in vitro de las moléculas mARN scFv. Y que su inclusión puede reducir los dos enlaces de disulfuro intracadena en una molécula scFv, que se producen mediante actividad PDI, se investigó el efecto potencial de DTT en la función de enlace de antígeno scFv (ver figura 11). La presencia de DTT abolió significativamente la actividad de enlace de antígeno de 17/9 scFv después de RT, lo cual es consistente con la dependencia de actividad PDI para la función 17/9 mostrada en la figura 11. Esta pérdida de actividad de enlace de antígeno no se debió a la propia reacción RT, ya que la mayor parte de la actividad de enlace de antígeno de 17/9 fue conservada si DTT fue omitida de RT. Además, los resultados muestran que el cADN 17/9 scFv de hecho fue transcrito en forma inversa del mARN en la ausencia de DTT mediante PCR, lo que sugiere que DTT es suministrable a partir de la reacción RT (datos no mostrados).
Los resultados que muestran que DTT en la reacción RT antes de la selección intacta a la funcionalidad de 17/9, se muestran más adelante en la tabla 20. Tal como se muestra en la figura 12, sin embargo, DTT no impacta el proceso RT.
Tabla 17: DTT en reacción RT antes de la selección impacta en la funcionalidad de 17/9 En contraste con 17/9 scFv, la función Y61 scFv anti-IL- 2 no fue afectada por DTT (ver figura 11). Esto es consistente con sin sensibilidad antes mencionada a la actividad PDI, y sugiere que no todo el anticuerpo scFv requerirá enlaces de disulfuro para funcionar. Las diferentes condiciones RT exploradas para Y61 -scCL-corta y los resultados correspondientes se muestran más adelante en la tabla 21 y también en la figura 13.
Tabla 18: Diferentes condiciones RT para Y61 -scCL-corta En una modalidad, DTT no está presente en RT o como alternativa RT es retrasado hasta después de la selección de antígeno para maximizar la producción del rendimiento de scFv funcional de la biblioteca mARN-scFv. Las tablas 22 y 23 que se encuentran más adelante, muestran los resultados del retraso del paso de RT, hasta después del paso de selección de antígeno para Y61 -ScCL-largo y Y61 -ScCL-corto, respectivamente.
Tabla 19: Comparación de Y61 -ScCL-largo con o sin el paso de RT Tabla 20: Comparación de Y61 -ScC L-corto con o sin la etap de RT EJEMPLO 7 OPTIMIZACIÓN DE LA TECNOLOGÍA DE DESPLIEGUE DE MARN PARA MEJORAR LA MULTIPLICACIÓN Y FUNCIÓN DE PROTEÍNA SCFV - INCLUSIÓN DE INHIBIDOR DE ARNSE DURANTE LA SELECCIÓN DE ANTÍGENO Se consideró la producción de mARN-cADN de hebra doble mediante RT para preparar las moléculas rriARN-scFv para enlace de antígeno, para evitar la degradación de ARN y reducir las estructuras secundarias de ARN. Después de selección mediante el antígeno, el cADN puede ser recuperado mediante hidrólisis alcalina del mARN y sirve como una plantilla de amplificación mediante PCR. Para evitar el impacto potencial de DTT en la función scFv mediante RT antes de la selección de antígeno, se necesitan emplear métodos alternativos para proteger el mARN para amplificación después de la selección.
Por consiguiente, se investigó si mARN en una molécula mARN-VH que carece de su hebra cADN protectora, puede ser lo suficientemente estable y accesible para amplificación mediante RT-PCR después de selección de antígeno. Se utilizó como una molécula modelo mARN-VH, una molécula de enlace IL-1a validada previamente. La recuperación de la secuencia Phylos40 VH fue comparada cuando RT se llevó a cabo antes o después de la selección de antígeno (ver figura 14). En comparación con el método en la técnica (RT de pre-selección y elución alcalina de cADN, columna izquierda), la recuperación de mARN mediante RT-PCR después de la selección de antígeno pareció ser reducida significativamente cuando se capturó el complejo mARN-IL-1a en cuentas magnét¡cas-SA y se utilizó directamente para RT (columna derecha). Esto puede ser debido a la degradación parcial de ARN durante la selección de antígeno o a la accesibilidad mARN deficiente en las cuentas para RT. Los intentos de interrumpir la interacción VH IL-1a- Phylos40 y disociar la molécula mARN-VH de las cuentas SA mediante elución de ácido (en pH 3) para una mejor accesibilidad mARN, parecieron empeorar su recuperación, posiblemente debido a la estabilidad de mARN disminuida o a la disociación deficiente de la molécula mARN-VH de su antígeno en el amortiguador de elución antes de que los complejos fueron eliminados con las cuentas SA. La figura 14 muestra resultados de transcripción inversa después de la selección de antígeno, que compara el método estándar de RT-PCR después de oligoDT con elución de ácido seguido de RT-PCR y RT-PCR directamente fuera de las cuentas después de la captura. La dilución con cuentas libres 1:10, 1:100 y 1:1000 mostró que se logró una re-amplificación fuerte en una dilución de 1:1000.
Ya que es posible emitir RT antes de la selección de antígeno y recuperar subsecuentemente el mARN mediante RT-PCR, se investigó si la recuperación reducida de la plantilla mARN puede ser restaurada o mejorada protegiendo ARN de la actividad RNase contaminante mediante el inhibidor de RNase. Se incluyó RNaseOUT™ (Invitrogen, cat.#10777-019) en una dilución 1:20 durante el paso de selección de antígeno y seguido de RT-PCR para comparar la recuperación de mARN (ver figura 15). Comparando con llevar a cabo RT antes de la selección de antígenos, la recuperación de plantillas de mARN fue reducida nuevamente si se lleva a cabo RT después de la selección de antígenos sin inhibidor RNase. En forma interesante, la inclusión del inhibidor RNase a la selección de antígeno, no únicamente reanudó, sino que también aumentó significativamente, la recuperación de mARN. Por lo tanto, parece que esta mejoría se debe al menos parcialmente a una mejor eficiencia en la captura de una molécula -280 kDa mARN- scFv más ligera que la de una molécula -560 kDa mARN-scFv más pesada con el cADN adicional.
También se probó la inclusión de RNase OUT con una molécula mARN-scFv. La figura 16 ilustra el experimento llevado a cabo para comparar Y61-CL-largo con Y61-CL-corta en la presencia o ausencia de RNase OUT. Los resultados se pueden apreciar en la tabla 24 que se encuentra a continuación así como en la figura 17.
Tabla 21: Comparación de CL-Largo Y CL-Corto en la Presencia o Ausencia de ARNseOUT EJEMPLO 8 SELECCIÓN DE BIBLIOTECA PARA 17/9 SCFV Para demostrar si una molécula mARN-scFv puede ser enriquecida a través de varias vueltas de selección utilizando método de despliegue de mARN aquí descritos, se construyó una biblioteca scFv con una diversidad de 25 traslapando PCR. Para crear la biblioteca scFv, se mezclaron cantidades iguales de los fragmentos VH y VL de 17/9, D2E7, 2SD4, Y61 y MAK195 y se combinaron en una biblioteca scFv con una diversidad máxima de 25 y se utilizaron tal como se describió anteriormente. Posteriormente seleccionó 17/9 scFv a partir de esta biblioteca mediante péptido de etiqueta HA biotinilado. Después de la selección, se revisó el enriquecimiento 17/9 mediante clonación y colonia de PCR. Los resultados que cuantifican 17/9 scFv antes y después de una vuelta de la selección mARN-scFv se muestran en la figura 18. Después de una vuelta de selección contra el péptido HA, todas las secuencias scFv recuperadas de la salida de selección fueron de 17/9 scFv.
EJEMPLO 9 SE PUEDE UTILIZAR LA TECNOLOGÍA DE DESPLIEGUE MARN PARA DIFERENCIAR ENLAZADORES SCFV CON DIFERENTE AFINIDAD Para determinar si se puede utilizar la tecnología de despliegue mARN, por ejemplo tal como se describió anteriormente, para diferenciar enlazadores scFv con diferente afinidad, se elaboraron quimeras entre D2E7 y 2SD4. 2SD4 es el precursor D2E7 scFv el cual exhibe baja afinidad (KD ~ 200 nM como proteína libre) para TNFa. La figura 19 ilustra las quimeras.
La trituración se llevó a cabo para proteínas libres. La figura 20a, muestra el porcentaje de recuperación después del enlace de antígeno entre las diferentes quimeras, en tanto que la figura 20b ¡lustra el porcentaje de recuperación normalizado después de selección de antígeno. Los resultados anteriores muestran que se puede utilizar la tecnología de despliegue ARN tal como aquí se describe, para diferenciar enlazadores con diferente afinidad.
EJEMPLO 10 TERMOESTABILIDAD DE MOLÉCULAS MARN-SCFV Para determinar la termoestabilidad de moléculas mARN-scFv, se tradujeron D2E7-scCk y Y61-scCk y se purificaron en un formato mARN-scFv, tal como se describe en la presente invención. Posteriormente las moléculas mARN-scFv fueron incubadas a diferentes temperaturas durante 30 minutos antes de la selección. El porcentaje de recuperación normalizado después de la selección de antígeno se muestra en la figura 21.
La figura 22 muestra que ARN puede ser recuperado después de tratamiento a alta temperatura de moléculas mARN-scFv. Aquí, se llevo a cabo RT-PCR en las cuentas con moléculas Y61-scCI mARN-scFv recuperadas.
Incorporación como Referencia Los contenidos de todas las referencias (incluyendo referencias de literatura, patentes, solicitudes de patente y sitios web) que pueden haber sido mencionados a lo largo de la presente solicitud, están incorporados expresamente en su totalidad como referencia para cualquier propósito, tal como se mencionan en la presente invención. La práctica de la presente invención puede emplear, a menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de cultivo celular y biología molecular, los cuales son conocidos en la técnica.
Equivalentes La presente invención puede ser representada en otras formas específicas sin apartarse del espíritu o características esenciales de la misma. Por consiguiente las modalidades anteriores serán consideradas en todos los aspectos como ilustrativos en lugar de limitantes de la invención aquí descrita. Por lo tanto, el alcance de la presente invención estará indicado por las reivindicaciones adjuntas, en lugar de por la descripción anterior, y todos los cambios que estén dentro del significado y rangos de equivalencia de las reivindicaciones, estarán, por consiguiente, comprendidos en la presente invención.

Claims (40)

REIVINDICACIONES
1. Un método para clasificar una biblioteca de despliegue de ARN scFv de anticuerpo, en donde el método comprende los pasos de: (a) proporcionar una molécula de mARN Fv de cadena simple (scFv) reticulada por puromicina o un análogo del mismo, en donde la molécula comprende un mARN que codifica una secuencia espaciadora 5'scFv y una 3', en donde la molécula es reticulada a un enlazador de ácido nucleico de hebra simple, comprendiendo el enlazador una puromicina o análogo del mismo, en un extremo 3' y un Psoralen C6 en el extremo 5'; (b) traducir in vitro el mARN scFv reticulado con puromicina en la presencia de una etiqueta bajo condiciones de modo que la molécula de proteína/mARN scFv reticulada con puromicina etiquetada sea formada; (c) purificar la molécula de proteína/mARN scFv reticulada con puromicina etiquetada; (d) someter la molécula de proteína/mARN scFv reticulada con puromicina etiquetada, purificada a selección de antígeno con al menos un antígeno; y (e) recuperar la molécula de proteína/mARN scFv reticulada con puromicina etiquetada, purificada utilizando cuentas magnéticas a base de afinidad.
2. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además el paso de (g) transcribir en forma inversa el mARN scFv después de selección de antígeno para elaborar un cADN.
3. El método tal como se describe en la reivindicación 2, caracterizado porque comprende además el paso de (h) amplificar el cADN.
4. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la etiqueta es una etiqueta radioactiva.
5. El método tal como se describe en la reivindicación 4, caracterizado porque la etiqueta es 35S metionina o cisteína.
6. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de espaciador 3' comprende aproximadamente 0 hasta aproximadamente 200 aminoácidos.
7. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de espaciador 3' comprende aproximadamente 16 aminoácidos.
8. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de espaciador 3' comprende una etiqueta de afinidad.
9. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el enlazador de ácido nucleico comprende, de 5' a 3': - Psoralen C6; - 2'OMe ribonucleótidos que comprenden la secuencia UAGCGGAUGC (SEC ID NO: 20); - seis porciones de trietilenglicol o PEG-150; - dos residuos de desoxicitidina; y, - Puromicina.
10. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula mARN scFv es fotoreticulada para el enlazador de ADN mediante UVA.
11. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula mARN scFv comprende un promotor 5' seleccionado del grupo que consiste en T7, SP6, y T3.
12. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula mARN scFv comprende una región no traducida 5' de virus de mosaico de tabaco.
13. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula de proteína/mARN scFv reticulada con puromicina etiquetada, es purificada mediante cromatografía oligodT.
14. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula de proteína/mARN scFv reticulada con puromicina etiquetada es purificada utilizando cuentas de agarosa de anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2.
15. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula de proteína/mARN scFv reticulada con puromicina etiquetada es purificada mediante cromatografía oligodT y cuentas de agarosa de anticuerpo monoclonar anti-FLAG M2.
16. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el antígeno es un péptido, proteína o hapteno biotinilado.
17. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el antígeno es una proteína de fusión con un fragmento de inmunoglobulina humana cristalizable (Fe).
18. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el antígeno es una proteína de fusión con un fragmento de inmunoglobulina de múrido cristalizable (Fe).
19. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el antígeno es un péptido, proteína o hapteno biotinilado.
20. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el antígeno es una población de células.
21. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo anti-IL- 12.
22. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo anti-HA.
23. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo de múrido.
24. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo humano.
25. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
26. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 24, caracterizado porque la traducción in vitro del mARN scFv reticulado con puromicina, se lleva a cabo adicionalmente en la presencia de GSSH/GSH.
27. El método tal como se describe en la reivindicación 26, caracterizado porque la traducción in vitro del mARN scFv reticulado con puromicina, se lleva a cabo adicionalmente en la presencia de isomerasa de disulfuro de proteína (PDI).
28. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 24, caracterizado porque la traducción in vitro del mARN scFv reticulado con puromicina, se lleva a cabo adicionalmente en la ausencia de ditiotreitol.
29. El método tal como se describe en la reivindicación 27, caracterizado porque la traducción del mARN scFv reticulado con puromicina se lleva a cabo adicionalmente en la ausencia de ditiotreitol.
30. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el método no comprende un paso de tapado con sello de mARN.
31. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el método no comprende un paso de transcripción inversa in vitro, antes del paso de purificación.
32. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque se agrega el inhibidor de Rnasa antes, durante o después de cualesquiera de los pasos del (a) al (g).
33. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el paso de purificación comprende transcripción inversa de mARN en la ausencia de detiotreitol para producir un cADN.
34. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 2 ó 33, caracterizado porque el cADN es eluido mediante hidrólisis alcalina con un pH de aproximadamente pH = 8.0 hasta un pH de aproximadamente pH = 10.0.
35. El método tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 2 ó 33, caracterizado porque el cADN es eluido mediante calor.
36. El método tal como se describe en cuaisquiera de las reivindicaciones 2 ó 33, caracterizado porque el cADN es eluido mediante ácido con un pH de aproximadamente pH = 3.0 hasta un pH de aproximadamente un pH = 6.0.
37. El método tal como se describe en la reivindicación 33, caracterizado porque el cADN se amplificó mediante reacción de cadena de polimerasa.
38. El método tal como se describe en la reivindicación 37, caracterizado porque la reacción de cadena de polimerasa emplea una polimerasa de ADN termoestable.
39. El método tal como se describe en la reivindicación 37, caracterizado porque la reacción de cadena de polimerización emplea una enzima de amplificación seleccionada del grupo que consiste en Platinum HiFi y KOD.
40. El método tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque las cuentas son seleccionadas del grupo que consiste en estreptavidina-M280, neutravidina-M280, SA-M270, NA-M270, SA-MyOne, NA-MyOne, SA-agarosa y NA-agarosa. R E S U M E La presente invención, presenta métodos mejorados para despliegue de ARN ¡n vitro, para permitir una expresión y selección confiable de moléculas de anticuerpo scFv a partir de bibliotecas de expresión. Los métodos mejorados, implican en parte, el uso de condiciones de reducción leves, las cuales favorecen el enlace de disulfuro de intra-cadena scFv y, por lo tanto, corrigen el pliegue de las moléculas de anticuerpo scFv. Aunque particularmente adecuados para expresión y selección de moléculas de anticuerpo scFv, los métodos de la presente invención, también son útiles para despliegue de ARN in vitro de todas las clases de proteína.
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