CN113710801A

CN113710801A - 一种使用cDNA展示的新型免疫PCR方法

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Publication number: CN113710801A
Application number: CN202080028992.2A
Authority: CN
Inventors: 根本直人; 安斋宏纪; 铃木武尊; 熊地重文; 寺井琢也
Original assignee: Epsilon Molecular Evolutionary Engineering Co ltd; Saitama University NUC
Current assignee: Epsilon Molecular Evolutionary Engineering Co ltd; Saitama University NUC
Priority date: 2019-02-22
Filing date: 2020-02-22
Publication date: 2021-11-26
Anticipated expiration: 2040-02-22
Also published as: EP3927823A4; WO2020171236A1; JP2022522337A; JP7334914B2; CN113710801B; US20210381026A1; SG11202108817RA; EP3927823A1

Abstract

本发明提供了一种通过使用cDNA展示的改进的免疫PCR方法，该方法包括以下步骤：将具有结合位点的第一抗体固定到固相上；将样品液与所述抗体接触以结合所述样品液中的靶分子；将所述靶分子与由以下组成的cDNA展示接触：由双链组成的主链，和具有结合第二抗体的第二抗原结合位点的侧链；并进行聚合酶链反应以定量检测所述cDNA。根据本发明的改进的免疫‑PCR方法，靶分子被筛选和定量获得，因为它使用由一种蛋白质/肽和一种DNA组成的cDNA展示。

Description

一种使用cDNA展示的新型免疫PCR方法

技术领域

本发明涉及一种新型免疫-PCR方法。具体而言，它涉及使用cDNA展示的新型免疫PCR方法。

背景技术

以低浓度存在于生物样品(例如，血清、尿液等)中的生物标志物的检测在基础生物学和诊断中至关重要。由Sano等首先开发的免疫-PCR(它被称为“IPCR”)[参见非专利文献1，现有技术1]，是用于此目的的灵敏且定量的分析技术[参见非专利文献2]。

一般IPCR方法包括用包被在表面上的捕获抗体初始捕获靶标抗原，随后用连接有DNA报告基因的检测抗体进行检测。该DNA用合适的引物通过PCR扩增，并使用实时PCR装置进行荧光定量。由于该方法结合了免疫分析和PCR的优点，它兼具高通用性和指数信号放大。近年来，IPCR已被应用于检测各种抗原，包括癌症生物标志物和病毒。

在IPCR的开发和应用中，抗体如何与报告基因DNA结合是一个关键问题。传统上，链霉亲和素已被用作结合生物素化DNA和生物素化抗体的接头(图1A)。在图1A中，链霉亲和素用于将生物素标记的抗体与生物素标记的DNA报告基因连接起来。然而，链霉亲和素的四聚体性质导致异质DNA-抗体缀合物的形成，这可能会降低IPCR的重现性。

另一种方法依赖于将DNA直接缀合到抗体上的化学交联剂(图1B)。在图1B中，使用了共价交联的抗体-DNA缀合物。虽然这可以降低复杂性并且很简单，但常规交联化学会与抗体中的所有半胱氨酸/赖氨酸残基发生反应，并且修饰可能会损害抗体的结合亲和力。此外，与一种抗体结合的DNA分子的数量是异质的并且难以控制。为了解决这些问题，Zhang等开发了一项创新技术：噬菌体展示介导的免疫PCR(PD-IPCR，图1C)。在图1C中，包括抗体的单链可变片段和VHH的不同的肽可以展示在M13或T7噬菌体的表面上。噬菌体DNA用作DNA标记物。

噬菌体展示于1985年由Smith首次描述[参见非专利文件3]，并广泛用于包括抗体在内的多肽的定向进化。在PD-IPCR中，一种表达病毒表面分析物的单链抗体的工程化的噬菌体M13(或T7)用作抗体和DNA的超分子复合物。噬菌体与经固定抗原温育后，细菌DNA被扩增以进行定量。在IPCR中使用噬菌体颗粒避免了抗体-DNA缀合物的繁琐制备，并提供了低成本和高灵敏度的蛋白质、毒素和病毒的检测[参见专利文件4和5]。

引用列表

非专利文件

NPL 1：T.Sano等，Science，258(1992)120-122.

NPL 2：L.Chang等，Anal.Chim.Acta.，910(2016)12-24.

NPL 3：G.P.Smith，Filamentous fusion phage：novel expression vectorsthat display cloned antigens on the virion surface，Science，228(1985)1315–1317.

NPL 4：R.Monjezi等，J.Virol.Methods，187(2013)121-126.

NPL 5：J.Lei等，Anal.Chem.，86(2014)10841-10846.

发明内容

技术问题

尽管如此，PD-IPCR仍然存在某些问题。由于对暴露的工程化的外壳蛋白的数量进行严格控制是很困难的，DNA-蛋白质连接的异质性并没有完全解决。此外，由于这些病毒噬菌体是基因工程病毒，因此必须在严格的法律法规下进行实验，这可能会成为一些实际应用的障碍。因此，构建一种新型IPCR系统非常重要，该系统1)基于严格同源的DNA抗体缀合，2)非病毒性，3)没有有机合成知识的生物学家也易于进行。

为了解决这个问题，经过深入研究，我们发明了一种使用“cDNA展示”的新型IPCR方法作为满足上述要求的系统。cDNA展示分子是cDNA及其编码多肽的单分子缀合物(图2A)，它是由mRNA通过与嘌呤霉素DNA接头连续连接、体外翻译和逆转录而生化合成的(图3)。与噬菌体展示相比，cDNA展示在文库大小(10¹³/mL)方面具有优势，并且在诸如有机溶剂、强酸/碱、热等恶劣条件下也是稳定的。此外，由于缀合机制，DNA-肽的比例始终为1:1。到目前为止，我们和其他人已经将cDNA展示应用于对蛋白质、RNA、脂质膜和小分子具有亲和力的肽的体外选择。

在PD-IPCR的刺激下，我们设想cDNA展示分子也可以被视为用于IPCR的抗体-DNA缀合物，并实现了如下所述的想法。新开发的方法，我们称为cDNA展示介导的免疫PCR(cD-IPCR，图2B)，已成功应用于检测血清中掺入的模型靶蛋白(GFP)。尽管也报道了一些其他单分子水平的蛋白质-DNA缀合系统，如核糖体展示和mRNA展示，但这些复合物在生理条件下(如在血清中)并不稳定。因此，我们相信cD-IPCR利用了cDNA展示的稳定性。

解决问题的方法

在上述情况下，本发明的发明人完成了本发明。即，本发明的一个方面是通过使用cDNA展示的改进的免疫PCR方法，其包括以下步骤：将具有结合位点的第一抗体固定在固相上：将样品液与所述抗体接触以结合所述样品液中的靶分子；将所述靶分子与由以下组成的cDNA展示接触：1)包括待扩增的DNA序列的主链核酸链，和2)具有多肽缀合位点的共价结合侧链，所述多肽缀合位点缀合有结合所述靶分子的第二抗体该；并进行聚合酶链反应以定量检测所述cDNA。

在这里，第一抗体不利用任何东西或利用诸如小分子、蛋白质、肽或人造聚合物等某种东西与固相结合。它优选通过生物素-链霉亲和素相互作用与固相结合。

所述第一抗体为选自由靶分子中所含的IgG、单域抗体、其片段和与靶分子表位结合的适体组成的组中的任一种。所述第二抗体是由具有与靶分子结合能力的单一多肽组成的蛋白质。即，第二抗体是选自由IgG的单链可变片段、单域抗体和与第一抗体不同的靶分子表位结合的肽适体组成的组中的任一种。

所述主链包含结合靶分子的第二抗体的DNA序列。所述多肽缀合位点由嘌呤霉素或其衍生物组成。所述PCR优选为定量PCR。

本发明的有益效果

根据本发明的改进的免疫-PCR方法，样品液中的靶分子被定量检测和测量，因为它使用由一种蛋白质/肽和一种DNA组成的cDNA展示。此外，根据本发明的方法，可以通过使用cDNA展示技术来选择针对给定靶分子的合适的第二抗体；然后将鉴定的第二抗体用于cD-IPCR，而无需费力优化。

附图说明

图1显示了cDNA展示介导的免疫-PCR(cD-IPCR)的示意图。图1(A)至(C)显示了先前开发的免疫PCR格式。图1(A)是使用链霉亲和素的免疫PCR原始通用系统。图1(B)显示了化学交联的抗体-DNA缀合物。图1(C)显示了噬菌体展示介导的免疫PCR(PD-IPCR)。“Ag”表示抗原。

图2是cDNA展示、检测方法、灵敏度和使用cDNA展示的检测的示意图。图2(A)显示了cDNA展示的示意结构，它是通过嘌呤霉素接头缀合的共价肽-DNA复合物。在核糖体翻译反应过程中，嘌呤霉素接头在其C端与新生肽形成酰胺键。在本研究中，使用光交联基(3-氰基乙烯基咔唑，以下称为“cnvK”)将mRNA与cDNA杂交。放大图显示了嘌呤霉素接头部分的详细化学结构。

图2(B)为cD-IPCR(夹心型检测)示意图。使用捕获(或第一)抗体在固相(珠或板)上捕获生物样品中的靶标蛋白质。洗涤后，加入对靶标具有亲和力的多肽的cDNA展示。洗涤未反应的展示分子，并通过qPCR对产生的cDNA进行定量。在这里，cDNA展示既可以用作靶标的抗体，也可以用作PCR定量的DNA标记，这是本研究的重点。

图3示意性地显示了cDNA展示的制备。实例中描述了每个步骤的详细方案。

图4显示了cDNA展示分子qPCR的灵敏度和线性图(图4A)，以及使用cD-IPCR检测IgG的结果(图4B)。在图4A中，呈递BDA(一种与IgG结合的肽)的cDNA展示分子在PCR管中被连续稀释，并使用适当的引物组进行qPCR。计算样品和对照(无模板)之间的阈值循环差异(ΔCt)。数据显示为平均值±S.D.(n＝3)。在图4B中，固定在固相上的IgG被连续稀释并与呈递BDA的cDNA展示反应。使用合适的引物组进行qPCR。ΔCt计算为样品和对照(无靶标)之间的差异。

图5显示在GFP-VHH模型中的cD-IPCR，和用cD-IPCR方法检测GFP的示意图。图5(A)至(D)均显示cD-IPCR的示意图。抗GFP IgG用作第一抗体，呈递抗GFP VHH的cDNA展示用作检测剂。图5(E)是在缓冲液中检测GFP的曲线图，图5(F)显示在血清中掺杂的。ΔCt计算为样品和对照(无靶标)之间的差异。

图6显示了封闭剂的比较。每种封闭剂都用于IgG固定化磁珠(MagnosphereMS300//链霉亲和素)，BDA的cDNA展示与磁珠一起温育。通过qPCR评估收集的DNA。ΔCt计算为样品和无靶标的对照之间的差异。用脱脂乳(SM)和BSA观察到定量扩增。使用明胶(来自冷水鱼)和对照(不含任何封闭剂)，获得的数据与浓度无关。

图7A是BDA全长构建体。

图7B是抗GFP VHH全长构建体。

图8是使用凝胶电泳确认BDA的cDNA展示形成。

图9是使用凝胶电泳确认编码抗GFP VHH的cDNA展示形成。

图10是直接cD-IPCR的概念验证实验。BDA的cDNA展示与固定在链霉亲和素珠(Dynabeads MyOne链霉亲和素C1链霉亲和素)上的不同量的其靶蛋白(IgG)一起温育。进行qPCR并确定Ct值。图10A：封闭剂的比较(从左到右：脱脂乳、来自酵母的tRNA、脱脂乳和tRNA的混合物、BSA和无封闭剂)。计算针对无模板(仅引物)对照的ΔCt，数据显示为平均值±S.D.(n＝3)图10B：直接cD-IPCR格式的IgG定量。脱脂乳(5％,w/v)用作封闭剂。计算针对无IgG对照的ΔCt，数据显示为平均值±S.D.(n＝3)。**表示p<0.01(对于0ng/mL，t检验)。对于每隔一对柱，确认了统计显著性(p<0.001)。有关详细方案，参见实例。

具体实施方式

下面，通过附图对本发明进行详细说明。

1.DNA的构建

首先，我们制备了包含A蛋白的B结构域的编码序列的DNA构建体(全长BDA，图7A)。全长BDA由编码BDA的序列(BDA基因)、T7启动子、翻译促进序列(W)、间隔区、组氨酸标签(His标签)以及与嘌呤霉素接头的一部分具有互补链的序列组成。其中，由T7启动子序列和翻译促进序列组成的DNA片段被添加到BDA基因的5'上游。在BDA基因的3'下游添加组氨酸标签(His标签)和与嘌呤霉素接头的一部分具有互补链的序列。

全长BDA是通过标准分子生物学技术使用PCR合成的，然后使用常规方法进行纯化。然后，根据试剂盒附带的方案，使用T7 RiboMAX Express大规模RNA生产系统(Promega,Inc.)将它们转录为RNA，以获得约5至30pmol/μL的mRNA(SEQ ID No.1)。

如下制备抗GFP VHH构建体(Fig.7B)：首先，编码抗GFP VHH的基因(LaG-16，在P.C.Fridy等，Nat.Methods 11(2014)1253-1260.中)，由GenScript化学合成，将其通过PCR扩增(25个循环，50μL规模)，使用第一Fw VHH和第一Rv VHH作为引物(对于引物序列，SEQID No.8&9，见表2)。然后使用上述DNA作为模板和T7Ω和cnvK-NewY标签作为引物(SEQ IDNo.7&6，见表2)进行第二次PCR以连接5'-UTR(25个循环，50μL规模)。产物通过制备型PAGE(4％，变性条件)纯化。

本发明中使用的嘌呤霉素接头(有时称为“cnvK接头”)的合成如下所述制备。修饰的寡核苷酸Puro-F-S2和生物素-rG-cnvK片段可以订购给DNA合成公司(例如，TsukubaOligo Service)。Puro-F-S2片段代表5’-(S)-TC-(F)-CTC-(间隔子18)-(间隔子18)-CC-(Puro)-3’，其中S是5'-硫醇修饰剂C6，F是荧光素-dT，Puro是嘌呤霉素CPG，间隔子18是间隔子亚磷酰胺18。生物素-rG-cnvK片段，它代表5’-(B)-AA-(rG)-AATTTCCA-(K)-GCCGCCCCCCG-(T)-CCT-3’，其中B是5'-生物素TEG，K是cnvK，T是氨基修饰剂C6 dT。Puro-F-S2片段和生物素-rG-cnvK片段通过N-(6-马来酰亚胺己酰氧基)琥珀酰亚胺(EMCS，Dojindolaboratories，Kumamoto，日本)的交联反应是根据先前报告描述的方法进行(Yamaguchi等，Nucleic Acids Res.37(2009)e108；Mochizuki等ACS Comb.Sci.13(2011)478-485)。

预定量的Puro-F-S2片段在预定时间和温度下通过预定浓度的二硫苏糖醇在预定浓度的磷酸氢二钠中还原，然后在即将使用前在NAP-5柱(GE Health care，Waukeshu，WIUSA)上脱盐。例如，30nmol Puro-F-S2片段在室温下用50mM二硫苏糖醇在1M磷酸氢二钠中还原1小时。然后，将还原的片段脱盐，例如通过在即将使用前使用NAP-5柱(GE Healthcare，Waukeshu，WI USA)脱盐。

将预定体积的生物素-rG-cnvK片段和EMCS在预定体积的磷酸钠缓冲液中混合。例如，将总共约5至15nmol的生物素-rG-cnvK片段和约1至3mmol的EMCS在约50至150μL的约0.1至0.3M的磷酸钠缓冲液(pH约7.0至7.5)中混合。

随后将混合物温育预定的时间和温度，并通过乙醇沉淀去除过量的EMCS。例如，随后将混合物在37℃温育30分钟，并通过使用诸如Quick-Precip Plus溶液(EdgeBioSystems，Gaithersburg，MD USA)等共沉淀剂的乙醇沉淀来去除过量的EMCS。将还原的Puro-F-S2片段立即加入到沉淀物中，并在低温和预定时间段内温育，例如4℃过夜。

为了终止反应，在样品中加入预定浓度的二硫苏糖醇(DTT)，并温育预定时间和温度。例如，DTT的终浓度约为40至60mM，温育时间和温度为20至40分钟在35至40℃左右。为了去除未反应的Puro-P-S2片段，可以使用上述共沉淀剂进行乙醇沉淀。将沉淀物用无核酸酶的水溶解并在预定条件下通过使用C18 HPLC柱进行纯化。参见表1。

(表1)

收集在UV监测中形成最后一个峰的级分，它对应于在510至530nm附近发射的单个荧光峰，以获得cnvK-Pu-接头。干燥级分后，将cnvK-Pu-接头重新悬浮在无核酸酶的水中。对于每个DNA构建体(及其转录的mRNA)，通过含有8M尿素的变性PAGE检查纯度和大小。

2.cDNA展示的制备

BDA(SEQ ID NO.1，图7A)和抗GFP VHH(SEQ ID NO.12，图7B)的DNA构建体根据稍加修改的常规方法转化为cDNA展示(图2)。然后通过尿素SDS-PAGE(图8和9)证实cDNA展示的形成，这是此类蛋白质-DNA缀合物的标准方法。

3.溶液中cDNA展示的qPCR定量

首先，需要确认cDNA展示分子是否真的可以通过实时PCR(以下简称“qPCR”)进行定量，以及它们的检测灵敏度。编码BDA的cDNA展示分子用超纯蒸馏水(UPDW)每10倍(约10³-10⁹个拷贝/约2μL)和约3.3倍(约10¹-10³个拷贝/约2μL)稀释。然后将约2μL的这些溶液用作qPCR的DNA模板。例如，qPCR是通过THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(Toyobo，日本)使用StepOne实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific，USA)进行的。

PCR混合物包含，例如，约1×THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix，约250至350nM浓度的每个引物(正向引物：BDA_qPCR(+)，反向引物：BDA_qPCR(-)，(参见表2，SEQ ID NO.3和4)，约0.2至0.6μL的约40至60×ROX参比染料，约1至约3μL cDNA展示稀释物和UPDW，其最终体积约15至25μL。PCR的步骤程序如下：约94至约96℃持续约0.5至1.5分钟，然后在约94至约96℃持续约10至20秒进行约35至45个循环，和约60至65℃持续约25至约35秒。

包含除DNA模板外的所有qPCR试剂的阴性对照以验证扩增质量，并计算样本与对照之间的Ct值差异。LOD，即检测限，确定为可检测模板分子的最低数目，并采用t检验进行分析。

4.IgG的直接cD-IPCR检测

在直接cD-IPCR中，将IgG固定化磁珠(Dynabeads MyOne链霉亲和素C1，如实施例中所述制备)与完整磁珠以10倍连续稀释混合。试管中IgG的最终浓度设定为例如约1.6至约1600ng/mL和0ng/mL。在适当的缓冲液中用预定的封闭剂封闭珠；例如，约5％(w/v)的脱脂乳，其分散在约1×SA结合缓冲液中(约40至60μL，约8至15mM Tris-HCl，pH约7.2至7.6，包括约0.5至1.5mM EDTA、约0.5至1.5M NaCl、约0.05至约0.15％(v/v)吐温20)。

封闭后，用结合缓冲液将珠洗涤预定次数；例如，用约50至150μL的约1×SA结合缓冲液洗涤两次。然后，它们与通过使用约10至30μL的约5倍稀释的编码BDA的cDNA展示与约1×SA结合缓冲液在约23至27℃反应约50至70分钟。在缓冲液中，显示的cDNA量至多约为70至90fmol/样品)。

洗涤珠后，结合的cDNA展示用适当的缓冲液洗脱，所述缓冲液例如，约50至约150μL的SDS/DTT缓冲液，其中包括约0.5至1.5％(v/v)SDS，约25至75mM DTT、约25至75mM Tris-HCl、约0.4至0.6M NaCl、约0.5至1.5mM EDTA、约0.04至0.06％(v/v)的吐温20，pH约7.2至7.6，约40至60℃持续约25至35分钟。DNA纯化后，样品以qPCR为模板进行。qPCR条件与上述相同。计算样品与无抗原阴性对照(0ng/mL IgG)之间的Ct值差异。

5.缓冲液中GFP的夹心cD-IPCR检测

聚苯乙烯微量滴定板，例如，MICROLON(商标)，96孔单断条板，PS，Greiner)，在大约4℃用预定的抗体包被过夜，所述抗体如用PBS稀释约1000倍的抗GFP pAb(MBL，#598)，其包含约5至15mM磷酸钠缓冲液，其中含有约130至145mM NaCl和约2.5至3.0mM KCl，pH值约为7.2至7.6，约100μL。

用PBS洗涤板后，通过在约22至27℃温育约1至3小时用封闭剂封闭，所述封闭剂例如含有约0.5至1.5％(w/v)脱脂乳的PBS，然后用PBS洗掉(例如150至250μL左右，2至4次)。将约100μg/mL到约1ng/mL的PBS中GFP的每10倍连续稀释以及阴性对照(无GFP)在约22至27℃施加到孔中约1至3小时，然后用PBS(约150至250μL，6至10次)洗掉。

编码抗GFP VHH的cDNA展示用如上所述的PBS-T稀释预定倍数，例如60至70倍。它对应于高达约1.5fmol/样品的那些，然后在约22至27℃温育约1至3小时。如上所述用PBS-T洗涤后，通过使用例如甘氨酸/HCl缓冲液(约0.1至0.3M，pH约2.0至2.4，约100μL)洗脱结合的cDNA展示。

洗脱液用约0.5至1.5M Tris碱溶液中和，并使用例如Favorprep试剂盒纯化cDNA展示，用作qPCR的DNA模板。作为qPCR，可以使用与上述相同的试剂盒，并且可以按照与上述相同的方式进行实验。PCR程序可以被修改，例如，约94至96℃持续0.5至1.5分钟，然后约94至96℃持续约10至20秒进行约30至50个循环，和约64至68℃持续25到35秒。还包括仅引物对照以验证扩增质量。计算样品与不含GFP的阴性对照之间的Ct值差异。

6.血清中GFP的夹心cD-IPCR检测

血清中GFP的夹心cD-IPCR检测程序与上述类似，不同之处在于将GFP溶解在市售的健康人血清(Kohjin Bio，日本)而不是PBS中，并用于反应。

在本研究中，使用Thunderbird SYBR qPCR mix(Toyobo)试剂和适当的引物，使用系统(StepOne，ThermoFisher)进行qPCR。参见下表1。

(表2)

*1：表1中，“cnvK”表示3-氰基乙烯基咔唑。

*2：“Fw”表示正向。

*3：“Rv”表示反向。

用附带的软件分析扩增数据曲线(相对荧光单位)，将Ct值定义为荧光信号越过阈值所需的循环数。

如图4A所示，ΔCt(Ct值相对于无模板对照的差异)与10³至10⁹个拷贝范围内的cDNA展示分子的数量呈线性相关，并且标准偏差非常低。在较低浓度下，虽然没有保持线性，但对于含有低至100个分子的样品，观察到具有统计学意义的ΔCt。低检测限(LOD)和宽检测范围(从10²至10⁹)都是IPCR的独特优势。

然后我们转向直接固定在固相上的靶标蛋白的cD-IPCR检测(即直接cD-IPCR)。在对封闭剂(图6)和使用的磁珠等几种条件进行优化后，将BDA与IgG的结合用作模型系统(图4B)。

将不同量的兔IgG固定在磁珠上，BDA的cDNA展示分子与磁珠一起温育。洗涤未结合的分子后，BDA-IgG相互作用被Gly-HCl处理破坏，如上所述，洗脱液中的cDNA通过qPCR进行定量。结果表明，直接cD-IPCR可以检测1.6μg/mL至160pg/mL的IgG。

接下来，我们证明了cD-IPCR可以应用于使用单域抗体的夹心型检测方案(图5A-D)。单域抗体(也称为重链抗体的重链可变域；VHH或纳米抗体)因其稳定性、生产成本效益和易于修改而成为治疗和诊断的有前途的试剂。

由于其体积小(大约15kDa)和单链性质，VHH适用于使用噬菌体展示和cDNA展示的定向进化。特别是，像这样的体外选择方法使我们能够筛选出动物无法免疫其毒性的抗原。在这里，我们将编码抗GFP VHH的cDNA展示应用于GFP的cD-IPCR检测(P.C.Fridy等，Nat.Methods.，11(2014)1253-1260.)。首先，通过物理吸附将GFP的多克隆抗体(pAb)固定在ELISA板上，并在板上捕获不同量的稀释在PBS中的GFP。

然后，它与呈递抗GFP VHH的cDNA展示反应。酸性洗脱后，通过qPCR对DNA进行定量。如图5E所示，ΔCt值随着GFP浓度(从10至10⁵ng/mL)逐渐增加，10ng/mL是最低检测浓度。最后，通过检测人血清中掺杂的GFP(最终GFP浓度：1至100ng/mL)来评估基于VHH的cD-IPCR系统的稳健性和潜在的实用性。检测灵敏度与缓冲液基本相同，这表明cD-IPCR可用于生物样品(图5F)。

结论是，我们对称为cD-IPCR的新型基于PCR的抗原检测方法进行了概念验证研究。与ELISA相比，cD-IPCR的信号放大是指数级的，导致具有非常高的灵敏度(约100个分子/样本)和广泛的检测动态范围(>10⁷倍)。与传统的IPCR和PD-IPCR相比，由于cDNA及其编码蛋白的固有一对一缀合比，该方法在定量和重现性方面具有潜在优势。

我们相信这里开发的方法在各种抗原的免疫测定中具有广泛的适用性和实用性。此外，与PD-IPCR一样，新开发的方法可以与从庞大的文库中优化多肽的体外选择相结合。因此，应该可以通过cDNA展示快速筛选给定靶标物质的新结合肽(或单链抗体)，并将已鉴定的结合剂用于cD-IPCR。当然，与其他IPCR一样，检测的灵敏度高度取决于许多因素，包括捕获/检测抗体的亲和力、DNA抗体缀合物的非特异性结合程度以及引物对的选择。

以下实施例解释了本发明的特征之一，但并不限制本发明的范围。

实施例

(实施例1)

(1)材料和通用仪器

通用化学品是最高级别，由Tokyo Chemical Industries(日本)和Wako PureChemical Industries(日本)提供。用于分子生物学实验的化学品购自SIGMA和Wako PureChemical Industries。它们无需进一步纯化即可使用。DNA寡核苷酸由EurofinsGenomics、Tsukuba Oligo Service(日本)和Hokkaido System Science(日本)合成。

PCR使用Biometra TRIO48热循环仪进行。实时定量PCR(qPCR)使用THUNDERBIRDSYBR qPCR Mix(Toyobo，日本)使用StepOne实时PCR系统进行。除非另有说明，在制造商推荐的条件下使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(Takara)进行PCR，并通过FavorPrep PCRClean-Up Mini试剂盒(Favorgen)纯化DNA。引物见上表2。

凝胶图像是用Typhoon FLA9500成像仪(GE Healthcare)拍摄的。除非另有说明，DNA和RNA的PAGE分析在60℃使用含有8M尿素的凝胶进行，0.5x TBE作为运行缓冲液。使用含有8M尿素的Tris-HCl凝胶在室温(r.t.)下进行cDNA展示分子和肽-接头复合物的SDS-PAGE分析。用于测序的DNA样品的制备按照制造商的说明进行。

(2)cnvK-rG接头的合成

cnvK-rG接头由两个修饰的寡核苷酸合成，puro-F-S2片段(5’-STCFCTC-(间隔子18)2-CCP-3’)和生物素-rG-cnvK片段(5’-BA-(rG)-AATTTCCAKGCCGCCCCCCG-(T-NH2)-CCT-3’)，使用我们之前的论文描述的用于cnvK-Pu接头的相同方案(Y.Mochizuki，T.Suzuki，K.Fujimoto和N.Nemoto，J.Biotechnol.，2015，212，174-180.)，其中S是5'-硫醇-修饰剂C6，F是荧光素-dT，P是嘌呤霉素CPG，间隔子18是间隔子亚磷酰胺18，B是5'-生物素-TEG，rG是鸟嘌呤核糖核苷酸，K是cnvK(Y.Yoshimura和K.Fujimoto,Org.Lett.,2008,10,3227-3230)，T-NH₂是氨基修饰剂C6 dT(术语根据Tsukuba Oligo Service)。

(3)DNA构建

根据常规方法制备编码BDA的构建体(图7A)。如下制备抗GFP VHH构建体(图7B)。首先，由GenScript化学合成的编码抗GFP VHH(LaG-16)的基因通过PCR(25个循环，50μL规模)以第一Fw VHH和第一Rv VHH作为引物进行扩增。然后使用上述DNA作为模板并且T7Ω和cnvK-NewYtag作为引物进行第二次PCR以连接5'-UTR(25个循环，50μL规模)。产物通过制备型PAGE(4％，变性条件)纯化。

(4)cDNA展示的制备

根据制造商的说明，使用T7 RiboMAX大规模RNA生产系统(Promega)进行DNA转录，并通过Agencourt RNA Clean XP(Beckman Coulter)纯化mRNA。然后将mRNA(1μM)(1μM)在具有100mM NaCl的25mM Tris-HCl(pH 7.5)中在以下退火条件下杂交与cnvK-rG接头在3'-末端区域杂交：90℃加热1分钟，然后以0.4℃/秒的速度将温度降至70℃，温育1分钟，然后以0.08℃/秒的速度冷却至25℃。

使用CL-1000UV交联剂(UVP,Upland,USA)用365nm的紫外光照射样品30秒。然后将获得的mRNA-接头复合物用兔网织红细胞裂解物系统(Promega，在50μL反应体积中加入6pmol mRNA-接头)在30℃体外翻译20分钟。为了合成mRNA-接头-蛋白质融合(即mRNA展示或IVV)，将KCl和MgCl₂加入混合物(最终浓度分别为900mM和75mM)，并将混合物在37℃温育60分钟。

加入EDTA(最终70mM)和等体积的2×SA结合缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.4，2mMEDTA，2M NaCl，0.2％(v/v)吐温20)后，mRNA展示文库在25℃固定在链霉亲和素(SA)包被的磁珠(Dynabeads MyOne链霉亲和素C1链霉亲和素磁珠，Invitrogen，60μL)上30分钟。用1×SA结合缓冲液(100μL、10mM Tris-HCl、pH 7.4、1mM EDTA、1M NaCl、0.1％(v/v)吐温20)将珠洗涤3次。

然后将固定的文库用ReverTra Ace逆转录酶(Toyobo，日本，200U，50μL反应体积)在42℃逆转录30分钟。用His标签结合缓冲液(100μL，20mM磷酸钠缓冲液，0.5M NaCl，5mM咪唑，pH 7.4)洗涤珠，并向珠加入RNase T1(Thermo Fischer Scientific)(50μL His标签结合缓冲液中的250U)。将混合物在37℃温育30分钟，以从珠中释放mRNA/cDNA-蛋白质融合分子(即cDNA展示)。

收集含有cDNA展示分子的上清液，如下使用His₆肽标签进行纯化以去除污染的cDNA-接头复合物。将上述上清液加入His Mag Sepharose Ni珠(20μL，GE Healthcare)中，25℃温育2小时。用His标签洗涤缓冲液(100μL，20mM磷酸钠缓冲液，0.5M NaCl，20mM咪唑，pH 7.4)洗涤珠，并在His标签洗脱缓冲液(20μL，20mM磷酸钠缓冲液，0.5M NaCl，250mM咪唑，pH 7.4)中在25℃温育15分钟。洗脱的级分在适当稀释后用于免疫测定。

(5)通过SDS-PAGE确认BDA的cDNA展示形成(抗GFP VHH，(图8))

如上所述，从6pmol mRNA-接头复合物制备编码BDA的cDNA展示。取mRNA-接头(泳道1)，输入(＝IVV，泳道2)和SA珠固定的上清液(泳道3)，RNase T1处理的洗脱液(泳道4，即粗cDNA展示)，Ni珠的上清液(泳道5)，最后收集的His标签洗脱液(泳道6，即纯化的cDNA展示)的等分试样并用含8M尿素的SDS-PAGE(4％浓缩胶-6％分离胶，20mA，120分钟)分析。

所有样品对应于0.5pmol的分子，假设每一步都以完美收率进行。凝胶用FITC过滤器组进行荧光可视化(连接到cnvK-rG接头的荧光素的荧光可视化)，计算条带强度以估计cDNA展示形成效率以及最终cDNA展示溶液的绝对浓度。对于最后三个样品，向样品中加入RNase H(Takara，10U)和10×NE缓冲液2(1/10体积，NEB)，并将混合物在37℃温育30分钟，然后上样到凝胶，以消化RNA/cDNA双链体。

图8的条带强度的量化表明cDNA展示形成的总效率(从mRNA接头到His标签洗脱)约为7.7％。

用Ni-NTA珠(上清液在泳道5分析)进一步纯化，产生纯cDNA展示分子(泳道6)。对于泳道4-6，样品在RNase H处理后上样。通过含有8M尿素的SDS-PAGE分析样品，并用凝胶成像仪观察附着在cnvK-rG接头上的荧光素的荧光。条带强度的量化表明cDNA展示形成的总效率(从mRNA接头到His标签洗脱)约为7.7％。

(6)通过SDS-PAGE(抗GFP VHH)确认cDNA展示形成

如上所述，从6pmol mRNA-接头复合物制备抗GFP VHH编码cDNA展示。在cDNA展示形成过程中，收集了以下等分试样：mRNA-接头；输入，即IVV；SA-珠固定的上清液；RNase T1处理的洗脱液，即粗cDNA展示；Ni珠上清液；收集的His标签洗脱液，即纯化的cDNA展示；用Micro Bio-Spin 6柱纯化的最终样品，即缓冲液交换的等分试样。然后，通过含有8M尿素的SDS-PAGE(4％浓缩-6％分离凝胶，20mA，120分钟)对其进行分析。除了Bio-Spin 6洗脱(1.7pmol)之外的所有样品对应于0.5pmol的分子，假设每个步骤都以完美的收率进行。凝胶用FITC滤光片组进行荧光可视化，计算条带强度以估计cDNA展示形成效率。对于最后四个样品，向样品中加入RNase H(Takara，10U)和10×NE缓冲液2(1/10体积，NEB)，并将混合物在37℃温育30分钟，然后上样到凝胶中，以消化RNA/cDNA双链体。

图9中的泳道对应于以下内容。泳道1：mRNA接头。泳道2：IVV。泳道3：磁珠上清液。泳道4：粗cDNA展示。泳道5：Ni珠上清液。泳道6：纯化的cDNA展示分子。泳道7：用Micro Bio-Spin 6柱纯化的最终样品。图9条带强度的量化表明cDNA展示形成的总效率(从mRNA接头到Bio-Spin 6洗脱)约为0.3％。

(实施例2)

(1)cD-IPCR的灵敏度评估(图4A)

用超纯蒸馏水(UPDW)每10倍(10³-10⁹个拷贝/2μL)和3.3倍(10¹-10³个拷贝/2μL)稀释编码BDA的cDNA展示分子，然后2μL这些溶液用作qPCR的DNA模板。使用StepOne实时PCR系统，使用THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(Toyobo，日本)进行qPCR。

PCR混合物包含1×THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix，每个引物浓度为300nM(正向引物：BDA_qPCR(+)，反向引物：BDA_qPCR(-))，0.4μL 50×ROX参考染料，2μL上述cDNA展示稀释物和UPDW，其最终体积为20μL。PCR的步骤程序如下：95℃持续1分钟，然后是95℃持续15秒和62℃持续30秒的40个循环。包含除DNA模板外的所有qPCR试剂的阴性对照以验证扩增质量，并计算样品与对照之间的Ct值差异。如图4A所示，ΔCt(Ct值相对于无模板对照的差异)与10³-10⁹个拷贝范围内的cDNA展示分子的数量呈线性相关，并且标准偏差非常低。在较低浓度下，虽然没有保持线性，但对于含有低至100个分子的样品，观察到具有统计学意义的ΔCt。低检测限(LOD)和宽检测范围(从10²-10⁹)都是IPCR的独特优势。

(2)将IgG固定在磁珠上(图4B、图6、图10)

在反应缓冲液(0.1M Na₂HPO₄、0.1M NaH₂PO₄、0.3M NaCl)中的来自兔血清(Sigma，1.5nmol)的IgG与反应缓冲液中的EZ-Link Sulfo-NHS-SS-生物素(Thermo，30nmol)在25℃反应30分钟，然后将缓冲液更换为1×SA结合缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA，1MNaCl，0.1％(v/v)吐温20)。收集产量由IgG的吸光度测量。

Magnosphere MS300/链霉亲和素(JSR，20μL，在图6的情况下)或Dynabeads MyOne链霉亲和素C1链霉亲和素磁珠(Invitrogen，20μL，在图4B和图10的情况下)用1×SA结合缓冲液(100μL)洗涤，与收集的IgG(60pmol)在25℃反应30分钟，然后用1×SA结合缓冲液(100μL，3次)洗掉。通过从输入中减去流中IgG的吸光度来估计固定反应的收率，约为10％(Magnosphere MS300/链霉亲和素)和40％(Dynabeads MyOne链霉亲和素C1链霉亲和素磁珠)。

(3)与封闭剂的比较(图6和10A)

每种封闭剂都用于如上所述制备的IgG固定磁珠，并将BDA的cDNA展示与珠一起温育。首先，每种封闭剂(5％(w/v)脱脂乳、3％(w/v)BSA、0.02％(w/v)酵母tRNA、1％(w/v)冷水鱼明胶和2.5％/0.01％(w/v)BSA/tRNA混合物)分散在1×SA结合缓冲液(50μL)中，并在25℃与不同浓度的IgG固定珠(10μL)反应60分钟。

封闭珠用1×SA结合缓冲液(100μL，3次)洗涤，然后在25℃与用1×SA结合缓冲液稀释5倍的编码BDA的cDNA展示反应60分钟(20μL，即cDNA展示量不超过0.08pmol)。用1×SA结合缓冲液(100μL)洗涤珠2次，将珠悬液(2μL)直接用作qPCR模板。qPCR条件与上述相同(参见cD-IPCR的灵敏度评估)。

通过qPCR评估收集的DNA。根据结果，我们得出结论，脱脂乳是与Dynabeads MyOne链霉亲和素C1链霉亲和素磁珠结合使用的最佳封闭剂。

(实施例3)

(1)IgG的直接cD-IPCR检测(图4B和10B)

在直接cD-IPCR中，IgG固定的Dynabeads MyOne链霉亲和素C1链霉亲和素磁珠(如上制备)以10倍连续稀释与完整的Dynabeads MyOne链霉亲和素C1链霉亲和素磁珠混合(IgG的最终浓度为0.16至1600ng/mL)。用分散在1×SA结合缓冲液(50μL、10mM Tris-HCl、pH 7.4、1mM EDTA、1M NaCl、0.1％(v/v)吐温20)中的5％(w/v)脱脂乳封闭珠。封闭的珠用1×SA结合缓冲液(100μL)洗涤两次，然后在25℃与用1×SA结合缓冲液稀释5倍的编码BDA的cDNA展示(20μL，即cDNA展示量为约80fmol/样品)反应60分钟。用1×SA结合缓冲液(100μL)洗涤珠两次后，结合的cDNA展示用SDS/DTT缓冲液(100μL，1％(v/v)SDS，50mM DTT，50mMTris-HCl，0.5M NaCl、1mM EDTA、0.05％(v./v)吐温20，pH 7.4)在50℃洗脱30分钟。DNA纯化后(用30μL水从离心柱中洗脱)，将样品用于qPCR作为模板(8μL)。qPCR条件与上述相同(参见cD-IPCR的灵敏度评估)。计算样品与无抗原阴性对照(0ng/mL IgG)之间的Ct值差。

检测结果如图4B和10B所示。表明直接cD-IPCR可以检测1.6μg/mL至1.6ng/mL的IgG。

(2)缓冲液中GFP的夹心cD-IPCR检测(图4B)

聚苯乙烯微量滴定板(MICROLON，96孔单断条板，PS，Greiner)在4℃用PBS(10mM磷酸钠缓冲液，含137mM NaCl和2.68mM KCl，pH 7.4，100μL)稀释1000倍的抗GFP pAb(MBL，#598)包被过夜。用PBS(200μL)洗涤后，用含1％(w/v)脱脂乳的PBS在25℃温育2小时以封闭板，然后用PBS(200μL，3次)冲洗。将100μg/mL至1ng/mL的PBS中GFP的每10倍连续稀释液在25℃施用于孔2小时，然后用PBS(200μL，8次)冲洗。

编码抗GFP VHH的cDNA展示，用PBS-T(10mM磷酸钠缓冲液，含有137mM NaCl和2.68mM KCl，0.05％(v/v)吐温20，pH 7.4，100μL)稀释65倍，然后在25℃温育2小时。用PBS-T(200μL，8次)洗涤后，结合的cDNA展示用甘氨酸/HCl缓冲液(0.2M，pH 2.2，100μL)洗脱。洗脱液用1M Tris碱溶液中和，cDNA展示用Favorprep试剂盒纯化，用作qPCR的DNA模板。使用StepOne实时PCR系统用THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(Toyobo，日本)进行qPCR。

PCR混合物包含1×THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix、300nM浓度的每个引物(正向引物：GFPVHHqPCRFw，反向引物：GFPVHHqPCRRv)、0.4μL 50×ROX参考染料、2μL纯化的洗脱cDNA展示和UPDW，其最终体积为20μL。PCR的步骤程序如下：95℃持续1分钟，然后95℃持续15秒和66℃持续30秒的40个循环。包含除DNA模板之外的所有qPCR试剂的阴性对照用于验证扩增质量。

图5(E)显示了使用cD-IPCR方法检测缓冲液中的GFP(**p<0.01；***p<0.001，相对于0ng/mL，学生t检验)。数据显示为平均值±S.D.(n＝3)。ΔCt值随着GFP浓度的增加(从10至10⁵ng/mL)逐渐增加，10ng/mL是检测到的最低浓度。

(3)血清中GFP的夹心cD-IPCR检测(图5F)

血清中GFP的夹心cD-IPCR检测程序与“缓冲液中GFP的夹心cD-IPCR检测”类似，不同之处在于将抗GFP pAb溶解在市售的健康人血清(Kohjin Bio，日本)中来代替PBS，并用于反应。

图5(F)显示了用cD-IPCR检测掺杂在血清中的GFP的结果(*p<0.05；***p<0.001，相对于0ng/mL，学生t检验)。数据显示为平均值±S.D.(n＝3)。检测灵敏度与缓冲液基本相同，这表明cD-IPCR可用于生物样品。

与ELISA相比，cD-IPCR的信号放大是指数级的，导致具有非常高的灵敏度(约100个分子/样本)和宽的检测动态范围(>10⁷倍)。与传统的IPCR和PD-IPCR相比，该方法由于cDNA与其编码蛋白的固有一对一缀合比例，在定量和重现性方面具有潜在优势。因此，这里开发的方法在多种抗原的免疫测定中具有广泛的适用性和实用性。

此外，与PD-IPCR一样，新开发的方法可以与从庞大的文库中优化多肽的体外选择相结合。当然，与其他IPCR一样，检测的灵敏度很大程度上取决于许多因素，包括捕获/检测抗体的亲和力、DNA抗体缀合物的非特异性结合程度以及引物对的选择。

总之，我们建立了一种新的基于PCR的抗原检测方法，称为cD-IPCR。cD-IPCR，利用cDNA展示(一种为多肽体外进化而开发的肽-cDNA缀合物)的结构特点，被证明可用于靶蛋白的直接型和夹心型检测，并且检测血清中的靶标也是可能的。与ELISA相比，cD-IPCR的信号放大是指数级的，导致具有很高的潜在灵敏度(约100个分子/样本)和宽的检测动态范围(>10⁷倍)。经过大量优化，该方法与传统的IPCR和PD-IPCR相比，由于cDNA与其编码蛋白固有的一对一缀合比，在定量和重现性方面可能具有优势。

工业适用性

本发明可用于医疗、制药和诊断领域。

序列表

<110> 爱普思隆分子进化工程株式会社

<120> 一种使用cDNA展示的新型免疫PCR方法

<130> P20EM001PCT

<150> JP2019-030509

<151> 2018-02-22

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 367

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 包括全长BDA的cDNA展示分子

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(367)

<400> 1

gatcccgcga aattaatacg actcactata ggggaagtat ttttacaaca attaccaaca 60

acaacaacaa acaacaacaa cattacattt tacattctac aactacaagc caccatggat 120

aacaaattca acaaagaaca acaaaatgct ttctatgaaa tcttacattt acctaactta 180

aacgaagaac aacgcaatgg tttcatccaa agcctaaaag atgacccaag ccaaagcgct 240

aaccttttag cagaagctaa aaagctaaat gatgctcaag caccaaaagc tgacaacaaa 300

ttcaacgggg gaggcagcca tcatcatcat catcacggcg gaagcaggac ggggggcggc 360

gtggaaa 367

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 生物素-聚A-肌苷 cnvK 片段(生物素 -聚 A-肌苷 cnvK

片段)

<220>

<221> misc_特征

<223> y是肌苷, k是氰基乙烯基咔唑，M是

氨基改性剂C6 dT

<400> 2

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa yttccakgcc gccccccgmc t 41

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> BDA_pPCR(+)

<220>

<221> 引物_结合

<222> (1)..(21)

<400> 3

ctacaagcca ccatggataa c 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> BDA_pPCR(-)

<220>

<221> 引物_结合

<222> (1)..(20)

<400> 4

gcttgggtca tcttttaggc 20

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Newleft

<220>

<221> 引物_结合

<222> (1)..(33)

<400> 5

gatcccgcga aattaatacg actcactata ggg 33

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> cnvK-NewYtag

<220>

<221> 引物_结合

<222> (1)..(22)

<400> 6

tttccacgcc gccccccgtc ct 22

<210> 7

<211> 117

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> T7 Omega

<220>

<221> 外显子

<222> (1)..(117)

<400> 7

gat ccc gcg aaa tta ata cga ctc act ata ggg gaa gta ttt tta caa 48

Asp Pro Ala Lys Leu Ile Arg Leu Thr Ile Gly Glu Val Phe Leu Gln

1 5 10 15

caa tta cca aca aca aca aca aac aac aac aac att aca ttt tac att 96

Gln Leu Pro Thr Thr Thr Thr Asn Asn Asn Asn Ile Thr Phe Tyr Ile

20 25 30

cta caa cta caa gcc acc atg 117

Leu Gln Leu Gln Ala Thr Met

35

<210> 8

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1st Fw VHH

<220>

<221> 引物_结合

<222> (1)..(47)

<400> 8

cattttacat tctacaacta caagccacca tggcccaggt gcagctg 47

<210> 9

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 1st Rv VHH

<220>

<221> 引物_结合

<222> (1)..(54)

<400> 9

tttccacgcc gccccccgtc ctgcttccgc catgatgatg atgatgatgg gaac 54

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GFP VHH qPCR FW

<220>

<221> 引物_结合

<222> (1)..(20)

<400> 10

aacaccatcc tgggcgatag 20

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GFP VHH qPCR Rv

<220>

<221> 引物_结合

<222> (1)..(13)

<400> 11

gtgtttttgg cgcgatcac 19

<210> 12

<211> 571

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 包括全长抗-GFP VHH的cDNA展示分子

<220>

<221> misc_特征

<222> (1)..(571)

<400> 12

gatcccgcga aattaatacg actcactata ggggaagtat ttttacaaca attaccaaca 60

acaacaacaa acaacaacaa cattacattt tacattctac aactacaagc caccatggcc 120

caggtgcagc tggttgaaag cggtggccgt ctggtgcagg cgggtgatag cctgcgtctg 180

agctgtgccg caagcggtcg cacctttagc accagcgcca tggcatggtt tcgtcaggcc 240

ccgggccgtg aacgcgaatt tgtggcggcc attacctgga ccgttggtaa caccatcctg 300

ggcgatagcg tgaaaggtcg ttttaccatt agccgtgatc gcgccaaaaa caccgtggat 360

ctgcagatgg ataatctgga accggaagat accgcggttt attattgtag cgcccgtagc 420

cgcggttatg tgctgagcgt tctgcgcagc gttgatagct atgattattg gggtcagggc 480

acccaggtta cggtcagcgg cggcggctcg ggcggcggtt cccatcatca tcatcatcat 540

ggcggaagca ggacgggggg cggcgtggaa a 571

Claims

1.使用cDNA展示的改进的免疫PCR方法，其包括以下步骤：

将具有结合位点的第一抗体固定到固相上：

使样品液与所述第一抗体接触以结合所述样品液中的靶分子；

将所述靶分子与由以下组成的cDNA展示接触：1)包含待扩增DNA序列的主链核酸链和2)具有多肽缀合位点的共价结合侧链，所述多肽缀合位点缀合有结合所述靶分子的第二抗体；和

进行聚合酶链反应以对所述DNA进行定量扩增和检测。

2.如权利要求1所述的使用cDNA展示的改进的免疫PCR方法，其中，所述第一抗体直接结合到固相上。

3.如权利要求1所述的使用cDNA的改进的免疫PCR方法，其中，所述第一抗体通过生物素-链霉亲和素相互作用结合到固相上。

4.如权利要求3中任一项所述的使用cDNA的改进的免疫PCR方法，其中，所述第一抗体是选自由IgG、其片段、单域抗体和与靶分子的表位结合的适体组成的组中的任一种。

5.如权利要求4中任一项所述的使用cDNA的改进的免疫PCR方法，其中，所述第二抗体是由具有与靶分子结合能力的单一多肽组成的蛋白质。

6.如权利要求5中任一项所述的使用cDNA的改进的免疫PCR方法，其中，所述第二抗体是选自由IgG的单链可变片段、单域抗体和与不同于第一抗体的靶分子表位结合的肽适体组成的组中的任一种。

7.如权利要求1中任一项所述的使用cDNA的改进的免疫PCR方法，其中，所述主链包含与靶分子结合的第二抗体的DNA序列。

8.如权利要求1中任一项所述的使用cDNA的改进的免疫PCR方法，其中，所述多肽缀合位点由选自由嘌呤霉素及其衍生物组成的组中的任一种化合物组成。

9.如权利要求1中任一项所述的使用cDNA的改进的免疫PCR方法，其中，所述PCR是定量PCR。