JP2002536025A - Ｒｎａ−タンパク質融合体を用いたタンパク質の選別 - Google Patents

Ｒｎａ−タンパク質融合体を用いたタンパク質の選別

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Abstract

(57)【要約】 高濃度塩における翻訳後インキュベーション段階を含むRNA-タンパク質融合体作製法を本明細書に記載する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 本出願は同時係属中出願である、ゾスタック（Szostak）らにより1997年11月6
日に出願され現在は放棄された米国特許出願第60/064,491号、および1997年1月2
1日に出願され現在は放棄された米国特許出願第60/035,963号である仮出願から
もたらされる恩典を主張する、ゾスタック（Szostak）らにより1998年1月14日に
出願された米国特許出願第09/007,005号の一部継続出願である。
【０００２】 本発明は、蛋白質を選抜する方法に関する。
【０００３】 本発明は、助成金F32GM17776-01とF32GM17776-02による政府の支援を受けて行
われた。政府は、本発明について一定の権利を有する。
【０００４】 RNA分子およびDNA分子を、その機能に基づいて単離するための方法が現在存在
する。例えば、エリントンとスゾスタック（Ellington and Szostak）（Nature
346:818 (1990); およびNature 355:850 (1992)）、およびツアークとゴールド
（Tuerk and Gold）（Science 249:505 (1990); およびJ. Mol. Biol. 222:739
(1991)）の実験によって、選抜と増幅を何回も繰り返すことで、雑多な分子のプ
ールから所期の性質をもつ非常に稀少な（1013個の中に1個よりも少ない）核酸
分子を単離することができることが示された。これらの方法は、（i）非常に大
きな候補プールをスクリーニングすることができ（>1015）、（ii）宿主の生存
力とインビボの条件とは無関係で、また、（iii）インビボでの遺伝学的なスク
リーンがなくても選抜を行うことができるという点で、従来の遺伝学的選抜より
も優れている。インビボ選抜の威力は、新規のRNAおよびDNAの配列で、特異的な
蛋白質結合機能をもつもの（例えば、Tuerk and Gold, Science 249:505 (1990)
; Irvine et al., J. Mol. Biol. 222:739 (1991); Oliphant et al., Mol. Cel
l. Biol. 9:2944 (1989); Blackwell et al., Science 250:1104 (1990); Pollo
ck and Treisman, Nuc. Acids Res. 18:6197 (1990); Thiesen and Bach, Nuc.
Acids Res. 18:3203 (1990); Bartel et al., Cell 57:529 (1991); Storino an
d Yoshida, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5699 (1991); およびBock et al.,
Nature 355:564 (1992)）、低分子結合機能をもつもの（Ellington and Szosta
k, Nature 346:818 (1990); Ellington and Szostak, Nature 355:850 (1992)）
、および触媒機能をもつもの（Green et al., Nature 347:406 (1990); Roberts
on and Joyce, Nature 344:467 (1990); Beaudry and Joyce, Science 257:635
(1992); Bartel and Szostak, Science 261:1411 (1993); Lorsch and Szostak,
Nature 371:31-36 (1994); Cuenoud and Szostak, Nature 375:611-614 (1995)
; Chapman and Szostak, Chemistry and Biology 2:325-333 (1995); およびLoh
se and Szostak, Nature 381:442-444 (1996)）を定義するときに示されてきた
。蛋白質の選抜と増幅についても同様のやり方が示されている。
【０００５】発明の概要 本発明の目的は、インビトロ選抜とインビトロ展開の原理を蛋白質に応用でき
る様にすることである。本発明は、部分的に、または完全に無作為なアミノ酸配
列の大きなプールから所期の特質をもった蛋白質を単離することを容易にする。
さらに、本発明は、mRNAのコード配列を蛋白質分子に共有的に結合させることに
よって、蛋白質の配列情報を回収し増幅するという問題を解決する。 一般的に、本発明の方法は、自身のmRNAの3'末端に共有的に結合された蛋白質
、すなわち、RNA-蛋白質融合体を作出する、インビトロまたはインサイチューの
転写/翻訳プロトコールからなる。これは、その3'末端にペプチド受容体を付着
させたmRNA分子を合成し、インビトロまたはインサイチューで翻訳することによ
って行われる。一つの好ましいペプチド受容体は、伸長しているペプチド鎖のC
末に付加されると翻訳を終了させるヌクレオシド類似化合物のピューロマイシン
である。好ましいデザインの一つにおいて、メッセージの末端とペプチド受容体
との間に、オープンリーディングフレームの末端でリボソームが停止するように
設計されたDNA配列を含ませ、これによって、ペプチド受容体（例えば、ピュー
ロマイシン）が、ペプチジルtRNA結合が加水分解される前に、生成中のペプチド
鎖を受容するための時間を延ばす。
【０００６】 この蛋白質の配列情報は、逆転写と増幅（例えば、PCR増幅、および3SRもしく
はTSAなどのRNAによる増幅技術など、その他の増幅技術）によって回収すること
ができるので、望ましいならば、この結果できたRNA-蛋白質融合体で、選抜と増
幅を繰り返し行うことができる。そして、増幅された核酸を転写、修飾させ、イ
ンビトロまたはインサイチューで翻訳させて、次回の選抜のためのmRNA-蛋白質
融合体を作出することができる。何回も選抜と増幅を行うことができるために、
例えば、101５個からなるプールの中の1個の所期の分子というように、非常に稀
少な分子を増やして単離することが可能になる。これによって、次に、実質的に
何らかの標的を特異的に認識するか、または所期の化学反応を触媒する新規また
は改良された蛋白質の単離が可能になる。
【０００７】 したがって、第一の局面において、本発明は、所期の蛋白質を選抜するための
方法で、（a）それぞれが、候補蛋白質のコード配列に機能的に結合された翻訳
開始配列と開始コドンとを含み、またそれぞれが、候補蛋白質のコード配列の3'
末端でペプチド受容体に機能的に結合されている、候補となるRNA分子の集団を
提供する段階、（b）候補となるRNA-蛋白質融合体の集団を産生するために、候
補となる蛋白質のコード配列を、インビトロまたはインサイチューで翻訳する段
階、および（c）所期のRNA-蛋白質融合体を選抜し、それによって所期の蛋白質
を選抜する段階を含む方法を特徴とする。
【０００８】 関連する局面において、本発明は、所期の蛋白質をコードするDNA分子を選抜
するための方法で、（a）それぞれが、候補蛋白質のコード配列に機能的に結合
された翻訳開始配列と開始コドンとを含み、またそれぞれが、候補蛋白質のコー
ド配列の3'末端でペプチド受容体に機能的に結合されている、候補となるRNA分
子の集団を提供する段階、（b）候補となるRNA-蛋白質融合体の集団を産生する
ために、候補となる蛋白質のコード配列を、インビトロまたはインサイチューで
翻訳する段階、（c）所期のRNA-蛋白質融合体を選抜する段階、および（d）融合
体のRNA部分から、所期の蛋白質をコードするDNA分子を作製する段階を含む方法
を特徴とする。
【０００９】 別の関連する局面において、本発明は、参照となる蛋白質に較べて変容した機
能をもつ蛋白質を選択する方法で、（a）候補となるDNA鋳型が、それぞれ、参照
となる蛋白質のコード配列とは異なる候補蛋白質のコード配列をもち、RNA分子
は、それぞれ、候補蛋白質のコード配列に機能的に結合された翻訳開始配列と開
始コドンとを含み、3'末端でペプチド受容体に機能的に結合されている、DNA鋳
型集団から候補となるRNA分子の集団を産生する段階、（b）候補となるRNA-蛋白
質融合体の集団を産生するために、候補となる蛋白質のコード配列を、インビト
ロまたはインサイチューで翻訳する段階、および（c）変容した機能をもつRNA-
蛋白質融合体を選抜し、それによって変容した機能をもつ蛋白質を選抜する段階
を含む方法を特徴とする。
【００１０】 さらに別の関連する局面において、本発明は、参照となる蛋白質に較べて変容
した機能をもつ蛋白質をコードするDNA分子を選択する方法で、（a）候補となる
DNA鋳型が、それぞれ、参照となる蛋白質のコード配列とは異なる、候補蛋白質
のコード配列をもち、RNA分子は、それぞれ、候補蛋白質のコード配列に機能的
に結合された翻訳開始配列と開始コドンとを含み、3'末端でペプチド受容体に機
能的に結合されている、候補となるDNA鋳型集団から候補となるRNA分子の集団を
産生する段階、（b）RNA-蛋白質融合体の集団を産生するために、候補となる蛋
白質のコード配列を、インビトロまたはインサイチューで翻訳する段階、（c）
変容した機能をもつRNA-蛋白質融合体を選抜する段階、および（d）融合体のRNA
部分から、変容した機能をもつ蛋白質をコードするDNA分子を作出する段階を含
む方法を特徴とする。
【００１１】 さらに別の関連する局面において、本発明は、所期のRNAを選抜するための方
法で、（a）それぞれが、候補蛋白質のコード配列に機能的に結合された翻訳開
始配列と開始コドンとを含み、またそれぞれが、候補蛋白質のコード配列の3'末
端でペプチド受容体に機能的に結合されている、候補となるRNA分子の集団を提
供する段階、（b）候補となるRNA-蛋白質融合体の集団を産生するために、候補
となる蛋白質のコード配列を、インビトロまたはインサイチューで翻訳する段階
、および（c）所期のRNA-蛋白質融合体を選抜し、それによって所期のRNAを選抜
する段階を含む方法を特徴とする。
【００１２】 上記の方法の好ましい態様において、ペプチド受容体はピューロマイシンであ
り；各候補RNA分子は、停止配列をさらに含むか、またはRNAの3'末端に共有結合
されたDNA配列もしくはDNA類似配列をさらに含み；候補RNA分子集団は、少なく
とも109個、好ましくは少なくとも1010個、より好ましくは少なくとも101１個、
101２個、または101３個、また最も好ましくは少なくとも1014個の異なったRNA
分子を含み；インビトロの翻訳反応を、真核細胞またはその一部から調製された
ライセート（すなわち、例えば、網状赤血球またはコムギ胚芽のライセート）の
中で行い；インビトロの翻訳反応を、原核細胞（例えば、大腸菌（E. coli））
またはその一部から調製された抽出物の中で行い；選抜段階が、所期の蛋白質を
、固定した結合パートナーに結合させることを含み；選抜段階は、所期の蛋白質
の機能的活性を測定することを含み；DNA分子を増幅し；本方法は、上記の選抜
方法の段階を繰り返すことをさらに含み；本方法は、DNA分子からRNA分子を転写
させ、段階（a）から（d）を繰り返すことをさらに含み；インビトロ翻訳段階の
後に、本方法は、50〜100 mM Mg2+存在下で行われるインキュベーション段階を
さらに含み；RNA-蛋白質融合体は、ペプチド受容体の近傍にある、可塑性を高め
るような核酸または核酸類似体の配列をさらに含む。
【００１３】 別の関連する局面において、本発明は、本発明の方法のいずれかによって選抜
されたRNA-蛋白質融合体；アミド結合によって、このリボ核酸によってコードさ
れているアミノ酸配列に共有結合されたリボ核酸；および、候補蛋白質のコード
配列に機能的に結合された翻訳開始配列と開始コドンとを含み、候補蛋白質のコ
ード配列の3'末端でペプチド受容体（例えば、ピューロマイシン）に機能的に結
合されているリボ核酸を特徴とする。
【００１４】 第二の局面において、本発明は、配列プールを増幅して、所期の蛋白質または
所期のRNAを選抜するための方法を特徴とする。この方法は、（a）それぞれが、
候補蛋白質のコード配列に機能的に結合された翻訳開始配列と開始コドンとを含
み、またそれぞれが、候補蛋白質のコード配列の3'末端でペプチド受容体に機能
的に結合されている、候補となるRNA分子の集団を提供する段階、（b）候補とな
るRNA-蛋白質融合体の集団を産生するために、候補となる蛋白質のコード配列を
、インビトロまたはインサイチューで翻訳する段階、（c）結合している結合パ
ートナー-RNA-蛋白質融合体複合体が集団の非結合構成分子から実質的に分離さ
れる条件の下で、RNA-蛋白質融合体の集団を、RNA-蛋白質融合体のRNA部分また
は蛋白質部分のどちらかに特異的な結合パートナーと接触させる段階、（d）結
合したRNA-蛋白質融合体を複合体から解離させる段階、および（e）結合してい
る結合パートナー-RNA-蛋白質融合体複合体が集団の非結合構成分子から実質的
に分離される条件の下で、段階（d）のRNA-蛋白質融合体集団を、所期のRNA-蛋
白質融合体の蛋白質部分に特異的な結合パートナーと接触させ、それによって、
所期の蛋白質および所期のRNAを選抜する段階を含む。
【００１５】 好ましい態様において、本方法は、段階（a）から（e）を繰り返すことをさら
に含む。さらに、これらの反復段階において、所期のRNA-蛋白質融合体を選択的
に増加させるために、何らかの順序で、同一の、または異なった結合パートナー
を用いることができる。別の好ましい態様において、段階（d）は、所期の融合
体の蛋白質部分に特異的な結合パートナー（例えば、モノクローナル抗体）を使
用することを含む。この段階は、好ましくは、所期の蛋白質をコードするDNAを
作出するために、融合体のRNA部分を逆転写した後に行う。望ましいならば、こ
のDNAは、単離および/またはPCR増幅することができる。この増幅技術を用いて
、所期の蛋白質を選抜することができ、または、参照用蛋白質と較べて変容した
機能をもつ蛋白質を選抜することもできる。
【００１６】 増幅方法の別の好ましい態様において、ペプチド受容体はピューロマイシンで
あり；各候補RNA分子は、停止配列をさらに含むか、またはRNAの3'末端に共有結
合されたDNA配列もしくはDNA類似配列をさらに含み；候補RNA分子集団は、少な
くとも109個、好ましくは少なくとも1010個、より好ましくは少なくとも101１個
、101２個、または101３個、また最も好ましくは少なくとも1014個の異なったRN
A分子を含み；インビトロの翻訳反応を、真核細胞またはその一部から調製され
たライセート（すなわち、例えば、網状赤血球またはコムギ胚芽のライセート）
の中で行い；インビトロの翻訳反応を、原核細胞（例えば、大腸菌（E. coli）
）またはその一部から調製された抽出物の中で行い；DNA分子を増幅し；少なく
とも一つの結合パートナーを固体支持体に固定し；インビトロ翻訳段階の後に、
本方法は、50〜100 mM Mg2+存在下で行われるインキュベーション段階をさらに
含み；また、RNA-蛋白質融合体が、ペプチド受容体の近傍にある、可塑性を高め
るような核酸または核酸類似体の配列をさらに含む。
【００１７】 関連する局面において、本発明は高濃度塩（K+、NH4 +、もしくはNa+のような
一価陽イオン、Mg2+のような二価陽イオン、またはそれらの組合せを含んだ、高
濃度塩を含むが、これらに限定されない）存在下で翻訳後インキュベートする段
階を含む、ライブラリー（例えば、タンパク質、DNAまたはRNA-融合体ライブラ
リー）の作製に関する方法または所望の分子（例えば、タンパク質、DNA、もし
くはRNA分子、または特定の機能もしくは改変された機能を持つ分子）を選別す
るための方法を特徴とする。このインキュベーションをほぼ室温または約-20℃
で行うことができ、塩濃度は、一価陽イオンについては約125mM〜1.5Mの間（よ
り好ましくは、約300mM〜600mMの間）および二価陽イオンについては約25mM〜20
0mMの間であることが好ましい。
【００１８】 もう一つの局面において、本発明は、本明細書で説明されている選抜方法のい
ずれかを行うためのキットを特徴とする。
【００１９】 最後の第三の局面において、本発明は、RNA-蛋白質融合体にハイブリダイズす
る一本鎖核酸を固定した配列を含むマイクロチップを特徴とする。好ましくは、
RNA-蛋白質融合体の蛋白質成分は、そのRNAによってコードされている。
【００２０】 本明細書で用いられる「集団」とは、一つよりも多い分子（例えば、複数のRN
A分子、DNA分子、またはRNA-蛋白質融合体分子）を意味する。本発明の方法によ
り、必要に応じて、多数の候補分子から出発する選抜が容易となるため、本発明
に係る「集団」は、好ましくは109分子よりも多く、より好ましくは1011、1012
、または1013分子よりも多く、また最も好ましくは1013分子よりも多いことを意
味する。
【００２１】 「選抜する」とは、集団の中のその他の分子から、ある分子を実質的に区分け
することを意味する。本明細書で用いられる場合、「選抜」段階により、所期の
分子が、選抜段階の後に集団中の所期の分子でないものに較べて、少なくとも2
倍、好ましくは30倍、より好ましくは100倍、そして最も好ましくは1000倍に増
幅される。本明細書において示されているように、選抜段階は、所定の方法にお
いて、何回でも反復することができ、また、異なったタイプの選抜段階を組み合
わせることもできる。
【００２２】 「蛋白質」とは、一つ以上のペプチド結合によって結合された、天然の、また
は修飾された2個以上の任意のアミノ酸を意味する。「蛋白質」および「ペプチ
ド」は、本明細書では、互換できるように使用されている。
【００２３】 「RNA」とは、共有結合された2つ以上の、天然または修飾されたリボ核酸の配
列を意味する。この用語に含まれる、修飾されたRNAの一つの例は、ホスホロチ
オエートRNAである。
【００２４】 「翻訳開始配列」とは、機能的なリボソーム進入部位を提供できる任意の配列
を意味する。バクテリアのシステムにおいては、この領域は、シャイン-ダルガ
ルノ（Shine-Dalgarno）配列ともいわれる。
【００２５】 「開始コドン」とは、蛋白質をコードする配列の開始のシグナルである3塩基
を意味する。一般的に、これらの塩基はAUG（またはATG）であるが、この態様に
おいて使用されうる別の塩基トリプレットで代用することもできる。
【００２６】 ペプチド受容体に「共有結合された」とは、ペプチド受容体が、共有結合によ
って直接、または、別の共有結合された配列（例えば、停止配列に相当するDNA
）によって間接的に、「蛋白質のコード配列」に結合していることを意味する。
【００２７】 「ペプチド受容体」とは、リボソームのペプチジルトランスフェラーゼ機能の
触媒活性によって、伸長している蛋白質鎖のC末に付加されうる任意の分子を意
味する。典型的には、このような分子は、（i）ヌクレオチドまたはヌクレオチ
ド様部分（例えば、アデノシンまたはアデノシン類似体（N-6アミノ部位のジメ
チル化は許容される））、（ii）アミノ酸またはアミノ酸様部分（例えば、20個
の任意のD-もしくはL-アミノ酸、またはそれの任意の類似体（例えば、O-メチル
チロシン、または、Ellmanら、Meth. Enzymol. 202:301, 1991で説明されている
類似体のいずれか））、および（ii）これら二つの間の結合（例えば、3'位置、
またはあまり好ましくはないが、2'位置でのエステル、アミド、またはケトン結
合）；好ましくはこの結合は、天然のリボヌクレオチドの立体構造でできる環の
しわを有意に乱すことのないものである。また、ペプチド受容体は、求核基をも
つことができる。この求核基に制限はないが、アミノ酸基、ヒドロキシル基、ま
たはスルフヒドリル基などである。さらに、ペプチド受容体は、ヌクレオチド擬
似体、アミノ酸擬似体、または、ヌクレオチド-アミノ酸結合構造物の擬似体か
らなっていてもよい。
【００２８】 蛋白質コード配列の「3'末端」に位置するペプチド受容体とは、ペプチド受容
体分子が、蛋白質コード配列の終止コドンの後に位置していることを意味する。
この用語には、蛋白質コード配列のまさに3'末端に位置するペプチド受容体分子
と、介在するコード配列、もしくは非コード配列（例えば、停止部位に相当する
配列）によって終止コドンから離されているペプチド受容体分子が含まれるが、
これに制限されない。また、この用語には、コード配列または非コード配列が、
ペプチド受容体分子の後ろに続いている（すなわち、3'末端側にある）構築物も
含まれる。さらに、この用語には、制限なしに、蛋白質のコード配列に（直接的
、または介在する核酸配列によって間接的に）共有結合されたペプチド受容体、
また、例えば、蛋白質コード配列の3'末端またはその近くに結合する別の核酸配
列で、それ自体がペプチド受容体分子に結合している別の核酸配列を用いたハイ
ブリダイゼーションのような、何らかの非共有的な方法によって蛋白質コード配
列に結合されているペプチド受容体が含まれる。
【００２９】 「変容した機能」とは、ある分子の機能における、質的または量的な任意の変
化を意味する。
【００３０】 「停止配列」とは、リボソームの翻訳の速さを遅くするか停止させる核酸配列
を意味する。
【００３１】 本明細書で用いられる「結合パートナー」とは、所期のRNA-蛋白質融合体の一
部に、特異的で、共有結合的、または非共有結合的な親和性をもつ任意の分子を
意味する。結合パートナーには制限はないが、その例には、抗原/抗体対、蛋白
質/インヒビター対、レセプター/リガンド対（例えば、ホルモンレセプター/ペ
プチドホルモン対などの細胞表面レセプター/リガンド対）、酵素/基質対（例え
ば、キナーゼ/基質対）、レクチン/炭水化物対、オリゴマー、もしくはヘテロオ
リゴマーの蛋白質集合体、DNA結合蛋白質/DNA結合部位対、RNA/蛋白質対、およ
び核酸の二本鎖、ヘテロ二本鎖、もしくは連結させた鎖のいずれか、および、RN
A-蛋白質融合体のいずれかの部分と一つ以上の共有結合もしくは非共有結合（例
えば、ジスルフィド結合）を形成することができる任意の分子が含まれる。結合
パートナーには、非制限的に、図2に示されている「選抜モチーフ」のいずれか
が含まれる。
【００３２】 「固体支持体」とは、制限ではないが、任意のカラム（または、カラム材料）
、ビーズ、試験官、微量滴定用プレート、固形粒子（例えば、アガロースまたは
セファロース）、マイクロチップ（例えば、シリコン、シリコンガラス、または
金製チップ）、または、直接的もしくは間接的（例えば、別の抗体やプロテイン
Aなどの、別の結合パートナー中間体）に親和的な複合体が結合できるか、もし
くは親和的な複合体が（例えば、レセプターまたはチャンネルを通して）包埋さ
れえる膜（例えば、リポソームまたは液胞の膜）を意味する。
【００３３】 「高濃度塩」とは、少なくとも200mM、および好ましくは、少なくとも500mMも
しくは1Mまでの濃度の一価陽イオン、ならびに/または少なくとも25mM、好まし
くは少なくとも50mM、および最も好ましくは、少なくとも100mM濃度の二価もし
くはより多価の陽イオンを持つことを意味する。
【００３４】 本明細書で請求されている発明は、数多くの有意な利点を提供する。まず、こ
れは、蛋白質を選抜、増幅するためのこの種の案の初めての例である。この技術
は、所期の単離された蛋白質に対応する塩基配列を回収する必要がある（なぜな
ら、核酸のみが複製可能だから）ために生じた困難を克服している。特に、部分
的に、または完全に無作為化されたプールからの蛋白質の単離を可能にした多く
の先行技術は、インビボの段階によって単離を行った。本方法には、モノクロー
ナル抗体技術（Milstein, Sci. Amer. 243:66 (1980); およびSchultzら、J. Ch
em. Engng. News 68:26 (1990)）、ファージディスプレイ（Smith, Science 228
:1315 (1985); Parmley and Smith, Gene 73:305 (1988); およびMcCaffertyら
、Nature 348:552 (1990)）、ペプチド-lacリプレッサー融合体（Cullら、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89:1865 (1992)）、および古典的な遺伝学的選抜法が含
まれる。本技術とは異なり、これらの各方法は、蛋白質と核酸とのトポロジー的
な結合に依存し、そのために、蛋白質の情報が保たれて、読み取り可能な核酸の
形で回収できる。
【００３５】 さらに、本発明は、まだ、リボソームおよびmRNAと複合体を形成している生成
中の蛋白質鎖の何らかの特性に対して選抜が行われるという、行き詰まった翻訳
技術（Tuerk and Gold, Science 249: 505 (1990); Irvineら、J.Mol.Biol.222:
739 (1991); Kormanら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79: 1844-1848 (1982); Matt
heakisら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91: 9022-9026 (1994); Mattheakisら、Met
h.Enzymol.267:195 (1996); およびHanes and Pluckthun, Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 94:4937 (1997)）に対する利点を提供する。行き詰まった翻訳技術とは異な
り、本方法は、非常に壊れやすく、そのために、技術的に用いることのできる選
抜のタイプ関する制限がある複合体である、mRNA：リボソーム：生成鎖の3成分
の複合体の完全性を維持することに依存しない。
【００３６】 本方法は、また、ブレナートとラーナー（Brenner and Lerner）（Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 89:5381-5383 (1992)）によって提案された、DNA-ペプチド融
合体を作り、選抜を一回行って遺伝情報を理論的に回収するという、枝分かれ合
成法に対する利点を提供する。枝分かれ合成法とは異なり、本方法では、（枝分
かれ合成法においては、一般的に、化学合成する毎に行われる）融合体のDNA部
分からのペプチド再生を行う必要がない。したがって、本方法は、候補分子の集
団を用いて、選抜を何度も繰り返すことが可能である。さらに、非常に短い配列
を選抜するため一般的に限定される枝分かれ合成技術とは異なり、本方法は、か
なりの長さの蛋白質分子を選抜するのに用いることができる。
【００３７】 さらに別の利点として、この選抜、および方向性をもった展開技術は、非常に
大きく複雑な、候補配列のライブラリーを利用することができる。これとは対照
的に、インビボの段階に依存する現存の蛋白質選抜法は、典型的には、ある程度
複雑さが限定されている、比較的小さなライブラリーに限定される。機能的な蛋
白質の配列を選抜するとき、例えば、長さが10アミノ酸しかないペプチドに対し
て、1013通りの配列が存在することを考えれば、この利点は特に重要である。古
典的な遺伝学的方法、lacリプレッサー融合法、およびファージディスプレイ法
では、最大の複雑さでも、一般的に、1013個という桁数よりは小さくなる。大き
なライブラリーサイズは、どのような出発配列についても、配列空間をより深く
調べることができるという点で、方向性をもった展開に応用するにも有利である
。
【００３８】 また、本技術は、選抜段階が、状況に依存しないという点で、先行する方法と
は異なる。多くの別の選抜スキームでは、例えば、発現された蛋白質が存在する
情況が、作製されるライブラリーの性質に大きな影響を与えることがある。例え
ば、特定のシステムでは、発現蛋白質が適正に発現されないか、または、（例え
ば、ファージ粒子の表面上に）正しく提示されないかもしれない。または、蛋白
質の発現は、実際には、選抜サイクルの一つ以上の重要な段階、例えば、ファー
ジの生存力もしくは感染力、またはlacリプレッサーの結合によって妨害される
ことがある。これらの問題は、機能的な分子の消失をもたらすことがあり、用い
ることのできる選抜方法の性質を制約することになる。
【００３９】 最後に、本方法は、調べることのできる蛋白質のレパートリーを調節すること
ができるため、有益である。一定の技術（例えば、抗体選抜）においては、最初
のプールの性質を調節することがほとんどできないか全くできない。さらに別の
技術（例えば、lac融合およびファージディスプレイ）では、候補プールを、融
合蛋白質という状態で発現させなければならない。これに対し、RNA-蛋白質融合
体構築物は、スクリーニングに用いることのできる候補プールの性質に対する調
節を具えている。さらに、候補プールの大きさは、インビトロ翻訳反応を行う規
模によって制約されるだけで、RNAまたはDNAのプールと同じ大きさにすることが
できる（〜1015個）。そして、候補プールの組み立ては、完全に実験のデザイン
しだいである。すなわち、無作為領域は、単独にスクリーニングしてもよいし、
または、所期の融合蛋白質に関連させてスクリーニングしてもよい。また、RNA-
蛋白質融合体の候補プールにおいて、すべてではないにしても、ほとんどの配列
を発現させることができる。
【００４０】 本発明のこの他の特徴と長所は、次の詳細な説明および請求の範囲から明らか
になると思われる。
【００４１】詳細な説明 まず、図面について、簡単に説明する。
【００４２】 蛋白質が、それら自身のメッセンジャーRNAに共有的に連結している融合体を
用いた、所期の機能をもつ蛋白質を選抜するための一般的な方法を本明細書にお
いて説明する。これらのRNA-蛋白質融合体は、3'末端に付着したペプチド受容体
を含むmRNAプールをインビトロ、またはインサイチューで翻訳して合成される（
図1B）。一つの好ましい態様において、メッセージのオープンリーディングフレ
ームをリードスルーした後、設計された停止部位に到達すると、リボソームが停
止し、リボソームのAサイトに受容体部分が入り、Pサイトにいるペプチジル-tRN
Aから生成中のペプチド鎖を受け取って、RNA-蛋白質融合体を生成させる（図1C
）。蛋白質とRNAとの間の共有結合（mRNAの3'末端と、それのコードする蛋白質
のC末との間のアミド結合の形になる）によって、蛋白質中の遺伝学的情報を回
収し、RNAの逆転写による選抜の後に（例えば、PCRによって）増幅することが可
能になる。融合体が生成されれば、mRNA-蛋白質融合体の特性に基づいた選抜も
しくは増幅を行うか、または、一本鎖RNAが選抜に及ぼす何らかの影響を防ぐた
めに蛋白質に付着している間に、mRNA鋳型を用いて逆転写を行うことができる。
mRNA-蛋白質構築物を用いるときには、選抜した融合体を調べて、どちらの部分
（蛋白質、RNA、またはその両方）が、所期の機能を具備しているのかを判定す
ることができる。
【００４３】 好ましい態様の一つにおいて、（チロシルアデノシンに類似している）ピュー
ロマイシンが、伸長しているペプチドがそのmRNAに付着するための受容体として
機能する。ピューロマイシンは、ペプチド伸長を終結させることにより作用する
抗生物質である。これは、アミノシルtRNAの擬似体として、Aサイトに結合し、
伸長中のペプチド鎖を受容し、リボソームを離脱させる（Kd＝10-4 M）（Traut
and Monro, J. Mol. Biol. 10:63 (1964); Smithら、J. Mol. Biol. 13:617 (19
65)）ことによって、蛋白質合成の普遍的なインヒビターとして作用する。ピュ
ーロマイシンの最も魅力的な特徴の一つは、伸長中のペプチド鎖と安定したアミ
ド結合を形成するために、不安定なエステル結合を形成する可能性のある受容体
と較べて、より安定した融合体が可能になるという事実である。特に、ペプチジ
ル-ピューロマイシン分子は、ペプチドとピューロマイシンのO-メチルチロシン
部位との間に安定したアミド結合を含む。そして、O-メチルチロシンは、安定し
たアミド結合によってピューロマイシンの修飾されたアデノシン部分の3'-アミ
ノ基連結している。
【００４４】 この他に、受容体として選択可能なものには、mRNAの3'末端のtRNA様構造、お
よびピューロマイシンと同じように作用する他の化合物が含まれる。このような
化合物には、制限ではないが、アデノシン、またはアミノ酸ヌクレオチド、フェ
ニルアラニル-アデノシン（A-Phe）、チロシルアデノシン（A-Tyr）、およびア
ラニル-アデノシン（A-Ala）などのアデニン様化合物、ならびに、フェニルアラ
ニル3'デオキシ3'アミノアデノシン、アラニル3'デオキシ3'アミノアデノシン、
およびチロシル3'デオキシ3'アミノアデノシンなどのアミド結合構造物などがあ
り、これらの化合物のいずれにおいても、天然のL-アミノ酸またはそれらの類似
体を利用することができる。さらに、tRNA様3'構造物-ピューロマイシンを結合
させた結合体も、本発明において用いることができる。
【００４５】 図2に示されているのは、本発明にしたがった好ましい選抜スキームである。
この選抜に含まれる段階は、一般的に、以下のようにして行われる。
【００４６】段階1．DNA鋳型の調製 本発明のRNA-蛋白質融合体を作出することを目的とする段階として、融合体の
RNA部分を合成する。これは、直接的なRNAの化学合成により行い、または、より
一般的には、適当な二本鎖のDNA鋳型を転写して行うことができる。
【００４７】 このようなDNA鋳型は、常法（組換えDNA技術、化学合成、またはその両方を含
む技術など）によって作製することができる。原則として、既知の、無作為の、
無作為化した、または変異誘発した配列を含む鋳型を一つ以上産生させる方法が
、この目的のために用いられる。特定の方法の一つでは、オリゴヌクレオチド（
例えば、無作為の塩基を含むもの）を合成して、転写の前に（例えば、PCRで）
増幅する。後で既知の蛋白質コード配列の中央に挿入される無作為なカセットを
作製するために化学合成を用いることもできる（例えば、アウスウベル（Ausube
l）ら、分子生物学の最新プロトコール（Current Protocol in Molecular Biolo
gy）、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社およびグリーンパブリッシングカン
パニー（John Wiley & Sons and Greene Publishing Company）、1994年の8.2章
を参照のこと）。後者の方法によって、目的とする蛋白質の特定の部位近くに高
密度の突然変異が誘発される。
【００４８】 DNA鋳型の配列を完全に無作為化する代わりに部分的に無作為化され、そうし
て合成されたプールは、一般的に、「ドープド（dopede）」プールと呼ばれる。
この技術の例で、RNA配列について行われたものが、例えば、エクランド（Eklan
d）ら（Nucl. Acids Research, 23:3231 (1995)）によって説明されている。部
分的な無作為化は、それぞれの塩基付加反応混合液が1つの塩基を過剰に含み、
他の塩基それぞれの量が少なくなるようにして合成反応にバイアスをかけること
によって、化学的に行うことができる。また、塩基の濃度を慎重に調節すること
によって、この方法で、望ましい突然変異頻度を実現することができる。また、
部分的に無作為化したプールは、エラープローン（error prone）PCR技術を用い
て、例えば、ボードリーとジョイス（Beaudry and Joyce）（Science 257:635 (
1992)）、およびバーテルとスゾスタック（Bartel and Szostak）（Science 261
:1411 (1993)）で説明されているようにして作製することができる。 既知の配列から出発し、変異を起こしたDNAプールを作製してDNA構築物を作製
する数多くの方法を利用することもできる。このような技術の例は、アウスウベ
ル（Ausubel）ら（前記、第8章）、およびサムブルック（Sambrook）ら、(「分
子クローニング：実験マニュアル(Molecular Cloning. A Laboratory Manual)」
、第15章、Cold Spring Harbor Press、第２版、(1989))、カドウェル（Cadwell
）ら(PCR Methods and Applications 2:28(1992))、ツァンド（Tsand）ら(Meth.
Enzymol. 267:410(1996))、レイダール-オルセン（Reidhaar-Olsen）ら(Meth.
Enzymol. 208:564(1991))、およびエクランド（Ekland）ならびにバーテル（Bar
tel）(Nucl. Acids. Res. 23:3231(1995))により説明されている。ランダム配列
を、ステマー（Stemmer）（Nature 370:389 (1994)）において概説されている「
シャッフリング」技術によって作製することができるる。最後に、開始ライブラ
リーを作製するために、一連の２つ又はそれ以上の相同的な遺伝子を、インビト
ロにおいて組み換えることができる（Crameriら、Nature 391:288〜291(1998)）
。
【００４９】 選抜されたコドンに依存する様々な方法で、ランダムな配列からオープンリー
ディングフレームを構築してもよい。オープンリーディングフレーム中の停止コ
ドンを排除することが好ましい。全体としてランダム配列ライブラリーが用いら
れうるが（NNNをコードする）、全てにおいて許容範囲外に高いが、最少のライ
ブラリーでありうる比率の一部停止コドン（3/64=コドンあたり4.7％）を含む。
またこのようなライブラリーは、時々翻訳低下をもたらすことのできる、めった
に使用されないコドンも含む。哺乳類翻訳システムにおいて、NNG/Cコドンはわ
ずかに停止頻度を減じさせる（1/32=コドンあたり3.1％）一方、全20アミノ酸に
ついて最適なコドンへのアクセスを与える。7例（AEGKRTV）において、最適コド
ンがAまたはTで終わるような細菌翻訳システムにおいて適用される場合にNNG/C
コドンは最適ではない。停止コドン頻度を極めて低くする、3つの異なるヌクレ
オチド混合物、N1N2N3コドンを使用した球状タンパク質と類似のアミノ酸組成を
もついくつかの溶液が存在する（LaBeanおよびKauffman、Protein Science 第2
巻：1249〜1254（1993年））（および本明細書における参照）。最後に、ほぼ無
限の多様性をもつ半合理的な設計戦略を、アミノ酸型に従ってパターンライブラ
リーに適用してもよい。例えば、NTNまたはNANコドンそれぞれを用いて、疎水性
（h）または極性（p）アミノ酸を選抜することができる（BeasleyおよびHecht、
J. Biol. Chem. 第272巻：2031〜2034（1997年））。α-ヘリックス（phpphhpp
…）またはβ-シート（phphph…）形成が優先するようにこれらをパターン化す
ることができる。
【００５０】 合成配列から構築されたオープンリーディングフレームもまた、合成DNAの挿
入または欠失によって生じる停止コドンを含みうる。翻訳読み枠（translation
reading frame）の変更のため、これらの欠陥は否定的な結果を含みうる。合成
オリゴヌクレオチドから構築された多数のプールおよび合成遺伝子の検査は、挿
入および欠失は部位あたり0.6％以下、またはコドンあたり1.8％の頻度で起こる
ことを示す。これらの発生の正確な頻度は可変的であり、合成DNAの供給源およ
び長さに依存すると考えられる。特に、長い配列ほど挿入頻度および欠失頻度が
高いことが示されている（Haasら、Current Biology 第6巻：315〜324（1996年
））。オープンリーディングフレーム内のフレームシフトを減少させるための簡
便な解決策は、均一に精製されうる合成DNAの比較的短いセグメント（80ヌクレ
オチドまたはそれ未満）を用いて行うことである。次にいくつかの短い配列の制
限酵素消化およびライゲーションにより、より長いオープンリーディングフレー
ムを作製することができる。
【００５１】 本発明の選抜スキームを最適化するために、鋳型の5'末端と3'末端の配列と構
造を変更することもできる。好ましくは、これは、無作為なドメインを鋳型の適
当な末端の近くに挿入することを含み、その後選抜を行うという、二つの別々の
選抜によって行うことができる。これらの選抜法は、（i）作製される融合体の
量を最大にする（そして、それによってライブラリーの複合性を最大にする）か
、または（ii）最適化された翻訳配列を提供するために利用することができる。
さらに、本方法は、一般的に、コード領域と非コード領域の両方において翻訳用
鋳型を最適化するために、変異原PCRと組み合わせて適用することができる。
【００５２】段階2．RNAの生成 上記したように、オリゴヌクレオチド合成の標準的な技術を用いて、RNA-蛋白
質融合体のRNA部分を化学的に合成することができる。または、および特に、長
いRNA配列が用いられるときは、RNA部位は、DNA鋳型のインビトロ転写によって
作製される。好ましい方法の一つにおいては、T7ポリメラーゼを用いて、酵素的
に、RNA鎖を生成させる。転写は一般的にPCR反応と同じ容量において行われる（
100μl反応由来のPCR DNAが、100μlの転写に用いられる）。望ましいならば、
転写反応における大量のモル数の過剰なM7GpppGをGTPに用いて、5'キャップをも
つこのRNAを作製することができる（GrayおよびHentze、EMBO J. 13:3882〜3891
(1994)）。このように用いられる他の適当なRNAポリメラーゼには、制限ではな
いが、SP6、T3、および大腸菌のRNAポリメラーゼなどがある（例えば、アウスウ
ベル（Ausubel）ら（前記、第3章）で説明されている）。さらに、合成RNAは、
全体的または部分的に修飾されたRNAであってもよい。一つの特定の例において
、修飾されたリボヌクレオチドと標準的な技術を用いて、ホスホロチオエートRN
Aを作出することができる（例えば、T7転写によって）。このように修飾されたR
NAは、ヌクレアーゼ安定的であるという長所がある。その後、以前に記載された
ように、尿素PAGEを用いて全長RNA試料を転写反応物から精製し、続いてNAP-25
（Phaemacia）で脱塩する（RobertsおよびSzostak、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94
:12297〜12302(1997))。
【００５３】段階3．鋳型ヘのピューロマイシンのライゲーション 次に、ピューロマイシン（または、別の適当なペプチド受容体）を、鋳型配列
に共有結合させる。この段階は、T4RNAリガーゼを用いて、ピューロマイシンをR
NA配列に直接付着させて行うことができるが、好ましくは、T4 DNAリガーゼ、ま
たは二つの塩基配列をつなぎ合わせることができる別の酵素を用いて、ピューロ
マイシンをDNAの「スプリント（splint）」を通して付着させることができる（
図1B参照）（また、例えば、アウスウベル（Ausubel）ら、前記、第3章14節と15
節も参照のこと）。tRNA合成を用いて、ピューロマイシン様化合物をRNAに付着
させることができる。例えば、フェニルアラニルtRNA合成酵素は、フェニルアラ
ニンを、3'アミノ基をもつフェニルアラニルtRNA分子に結合させて、ピューロマ
イシン様の3'末端をもつRNA分子を生成させる（Fraser and Rich, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 70:2671 (1973)）。用いることのできる別のペプチド受容体に
は、制限ではないが、アミノ酸ヌクレオチド、フェニルアラニル-アデノシン（A
-Phe）、チロシルアデノシン（A-Tyr）、およびアラニル-アデノシン（A-Ala）
などのアデニン様化合物、ならびに、フェニルアラニル3'デオキシ3'アミノアデ
ノシン、アラニル3'デオキシ3'アミノアデノシン、およびチロシル3'デオキシ3'
アミノアデノシンなどのアミド結合構造物など、アデニンまたはアデニン様化合
物に結合したアミノ酸をもつ化合物が含まれる。また、これらの化合物のいずれ
かにおいて、天然のL-アミノ酸、またはそれらの類似化合物を利用することがで
きる。数多くのペプチド受容体が、例えば、クラエフスキーとクカノバ（Krayev
sky and Kukahnova）、Progress in Nucleic Acids Research and Molecular Bi
ology 23:1 (1979)で説明されている。
【００５４】段階4．RNA-蛋白質融合体の生成と回収 RNA-蛋白質融合体を生成させるために、どのようなインビトロ、またはインサ
イチューの翻訳システムを利用してもよい。下に示すように、真核生物のシステ
ムが好ましく、2つの特に好ましいシステムには、コムギ胚芽と網状赤血球のシ
ステムがある。しかし、原則として、RNA-蛋白質融合体を形成でき、融合体のRN
A部分を有意に分解しない翻訳システムであれば、本発明において有用である。
さらに、これらのシステムのいずれかにおいて、RNA分解を低下させるために、
翻訳反応混合液の中に、分解を遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチドを入れ
ることができる。このようなオリゴヌクレオチドは、分解が開始する、分子のRN
A部位の中の配列に特異的にハイブリダイズして、それを覆う（例えば、Hanes a
nd Plucthun, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937 (1997)）。 上記したように、真核細胞の翻訳システムを本発明で使用することができる。
これらには、制限はないが、酵母、腹水、腫瘍細胞のライセート（Leibowitzら
、Meth. Enzymol. 194:536 (1991)）、およびアフリカツメガエル（xenopus）の
卵母細胞が含まれる。バクテリアシステムで有用なインビトロ翻訳システムには
、制限はないが、ズベイ（Zubay）（Ann. Rev. Genet. 7:267 (1973))；チェン
とズベイ（Chen and Zubay ）(Meth. Enzymol. 101:44 (1983)）；およびエルマ
ン（Ellman）（Meth. Enzymol. 202:301 (1991)）で説明されているものが含ま
れる。
【００５５】 さらに、翻訳反応を、インサイチューで行うことができる。特異的な例の一つ
において、標準的な技術を用いて、アフリカツメガエル（xenopus）の卵母細胞
にmRNAを注射することによって翻訳を行わせることができる。
【００５６】 生成されたところで、蛋白質またはRNAの標準的な精製技術を用いて、翻訳反
応混合液からRNA-蛋白質融合体を回収する。典型的には、蛋白質の精製技術を利
用する。下記に示すように、例えば、dT25アガロースまたはチオプロピルセファ
ロースなど、適当なクロマトグラフィー試薬を用いることによって、融合体の精
製を容易に行うことができるようになる。しかし、精製は、また、あるいはまた
は、融合体のRNA部位に基づいた精製を含むことができる。このような精製技術
は、例えば、アウスウベル（Ausubel）ら（前記、第4章）において説明されてい
る。
【００５７】段階5．所期のRNA-蛋白質融合体の選抜 候補融合体の集団から、所期の融合体を選択的に区別または単離するために利
用可能な方法によって、所期のRNA-蛋白質融合体の選抜を行うことができる。分
離技術の例に制限ではないが、例えば、カラム、ビーズ、膜、またはその他の固
形支持体上に直接的または間接的に固定された結合パートナーへの選択的な結合
、および融合体の蛋白質部位に特異的な抗体を用いた免疫沈降などがある。これ
らの技術のうち最初のものは、結合が可能な、いずれかのタイプの分子からなる
、固定された選択モチーフを利用する。選択モチーフ分子の可能性のあるものの
リストが、図2に示されている。選抜はまた、候補分子と反応するアフィニティ
ー標識（例えば、基質-ビオチン）に付着した基質分子を用いることによって行
うこともできるし、または、融合分子との別のタイプの相互作用に基づいて行う
こともできる。さらに、蛋白質は、RNA酵素の単離について、バーテルとスゾス
タック（Bartel and Szostak）（前記）によって説明されている方法と同じよう
にして、それらの触媒活性に基づいて選抜することができるが、この特殊な技術
によれば、所期の分子は、標的分子をそれら自身に結合させることのできる能力
に基づいて選抜され、次に、その標的が存在することによって、機能的な分子を
単離することができる。これと同じ方法を用いた新規の、または改良された触媒
蛋白質を単離するための選抜法、または、別の機能的な選抜法が、本発明によっ
て可能になる。
【００５８】 さらに、本明細書において説明されているように、所期のRNA-蛋白質融合体（
または、そのDNAコピー）の選抜は、候補分子のプールの中で、この融合体を増
幅することによって容易にすることができる。このような選択的な増幅を行うた
めに、サンプル中の非結合構成分子から結合パートナー-融合体複合体が実質的
に分離される条件の下で、候補であるRNA-蛋白質融合体の集団を、この融合体の
RNA部位または蛋白質部位のどちらかに特異的な結合パートナー（例えば、結合
パートナーの一つが上記されている）と接触させる。この段階は反復することが
でき、この技術は、好ましくは、RNA部位に特異的な結合パートナーを用いて融
合体を選択するという一つの段階と、蛋白質部位に特異的な結合パートナーを用
いて融合体を選択するというもう一つの段階という、少なくとも2つの連続的な
増幅段階を含む。さらに、融合体の同じ部位（例えば、蛋白質部位）を標的とし
た増幅段階を繰り返すときは、好ましくは、異なった結合パートナーを利用する
。本明細書で説明されている特定の実施例においては、所期の融合体について、
まず、融合体のRNA部位に特異的な結合パートナーを用いて、次に、2段階の連続
段階において、どちらも融合体の蛋白質部位に特異的な、2つの異なる結合パー
トナーを用いて分子集団を増幅する。再び、制限ではないが、カラムアフィニテ
ィークロマトグラフィー、遠心分離、または免疫沈降などの標準的な分離技術に
よって、サンプル成分からこれらの複合体を分離することができる。
【００５９】 なお、増幅（または選抜）混合液からのRNA-蛋白質融合体の溶出は、多くの方
法で行うことができる。例えば、本明細書において説明されているように、所期
のRNA-蛋白質融合体を単離するために、変性または非特異的な化学的溶出段階を
利用することができる。このような段階は、複合体の成分の間の、および/また
は複合体の成分と固形支持体との間の非共有結合を切断することによって、比較
的非特異的な方法で、複合体の成分を、互いから、または結合している固形支持
体から解離するのを容易にする。本明細書において説明されているように、変性
、または非特異的な化学的溶出試薬の一例は、4% HOAc/H2Oである。この他の変
性または非特異的な化学的溶出試薬の例には、グアニジン、尿素、高塩、界面活
性剤、または非共有結合的な付加物が一般的に除去できるような他の方法が含ま
れる。または、融合体分子の特異的な解離をもたらすような試薬を活用する、特
異的な化学的溶出法を利用することもできる。一つの特異的な例において、所期
の融合蛋白質のリンカーアームが、一つ以上のジスルフィド結合を含んでいたな
らば、結合している融合アプタマーを、例えば、DTTを添加することによって溶
出することができ、その結果、ジスルフィド結合が低下して結合標的が解離する
。
【００６０】 または、親和複合体を特異的に崩壊させることによって溶出を行うことができ
るが、このような技術は、複合体のメンバーを過剰に加えることによって、複合
体の成分を選択的に解離させる。例えば、ATP結合選抜法においては、過剰量のA
TPをインキュベーション混合液に加えて溶出を行う。最後に、酵素的溶出を行う
こともできる。この方法によって、結合している分子自体、または外から加えた
プロテアーゼ（または、他の適当な加水分解酵素）が、標的または酵素のいずれ
かを切断して解離させる。特異的な実施例の一つにおいて、プロテアーゼの標的
部位は、複合体の成分のいずれかに含まれていて、プロテアーゼを付加すること
によって、結合している分子を溶出するかもしれない。または、触媒的な選抜に
おいて、固形支持体から自身を解離する（例えば、切断する）ことができる分子
を分離するための選抜段階として溶出を利用することができる。
【００６１】段階6．逆転写酵素を用いたRNA配列のDNAコピーの作出 望ましいならば、選抜されたRNA融合配列のDNAコピーは、標準的な技術のいず
れか（例えば、スーパースクリプト（Superscript）逆転写酵素）を用いて、RNA
配列を逆転写して簡単に手に入れることができる。この段階は、選抜または増幅
段階の前に行うことができる（例えば、図16で検討されている）が、この段階の
後に行うこともできる。または、逆転写処理は、インビトロまたはインサイチュ
ーの翻訳混合液から融合体を単離する前に行うことができる。
【００６２】 次に、部分的な、または全長の二本鎖配列としてDNA鋳型を増幅する。好まし
くは、この段階で、適当なオリゴヌクレオチドとPCR増幅を用いて、全長のDNA鋳
型が生成される。
【００６３】 これらの段階、ならびにこれらの段階を行うための試薬および技術は、特異的
な実施例を用いて、これから詳しく説明される。これらの実施例は、本発明を例
示する目的で提供されている。したがって、これらを制限的なものと考えてはな
らない。
【００６４】RNA-蛋白質融合体のための鋳型の作製 図1Aと2に示されているように、本発明の選抜法は、好ましくは、設計された
要素をいくつか含む二本鎖DNA鋳型を利用する。これらの要素のうち第一のもの
は、mRNA合成のための所期のRNAポリメラーゼとともに用いられるプロモーター
である。図1Aと本明細書で説明されているように、T7プロモーターが好ましいが
、直鎖上の二本鎖DNAからの合成を促すことのできるプロモーターを用いること
もできる。
【００６５】 図1に示されている鋳型の第二の要素は、5'非翻訳領域（または5'UTR）と名づ
けられていて、翻訳開始部位の上流にあるRNAに相当する。図1Aに示されている
のは、タバコモザイクウイルスの5'非翻訳領域の欠失変異体で、好ましい5'UTR
（「TE」と名づけられている）であるが、特に、TMVの翻訳開始位置のすぐ5'側
にある塩基に相当する。なお、このUTRの配列は、以下の通りである。すなわち
、rGrGrGrArCrArArUrUrArCrUrArUrUrUrArCrArArUrUrArCrA（最初の3つのGヌクレ
オチドは、転写を増加させるために挿入されている）（配列番号：5）。この他
の適当な5'UTRを使用することもできる（例えば、Kozak, Microbiol. Rev. 47:1
(9183)、及びJoblingら、Nature 325:622(1987)を参照のこと）。
【００６６】 図1Aに示されている第三の要素は、翻訳開始部位である。一般的に、これは、
AUG開始コドンである。しかし、天然のコード配列において、AUG以外のコドンが
使用される例があるため、これらのコドンも本発明の選抜法において用いること
ができる。
【００６７】 このコドンの周囲の正確な配列の前後関係が、翻訳効率に影響する（Kozak、m
icrobiological Reviews 第47巻：1〜45（1983年）；およびKozak、J. Biol. Ch
em. 第266巻：19867〜19870（1991年））。第1プリン（-3）としてA、および第2
（+4）としてGを優先するほとんどの配列に対して、5'RNNAUGR 配列は良好な前
後関係を提供する（Kozak、microbiological Reviews 第47巻：1〜45（1983年）
；およびKozak, J. Mol. Biol. 第196巻：947〜950（1987年））。
【００６８】 図1Aに示されている第四の要素は、蛋白質の配列をコードするオープンリーデ
ィングフレーム（ORFと呼ばれる）である。このオープンリーディングフレーム
は、天然の、無作為の、無作為化された、変異誘発された、または全部合成され
た蛋白質の配列である。ORF及び隣接する3'定常領域の最も重要な特徴は、どち
らも停止コドンを含まないことである。停止コドンの存在はタンパク質合成の 中途での終結を可能にし、融合形成を阻害する。
【００６９】 図1Aに示されている第五の要素は、3'定常領域である。この配列は、プールさ
れた配列のPCR増幅と、ピューロマイシンを含むオリゴヌクレオチドのmRNAへの
ライゲーションを容易にする。望ましいならば、この領域は、リボソームを停止
させ、それによって受容体部分（例えば、ピューロマイシン）がペプチジル-tRN
Aから生成中のペプチド鎖を受け取るための時間を増加させることのできる配列
である停止配列を含むこともある。この停止部位については、後にもっと詳しく
考察する。
【００７０】 本方法を開発するために、まず、1〜2個のコドンを含む、非常に単純化された
mRNA鋳型を用いて、RNA-蛋白質融合体を作製した。2つの理由で、この方法を選
んだ。まず、このサイズの鋳型は、化学合成によって簡単に作製することができ
る。そしてもう一つは、小さなオープンリーディングフレームは、結合効率、末
端の不均一性、鋳型依存性、および翻訳の正確性などを含む反応の重要な特徴を
簡単に測定することを可能にした。
【００７１】構築物の設計 試験用のRNA-蛋白質融合体を作製するために、基本的な構築物を用いた。この
分子は、リボソーム蛋白質L1のSD配列を3塩基欠失させたもので、16S rRNA（す
なわち、rGrGrA rGrGrA rCrGrArA）（配列番号：6）（Stomoら、Nucleic Acids
Research 10:2971-2996 (1982); Shine and Dalgarno, Proc.Natl.Acad.Sci.USA
71: 1342-1346 (1974);およびSteitz and Jakes, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72:
4734-4738 (1975)）の5塩基に相補的な、翻訳開始のためのシャイン-ダルガルノ
（SD）配列、（ii）AUG開始コドン、（iii）停止配列として働くDNAリンカー（
すなわち、5'-(dA)27）、（iv）dCdC-3'、および（v）3'ピューロマイシン（P）
を含むmRNAからできていた。ポリdA配列を選んだのは、それが、AサイトでtRNA
を鋳型とすることが少なく（Morganら、J. Mol. Biol. 26:477-497 (1967); Ric
ker and Kaji, Nucleic Acids Research 19:6573-6578 (1991)）、また、十分に
停止配列として作用するように設計されていたからである。オリゴdAリンカーの
長さは、翻訳部位とペプチド転移中心との間の距離が約60〜70オングストローム
続いていることから決定した。dCdCPはtRNAのCCA末端を模倣するので、ピューロ
マイシンがリボソームのAサイトに結合するのが促進されるよう設計した。
【００７２】最小鋳型43-Pの化学合成 構築物43-P（図3に示されている）を合成するために、まず、標準的なホスホ
ロアミダイトオリゴヌクレオチド合成化学法と親和的な方法で、ピューロマイシ
ンを固形支持体に付着させた。このオリゴの合成プロトコールは、図3に概略が
図解されており、より詳しくは後述される。ピューロマイシンを、調節された多
孔ガラス（CPG）に付着するために、アプライドバイオシステムズ社（Applied B
iosystems）のDNA合成機モデル380用のユーザー会報49号（1988）で説明されて
いるところにしたがって、トリフルオロアセチル基でアミノ基を保護した。次に
、標準的なDMT-Cl法（ゲート（Gait）、オリゴヌクレオチド合成、実際的方法（
Oligonucletide Synthesis, A Practical Approach）、実用的応用シリーズ（Th
e Practical Approach Series）（IRLプレス、オクスフォード（IRL Press, Oxf
ord）、1984））を用いて、5'OHの保護を行い、また、3'OHを用いてデオキシヌ
クレオチドの付着を行ったのと全く同じ方法で、2'OHによるアミノヘキシルCPG
への付着を行った（図3と、ゲート（Gait）、前記参照）。こうして、5'DMT-CPG
結合して保護されたピューロマイシンが、ホスホロアミダイトモノマーによる鎖
伸長に適したものとなった。オリゴ合成は、3'→5'の方向に進み、（i）3'ピュ
ーロマイシン、（ii）pdCpdC、（iii）リンカーとしての約27ユニットのdA、（i
v）AUG、および（v）シャイン-ダルガルノ配列の順序で進んだ。43-P構築物の配
列を下に示す。
【００７３】CPGピューロマイシンの合成 保護されたCPGピューロマイシンの合成は、以前概説されている（ゲート（Gai
t）、オリゴヌクレオチド合成、実際的方法（Oligonucletide Synthesis, A Pra
ctical Approach）、実用的応用シリーズ（The Practical Approach Series）（
IRLプレス、オクスフォード（IRL Press, Oxford）、1984））ように、デオキシ
ヌクレオチドに用いた一般的な経路にしたがった。主な出発点には、適当なN末
阻害基の選択、ピューロマイシン2'OHにおける固形支持体への付着、および固形
支持体への結合反応が含まれる。後者の場合には、この物質が、固形支持体より
もかなり高価であったため、活性化されたヌクレオチドの濃度が非常に低いとこ
ろで反応を行なった。この結果、希釈した反応条件を考慮すれば、非常に満足の
ゆく収量（〜20μmol/g支持体）が得られた。
【００７４】N-トリフルオロアセチルピューロマイシンの合成 267 mg（0.490 mmol）のピューロマイシン塩酸を、まず水に溶解し、pH 11の
炭酸緩衝液を加えてから、クロロホルムの中（3×）で抽出して、遊離塩基の形
に変えた。有機層を蒸発させて乾燥させ、重量を計量した（242 mg, 0.513 mmol
）。次に、遊離の塩基を11 mlの無水ピリジンと11 mlの無水アセトニトリルに溶
解してから、139μl（2.0 mmol）のトリエチルアミノ（TFA、Fluka）と139μl（
1.0 mmol）の無水トリフルオロ酢酸（TFAA、Fluka）を加えて撹拌した。そして
、薄層クロマトグラフィー（tlc）（93：7、クロロホルム/MeOH）によって測定
して、出発物質が完全になくなるまで、この混濁液にTFAAの等量液を20μlずつ
加えた（総量280μl）。この反応を1時間行なわせた。この時点で、薄層クロマ
トグラフィーで二本のバンドが見えたが、どちらも、出発物質よりは高い移動度
をもっていた。NH4OHと水で反応を進めたところ、単一のバンドだけになった。
シリカクロマトグラフィー（93：7、クロロホルム/MeOH）によって、293 mg（0.
515 mmol）の産物、N-TFA-Purが得られた。この反応産物を、図4に概略的に示す
。
【００７５】N-トリフルオロアセチル5'-DMTピューロマイシンの合成 上記の反応からの産物を等量液にして、水を除去するために、無水ピリジンと
とともに2回蒸発させた。複数のチューブを用意して、いくつかの反応条件を調
べた。少量の反応では、27.4 mg（48.2μモル）のN-TFA-Purを、0.05当量のDMAP
と1.4当量のTEAを含む、480μlのピリジンの中に溶解した。この混合液に、20.6
mgのジメトキシルトリチルクロライド（60μmol）を加えて、撹拌しながら反応
を完全になるよう進行させた。等量の水（約500μl）を溶液に加えて、この反応
を停止させた。この反応は成功したように見えたので、大規模にして実験を行な
った。特に、262 mg（0.467 mmol）のN-TFA-Purを、2.4mlのピリジンの中に溶解
した後、1.4当量のTEA、0.05当量のDMAP、および1.2当量のジメトキシルトリチ
ルクロライドを加えた。約2時間後、さらに50 mg（0.3当量）のジメトキシトリ
チル*Cl（DMT*Cl）を加えて、反応をさらに20分間進ませた。3 mlの水を加えて
反応を停止させ、CH3CNとともに3回蒸発させた。この反応物を、100 mlシリカ（
乾燥）、直径2 mmのカラム上で、95：5のクロロホルム/MeOHによって精製した。
精製が不完全だったため、別の同じカラム上で97.5：2.5のクロロホルム/MeOHに
よって行なった。全収量は、325 mgまたは0.373 mmol（または72%の収率）であ
った。この反応産物を図4に図解する。
【００７６】N-トリフルオロアセチル、5'-DMT、2'スクシニルピューロマイシンの合成 少量の反応スケールでは、32 mg (37μmol)の上記合成産物を、1.2当量のDMAP
と結合させ、350μlのピリジンに溶解した。この溶液に、44μlの無水CH3CNに入
った1.2当量の無水コハク酸を加えて一晩撹拌した。薄層クロマトグラフィーに
よって、出発物質が少し残っているのが分かった。大規模な反応においては、29
2 mg (336μmol)の前記産物を、3 mlのピリジンの中で、1.2当量のDMAPと結合さ
せた。これに、無水CH3CNに入った403μlの1 M無水コハク酸（Fluka）を加え、
混合液を一晩撹拌した。薄層クロマトグラフィーによって、再び、出発物質が少
し残っているのが分かった。この2つの反応液を合わせて、さらに0.2当量のDMAP
とコハク酸を加えた。この産物をトルエンとともに1回蒸発させ、高い真空状態
で、黄色い泡になるまで乾燥させた。CH2Cl2を加えて（20 ml）、15 mlの10%氷
冷クエン酸で2回抽出し、さらに2回、純水で抽出した。この産物を乾燥させて、
2 mlのCH2Cl2に再溶解し、さらに、50 mlのヘキサンを加えて撹拌しながら沈殿
させた。そして、この産物をボルテックスで撹拌してから、医療用の遠心分離器
で600 rpmで10分間遠心分離した。溶出物のほとんどを除去してから、デシケー
タの中で、最初は低い真空状態で、次に高い真空状態にして、残りの産物を乾燥
させた。この反応物の収量は約260μmolで、1段階についての収率は約70%であっ
た。
【００７７】N-トリフルオロアセチル5'-DMT、2'スクシニル、CPGピューロマイシンの合成 次に、前記段階からの産物を、1 mlのジオキサン（Fluka）で溶解してから、0
.2 mlのジオキサン/0.2 mlのピリジンに溶解した。この溶液に、40 mgのp-ニト
ロフェノール（Fluka）と、140 mgのジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC、Si
gma）を加えてから、反応を2時間進行させた。この反応で産生された不溶性のシ
クロヘキシルウレアを遠心分離して除去し、この産物溶液を、22 mlの無水DMFに
懸濁された5 gのアミノヘキシル調節多孔ガラス（CPG）に加えて、一晩撹拌した
。そして、DMF、メタノール、およびエーテルで樹脂を洗浄してから乾燥させた
。この結果できた樹脂は、1 g当り22.6μmolのトリチルを含んでいると測定され
たが、これは、このタイプの支持体について十分に許容できる範囲に含まれる。
そして、支持体に蓋をして、15 mlのピリジン、1 mlの無水酢酸、および60 mgの
DMAPとともに30分間インキュベートした。このカラム材料は、ブロッキングする
前はこのカラム材料が濃青色反応を生じたという結果とは対照的に、ニンヒドリ
ン試験で陰性（発色なし）の結果を生じた。この反応産物を、図4に示す。また
は、ピューロマイシン-CPGを購入することができる（Trilink）。
【００７８】mRNA-ピューロマイシン結合体の合成 上記で検討したように、ピューロマイシンを繋げたオリゴを用いて、2つの方
法のどちらかで、翻訳用の鋳型として働くmRNA-ピューロマイシン結合体を作製
することができる。非常に短いオープンリーディングフレームのために、ピュー
ロマイシンオリゴは、典型的には、RNAまたはDNAのモノマーとともに化学的に伸
長して、全部が合成された鋳型を作出する。より長いオープンリーディングフレ
ームが望ましいときには、一般的には、ムーアとシャープ（Moore and Sharp）
（Science, 256:992 (1992)）によって説明されているようにして、DNAスプリン
トとT4 DNAリガーゼを用いて、RNAまたはDNAオリゴをmRNAの3'末端に連結させる
。
【００７９】インビトロでの翻訳およびRNA-蛋白質融合物の試験 以下のように細菌細胞および真核細胞のインビトロ翻訳系を共に使用して、上
記のように作成した鋳型をインビトロで翻訳した。
【００８０】最小鋳型のインビトロ翻訳 （i）エルマン（Ellman）ら（Methods Enzymol. 202:301（1991））が記載す
るように調製した大腸菌（E. coli）MRE600由来のS30系（Zubay, Ann. Rev. Gen
et. 7:267（1973）；Collins, Gene 6:29（1979）；Chen and Zubay, Methods E
nzymol, 101:44（1983）；Pratt, in Transcription and Translation: A Pract
ical Approach, B. D. Hammes, S. J. Higgins, Eds.（IRL Press, Oxford, 198
4）pp.179-209; and Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301（1991））；（
ii）クドリッキ（Kudlicki）ら（Anal. Chem. 206:389（1992））が記載するよ
うに調製した同菌株由来のリボソーム分画；および（iii）レスリー（Lesley）
ら（J. Biol. Chem. 266:2632（1991））が記載するように調製した大腸菌（E.
coli）BL21由来のS30系を含むいくつかの異なるインビトロ翻訳系に43-Pおよび
関連するRNA-ピューロマイシン結合体を添加した。どの場合も、使用したプレミ
ックスはレスリー（Lesley）ら（J. Biol. Chem. 266:2632（1991））が使用し
たものであり、インキュベーション期間は30分とした。
【００８１】融合物の性質の試験 大腸菌（E. coli）のS30翻訳抽出物を使用して43-P鋳型をまず試験した。図5
は（反応「A」）は、43-Pがリボソームに結合し、fMetの鋳型であると同時にア
クセプターとして作用する、望ましい分子内（シス）反応を示す。鋳型への35S-
メチオニンの取り込みおよびその位置をまず試験し、結果を図6Aおよび図6Bに示
す。インビトロ翻訳反応混合物をフェノール/クロロホルムで抽出し、産物をSDS
-PAGEにより分析すると、35S標識バンドが43-P鋳型と同じ移動度で出現した。こ
のように合成した材料の量はMg2+濃度に依存した（図6A）。至適Mg2+濃度は9〜1
8mMであると思われ、本発明の系での翻訳の最適値と類似していた（Zubay, Ann.
Rev. Genet. 7:267（1973）；Collins, Gene 6:29（1979）；Chen and Zubay,
Methods Enzymol, 101:44（1983）；Pratt, in Transcription and Translation
: A Practical Approach, B. D. Hammes, S. J. Higgins, Eds.（IRL Press, Ox
ford, 1984）pp.179-20；Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301（1991）；
Kudlicki et al., Anal. Chem. 206:389（1992）；and Lesley et al., J. Biol
. Chem. 266:2632（1991））。さらに、取り込まれた標識はNH4OHによる処理に
安定であった（図6B）。これは、標識が分子の3'側の半部に位置し（塩基安定DN
A部分）、ピューロマイシンとfMetとの間のアミド結合に期待されるように、塩
基安定結合によって結合されてていることを示している。
【００８２】リボソームおよび鋳型依存性 上記に観察されたリボソーム上で生じた反応を明らかにするために、リボソー
ムのペプチジルトランスフェラーゼ機能の特異的阻害剤の影響を試験し（図6C）
、メチオニンをコードする配列を変更する影響を調査した（図6D）。図6Cは、反
応がペプチジルトランスフェラーゼ阻害剤であるバージニアマイシン、ゴーゲロ
チンおよびクロラムフェニコール（virginiamycin, gougerotin, and chloramph
enicol）によって強力に阻害されたことをはっきりと示している（Monro and Va
zquez, J. Mol. Biol. 28:161-165（1967）；and Vazquez and Monro, Biochemi
ca et Biophysical Acta 142:155-173（1967））。図6Dは、鋳型の1つの塩基をA
からCに変更することにより、9mMのMg2+では35Sメチオニンの取り込みを阻止し
、18mMではかなり低下させることを示す（高濃度のMg2+はメッセージを誤読する
という事実と一致する）。これらの実験は、反応が鋳型依存的にリボソーム上で
生じることを示した。
【００８３】リンカー長 リンカー長に対する反応の依存性についても試験した（図6E）。リンカーが解
読部位（鋳型のAUGが占める）からアクセプター部位（ピューロマイシン部位が
占める）までの距離にわたるように元の鋳型を設計した。距離はtRNAのアンチコ
ドンループからアクセプターステムまでの距離、すなわち約60〜70Åとほぼ同じ
であった。試験した最初のリンカーは、塩基あたり最小3.4Åであることに基づ
いて（≧102Å）、30ヌクレオチド長であった。30〜21ヌクレオチドの範囲では
（n=27 - 18; 長さ≧102 - 71 Å）、反応効率にわずかな変化が観察されただけ
であった。従って、リンカー長は変更されてもよい。21〜30ヌクレオチドのリン
カーが好ましい長さとなるが、80ヌクレオチドより短いリンカー、好ましくは45
ヌクレオチドより短いリンカーも本発明に使用することができる。
【００８４】分子内反応と分子間反応 最後に、本発明者らは、反応が望ましく分子内に生じたか（図5、反応「A」）
または分子間で生じたか（図5、反応「B」）を試験した。3'側のピューロマイシ
ンを持つが、リボソーム結合配列を持たないオリゴヌクレオチド（すなわち、鋳
型25-P、13-Pおよび30-P）を43-P鋳型を含む翻訳反応に添加することによってこ
れを試験した（図6F、6Gおよび6H）。反応が分子間機序によって生じると、比較
的短いオリゴも標識されるだろう。図6F〜Hに示すように、比較的短い3つのオリ
ゴは35Sメチオニンの取り込みがほとんどなかった。これは、反応が主に分子内
的に生じたことを示している。25-P（配列番号：10）、13-P（配列番号：9）お
よび30-P（配列番号：8）の配列を以下に示す。
【００８５】網状赤血球溶解産物 図6Hは、上記に使用した大腸菌（E. coli）以外にも、インビトロ翻訳のため
のウサギ網状赤血球溶解産物（以下を参照のこと）を使用して、35S-メチオニン
が43-P鋳型に取り込まれることができることを示す。この反応は、望ましくも、
主に分子内機序で生じた。
【００８６】c-mycエピトープタグを有する融合物の合成と試験 蛋白質部分にc-mycモノクローナル抗体9E10のエピトープタグを有する例示的
な融合物も作製した（Evan et al., Mol. Cell Biol. 5:3610（1985））。
【００８７】鋳型の設計 3種類の最初のエピトープタグ鋳型（すなわち、LP77、LP154およびプール番号
1）を設計し、図7A-Cに示す。最初の2つの鋳型はc-mycエピトープタグ配列EQKLI
SEEDL（配列番号：2）を有し、3つめの鋳型はランダム選択プールの合成に使用
する設計であった。LP77は12アミノ酸配列をコードし、コドンは細菌翻訳に最適
化していた。LP154およびその誘導体は33アミノ酸mRNA配列を有し、コドンは真
核細胞の翻訳に最適化していた。コードされたアミノ酸配列MAEEQKLISEEDLLRKRR
EQKLKHKLEQLRNSCA（配列番号：7）は、9E10抗体を単離するために使用した元の
ペプチドに相当した。プール番号1は、NNG/Cの27コドン（ランダムペプチドを作
製する）と、その下流に、mycペプチドの最後の7アミノ酸に相当する配列（myc
エピトープ配列の一部ではない）を有した。これらの配列を以下に示す。
【００８８】網状赤血球インビトロ翻訳系と小麦胚芽インビトロ翻訳系 43-P、LL77およびLP154鋳型をウサギ網状赤血球翻訳系および小麦胚芽抽出物
（プロメガ（Promega）社、ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim）社
）翻訳系の双方で試験した（図8）。翻訳は30℃で60分間実施した。4℃において
dT25アガロースを使用して鋳型を単離した。15mM NaOH、1mM EDTAを使用して鋳
型をアガロースから溶出し、NaOAc/HOAc緩衝液で中和し、速やかにエタノールで
沈殿させ（2.5〜3容量）、洗浄し（100%エタノール）、スピードバック（speedv
ac）濃縮器で乾燥した。図8は、35Sメチオニンが小麦胚芽系および網状赤血球系
の双方において3種類の全ての鋳型に取り込まれたことを示す。網状赤血球系の
融合反応では鋳型の分解はあまり観察されず、従って、この系はRNA-蛋白質融合
物の作製に好ましい。また、一般に、真核細胞系が細菌細胞系より好ましい。真
核細胞はヌクレアーゼの量がより少ない傾向にあるので、mRNAの寿命は細菌細胞
より真核細胞の方が概して10〜100倍長い。1つの特定の大腸菌（E. coli）翻訳
系を使用した実験において、c-mycエピトープをコードする鋳型を使用した融合
物の作製は観察されなかった；鋳型の種々の位置での標識は、これが鋳型のRNA
およびDNA部分の分解による可能性があることを示した。
【００８９】 これらの融合物のペプチド部分を調査するために、試料をRNaseで処理して、
コード配列を除去した。この処理により、43-P産物は32P標識30-Pオリゴとほぼ
同じ移動度で移動した。これは30-Pに添加した非常に小さいペプチド（おそらく
メチオニンのみ）に一致した。LP77は、コード配列を除去することにより、30-P
オリゴより移動度の小さい産物を生成した。これは12アミノ酸ペプチドがピュー
ロマイシンに添加されたという考えと一致する。最後に、LP154は、コード配列
を除去することにより、移動度がさらに小さい産物を生成した。これは30-Pオリ
ゴに結合した33アミノ酸配列に一致する。RNase処理LP154網状赤血球レーンには
ローディングエラーによるオリゴは観察されなかった。図9では、この産物の移
動度が小麦胚芽抽出物中に作製された産物と同じであることを示した。要約する
と、これらの結果はRNAase耐性産物が30-Pオリゴの末端に添加されたこと、産物
のサイズはコード配列の長さに比例すること、および産物は大きさがほぼ同じで
あることを示した。また、両方の系は類似した融合産物を産生したが、網状赤血
球系は鋳型の安定性が高いことによりより優れていると思われた。
【００９０】RNase AおよびプロテイナーゼK感受性 図9では、RNase AおよびプロテイナーゼKに対する感受性をLP154融合物を使用
して試験した。レーン2〜4に示すように、35Sメチオニンの取り込みはLP154鋳型
では明らかである。この産物をRNase Aで処理すると、融合物の移動度は低下す
るが、32P標識30-Pオリゴヌクレオチドよりはかなり大きかった。これは、3側末
端に33アミノ酸ペプチドを添加したことに一致する。この材料をプロテイナーゼ
Kでも処理すると、35Sシグナルは完全に消失した。これもまた、標識が30-P断片
の3'側末端のペプチドに存在するという考えに一致した。同様の結果が、43-Pと
LP77の融合物を使用した同等の実験で得られている。
【００９１】 35S Metによる鋳型の標識が翻訳の結果であること、さらに詳細にはリボソー
ムのペプチジルトランスフェラーゼ活性によって生じたことを確認するために、
標識反応に対する種々の阻害剤の影響を調べた。真核細胞のペプチジルトランス
フェラーゼの特異的な阻害剤である、アニソマイシン、ゴーゲロチンおよびスパ
ルソマイシン（anisomycin, gougerotin, and sparsomycin）（Vazquez, Inhibi
tors of Protein Biosynthesis（Springer-Verlag, New York）,pp. 312（1979
））、並びに転移阻害剤である、シクロヘキシミドおよびエメチン（cyclohexim
ide and emetine）（Vazquez, Inhibitors of Protein Biosynthesis（Springer
-Verlag, New York）,pp. 312（1979））は全て、長いmyc鋳型および網状赤血球
溶解産物翻訳抽出物を使用したとき、RNA-ペプチド融合物形成を〜95%低下した
。
【００９２】免疫沈降実験 mRNA-ペプチド融合物を免疫沈降させる効率を例示するために設計した実験で
は、インビトロ翻訳によって作製された遊離のc-mycペプチドを免疫沈降させる
試みを実施した。図10は、SDS-PAGEペプチドゲルでアッセイしたこれらの実験の
結果を示す。レーン1およびレーン2は、RNA124（LP154のRNA部分）またはβ-グ
ロビンmRNAのどちらかを含む翻訳反応の標識材料を示す。レーン3〜8は、いくつ
かの異なる緩衝液条件下において（以下に記載）、c-mycモノクローナル抗体9E1
0を使用した、これらの反応試料の免疫沈降を示す。レーン3〜5は、RNA124由来
のペプチドが効果的に免疫沈降され、最も良い例は、総TCA沈降可能計数の〜83%
が単離されたレーン4であった。レーン6〜8は、β-グロビン蛋白質をほとんど示
さない。これは精製が>100倍であることを示している。これらの結果は、RNA124
（およびLP154）によってコードされるペプチドはこの免疫沈降プロトコールに
よって定量的に単離され得ることを示した。
【００９３】融合物の免疫沈降反応 次に、本発明者らは、LP154翻訳反応およびc-mycモノクローナル抗体9E10を使
用して、キメラRNA-ペプチド産物を免疫沈降させる能力について試験した（図11
）。網状赤血球反応の翻訳産物は免疫沈降によって単離し（本明細書に記載する
ように）、室温で30分間1μgのRNaseで処理してコード配列を除去した。これに
よって5'側のOHを作製し、T4ポリヌクレオチドキナーゼで32P標識し、変性PAGE
でアッセイした。図11は、LP154融合物のRNase処理によって作製された、c-myc
エピトープと30-Pとの融合物に見られるものと同様の移動度を有する産物（上記
を参照のこと）が単離されたことを示すが、鋳型のRNA部分（RNA124）だけを翻
訳した場合には、対応する産物は作製されなかった。図12では、単離された融合
蛋白質の量を測定し、未修飾30-Pの量に対してプロットした（この図には示して
いない）。リンカー-mycペプチド融合物に対する未修飾リンカーの比の値は、取
り込まれたメッセージの0.2〜0.7%は融合産物に変換されたことを示す。より大
きいリボソーム/鋳型比が存在する場合には、より大きい割合の取り込まれたRNA
が融合蛋白質に変換された。試験した、取り込まれたmRNA濃度の範囲にわたって
、翻訳抽出物1mlあたり約0.8〜1.0×1012の融合分子が作製された。
【００９４】 また、本発明者らの結果は、RNA種に結合したペプチドはそのmRNAによってコ
ードされたことを示した。すなわち、新生ペプチドはいくつかの他のmRNAのピュ
ーロマイシンに転移しなかった。20 : 1 もの高い比で翻訳抽出物中でリンカー
（30-P）を長いmyc鋳型と共に同時インキュベーションした場合には、交差転移
を示すものは観察されず、遊離のリンカーの存在は、作製された長いmyc融合物
の量を有意には低下させなかった。同様に、短い鋳型と長い鋳型である、43-Pと
LP154の同時翻訳は、短い鋳型と長いmycペプチドとの融合に期待されるように、
鋳型が単独で翻訳された場合に観察される融合産物のみを作製し、中間の移動度
の産物は観察されなかった。これらの結果は共に、融合物の形成が新生ペプチド
と同じリボソームに結合したmRNAとの間で主に生じたことを示した。
【００９５】連続的単離 インビトロ翻訳されたLP154鋳型産物の性質をさらに確認するものとして、本
発明者らは2つの異なる種類のクロマトグラフィー媒体でのこの産物の挙動を調
査した。チオプロピル（TP）セファロースにより、遊離のシステインを有する産
物を単離することができる（例えば、C末端に隣接したシステイン残基を有するL
P154産物）（図13）。同様に、dT25アガロースにより、ポリdA配列を有する鋳型
を単離することができる（例えば、30-P）（図13）。図14は、TPセファロース次
いでdT25アガロースでの連続的な単離によりdT25アガロース単独で単離されるも
のと同じ産物を作製したことを示す。インビトロ翻訳産物がポリAトラクト（tra
ct）と遊離チオールの両方を有したということは、翻訳産物が望ましいRNA-ペプ
チド融合物であることを強く示した。
【００９６】 上記の結果はmRNA-ペプチド融合物を合成し、それらをインビトロ翻訳抽出物
から無傷で回収することをできることと一致する。このように合成された融合物
のペプチド部分は、免疫沈降および適当なクロマトグラフ技法を使用した単離に
よって明らかにされるように、目的の配列を有すると思われる。上記の結果によ
ると、反応は分子内的で、鋳型依存的に生じる。最後に、1%未満の鋳型修飾率の
場合でも、本発明の系は約1013分子の候補複合物に基づいた選択を容易にする。
【００９７】c-mycエピトープ回収選択 追加のc-mycエピトープを選択するために、ランダム領域を有する翻訳鋳型の
大きいライブラリー（例えば、1015分子）を作製した（図7Cおよび以下を参照の
こと）。このライブラリーを使用して、〜1012〜1013の融合物（本明細書に記載
されているように）を作製し、抗c-myc抗体で処理し（例えば、免疫沈降によっ
て、またはカラムもしくは他の固相支持体に固定した抗体を使用して）、インビ
トロ選択を繰り返し実施してc-mycコード鋳型を濃縮する。
【００９８】融合物形成モデル 特定の理論に結びつけることなく、本発明者らは、翻訳が正常に開始し、読み
取り枠の末端まで伸長が進行する、融合物形成機序のモデルを提案する。リボソ
ームが鋳型のDNA部分に達すると、翻訳は遅れる。この時点で、複合体は2つの運
命に分けられる：新生ペプチドの解離または新生ペプチドの鋳型の3'側末端のピ
ューロマイシンへの転移。転移反応の効率は、遅延した翻訳複合体の安定性とペ
プチジルトランスフェラーゼ中心のAサイトへの3'-ピューロマイシン残基の導入
に影響を与える数多くの要因によって制御されやすい。転移反応後では、mRNA-
ペプチド融合物は、既知の放出因子がRNAとペプチドドメインの安定なアミド結
合を加水分解することができないので、リボソームとの結合体を維持しているよ
うであった。
【００９９】 典型的な伸長モデル（Watson, Bull. Soc. Chim. Biol. 46:1399（1964））お
よび中間状態モデル（Moazed and Noller, Nature 342: 142（1989））は共に、
ピューロマイシンがペプチジルトランスフェラーゼ中心に導入されるためにAサ
イトになにも占めていないことを必要とする。開いているAサイトに導入される
ピューロマイシンにとっては、リンカーはリボソームの外側がループになってい
るか、またはAサイトを通る解読部位からペプチジルトランスフェラーゼ中心ま
で直接通過するかしなければならない。試験した最も短いリンカー（21nts）は
リボソームの外側を通過するのにも長すぎるので、本明細書に記載するデータは
これらの代替物をはっきりと区別していない。リボソーム構造のいくつかのモデ
ルでは（Frank et al., Nature 376: 441（1995））、mRNAは解読部位の一方の
側に延在する溝を通過するが、この場合には、ピューロマイシンにAサイトを通
過させてペプチジルトランスフェラーゼ中心に到達させるためには、溝からリン
カーを抜き取ることが必要であると思われる。
【０１００】 新生ペプチドのピューロマイシンへの転移は、リンカーに結合するペプチドの
均質性および長さによって明らかにされるように、伸長過程と比較してゆっくり
であると思われる。ピューロマイシンが伸長中にアミノアシルtRNAと効果的に競
合した場合には、融合産物中に存在するリンカー-ペプチド融合物はサイズが異
なることが予測されると思われる。さらに、Met-鋳型融合物と未修飾リンカーと
のゲル移動度が類似していることによって示されるように、リボソームはリンカ
ー領域に読み込まれないと思われた。dA3nは、リンカーの移動度を確かに低下さ
せる（lysinc）nをコードしなければならない。mRNAの速度の遅い抜き取りは転
移速度に比較して融合物形成速度が遅いことを説明している。予備試験による結
果は、形成された融合産物の量が、おそらく新生ペプチドがピューロマイシンま
で移行するのに利用する時間が長いために、低温での伸長された翻訳後インキュ
ベーションにより顕著に増加することを示唆している。
【０１０１】詳細な材料および方法 インビトロ翻訳およびmycエピトープタグを有する融合物を含むRNA-蛋白質融
合物の試験に関する詳細な材料と方法を以下に記載する。
【０１０２】配列 上記のRNA-蛋白質融合物を作製するために数多くのオリゴヌクレオチドを使用
した。これらのオリゴヌクレオチドは以下の配列を持つ。 オリゴヌクレオチドは全て5'側から3'側方向に掲載してある。リボヌクレオチド
塩基は、ヌクレオチドの名称の前に小文字「r」で示してある：Pはピューロマイ
シンである：rNは等量のrA、rG、rCおよびrUを示す：rSは等量のrGとrCを示す；
全ての他の塩基の名称はDNAオリゴヌクレオチドを示す。
【０１０３】化学物質 ピューロマイシンHCl、長鎖アルキルアミン制御式細孔ガラス、ゴーゲロチン
、クロラムフェニコール、バージニアマイシン、DMAP、塩化ジメチルトリチルお
よび無水酢酸はシグマケミカル（Sigma Chemical）社（ミズーリ州セントルイス
）から入手した。ピリジン、ジメチルホルムアミド、トルエン、無水コハク酸お
よびパラ-ニトロフェノールはフルカケミカル（Fluka Chemical）（ニューヨー
ク州ロンコンコマ）から入手した。β-グロビンmRNAはノバゲン（Novagen）社（
ウィスコンシン州マディソン）から入手した。TMV RNAはベーリンガーマンハイ
ム（Boehringer Mannheim）社（インディアナ州インディアナポリス）から入手
した。
【０１０４】酵素 プロテインキナーゼKはプロメガ（Promega）社（ウィスコンシン州マディソン
）から入手した。DNaseを含まないRNAaseはサムブルック（Sambrook）ら（前記
）により製造するか、またはベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim）
社から購入した。T7ポリメラーゼは報告されているグロッドベルグ（Grodberg）
およびダン（Dunn）のプロトコール（J. Bacteriol. 170:1245（1988））にザワ
ヅキー（Zawadzki）およびグロス（Gross）（Nucl. Acids Res. 19:1948（1991
））の改良を加えたものによって製造した。T4 DNAリガーゼはニューイングラン
ドバイオラブズ（New England Biolabs）（マサチューセッツ州ベバーリー）か
ら入手した。
【０１０５】放射能標識導入の定量 放射活性ゲルバンドでは、各バンドに存在する放射標識（35Sまたは32P）の量
をベータゲン（Betagen）603ブロットアナライザー（ベータゲン（Betagen）、
マサチューセッツ州ワルサム）で、またはホスホールイメージャープレート（ph
osphorimager plates）（モレキュラーダイナミクス（Molecular Dynamics）、
カリフォルニア州サニーベール）を使用して定量測定した。液体試料および個体
試料は、存在する放射能標識（35Sまたは32P）の量をシンチレーション計数（ベ
ックマン（Beckman）、メリーランド州コロンビア）によって測定した。
【０１０６】ゲル画像 ゲル画像はオートラジオグラフィー（コダック（Kodak）XARフィルムを使用）
によって、または）ホスホールイメージャープレート（phosphorimager plates
）（モレキュラーダイナミクス（Molecular Dynamics））を使用して得た。
【０１０７】CPGピューロマイシンの合成 CPG-ピューロマイシンの合成の詳細なプロトコールは上記に概略してある。
【０１０８】酵素反応 一般に、大腸菌（E. coli）抽出物を使用したキナーゼのための核酸の調製、
転写、PCRおよび翻訳反応は同じであった。各調製プロトコールは等容量の1:1フ
ェノール/クロロホルムを使用した抽出から開始し、次に遠心分離、水相の単離
であった。酢酸ナトリウム（pH 5.2）およびスペルミジンを、それぞれ最終濃度
300mMおよび1mMまで添加し、3容量の100%エタノールを添加して、-70℃において
20分間インキュベーションすることによって試料を沈殿させた。試料を＞12,000
gで遠心分離し、上清を除去し、ペレットを過剰量の95%エタノールで0℃におい
て洗浄した。得られたペレットを次いで真空下で乾燥し、再懸濁させた。
【０１０９】オリゴヌクレオチド 全ての合成DNAおよびRNAは、製造業者が提供するように（Milligen, Bedford,
MA）、各々のための標準的な化学物質を使用して、ミリポア エクスペダイト
（Millipore Expedite）合成装置で合成した。3'ピューロマイシンを有するオリ
ゴヌクレオチドは、30〜50mgの固相支持体を充填したCPGピューロマイシンカラ
ムを使用して合成した（〜20μmoleピューロマイシン/グラム）。3'ビオチンを
有するオリゴヌクレオチドはグレンリサーチ（Glen Research）（バージニア州
スターリング）製の1μmoleバイオテグ（bioteg）CPGカラムを使用して合成した
。5'ビオチンを有するオリゴヌクレオチドは5'塩基としてバイオテグホスホラミ
ダイト（bioteg phosphoramidite）（グレンリサーチ（Glen Research））を添
加することによって合成した。RNA分子の3'側末端に結合されるオリゴヌクレオ
チドは5'側末端の化学的リン酸化（グレンリサーチ（Glen Research）製の化学
的リン酸化試薬を使用）した後に脱保護するか、または脱保護後にATPおよびT4
ポリヌクレオチドキナーゼ（ニューイングランドバイオラブズ（New England Bi
olabs））を使用して酵素的にリン酸化した。DNAだけ（および3'ピューロマイシ
ンまたは3'ビオチン）を含む試料は、25%NH4OHを添加し、次に55℃で12時間イン
キュベーションすることによって脱保護した。RNAモノマー（例えば、43-P）を
含む試料は、NH4OH溶液にエタノール（25%(v/v)）を添加し、55℃で12時間イン
キュベーションすることによって脱保護した。2'OHは、1M TBAFのTHF溶液（シグ
マ（Sigma）社）を使用して室温で48時間脱保護した。TBAFはNAP-25セファデッ
クスカラム（ファルマシア（Pharmacia）、ニュージャージー州ピスカタウェイ
）を使用して除去した。
【０１１０】 望ましくは、3'ヒドロキシル基の存在に関して試験するために、ピューロマイ
シンオリゴヌクレオチドを、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて5'末端におい
て放射標識し、末端デオキシヌクレオチド転移酵素による伸長のためのプライマ
ーとして用いてもよい。ピューロマイシンの第一アミンの存在を、NHS-LC-ビオ
チン（Pierce）のようなアミン誘導試薬との反応によって調べてもよい。30-Pの
ようなオリゴヌクレオチドは、反応の際に変性PAGEにより検出可能な移動度シフ
トを示し、試薬との定量的反応を示す。ピューロマイシンが欠損したオリゴヌク
レオチドはNHS-LC-ビオチンと反応せず、移動度の変化を示さない。
【０１１１】 脱保護後のDNAおよびRNA試料は、次いで変性PAGEを使用して精製し、次にソー
キングまたは、エルトラップ（Elutrap）（シュレイチャー アンド シャクル
（Schleicher and Schuell）、ニュハンプシャー州ケーン）を使用してゲルから
電気溶出（electro-eluting）し、上記のようにNAP-25セファデックスカラムま
たはエタノール沈殿することによって脱塩した。
【０１１２】myc DNA構築 c-mycエピトープタグを有する2つのDNA鋳型を構築した。最初の鋳型は、オリ
ゴヌクレオチド64.27（5'-GTT CAG GTC TTC TTG AGA GAT CAG TTT CTG TTC CAT
TTC GTC CTC CTC CCT ATA GTG AGT CGT ATT A-3'）（配列番号：18）および18.1
09（5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG-3'）（配列番号：19）の組み合わせから製造
した。この鋳型を使用した転写は、ペプチドMEQKLISEEDLN（配列番号：20）をコ
ードしたRNA47.1を作製した。RNA47.1と30-Pとの連結は図7Aに示すLP77を作製し
た。
【０１１３】 第2の鋳型は、RWR99.6の名称を持ち、配列5'AGC GCA AGA GTT ACG CAG CTG TT
C CAG TTT GTG TTT CAG CTG TTC ACG ACG TTT ACG CAG CAG GTC TTC TTC AGA GA
T CAG TTT CTG TTC AGC CAT-3'（配列番号：21）を有する、長さ99塩基の１つの
オリゴヌクレオチドとしてまず作製した。この配列を有する2本鎖転写鋳型は、
報告されているプロトコール（Ausubel et al., 前記、15章）により、オリゴRW
R 21.103（5'-AGC GCA AGA GTT ACG CAG CTG-3'）（配列番号：22）とRWR 63.26
（5'TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA ATG GCT GAA
GAA CAG AAA CTG-3'）（配列番号：23）を用いたPCRによって構築した。この鋳
型を使用した転写は、ペプチドをコードする、RNA124と呼ばれるRNAを作製した
。 MAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLRNSCA（配列番号：24）、このペプチドは、担体
蛋白質（オンコジーン サイエンス テクニカル ブルチン（Oncogene Science
Technical Bullutin））と結合したとき、モノクローナル抗体9E10を産生する
ために使用される配列を有した。RNA124は長さが124ヌクレオチドで、RNA124と3
0-Pとの連結は図7Bに示すLP154を作製した。RNA124の配列を以下に示す（配列番
号：32）： 5'-rGrGrG rArCrA rArUrU rArCrU rArUrU rUrArC rArArU rUrArC rArArUrG rGrC
rU rGrArA rGrArA rCrArG rArArA rCrUrG rArUrC rUrCrU rGrArA rGrArA rGrArC
rCrUrG rCrUrG rCrGrU rArArA rCrGrU rCrGrU rGrArA rCrArG rCrUrG rArArA r
CrArC rArArA rCrUrG rGrArA rCrArG rCrUrG rCrGrU rArArC rUrCrU rUrGrC rGr
CrU-3'。
【０１１４】ランダムプール構築 ランダムプールは、RWR130.1と命名される長さ130塩基の1つのオリゴヌクレオ
チドとして構築した。3'側末端から開始して、配列は3'CCCTGTTAATGATAAATGTTAA
TGTTAC(NNS)27GTC GAC GCA TTG AGA TAC CGA-5'（配列番号：25）であった。Nは
ランダム位置を示し、この配列は合成機の標準的なプロトコールにより作製した
。SはdGとdC塩基の等量混合物を示す。PCRはオリゴヌクレオチド42.108（5'-TAA
TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA）（配列番号：26）と
21.103（5'-AGC GCA AGA GTT ACG CAG CTG）（配列番号：27）を用いて実施した
。この鋳型の転写はプール130.1と命名されるRNAを作製した。プール130.1を30-
Pに連結すると、図7Cに示すプール番号1（LP160とも呼ばれる）を作製する。
【０１１５】 （i）RWR130.1の出発濃度は30ナノモルであった、（ii）各プライマーを1.5μ
Mの濃度で使用した、（iii）dNTP濃度が各塩基について400μMであった、および
（iv）Taqポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim）社）
を100μlあたり5単位の濃度で使用したこと以外は、報告されているプロトコー
ル（Ausubelら、前記）により7サイクルのPCRを実施した。2本鎖産物を非変性PA
GEで精製し、電気溶出によって単離した。DNAの量は260nmのUV吸光度と臭化エチ
ジウム蛍光発光の既知の標準品との比較によって測定した。
【０１１６】RNAの酵素的合成 2本鎖PCR DNAおよび合成オリゴヌクレオチドの転写反応は、以前に記載したよ
うに（Milligan and Uhlenbeck, Meth. Enzymol. 180:51（1989））実施した。
全長のRNAを、上記のように変性PAGE、電気溶出および脱塩により精製した。プ
ールRNA濃度は、吸光係数1300 O.D./μmole; RNA 124、1250 O.D./μmole; RNA
47.1、480 O.D./μmoleを使用して推定した。2本鎖プールDNAからの転写は〜90
ナノモルのプールDNAを作製した。
【０１１７】RNA-ピューロマイシン複合物の酵素的合成 mycおよびプールメッセンジャーRNA配列の、オリゴヌクレオチドを有するピュ
ーロマイシンとの連結を、ムーア（Moore）およびシャープ（Sharp）（Science
250:992（1992））が記載する手順と類似した手順を使用して、19.35（5'-TTT T
TT TTT TAG CGC AAG A）（配列番号：28）と呼ばれるDNAスプリント（splint）
を使用して実施した。反応はmRNA、スプリントおよびピューロマイシンオリゴヌ
クレオチド（30-P、dA27dCdCP）がモル比0.8:0.9:1.0であり、プールmRNA1ピコ
モルあたりDNAリガーゼは1〜2.5単位であった。反応は室温において1時間実施し
た。プールRNA融合物の構築は、mRNA濃度は〜6.6μMであった。連結後、RNA-ピ
ューロマイシン結合体を酵素反応について上記したように調製した。上記のよう
に、沈殿を再懸濁し、全長の融合物を変性PAGEで精製し、電気溶出により単離し
た。プールRNA濃度は吸光計数1650 O.D./μmoleおよびmyc鋳型1600 O.D./μmole
を使用して推定した。この方法では、2.5ナノモルの結合体が作製された。
【０１１８】dT25ストレプトアビジンアガロースの調製 3'ビオチンを含み（バイオテグホスホルアミダイト（biotag phosphoramidite
）カラム（グレン リサーチ（Glen Research）で合成）NAP-25カラム（Phaemac
ia）で脱塩されたdT25を、1μM〜10μM又は1〜20μMの濃度で、ストレプトアビ
ジンアガロースのスラリー（50容量%のアガロース、ピアース（Pierce）社、イ
リノイ州ロックフォード）と共にTE（10mM Tris Chloride pH8.2, 1mM EDTA）中
で室温において1時間インキュベーションし、洗浄した。次いで、アガロースの
結合能力を、溶液からのビオチン-dT25の消失によって、および／または既知量
の相補的なオリゴヌクレオチドを含む樹脂を滴下することによって、光学的に推
定した。
【０１１９】大腸菌（E. coli）由来抽出物およびリボソームを使用した翻訳反応 一般に、購入したキット（例えば、直鎖鋳型のためには大腸菌（E. coli）S30
抽出物、プロメガ（Promega）社、ウィスコンシン州マディソン）を使用して翻
訳反応を実施した。しかし、大腸菌（E. coli）MRE600（ATCCから入手、メリー
ランド州ロックビル）も使用して、報告されているプロトコール（例えば、Ellm
an et al., Meth. Enzymol. 202:301（1991））によって調製したS30抽出物を作
製し、またクドリッキ（Kudlicki）ら（Anal. Biochem. 206:389（1992））が記
載するようにリボソーム分画を調製した。マーカーとして20〜40μCiの35Sメチ
オニンを用いて50μlの容量で標準的な反応を実施した。反応混合物は、30v/v%
抽出物、9〜18mM MgCl2、メチオニンを除いた40v/v%プレミックス（プロメガ（P
romega）社）および5μMの鋳型（例えば、43-P）からなった。同時インキュベー
ション実験では、オリゴ13-Pおよび25-Pを5μMの濃度で添加した。リボソームを
使用した実験では、溶解物の代わりに反応につき3μlのリボソーム溶液を添加し
た。全ての反応は37℃において30分間インキュベーションした。酵素反応下で上
記のように鋳型を精製した。
【０１２０】小麦胚芽翻訳反応 製造業者の勧告に従い、メチオニンを含まない購入キット（プロメガ（Promeg
a）社を使用して図8の翻訳反応を実施した。鋳型の濃度は43-Pでは4μMで、LP77
およびLP154では0.8μMであった。反応は、30μCi35Sメチオニンを用いて総容量
25μlで25℃において実施した。
【０１２１】網状赤血球翻訳反応 購入キット（ノバゲン（Novagen）社、ウィスコンシン州マディソン）または
報告されているプロトコール（Jackson and Hunt, Mrth. Enzymol. 96:50（1983
））により調製した抽出物を使用して翻訳反応を実施した。網状赤血球が豊富な
血液はペル-フリーズバイオロジカルズ（Pel-Freez Biologicals）（アラスカ州
ロジャーズ）から入手した。両者の場合、反応条件はレッドノバリセート（Red
Nova Lysate）（ノバゲン（Novagen）社）と共に使用することが勧められるもの
であった。反応は、100mM KCl、0.5mM MgOAc、2mM DTT、20mM HEPES pH 7.6、8m
Mリン酸クレアチン、各アミノ酸の25μM（35Sを使用した場合には、メチオニン
を除く）および40v/v%の溶解物からなった。インキュベーションは30℃で1時間
とした。鋳型の濃度は実験に依存したが、一般に、50nM〜1μMであり、43-Pは例
外で4μMであった（図6H）。
【０１２２】 ランダムプールの作製は、10mlの翻訳反応を鋳型濃度〜0.1μM（1.25ナノモル
の鋳型）において実施した。また、32Ｐ標識鋳型を反応物中でインキュベーショ
ンし、精製および選択手順の各段階に存在する材料の量を測定した。30℃におい
て1時間の翻訳の後、反応物を氷上で30〜60分間冷却した。
【０１２３】dT25ストレプトアビジンアガロース又はオリゴdTセルロースを用いた融合物の単 離 インキュベーション後、翻訳反応物を、dT25濃度が〜10μMである10倍モル量
より過剰量のdT25-ビオチン-ストレプトアビジンアガロース又はオリゴdTセルロ
ース（Pharmacia）を含有する単離緩衝液（1.0M NaCl、0.1M Tris Chloride pH
8.2、10mM EDTA、及び1mM DTT又は0.2％ Triton X-100）で約150倍に希釈し（溶
解物の容量に等しいかまたはそれ以上の容量のスラリー）、4℃において1時間攪
拌しながらインキュベーションした。次いで、ろ過（ミリポア（Millipore）ウ
ルトラフリーMCフィルター）または遠心分離のいずれかによってアガロースを混
合物から除去し、冷却した単離緩衝液で2〜4回洗浄した。次いで、15mM NaOH、4
℃の1mM EDTA又は室温の純水の50〜100μlアリコートで繰り返し洗浄することに
よって、dT25ストレプトアビジンアガロースから鋳型を遊離させた。溶出液を速
やかに3M NaOAc pH5.2、10mMスペルミジンで中和し、エタノールで沈殿させるか
又は次の精製段階に直接用いた。プール反応物では、回収した総放射能が、導入
された鋳型の約50〜70%は回収されたことを示した。
【０１２４】チオプロピルセファロースによる融合物の単離 システインを含有する融合物は、図13のように、チオプロピルセファロース6B
を使用して精製することができる（ファルマシア（Pharmacia））。本明細書に
記載する実験では、単離は翻訳反応物から直接実施したり、または融合物を最初
に単離した後に実施した（例えば、ストレプトアビジンアガロースを用いて）。
例えば、直接精製する場合には、溶解物に対するセファロースの比は1:10（v/v
）を使用した。プールでは、0.5mlのセファローススラリーを使用して、5mlの反
応混合物から融合材料の全てを単離した。DNaseを含まないRNase（ベーリンガー
マンハイム（Boehringer Mannheim）社）を含有する1倍量のTE8.2（10mM Tris-C
l、1mM EDTA、pH8.2）で試料をチオプロピルセファロースの50:50（v/v）スラリ
ーに希釈し、4℃において回転させながら1〜2時間インキュベーションし、完全
に反応させた。過剰の液体を除去し、20mM DTTを含有する単離緩衝液でセファロ
ースを繰り返し洗浄し、遠心分離またはろ過により回収した。25〜30mMのジチオ
スレイトール（DTT）の10mM Tris Chloride pH 8.2、1mM EDTA溶液を使用して融
合物をセファロースから溶出した。次いで、上記のように、高真空下での留去及
びエタノール沈殿を組み合わせることによって、融合物を濃縮し、また望ましい
ならば、SDS-トリシン-PAGEによって分析した。プール反応物では、回収した総
放射能が、鋳型の約1%が融合物に変換したことを示した。
【０１２５】 所与の用途のためには、dT25をこの溶出液に添加して、4℃において1時間回転
させた。冷却した単離緩衝液でアガロースを3回すすぎ、ろ過によって単離し、
結合材料を上記のように溶出させた。担体tRNAを添加し、融合産物をエタノール
沈殿させた。DNaseを含まないRNase Aを含有するTE pH8.2に試料を再懸濁し、鋳
型のRNA部分を除去した。
【０１２６】免疫沈降反応 4μlの網状赤血球翻訳反応物、2μlの正常マウス血清および20μlのプロテイ
ンG+Aアガロース（カルビオケム（Calbiochem）社、カリフォルニア州ラホヤ）
とPBS（58mM Na2HPO4、17mM NaH2PO4、68mM NaCl）、希釈緩衝液（10mM Tris Ch
loride pH 8.2、140mM NaCl、1v/v% Triton X-100）、またはPBSTDS（PBS+1% Tr
iton X-100、0.5%デオキシコール酸塩、0.1%SDS）のいずれかの200μlとを混合
することによって、翻訳反応物のペプチドの免疫沈降（図10）を実施した。次い
で、試料を4℃において1時間回転させ、次に2500rpmで15分間遠心分離した。溶
出液を除去し、10μlのc-mycモノクローナル抗体9E10（カルビオケム（Calbioch
em）社、カリフォルニア州ラホヤ）および15μlのプロテインG+Aアガロースを添
加し、4℃において2時間回転した。次いで、試料をPBS、希釈緩衝液またはPBSTD
Sのいずれかの1mlで２回洗浄した。40μlのゲルローディング緩衝液（カルビオ
ケム（Calbiochem）社製品便覧）を混合物に添加し、シャガー（Schagger）およ
びファン ジャゴウ（von Jagow）（Anal. Biochem. 166:368（1987））が記載
するように、20μlを変性PAGEにローディングした。
【０１２７】 8μlの網状赤血球翻訳反応物と300μlの希釈緩衝液（10mM Tris chloride pH
8.2、140mM NaCl、1v/v%Triton X-100）、15μlプロテインGセファロース（シグ
マ（Sigma）社）および10μl（1μg）のc-myc抗体9E10（カルビオケム（Calbioc
hem）社）を混合することによって融合物の免疫沈降（図11に示す）を実施し、
次に4℃において数時間回転した。単離後、試料を洗浄し、DNaseを含まないRNas
e Aで処理し、ポリヌクレオチドキナーゼと32PガンマATPで標識し、変性尿素PAG
Eによって分離した（図11）。
【０１２８】融合物プールの逆転写 鋳型、水およびプライマーを70℃においてわずか2分間インキュベーションし
た以外は、スーパースクリプト（Superscript）IIに関する製造業者の推奨事項
に準拠して逆転写反応を実施した（ギブコ（Gibco）BRL、ニューヨーク州グラン
ドアイランド）。伸長をモニターするために、50μCiのα32PdCTPをいくつかの
反応物中でインキュベーションし、別の反応物中では、32PαATP（ニューイング
ランドヌクレアー（New England Nuclear）社、マサチューセッツ州ボストン）
とT4ポリヌクレオチドキナーゼ（ニューイングランドバイオラブズ（New Englan
d Biolabs）、マサチューセッツ州ベバリー）を使用して調製した5'32P-標識プ
ライマーを使用して逆転写をモニターした。
【０１２９】プロテインGおよび抗体セファロースの調製 50μlのプロテインGセファローススラリー（固形分50容量%）（Sigma）の２分
量を希釈緩衝液（10mM Tris chloride pH 8.2、140mM NaCl、0.025% NaN3、1v/v
% Triton X-100）で洗浄し、遠心分離によって単離した。最初の分は、選択マト
リックスに先立つプレカラムとして使用するために保存した。2番目の分を希釈
緩衝液に再懸濁した後、40μgのc-myc AB-1モノクローナル抗体（オンコジーン
サイエンス（Oncogene Science））を添加し、反応物を4℃において一晩回転さ
せながらインキュベーションした。次いで、1500〜2500rpmで15分間微小遠心管
中で遠心分離することによって抗体セファロースを精製し、希釈緩衝液で1〜2回
洗浄した。
【０１３０】選択 融合物を単離し、相補鎖を合成後、逆転写反応物全てを選択過程において直接
使用した。２つのプロトコールを本明細書において概略する。1回目は、上記の
ように調製した抗体セファロースに逆転写反応物を直接添加し、2時間インキュ
ベーションした。次の回では、洗浄したプロテインGセファロースと共に反応物
を〜2時間インキュベーションし、その後抗体カラムを通過させ、固定された抗
体ではなくプロテインGと相互作用する結合物質の数を低下させた。
【０１３１】 マトリックスからプールを溶出するために、いくつかの方法を採用することが
できる。最初は、4%酢酸による選択マトリックスの洗浄である。この手順は、マ
トリックスからペプチドを遊離させる。または、よりストリンジェントな洗浄（
例えば、尿素または他の変性物質を使用）を酢酸方法の代わりに、または酢酸方
法に追加して使用することができる。
【０１３２】選別した融合体のPCR プールの構築に関して上記に記載されたように、標準的なプロトコールを用い
たPCRにより、選別した分子を増幅する（例えば、Fitzwater及びPolisky, Meth.
Enzymol. 第267巻：第275頁（1996年）；ならびにConradら、Meth. Enzymol.
第267巻：第336頁（1996年））。増幅させたプールが選別を行ったものからもた
らされたと確認するために、この段階でPCRの対照を行うことが望ましい。プラ
イマーの精製度が最も重要である。プール配列または対照構築に混入物が生じう
る場合に、入力鋳型非存在下で組合せが増幅されるはずである。混入物が検出さ
れる場合には新規のプライマーを合成するべきである。cDNAが汚染されていない
ことを確認するために、単離された融合体もまたRT段階の前にPCRに供されねば
ならない。最後に、選別前後のPCR反応に必要なサイクル数を比較するべきであ
る。所与の配列の増幅に必要なサイクル数が多い（25回〜30回より多いPCR）と
、プライマー対とのRT反応の失敗または問題が示されうる。
【０１３３】β-グロビン融合体の合成および試験 β-グロビン融合構築物を合成するため、製造元のプロトコルに従って、グロ
ビンmRNA 2.5 μgからプライマー18.155（5' GTG GTA TTT GTG AGC CAG）（配列
番号：29）およびスーパースクリプト逆転写酵素（Gibco BRL社 ）200ピコモル
を用いた逆転写によってβ-グロビンcDNAを作製した。プライマー配列は、停止
コドンのβ-グロビン5'の18ヌクレオチドと相補的であった。T7プロモーターを
加えるために、逆転写反応液20 μlを採取して、プライマー18.155および40.54
（5' TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAC TTG CTT TTG ACA CAA C）（配列番号：
30）を用いたPCR６サイクルを行った。次に、得られた「syn-β-グロビン」mRNA
を、ミリガン＆アーレンベック（Milligan and Uhlenbeck）（Methods Enzymol.
180：51（1989））に従ってT7ランオフ転写によって生成し、RNAゲルを精製して
、電気溶出して本明細書に記述のように脱塩した。次に、ムーア＆シャープ（Mo
ore and Sharp）（Science 256：992（1992））の方法に従って、プライマー20.
262（5' TTT TTT TTT T GTG GTA TTT G）（配列番号：31）をスプリントとして
用いて、「LP-β-グロビン」をsyn-β-グロビン構築物から、同構築物を30-Pと
ライゲーションすることによって生成した。次にライゲーション反応産物をゲル
精製して、電気溶出し、上記のように脱塩した。最終産物の濃度は260 nmでの吸
光度から決定した。
【０１３４】 次に、これらのβ-グロビン鋳型を表１に記述のように総容量それぞれ25 μl
でインビトロで翻訳した。25 mM原液からMg2+を加えた。反応は全て30℃で１時
間行い、-20℃で一晩放置した。次に、溶解物６μlを用いてdT25沈殿可能なCPM
を２回測定し、バックグラウンドを差し引いた値を平均した。
【０１３５】
【表１】 β-グロビン鋳型を用いた翻訳反応
【０１３６】 ゲル分析用の試料を調製するため、各翻訳反応液６μlを単離用緩衝液（1 M N
aCl、100 mMトリスCl pH 8.2、10 mM EDTA、0.1 mM DTT）1000 μl、RNアーゼA
（DNアーゼ不含、Boehringer Mannheim社）１μl、および20 μM dT25ストレプ
トアビジンアガロース20 μlと混合した。試料を回転させながら４℃で１時間イ
ンキュベートした。過剰量の単離用緩衝液を除去して、試料をミリポア（Millip
ore）MCフィルターに加えて、残留単離用緩衝液を除去した。次に試料をH2O 50
μlで４回洗浄して15 mM NaOH、1 mM EDTA 50 μlで２回洗浄した。試料（300
μl）をTE pH 6.8（10 mMトリスCl、1 mM EDTA）100 μlで中和して１mg/ml RN
アーゼA（上記）１μlを加え、試料を37℃でインキュベートした。次に、２×SD
Sローディング用緩衝液（125 mMトリスCl、pH 6.8、２％SDS、２％β-メルカプ
トエタノール20％グリセロール、0.001％ブロモフェノールブルー）10 μlを加
え、試料を凍結乾燥させてH2O および１％β-メルカプトエタノール20 μlに再
懸濁した。次に、シャガー＆フォンヤゴウ（Schagger and von Jagow）（Analyt
ical Biochemistry 166：368（1987））が記述したように、ペプチド分解ゲル上
に試料をローディングしてオートラジオグラフィーによって可視化した。
【０１３７】 これらの実験の結果を図15Aおよび15Bに示す。図15Aに示すように、35S-メチ
オニンをsyn-β-グロビンおよびLP-β-グロビンの蛋白部分に取り込ませた。蛋
白は不均一であったが、１つの強いバンドがβ-グロビンmRNAについて予想され
る移動度を示した。同様に、図15Bに示すように、dT25単離およびRNアーゼA消化
の後、syn-β-グロビンのレーンには35S-標識材料は残っていなかった（図15B、
レーン２〜４）。対照的に、LP-β-グロビンのレーンでは、均一な大きさの35S-
標識産物を認めた。
【０１３８】 これらの結果から、上記のように、鋳型が3'ピューロマイシンを含む場合に限
って、融合産物がオリゴヌクレオチドアフィニティクロマトグラフィーによって
単離されることが示された。このことはシンチレーションカウントによって確認
した（表１参照）。得られた材料は、β-グロビンの何らかの部分と融合した30-
Pリンカーを含むと予想される。融合産物はゲル分析から判断する限り、大きさ
が全く均一であるように思われた。しかし、産物は天然のβ-グロビンと非常に
類似の移動度を示したため（図15Aおよび15B、対照レーン）、融合産物の蛋白部
分の正確な長さを測定することは困難であった。
【０１３９】RNA蛋白融合体形成のさらなる最適化 特定の要因がRNAペプチド融合体の形成効率をさらに増加させることが判明し
た。融合体形成、すなわちmRNAの3'末端でのそのtRNAからピューロマイシン部分
への未完成のペプチド鎖の移動は、未完成のペプチドを生成する初回の比較的迅
速なオープンリーディングフレームの翻訳の後に続く遅い反応である。融合体形
成の程度は、Mg2+濃度を上昇させた条件（好ましくは、50〜100 mMの範囲）下で
の翻訳後インキュベーションによって、および／またはmRNAとピューロマイシン
部分との間により柔軟なリンカーを用いることによって、実質的に増強される可
能性がある。さらに、低温（好ましくは-20℃）での長期間のインキュベーショ
ン（12〜48時間）によっても、30℃でのインキュベーションの際に起こる場合よ
りmRNA分解が少ない融合体の収率増加が得られる。これらの要因を組み合わせる
ことによって、下記に示すように、加えたmRNAの40％までがmRNAペプチド融合産
物に変換される可能性がある。
【０１４０】mRNA-ピューロマイシン結合体の合成 これらの最適化実験において、ピューロマイシン含有リンカーオリゴヌクレオ
チドを、おおよそ上記のように相補的DNAスプリントの存在下でバクテリオファ
ージT4 DNAリガーゼを用いて、mRNAの3'末端にライゲーションした。T4 DNAリガ
ーゼは、ライゲーション結合部近傍で正確な塩基対形成を嗜好し、T7、T3または
SP6 RNAポリメラーゼによるランオフ転写産物はしばしばその3'末端が不均一で
あるため（Nucleic Acids Research 15：8783（1987））、正しい3'-末端ヌクレ
オチドを含むRNAのみが効率よくライゲーションされた。標準的なDNAスプリント
を用いた場合、ランオフ転写産物の約40％がピューロマイシンオリゴとライゲー
ションされた。RNA量が過剰であればライゲーション産物の量は増加したが、ピ
ューロマイシンオリゴヌクレオチドが過剰である場合は増加しなかった。特定の
理論にとらわれることなく、ライゲーションの制限要因はDNAスプリントの対応
する領域と完全に相補的であるRNAの量であるように思われた。
【０１４１】 それらの転写物のライゲーションを3'末端で余分の非鋳型ヌクレオチドで終わ
らせるために（「N+1産物」と命名する）、標準的なDNAスプリントと、ライゲー
ション結合部でさらなるランダム塩基を含む新たなDNAスプリントとの混合物を
用いた。ライゲーション効率は、そのような混合DNAスプリントの存在下では典
型的なmyc RNA鋳型（すなわちRNA 124）の場合70％以上増加した。
【０１４２】 この改変DNAスプリントアプローチの他に、mRNA-ピューロマイシン結合体形成
の効率は、以下の３つの要因を考慮に入れることによってもさらに最適化された
。第一に、好ましくは、スプリントヌクレオチドとのアニーリングを妨害する何
らかの有意で安定な二次構造を有する3'-末端を欠損するmRNAを構築または利用
した。さらに、高濃度の塩は時にライゲーション反応の失敗を引き起こすため、
好ましくは、NAP-25カラムを用いたオリゴヌクレオチドの完全な脱塩を、技法の
１段階として含めた。最後に、ライゲーション反応は比較的迅速で、室温では40
分以内におおむね完了したため、有意に長いインキュベート期間は一般に用いら
れず、しばしばRNAの不必要な分解が起こった。 上記の条件を用いて、mRNA-ピューロマイシン結合体を以下のように合成した
。myc RNA配列（RNA 124）とピューロマイシン含有オリゴヌクレオチドとのライ
ゲーションは、標準的なDNAスプリント（例えば、5'-TTTTTTTTTTAGCGCAAGA）（
配列番号：32)またはライゲーション結合部にランダム塩基（N）を含むスプリン
ト（例えば、5'-TTTTTTTTTTNAGCGCAAGA）（配列番号：33)のいずれかを用いて行
った。反応はmRNA、DNAスプリント、およびピューロマイシンオリゴヌクレオチ
ドをモル比1.0：1.5〜2.0：1.0で含んだ。代替的モル比1.0：1.2：1.4もまた用
いられうる。これらの成分の混合物をまず、94℃で１分間加熱して、次に氷上で
15分冷却した。ライゲーション反応は、50 mMトリス塩酸（pH 7.5）、10 mM MgC
l2、10 mM DTT、１mM ATP、25 μg/ml BSA、15 μMピューロマイシンオリゴ、15
μM mRNA、22.5〜30 μM DNAスプリント、RNasin阻害剤（Promega社）１U/μl
、およびT4 DNAリガーゼをピューロマイシンオリゴ１ピコモルあたり1.6単位を
含む溶液中で室温で１時間行った。インキュベーションの後、EDTAを最終濃度30
mMとなるように加え、反応混合物をフェノール／クロロホルムで抽出した。PAG
Eを変性させて全長の結合物を精製し、電気溶出によって単離し、脱塩した。
【０１４３】網状赤血球翻訳条件全般 mRNA-ピューロマイシン結合体の合成を改善することに加えて、翻訳反応を以
下のようにさらに最適化した。反応は、異なる販売元（Novagen社、Madison、WI
；Amersham社、Arlington Heights, IL；Boehringer Mannheim社、Indianapolis
、IN；Ambion社、Austin、TX；およびPromega社、Madison、WI）のウサギ網状赤
血球溶解物において実施した。典型的な反応混合物（最終容量25 μl）は、20 m
M HEPES pH 7.6、２mM DTT、８mM燐酸クレアチン、100 mM KCl、0.75 mM Mg(OAc
)2、１mM ATP、0.2 mM GTP、25 μM各アミノ酸（35S-Metを用いる場合には0.7
μMメチオニン）、RNasin１U/ml、および60％（v/v）溶解物を含んだ。鋳型の最
終濃度は50 nM〜800 nMの範囲であった。各インキュベーションについて、溶解
物を除く全ての成分を氷上で注意深く混合して、凍結した溶解物を使用直前に融
解した。溶解物を加えた後、反応混合物を緩やかなピペッティングによって十分
に混合して、30℃でインキュベートして翻訳を開始させた。Mg2+およびK+の至適
濃度は異なるmRNAについてそれぞれ、0.25 mM〜２mMおよび75 mM〜200 mMの範囲
内で、好ましくは予備実験において決定した。翻訳の不十分なmRNAに関しては特
に、ヘミン、燐酸クレアチン、tRNA、およびアミノ酸の濃度もまた時に最適化し
た。融合反応に関しては、酢酸カリウムより塩化カリウムが一般に好ましかった
が、KClとKOAcの混合物は時によりよい結果を生じた。
【０１４４】 30℃で30〜90分間翻訳した後、反応を氷上で40分冷却し、Mg2+又はK+を加えた
。この段階で加えたMg2+の最終濃度もまた、異なるmRNA鋳型について最適化した
が、一般に50 mM〜100 mMの範囲であった（混合鋳型のプールには50 mMを用いる
ことが好ましい）。添加されたK+の量は一般に125mM〜1.5Mの範囲であった。Mg2 + の反応に関しては、得られた混合物は好ましくは-20℃で16〜48時間インキュベ
ートされたが、12時間ほどの短い間インキュベートされることもできた。K+又は
Mg2+/K+が添加された場合、混合物は室温で一時間インキュベートされた。
【０１４５】 標識した融合産物を可視化するために、反応混合物２μlをローディング用緩
衝液４μlと混合して、混合物を75℃で３分間加熱した。得られた混合物を６％
グリシンSDS-ポリアクリルアミドゲル（32P-標識鋳型用）または８％トリシンSD
S-ポリアクリルアミドゲル（35S-Met標識鋳型用）にローディングした。このア
プローチの代用として、融合産物はまた、おおむね本明細書に記述のように、dT 25 ストレプトアビジンアガロースまたはチオプロピルセファロース（またはその
両者）を用いて単離してもよい。
【０１４６】 SDS-PAGEによって後に分析するため、RNA-リンカー-ピューロマイシン-ペプチ
ド結合体のRNA結合部分を除去するために、適当量のEDTAを翻訳後インキュベー
ションの後に加え、反応混合物をミクロコン-10（またはミクロコン-30）カラム
を用いて脱塩した。得られた混合液２μl（全体で約25 μl）を、RNアーゼH緩衝
液（30 mMトリス塩酸、pH 7.8、30 mM(NH4)2SO4、８mM MgCl2、1.5 mMβ-メルカ
プトエタノール、および適当量の相補的DNAスプリント）18 μlと混合し、混合
液を４℃で15分間インキュベートした。次にRNアーゼHを加え、37℃で20分消化
させた。
【０１４７】ピューロマイシンオリゴの質 ピューロマイシンオリゴヌクレオチドの質も、融合産物の効率的な生成にとっ
て重要であった。5'-DMT、2'-スクシニルN-トリフルオロアセチルピューロマイ
シンとCPGとのカップリングは、標準的なヌクレオチドのカップリングほど効率
的ではなかった。そのため、カップリング反応を注意深くモニターして、カップ
リングしたピューロマイシンの濃度をかなり低くしてCPGが形成されないように
し、3'-末端ピューロマイシンを欠損するオリゴヌクレオチドが続いて合成され
ないようにするため、CPG上の未反応のアミノ基を十分に消滅させた。また、こ
れらは続く自動化オリゴヌクレオチド合成段階の際にバルブの目詰まり問題を引
き起こしうるため、非常に細かいメッシュ粒子を含むCPGを用いないようにする
ことも重要である。
【０１４８】 さらに、合成されたピューロマイシンオリゴは、3'末端でピューロマイシンが
存在することを確認するために、大規模で使用する前に試験することが好ましい
。われわれの実験では、ピューロマイシンを3'末端で一級アミノ基を含むデオキ
シアデノシンに置換すれば、融合体は検出されなかった。3'ヒドロキシル基の有
無を調べるために（すなわち、3'-末端ピューロマイシンを欠損するオリゴの望
ましくない合成）、ピューロマイシンオリゴをまず放射標識し（例えば5'-燐酸
化）、次にプライマーとして用いてターミナルデオキシヌクレオチジルトランス
フェラーゼによって伸長させた。3'-末端ピューロマイシン部分の存在下では、
伸長産物を認めなかった。
【０１４９】翻訳および翻訳後インキュベーションの時間経過 翻訳反応は比較的迅速で、30℃では概して25分以内に完了した。しかし、融合
反応は遅かった。標準的なリンカー（dA27dCdCP）を30℃で用いた場合、融合体
の合成はさらに45分で最高レベルに達した。翻訳後インキュベーションはより低
い温度、例えば室温、０℃、または-20℃で実施することが可能であった。-20℃
ではmRNA鋳型の分解はより少なかったが、最善の融合結果は-20℃で２日間イン
キュベートした後に得られた。
【０１５０】Mg2+濃度の効果 翻訳後インキュベーションの際にMg2+の濃度が高ければ、融合体形成は大きく
刺激された。例えば、上記のようなmyc RNA鋳型では、50 mM Mg2+の存在下で標
準的なリンカー（dA27dCdCP）を用いて-20℃で16時間インキュベートすると、融
合体形成の３〜４倍刺激を認めた（図17、レーン３と４の比較）。効率的な融合
体形成はまた、反応を室温で30〜45分実施した場合、50〜100 mM Mg2+濃度の存
在下で翻訳後インキュベーションを用いた場合に認めた。
【０１５１】 同様に、250mM〜500mMのK+を添加することにより、K+非添加対照と比較して7
倍以上融合体形成が増加した。最適K+濃度は一般的に300mM〜600mMの間である（
プールについては500mM）。また翻訳後にNH4Clを添加することによっても融合体
形成は増加した。陰イオンとしてのOAc- かCl-という選抜は、融合体形成に対し
て明確な効果をもたなかった。
【０１５２】リンカーの長さおよび配列 融合反応のリンカーの長さへの依存性を調べた。21ヌクレオチド及び30ヌクレ
オチド（n＝18〜27）の範囲では、融合反応の効率にほとんど変化を認めなかっ
た（上記のように）。19ヌクレオチド及び30ヌクレオチドに関しても同様の結果
が得られ、25ヌクレオチドのリンカーに関して最も融合体形成が多く観察された
。より短いリンカー（例えば長さが13ヌクレオチド又は16ヌクレオチド）及びよ
り長いリンカー（例えば長さが40ヌクレオチド以上長いリンカー）は、よりとて
も少ない融合体形成をもたらした。さらに、長さがより長い特定のリンカー（す
なわち、45ヌクレオチドおよび54ヌクレオチド）も同様に幾分低い融合効率であ
ったが、さらにより長いリンカーを用いても融合反応の効率が最適となる可能性
がある。
【０１５３】 リンカー配列に関しては、3'末端近傍のデオキシヌクレオチド残基をリボヌク
レオチド残基に置換しても、融合効率は有意に変化しなかった。しかし、リンカ
ーの3'末端でのdCdCP（またはrCrCP）配列は融合体形成にとって重要であった。
dCdCPをdUdUPに置換すると、融合体の形成効率は有意に減少した。
【０１５４】リンカーの柔軟性 融合反応のリンカーの柔軟性に及ぼす依存性についても試験した。これらの実
験において、3'末端近傍での相補的オリゴヌクレオチドによるアニーリングによ
ってリンカーの強直性が増加すれば、融合効率は低くなることが明らかになった
。同様に、より柔軟なリンカー（例えば、dA21C9C9C9dAdCdCP、ここでC9はHO(CH 2 CH2O)3PO2)を表す）を用いれば、融合効率は有意に改善した。標準的なリンカ
ー（dA27dCdCP）と比較すると、より柔軟なリンカー（dA21C9C9C9dAdCdCP）を用
いれば、RNA 124の融合効率は４倍以上改善した（図17、レーン１と９の比較）
。さらに、Mg2+の高濃度が存在しなければ翻訳後融合があまり進まない標準的な
リンカーによる鋳型とは対照的に（図17、レーン３および４）、柔軟なリンカー
を用いた鋳型は、-20℃でのさらなる翻訳後インキュベーションにおいて収率の
よい融合産物を生じるためにMg2+の上昇を必要としなかった（図17、レーン11お
よび12の比較）。したがって、このリンカーは、Mg2+の高濃度を翻訳後に加える
ことが望ましくない場合に非常に有用であった。さらに、柔軟なリンカーはまた
、Mg2+の濃度が上昇すれば最適な融合収率を生じた。
【０１５５】融合効率の定量 融合効率は、融合産物に変換された翻訳されたペプチドの分画、または融合産
物に変換された添加した鋳型の分画のいずれかとして表してもよい。融合産物に
変換された翻訳されたペプチドの分画を決定するために、翻訳されたペプチドの 35 S-Met標識を利用した。これらの実験では、dA27dCdCPまたはdA27rCrCPリンカ
ーを用いた場合、30℃での１時間翻訳インキュベーション後にそのmRNAに融合さ
れたのは翻訳されたペプチドの約3.5％であった。この値は-20℃で一晩インキュ
ベートすると12％に増加した。翻訳後インキュベーションを高濃度のMg2+の存在
下で実施すると、翻訳されたペプチドの50％以上が鋳型に融合した。
【０１５６】 柔軟なリンカーを用いた鋳型については、30℃での１時間の翻訳後鋳型に融合
されたのは、翻訳されたペプチドの約25％であった。この値は-20℃で一晩イン
キュベートすると50％以上に増加し、翻訳後インキュベーションを50 mM Mg2+の
存在下で実施すれば75％以上となった。
【０１５７】 融合産物に変換された添加した鋳型の百分率を決定するため、32P-標識mRNAリ
ンカー鋳型を用いて翻訳を実施した。柔軟なリンカーを用いて翻訳後インキュベ
ーションをMg2+の非存在下で-20℃で実施した場合、添加したRNA鋳型の濃度がそ
れぞれ800、400、200、100および50 nMであった場合、添加した鋳型の約20％、4
0％、40％、35％、および20％がmRNA-ペプチド融合体に変換された（図18）。翻
訳後インキュベーションを50 mM Mg2+の存在下で実施した場合にも同様の結果が
得られた。最善の結果はNovagen社、Amersham社、またはAmbion社から得た溶解
物を用いて得られた（図19）。
【０１５８】 SDS-PAGEによって測定したmRNAとmRNA-ペプチド融合体の間の移動度の差は、m
RNA鋳型が長い場合非常に小さい可能性がある。そのような場合、（例えば、mRN
Aピューロマイシン接合の前に[32P]γATP及びT4ポリヌクレオチドキナーゼを用
いて）リンカーの5'末端で鋳型を32Pで標識してもよい。次に、翻訳／インキュ
ベーション後、相補的DNAスプリントの存在下で長いRNA部分をRNアーゼHで消化
してもよく、融合効率はリンカーペプチド融合体に対する未修飾のリンカーの比
の定量によって決定してもよい。3'-Pおよび5'-OHを生じるRNアーゼA消化と比較
すると、このアプローチはリンカーの5'末端での32Pが除去されないという長所
を有する。
【０１５９】 RNase H 処理のために、翻訳に続くインキュベーション後にEDTAを添加してリ
ボソームを破砕し、マイクロコン（microcon）-10（またはマイクロコン-30）カ
ラムを用いて反応混合物を脱塩した。結果として得られた混合液の2μl を18μl
のRNase H 緩衝溶液（30mM Tris-HCl pH7.8、30mM (NH4)2SO4、8mM MgCl2、1.5
mM β-メルカプトエタノール、および過剰の相補的DNAスプリント）と混合し、4
℃で45分間インキュベートした。次に、RNase H を添加し、37℃で20分間消化を
行った。
【０１６０】翻訳後インキュベーションの際の分子内対分子間融合 上記実験の他に、われわれは、Mg2+の存在下で-20℃で起こった融合反応が本
質的に分子内または分子間であるか否かを調べた。遊離リンカー（dA27dCdCP、
またはdA21C9C9C9dAdCdCP、ここでC9はO(CH2CH2O)3PO2-)を表す）を、上記のよ
うに翻訳および翻訳後インキュベーション下において、DNAリンカーを含むが、3
'末端でピューロマイシンは含まない鋳型と共にインキュベートした。これらの
実験において、35S-Metの検出可能な量（すなわち正常レベルの２％未満）はリ
ンカー-ペプチド産物に取り込まれず、このことは翻訳後融合が、未完成のペプ
チドと、同じリボソームに結合したmRNAの間で起こったことを示唆している。
【０１６１】 追加実験において、鋳型及び、電気泳動によって融合体産物ならびに交差産物
（誤ったタンパク質と融合した鋳型）が分離されることのできたピューロマイシ
ンオリゴヌクレオチドを用いて共インキュベーションを行った。実験した任意の
鋳型およびリンカーの組合せについても、交差産物は検出されなかった。これら
の実験で、2種類の異なるトランスメカニズムによって融合交差産物を形成する
ことができた：（1）遊離鋳型もしくはリンカーと、ペプチド-mRNA-リボソーム
複合体中のペプチドとの反応、または（2）ある複合体の鋳型と別の複合体にお
けるペプチドとの反応。後者の可能性を試験した特定の実施例を図24に示す。そ
こで、221アミノ酸長のタンパク質を合成するラムダタンパク質脱リン酸化酵素
（λPPase）鋳型と33アミノ酸ペプチドを作製するmyc鋳型を共インキュベートし
た。両鋳型は、翻訳後インキュベーションの後にこれら自身による融合体形成を
示す。両者を混ぜ合わせた場合、個々の融合産物のみが観察された。λPPaseタ
ンパク質とmyc鋳型の融合体による交差産物は検出されなかった。myc 鋳型+単一
コドン鋳型、20：1比率の標準リンカー+myc 鋳型、および可動リンカー+myc 鋳
型といういくつかの異なる組合せを用いた同様の実験では、交差産物形成は示さ
れなかった。これらの結果は、両方のトランス融合体形成の潜在的メカニズムに
対して、強く反証した。
【０１６２】 融合体形成におけるリンカー長の効果はまた、シスメカニズムにおけるそれと
も一致した。リンカー長を19ヌクレオチドから13ヌクレオチドに減少させること
により、鎖が解読部位からペプチジル転移酵素中心に到達できないことが予想さ
れるような、融合産物量の急激な減少がもたらされた（図23）。しかしトランス
メカニズムが優勢である場合（例えば、リボソーム結合鋳型がトランスメカニズ
ムによって融合体を形成する場合）、この効果はリボソーム内でのピューロマイ
シンの閉塞にも起因しうる。一旦ピューロマイシンがリボソームから遊離すると
トランス反応の減少は見られないはずであるので、長いリンカーによる融合体形
成の減少はこの種の反応に対して再び反証している。
【０１６３】最適化結果 上記のように、柔軟なリンカーを用いることによっておよび／または高濃度の
Mg2+の存在下での翻訳後インキュベーションを実施することによって、融合効率
は添加したmRNAの約40％に増加した。これらの結果は、mRNA-ペプチド融合体の1
014個もの分子がインビトロ翻訳反応混合物１mlあたり産生されうること、そし
てインビトロ選択実験において使用するために非常に高度に複雑なmRNA-ペプチ
ド融合体のプールを生じることを示した。
【０１６４】RNA-蛋白融合体の選択的濃縮 われわれは、コードされたペプチドに基づくランダム配列融合の複雑なプール
から特定のRNA-ペプチド融合体を濃縮することによって、選択および発展実験に
おいてRNA-ペプチド融合体を用いることが可能か否かを明らかにした。詳しく述
べると、既知の配列の少量（この場合、長いmyc鋳型LP154）を何らかの量のラン
ダム配列プール（すなわちLP160）と組み合わせた一連の混合物を調製した。こ
れらの混合物を翻訳し、RNA-ペプチド融合産物を本明細書に記述のように、オリ
ゴヌクレオチドおよびジスルフィドアフィニティクロマトグラフィーによって選
択した。myc-鋳型融合は抗mycモノクローナル抗体によって選択的に免疫沈降し
た（図16A）。この選択段階において得られた濃縮を測定するために、免疫沈降
の前後のcDNA/mRNA-ペプチド融合体混合物のアリコットを放射標識プライマーの
存在下でPCRによって増幅した。増幅したDNAをmyc鋳型配列を切断するがプール
を切断しない制限エンドヌクレアーゼによって消化した（図16Bおよび16C）。切
断と非切断DNAの比の定量から、免疫沈降によってmyc配列がランダムライブラリ
と比較して20〜40倍濃縮されたことが示された。
【０１６５】 これらの実験は以下のように実施した。
【０１６６】翻訳反応 翻訳反応はおおむね上記のように実施した。詳しく述べると、反応は製造元（
Novagen社）の説明書に従って30℃で１時間実施し、-20℃で一晩凍結した。試料
６本を２通り作製し、一方には35Sメチオニンを含み、もう一方は非放射標識メ
チオニンを最終濃度52 μMとなるように加えた。反応１〜６には、表２に記述し
た鋳型の量が含まれた。表２の全ての数値は、反応混合液25 μlあたりの鋳型の
ピコモルを表す。
【０１６７】
【表２】 注入された選抜に用いられた鋳型の割合
【０１６８】dT25ストレプトアビジンアガロースの調製 ストレプトアビジンアガロース（Piece社）をTE 8.2（10 mMトリスCl pH 8.2
、１mM EDTA）で３回洗浄し、TE8.2に１：１（v/v）スラリーとして再懸濁した
。次に、バイオテグCPG（Glen Research社）を用いて合成した3'ビオチン化T25
を、望ましい最終濃度になるように加え（一般に10または20 μM）、攪拌しなが
らインキュベーションを１時間実施した。次に、dT25ストレプトアビジンアガロ
ースをTE 8.2で３回洗浄して、使用するまで４℃で保存した。
【０１６９】翻訳反応からの鋳型の精製 翻訳反応からの鋳型を精製するために、各反応液25 μlを採取して単離用緩衝
液（１M NaCl、100 mMトリスCl pH 8.2、10 mM EDTA、0.1 mM DTT）7.5 mlおよ
び20 μM dT25ストレプトアビジンアガロース125 μlに加えた。この溶液を回転
させながら４℃で１時間インキュベートした。チューブを遠心して溶出剤を除去
した。単離用緩衝液１mlを加え、スラリーを再懸濁して、混合物を1.5 ml微量遠
心管に移した。次に、氷冷単離用緩衝液１mlアリコットで試料を４回洗浄した。
同一反応からの温試料および冷試料をミリポアMCフィルターユニット中で合わせ
て、100 μl H2O、0.1 mM DTT２容量、および15 mM NaOH、１mM EDTA（4℃）2容
量で洗浄することによってdT25アガロースから溶出し、続いて中和した。
【０１７０】 この溶出液に、洗浄したチオプロピルセファロース（Pharmacia社）の50％ス
ラリー40 μlを加えて、インキュベーションを回転させながら４℃で１時間実施
した。次に試料をTE8.2 １ml容量で３回洗浄して溶出剤を除去した。１M DTT１
μlを固体に加え（総量は約20〜30 μl）、試料を数時間インキュベートして、
除去し、H2O 20 μl（総容量90 μl）で４回洗浄した。UV吸収によって判断する
と、溶出剤には2.5 mMチオピリドンが含まれた。３M NaOAc pH 5.2、10 mM スペ
ルミン、１μlグリコーゲン（10 mg/ml、Boehringer Mannheim社）および100％E
tOH 170 μl を加えて、-70℃で30分インキュベートし、微量遠心器で13,000 rp
mで30分遠心することによって、この試料50 μlをエタノール沈殿させた。
【０１７１】逆転写反応 沈殿したエタノールとチオピリドン溶出剤試料の双方に、以下のように逆転写
反応を実施した。エタノール沈殿試料については、再懸濁した鋳型30 μl、H2O
48 μl、およびプライマー21.103（配列番号：22）200ピコモルを70℃で５分間
アニーリングして氷上で冷却した。この試料に第一の鎖緩衝液（250 mMトリスCl
pH 8.3、375 mM KCl、および15 mM MgCl2；Gibco BRL社、Grand Island、NYか
ら入手可能）16 μl、100 mM DTT ８μl、および10 mM NTP４μlを加えて42℃で
平衡にし、スーパースクリプトII逆転写酵素（Gibco BRL社、Grand Island、NY
）４μlを加えた。H2O（13 μl）をTPセファロース溶出剤（35 μl）に加え、上
記のように反応を実施した。１時間インキュベートした後、番号をつけた試料を
合わせた（総容量160 μl）。試料10 μlを各非選択試料のPCR用に保存しておき
、試料150 μlを免疫沈降用とした。
【０１７２】免疫沈降 免疫沈降を実施するため、逆転写反応液170 μlを希釈用緩衝液（10 mMトリス
Cl pH 8.2、140 mM NaCl、１％ v/v トリトンX-100）１mlおよびプロテインG/A
結合物（Calbiochem社、La Jolla、CA）20 μlに加え、回転させながら４℃で１
時間インキュベーションを行い、予めきれいにした。溶出剤を除去してG/A結合
物20 μlおよびモノクローナル抗体（２μg、12ピコモル）20 μlを加え、試料
を回転させながら４℃で２時間インキュベートした。結合物は2500 rpmで５分間
微量遠心によって沈降させ、溶出剤を除去して結合物を氷冷希釈用緩衝液の１ml
アリコットを用いて３回洗浄した。試料を氷冷 10 mMトリスCl、pH 8.2、100 mM
NaCl１mlで洗浄した。凍結した４％ HOAc３容量を用いて結合した断片を除去し
、試料を凍結乾燥させた。
【０１７３】選択および非選択試料のPCR PCR反応は、濃縮NH4OH 20 μlを非選択材料および選択材料全体10 μlに加え
、試料中のRNAを破壊するために55℃、70℃および90℃で各５分インキュベート
することによって実施した。次に試料をスピードバックによって蒸発堅固させた
。PCR混合物（Mg2+を含むPCR緩衝液中に１μMプライマー21.103および42.108、2
00 μM dNTP）（Boehringer Mannheim社）200 μlおよびTaqポリメラーゼ（Boeh
ringer Mannheim社）２μlを各試料に加えた。非選択試料の２番にPCR を16サイ
クルを実施し、その他の試料全てに19サイクルを実施した。
【０１７４】 次に試料を5' 32P-標識プライマー21.103の存在下で表３に従って増幅し、ウ
ィザードダイレクトPCR精製キット（Promega社）を用いて個々に２回精製して、
全てのプライマーおよびより短い断片を除去した。
【０１７５】
【表３】 選択PCR試料及び非選択PCR試料の増幅
【０１７６】制限酵素消化 上記PCR反応のそれぞれから調製した32P-標識DNAを、表４に従って、制限酵素
消化反応に等量（試料のcpmによって）加えた。各反応の総容量は25 μlであっ
た。AlwnI （５単位、New England Biolabs社）0.5 μlを各反応に加えた。試料
を37℃で１時間インキュベートし、65℃で20分インキュベートすることによって
酵素を熱不活化させた。次に試料を変性ローディング用緩衝液10 μl（高純度ホ
ルムアミド（USB）１ml、0.5 M EDTA 20 μl、および１M NaOH 20 μl）と共に
混合して90℃で１分加熱し、冷却して、８M尿素を含む12％変性ポリアクリルア
ミドゲル上にローディングした。電気泳動の後、ゲルを10％（v/v）HOAc、10％
（v/v）MeOH、H2Oで固定した。
【０１７７】
【表４】 制限酵素消化条件 w/ AlwnI
【０１７８】消化物の定量 試料中に存在するmyc対プールしたDNAの量は、燐画像化装置（Molecular Dyna
mics社）を用いて定量した。各バンド中に存在する材料の量は、ゲルのバンド周
囲の同じ長方形の積分容量として測定した。各バンドに存在する総cpmはバック
グラウンドを差し引いた容積として計算した。バックグラウンドの３つの値を用
いた：(1)ゲル上でカウントが起こった領域外の同じ正方形の平均；(2)mycバン
ドが現れるはずの非選択プールレーンに存在するcpm（ゲル上のこの位置ではバ
ンドは現れない）；および(3)非選択レーン間の鋳型の10倍毎の増加に最も近い
値を再現する正常化値。図16Bおよび16Cのレーン２、３および４は、標的対プー
ル配列の濃縮を示す。レーン３での証明可能な濃縮（非選択／選択）により、こ
の試料のノイズ比に対するシグナルの最適化により最大値（方法１〜３を用いて
それぞれ17、43、および27倍）が得られた。これらの結果を表５に要約する。
【０１７９】
【表５】 プールに対するMyc鋳型の濃縮
【０１８０】 第二の一連の実験では、これらの同じPCR産物をウィザードダイレクトPCR精製
キットを用いて一度精製し、消化物を上記の方法(2)によって定量した。これら
の実験では同様の結果を得た；それぞれ10.7、38、および12 倍の濃縮が上記の
レーン２、３および４と同等の試料について測定された。
【０１８１】大きなRNA-ペプチド融合体ライブラリーからのインビトロ選別 大きなライブラリーからの所望の融合体分子の選別について示した別の実験に
おいて、2×1013のランダムRNA-ペプチド融合体のレパートリーを、上述の方法
の変法を用いて作製した。合成式 5'-(NNS)27-3'（ここでNは等モルのA,G,C,お
よびTを、ならびにSはGまたはCを指す）に基づく27のランダムコドンを含むDNA
ライブラリーを作製した。各NNSコドンは、天然の20アミノ酸全てに対するコド
ンを含んだ32トリプレットの混合物である。T7プロモーターをコードする配列お
よび翻訳のための開始部位同様に、逆転写およびPCRのために、ランダム領域に2
つのプライマー結合部位を隣接させた。インビトロ転写反応により合成したRNA
を、3'末端でピューロマイシンを含むオリゴヌクレオチドリンカーdA27dCdC-Pへ
の定方向鋳型ライゲーション（templete-directed ligation）により修飾した。
【０１８２】 RNA-タンパク質融合体を作製するために、精製、連結されたRNAをウサギ網状
赤血球抽出液中でインビトロ翻訳した：123merDNA PP.01（5'-AGC TTT TGG TGC
TTG TGC ATC (SNN)27 CTC CTC GCC CTT GCT CAC CAT-3'、N=A、G、C、T; S=C、G
）（配列番号：34）を合成し、6％変性ポリアクリルアミドゲルにて精製した。
全量5ml（50mM KCl、10mM Tris-HCl pH9.0、0.1％ TritonX-100、2.5mM MgCl2、
0.25mM dNTPs、500ユニット プロメガTaqポリメラーゼ）中、1μMのプライマーP
1F（5'-AGC TTT TGG TGC TTG TGC ATC-3'）（配列番号：35）およびPT7（5'-TAA
TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA ATG GTG AGC AAG GGC
GAG GAG-3'）（配列番号：36）を用いて、3回のPCR（94℃、1分間；65℃、1分
間；72℃、2分間）により1nmolの精製DNA（6×1014分子）を増幅した。沈降後、
DNAを100μl のTE（10mM Tris-HCl pH7.6, 1mM EDTA pH8.0）に再溶解させた。
アンビオン（Ambion）のメガショートスクリプトインビトロ転写キット（Megash
ortscript In vitro Transcription kit）を用いて、反応（1ml）中でDNA（60μ
l）をRNAに転写した。この反応溶液をフェノール/CHCl3で2回抽出し、過剰のNTP
をNAP-25カラム（Pharmacia）による精製によって除去した。リンカー30-P（5'-
dA27dCdCP）を含むピューロマイシンを本明細書に記載されたように合成し、定
方向鋳型ライゲーションによってRNAライブラリーの3'末端に添加した。T4 DNA
リガーゼ緩衝溶液（Promega）および1200ユニットのT4 DNAリガーゼ（Promega）
を含む反応溶液（1.5ml）中で、RNA（25nmol）を等モル量のリンカーおよび断片
（5'-TTT TTT TTT TNA GCT TTT GGT GCT TG 3'）（配列番号：37）とインキュベ
ートした。4時間室温でインキュベートした後、ライゲーションされたRNAを6％
変性ポリアクリルアミドゲルによりライゲーションされていないRNAから分離し
、ゲルから抽出して再溶解した（200μl ddH2O）。mRNA-ペプチド融合分子を作
製するため、アンビオン（Ambion）のウサギ網状赤血球IVTキットを用いて、ラ
イゲーションされたRNA（1.25nmol）を、全量7.5ml中3.7μCiの35S-メチオニン
存在下で翻訳した。インキュベーション後（30℃で30分間）、反応溶液の最終濃
度を530mM KClおよび150mM MgCl2に調製し、さらに1時間室温でインキュベート
した。翻訳反応終了後、この530mM KClおよび150mM MgCl2の添加により、融合体
形成が約10倍促進された。
【０１８３】 改善されたこの方法を用いて、1mlあたり約1013の精製融合分子が得られた。
オリゴヌクレオチドアフィニティークロマトグラフィーによって粗雑な翻訳反応
溶液からRNA-ペプチド融合体を精製し、選別段階の前に、RNase Hを含まない逆
転写酵素を用いて以下のように連結分子のRNA部分を逆転写した。翻訳された融
合産物をインキュベーション緩衝液（100mM Tris-HCl pH8.0、10mM EDTA pH8.0
、1M NaClおよび0.25％ TritonX-100；4℃で1時間）中でdT25セルロース（ファ
ルマシア）とインキュベートした。セルロースをフィルターろ過により単離して
インキュベーション緩衝液で洗浄し、その後ddH2Oを用いて融合産物を溶出した
。5倍過剰量のスプリントをプライマーとして用いて、RNAを逆転写した（2ユニ
ットのSuperscript II Reverse Transcriptase (Gibco BRL)を含む、25mM Tris-
HCl pH8.3、75mM KCl、3mM MgCl2、10mM DTT、および0.5mM dNTPs）。
【０１８４】 このRNA-ペプチド融合体選別技術の仕事率を調べるために、選別手段として免
疫沈降法を用い、c-mycモノクローナル抗体に結合するペプチドの選別にライブ
ラリーを使用した。5回の繰り返し選別および増幅により、抗mycモノクローナル
抗体9E10（Evan ら、Mol. Cell. Biol. 第5巻：第3610頁（1985年））に結合す
る融合分子の割合が増加した。最初の各3回の選別における溶出により、選別段
階で適用されたライブラリーの1％未満が回収されたが、ライブラリーの約10％
が抗体と結合し、4回目の選別で溶出した。結合分子の割合は、5回目の選別にお
いて34％に増加した。この結果は、これらの条件下で抗myc抗体に結合する野生
型c-myc融合構築物の割合（35％）とよく一致する。6回目の選別においてこれ以
上の濃縮は観察されず、6回目および7回目から得られた融合分子を、選別された
ペプチドの特性決定および配列決定に用いた。
【０１８５】 これらの実験を行うために、2×1013モルの開始ライブラリーを、選別緩衝溶
液（1×PBS、0.1％ BSA、0.05％ Tween）中で、12倍過剰量のc-myc結合抗体9E10
（Chemicon）と4℃において1時間インキュベートした。プロテインA-セファロー
スを加え、ペプチド融合体-抗体複合体を沈降させた。さらに4℃で1時間インキ
ュベートした後、フィルターろ過によってセファロースを単離し、フロースルー
（FT）画分を回収した。非特異的結合物を除去するために5倍量の選別緩衝液で
セファロースを洗浄し（W1-W5）、結合したペプチドを4倍量の15mM酢酸で溶出さ
せた（E1-E4）。溶出した融合分子のcDNA部分をPCRによって増幅し、得られたDN
Aを用いて高濃度の融合産物を作製し、選別のさらなる回に使用した。このプー
ルからプロテインA-セファロースに親和性を持つペプチドを除去するために、プ
ロテインA-セファロースについての前選別を2回目の選別に導入した。酢酸によ
る免疫沈降から溶出された35S標識化RNA-ペプチド融合体の割合を測定すること
により、選別の進行をモニターした。これらの結果を図20に示す。
【０１８６】 選別されたペプチドプールが選別に用いた抗myc抗体に特異的に結合すること
が示された。6回の非融合ペプチドとの結合実験では、融合ペプチドと比較して
抗体への同様の結合が示され、融合分子の核酸部分が結合に必要ではないことが
示されている（データは表記しない）。
【０１８７】 6回目の選別から得られた融合産物を、次の3つの異なる免疫沈降条件によって
評価した：（1）抗myc抗体なし、（2）mycエピトープと同じアイソタイプではあ
るがこれに結合しない抗インテグリンモノクローナル抗体ASC-3を用いる、およ
び（3）抗myc抗体9E10を用いる。選別緩衝液（1×PBS, 0.1％ BSA, 0.05％ Twee
n）中で、6回目の選別から得られた35S標識化RNA-ペプチド融合産物（0.2pmol）
を、抗mycモノクローナル抗体9E10（100pmol）、抗インテグリンβ4モノクロー
ナル抗体ASC-3（100pmol; Chemicon）、または抗体無しのいずれかと4℃におい
て1時間インキュベートすることにより実験を行った。ペプチド融合体-抗体複合
体をプロテインA-セファロースで沈降させた。5倍量の選別緩衝液でセファロー
スを洗浄した後、15mMの酢酸を添加することにより結合した種を溶出させた。
【０１８８】 抗体を用いない対照実験では主要な結合は検出できず、選別されたペプチドは
非特異的にプロテインA-アガロースに結合しないことが示された。加えて、抗イ
ンテグリンモノクローナル抗体への結合は観察されず、選別されたペプチドは抗
myc抗体に特異的であることが示された。選別されたペプチド融合分子が抗myc抗
体9E10の抗原結合部位と相互作用するかどうかを検証するために、合成mycペプ
チドを用いた競合実験を行った。6回目で得られた35S標識化融合分子を抗mycモ
ノクローナル抗体とインキュベートして未標識のmycペプチド量が増加したとき
、結合分子の割合が減少した。これらの結果を図21に示す。この図では、6回目
の選別から得られた35S標識化RNA-ペプチド融合産物を、0nmol、0.2nmol、1nmol
、2nmol、または10nmolの合成mycペプチド（Calbiochem）存在下で、100pmolの
抗mycモノクローナル抗体9E10とインキュベートした。融合ペプチド-抗体複合体
をプロテインA-セファロースを添加することにより沈降させた。評価は、抗体と
結合し15mMの酢酸によって溶出されうる融合分子の3回の結合反応により決定さ
れた平均割合を表している。競合データから、大多数の単離された融合分子はmy
c結合部位に特異的であることが示された。
【０１８９】 5回目および6回目の選別に由来する別々の116クローンそれぞれの配列解析か
ら2回生じる1つの配列が同定され、野生型c-mycエピトープEQKLISEEDL（配列番
号：2）を含んでいた。3番目の配列はほぼ他の2つと同じであったが、ヌクレオ
チドレベルで2箇所の点変異を示し、そのうちの1つにおいては、保存されたmyc
エピトープ領域内でイソロイシンからバリンへの変異が起こっていた。全ての配
列は、c-mycと非常に類似した共通配列であるX(Q、E)XLISEXX(L、M)（配列番号
：38）を含んでいた。中心領域の4アミノ酸LISEは、最も高度に保存されていた
。図22はランダム27残基ライブラリーから単離された、12個の選別されたペプチ
ドアミノ酸配列を示している。図の上段にc-mycエピトープのアミノ酸配列を示
す。表示された配列の共通モチーフを含む領域のみが含まれている。共通配列と
一致するペプチドの残基を反転させた。クローンR6-63は野生型mycエピトープを
含んでいた。共通残基（当てはめられた部位で50％以上の頻度）を、図の下段に
示す。
【０１９０】 保存されたモチーフが、定義された5'プライマー領域にコードされた一つのア
ミノ酸を含んでいたことを考慮し、本発明者らは2×1013分子の開始プールにお
いて、既知の10アミノ酸エピトープであるc-mycエピトープがわずか約60回しか
出現しないことを算出した。5回の選別で検出された野生型エピトープの濃縮は
、各回あたり200より多い個別の実験で確認された濃縮因子に非常に一致した。
【０１９１】 図22に示される12個の選別された配列について行われた免疫沈降実験によって
、抗mycモノクローナル抗体の抗原結合部位に対するライブラリー由来RNA-ペプ
チド融合体の特異的結合が確認された。RNA-ペプチド融合体として、12個の配列
全てが抗myc抗体と結合し、プロテインAセファロースに対する結合を示さなかっ
た。また、（12個の配列に由来する）35S標識化された融合産物および未標識合
成mycペプチドを用いて抗myc抗体に対する競合結合を確認した。使用された条件
において、未標識mycペプチド存在下で標識化野生型myc融合体の9％が結合し、
解析された12個の配列における結合の割合は0.4％から12％の間で変動した。こ
れらのデータは、これらの配列が野生型myc融合体の配列と同程度の親和性でmyc
抗体に結合することを示した。
【０１９２】ARMモチーフペプチドの精製および固定化RNAとの融合 標準的なホスホラミダイト化学を用いて、λ-ボックスBR（CilleyおよびWilli
amson、RNA 第3巻：57〜67（1997年））、BIV-TAR（Puglisiら、Science 第270
巻：1200〜1203（1995年））、およびHIV-RRE（Battisteら、Science 第273巻：
1547〜1551（1997年）についてのRNA結合部位を、3'ビオチン部位を含めて合成
した。本明細書に記載されたように、合成RNA試料を脱保護、脱塩、およびゲル
精製した。次に最終RNA濃度5mMにおいて、1×TE 8.2中でRNA濃縮原液と50％（v/
v）スラリーのイムノピュアストレプトアビジンアガロース（ImmunoPure strept
oavidin agarose）（Pierce）を振とうさせながら混合し、3'ビオチン化RNA部位
を固定化した。（1）1Nペプチド断片をコードする鋳型または（2）対照としてグ
ロビンmRNA（Novagen）を含む、2つの翻訳反応を行った。等量（50％スラリー（
v/v）で50μl ）の各固定化RNAを洗浄し、500μlの結合緩衝液（100mM KCl、1mM
MgCl2、10mM Hepes-KOH pH7.5、0.5mM EDTA、0.01％ NP-40、1mM DTT、50ug/ml
酵母tRNA）に再懸濁した。Nペプチドまたはグロビンの鋳型のいずれかを含んだ
15μl の翻訳反応溶液を、3つの固定化結合部位のうち1つを含むチューブに加え
、室温で1時間インキュベートすることによって結合反応を行った。遠心操作に
よってビーズを沈澱させ、100μl の結合緩衝液で2回洗浄した。結合した分子を
解離させるため、RNase A（DNase非含有、1μl、1mg/ml）（Boehringer）を添加
して37℃で1時間インキュベートした。上清を除去して30μlのSDS添加液と混合
し、SDS・トリシンPAGEによって解析した。Nペプチド融合体の単離に関しては、
融合体形成を促進させるために翻訳反応後35mM MgCl2を添加して室温で1時間イ
ンキュベートするという例外を除いては、同じプロトコールを使用した。
【０１９３】 これら3つの実験により、インビトロで合成される場合およびそれ自身のmRNA
とのRNA-ペプチド融合体として作製される場合の両方において、Nペプチドはそ
の正常な結合特異性を保持していることが示された。この結果は非常に重要であ
る。非融合配列と比較すると、ペプチドまたはタンパク質のC末端に長い核酸配
列が付着することにより（つまり、融合体形成）ペプチドの機能が妨害される可
能性がある。アルギニンリッチモチーフ（ARM）ペプチドは、その比較的強い非
特異的な核酸結合特性により、融合システムの厳密な機能分析（test）を示す。
Nペプチド-mRNA融合体（cDNA合成に先行して）が遊離ペプチドの機能を保持して
いるという事実は、自己複合体または非特異的複合体のいずれかを形成する可能
性がある場合でも、特異性が保持されていることを示している。
【０１９４】蛋白選択システムの利用 本発明の選択システムは蛋白技術を用いて治療的、診断的、または工業的問題
を解決する如何なる領域にも商業的に応用される。この選択技術は望みの機能を
有する新しい蛋白の単離と共に、既存の蛋白を改善または変化させるために有用
である。これらの蛋白は天然に起こる配列であってもよく、天然に起こる配列の
変化形であってもよく、または部分的もしくは完全に合成された配列であっても
よい。更に、これらの方法は有用な核酸又は小分子量の標的を単離又は同定する
のに用いられうる。
【０１９５】新規結合試薬の単離 １つの特定の応用において、本明細書において記述のRNA蛋白融合技術は、特
異的結合（例えば、リガンド結合）特性を有する蛋白の単離に有用である。非常
に特異的な結合相互作用を示す蛋白は、非抗体認識試薬として用いてもよく、こ
れによってRNA-蛋白融合技術は従来のモノクローナル抗体技術をしのぐことがで
きるようになった。この方法によって単離した抗体タイプの試薬は、診断および
治療応用を含む従来の抗体を利用する如何なる領域にも用いられる可能性がある
。
【０１９６】ヒト抗体の改善 本発明はまた、多くの疾患の治療のためにヒトまたはヒトに適合させた抗体を
改善するために用いてもよい。この応用において、抗体ライブラリを作製し、イ
ンビトロでスクリーニングすれば、細胞融合またはファージディスプレイのよう
な技術の必要性がなくなる。１つの重要な応用において、発明は１本鎖抗体ライ
ブラリを改善するために有用である（ワードら（Ward）、Nature 341：544（198
9）；およびグーロら（Goulot）、J. Mol. Biol. 213：617（1990））。この応
用に関しては、可変領域は、ヒト起源（レシピエントの考えられる有害な免疫反
応を最少にする）から構築してもよく、または完全にランダムなカセットを含ん
でもよい（ライブラリの複雑性を最大限にするため）。改善した抗体分子をスク
リーニングするため、標的分子に対する結合に関して候補分子のプールを調べる
（例えば、図２に示すように固定した抗原）。次に選択が１つのラウンドから次
へと進行するように、高レベルのストリンジェンシーを結合段階に適用する。ス
トリンジェンシーを増加させるため、洗浄段階の回数、過度の競合物質の濃縮、
緩衝液条件、結合反応時間の長さ、および固定化マトリクスの選択のような条件
を変化させる。
【０１９７】 １本鎖抗体は、治療のために直接または標準的な抗体の構築のために間接的に
用いてもよい。そのような抗体は、抗自己免疫抗体の単離、免疫抑制、およびAI
DSのようなウイルス疾患に対するワクチンの開発を含む、考えられる多くの応用
がある。
【０１９８】新しい触媒の単離 本発明はまた、新しい触媒蛋白を選択するために用いてもよい。インビトロ選
択および展開は、これまで新規触媒RNAおよびDNAの単離に用いられているが、本
発明では、新規蛋白酵素の単離に用いられる。このアプローチの１つの特定の例
において、触媒は、触媒の遷移状態の化学類似体への結合を選択することによっ
て間接的に単離してもよい。もう一つの特定の例において、直接の単離は、基質
との共有結合形成について選択することによって（例えば、アフィニティタグに
結合した基質を用いて）、または開裂（例えば、特異的結合を切断する能力につ
いて選択し、それによって固相支持体からのライブラリの触媒メンバーを生じる
ことによって）によって実施してもよい。
【０１９９】 新しい触媒を単離するこのアプローチは、触媒的抗体技術に対して少なくとも
２つの重要な長所を有する（シュルツら（Schultz）、J. Chem. Engng. News 68
：26（1990））。まず、触媒抗体技術において、初回プールは一般に免疫グロブ
リンの範囲に限定され；対照的にRNA-蛋白融合体の開始ライブラリは、完全にラ
ンダムであってもよく、または既知の酵素構造または蛋白骨格の変種を含んでも
よいがこれらに限定しない。さらに、触媒的抗体の単離は一般に遷移状態反応類
似体との結合に関しての初回選択に依存し、その後活性抗体についての面倒なス
クリーニングを行う；この場合も対照的に、RNAライブラリを用いて先に証明し
たように、RNA-蛋白融合ライブラリアプローチを用いた触媒の直接選択は可能で
ある。蛋白酵素を単離するもう一つのアプローチにおいて、遷移状態類似体およ
び直接選択アプローチを合わせてもよい。
【０２００】 この方法によって得られた酵素は非常に貴重である。例えば、現在開発すべき
化学プロセスを改善する新規かつ有効な工業的触媒に対する逼迫した必要性が存
在する。本発明の主要な長所は、任意の条件において選択を行ってもよく、例え
ば、インビボ条件に限定されないという点である。したがって、発明は、既定の
環境、例えば上昇した温度、圧力または溶媒濃度の環境において機能しながら、
非常に特異的な形質転換を行うことができる（およびそれによって望ましくない
副産物の形成を最小限にする）新規酵素または既存の酵素の改善変種の単離を容
易にする。
【０２０１】インビトロ相互作用トラップ RNA-蛋白融合技術はまた、cDNAライブラリをスクリーニングし、蛋白蛋白相互
作用に基づく新しい遺伝子をクローニングする際に有用である。この方法によっ
て、cDNAライブラリは望ましい起源から作製する（例えば、アウスベルら（Ausu
bel）、前記、第５章）。候補cDNAのそれぞれに対して、ペプチド受容体（例え
ば、ピューロマイシンの尾部のように）をライゲーションする（例えば、LP77、
LP154、およびLP160の産生について上記の技術を用いて）。次に、RNA-蛋白融合
体を本明細書で記述のように作製し、これらの融合体（または融合体の改善版）
が特定の分子と相互作用する能力を上記のように調べる。望ましいならば、停止
コドンおよび3' UTR領域は、このプロセスにおいて(i)サプレッサーtRNAを加え
て停止領域の読み過ごしを可能にする、(ii)免疫沈降による翻訳反応からの放出
因子を除去する、(iii)(i)と(ii)の組合せ、または(iv)DNA配列からの停止コド
ンおよび3' UTRの除去、のいずれかによって避けられる可能性がある。
【０２０２】 相互作用段階がインビトロで起こるという事実から、非特異的競合剤、温度、
およびイオン条件を用いて、反応のストリンジェンシーを注意深く調節すること
ができるようになる。正常な小分子を加水分解できない類似体（例えば、ATP対A
TPgS）に変化させることは、同じ分子の異なる配座異性体を識別する選択となる
。このアプローチは、選択した結合パートナーのRNA配列は共有結合し、したが
って、容易に単離される可能性があるため、多くの蛋白のクローニングおよび機
能的同定の双方にとって有用である。さらに、この技術は、その配列が現在ヒト
ゲノムプロジェクトによって決定されつつある〜50〜100,000個のヒト遺伝子の
機能および相互作用を特定するために有用である。
【０２０３】マイクロチップ形式でのRNA-蛋白融合体の利用 「DNAチップ」は、固定したオリゴヌクレオチドまたはcDNAもしくはゲノムDNA
の空間的に定義された配置を含み、迅速なシークエンシングおよび転写プロフィ
ーリングのような応用を有する。RNA-蛋白融合体の混合物（例えば、細胞DNAま
たはRNAプールから生じたもの）をそのようなDNAチップにアニーリングすること
によって、１つの固定化配列に対応する各スポットがRNA-蛋白融合体のプールに
おいてその対応する蛋白にアニーリングすることができる「蛋白ディスプレイチ
ップ」を作製することが可能である。このアプローチによって、対応する蛋白は
、その自身のmRNAとの結合のために、空間的に定義された様式で固定化され、一
連のDNA配列を含むチップが対応する一連の蛋白を表示する。または、これらの
蛋白のペプチド断片は、融合物のライブラリがcDNAまたはゲノムDNAのより小さ
い断片から生成する場合に表示される可能性がある。
【０２０４】 そのような蛋白およびペプチドを順序立てて表示することは、多くの用途を有
する。例えば、それらはこれまで未知の蛋白-蛋白相互作用の同定のための強力
なツールとなる。１つの明確な形式において、プローブ蛋白を検出可能に標識し
て（例えば、蛍光色素によって）、標識蛋白を蛋白ディスプレイチップによって
インキュベートする。このアプローチによって、プローブ蛋白と結合することが
できる蛋白の実体は、プローブの結合により標識されるに至ったチップ上のスポ
ットの位置から決定される。もう一つの応用は修飾酵素の作用を通じて化学修飾
された蛋白の迅速な定量である（例えば、蛋白キナーゼ、アシルトランスフェラ
ーゼ、およびメチルトランスフェラーゼ）。蛋白ディスプレイチップを関係酵素
および放射活性標識基質とインキュベートし、その後洗浄してオートラジオグラ
フィーを行うことによって、位置および、したがって酵素を修飾するための基質
であるそれらの蛋白の実体が容易に決定される可能性がある。さらに、小さいペ
プチドの順序表示によってこのアプローチを用いることは、そのような修飾部位
の位置を知ることがさらに可能となる。
【０２０５】 蛋白表示技術は、適当な固相支持体に固定化した核酸（RNAを含むが、好まし
くはDNA）の配置を用いて実施してもよい。一例としての固相支持体はガラス（
例えば、ガラス板）、シリコン、またはシリコンガラス（例えばマイクロチップ
）、または金（例えば、金板）のような材料で構成してもよい。核酸をそのよう
な固相表面上の正確な領域に接着させる方法、例えば、写真平板法は当技術分野
で周知であり、発明において用いられる固相支持体（例えば、DNAチップ）の作
製に用いてもよい。この目的のための一例としての方法は、シェナら（Schena）
、Science 270：467〜470（1995）；コザールら（Kozal）、Nature Medicine 2
：753〜759（1996）；チェンら（Cheng）、Nucleic Acids Research 24：380〜3
85（1996）；リップシュッツら（Lipshutz）、Bio Techniques 19：442〜447（1
995）；ピースら（Pease）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91：5022〜5026（199
4）；フォドア（Fodor）、Nature 364：555〜556（1993）；ピールンら（Pirrun
g）、米国特許第5,143,854号；およびフォドア（Fodor）ら、国際公開公報第92/
10092号を含むが、これらに限定されない。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 RNA-蛋白質融合体を作出するのに含まれる段階の概要を示したも
のである。図1Aは、融合体のRNA部分を作製するためのDNA構築物の見本を図示し
たものである。図1Bは、RNA/ピューロマイシン結合体の作出を図示したものであ
る。そして、図1Cは、RNA-蛋白質融合体が作出されるのを図示している。
【図２】 本発明による一般的な選抜プロトコールの概要を示したものであ
る。
【図３】 3'側にピューロマイシンをもつ最小翻訳鋳型の合成プロトコール
の概要を示したものである。段階（A）は、ピューロマイシンの反応官能基（5'-
OHとNH2）に保護基を付加するところを示している。すなわち、修飾されて、こ
れらの基は、ホスホロアミダイトによるオリゴヌクレオチド合成で使用するのに
適するように保護される。その3'OHにDNAを付加するための標準的なプロトコー
ルを用いて、この保護されたピューロマイシンを、2'OH基によって、アミノヘキ
シル調節多孔ガラス（CPG）に付着させた（ゲート（Gait）、オリゴヌクレオチ
ド合成、実際的方法（Oligonucletide Synthesis, A Practical Approach）、実
用的応用シリーズ（The Practical Approach Series）（IRLプレス、オクスフォ
ード（IRL Press, Oxford）、1984））。段階（B）では、43ヌクレオチドを含む
最小翻訳鋳型（「43-P」と呼ぶ）を、標準的なRNAおよびDNA化学法（ミリポア社
、マサチューセッツ州、ベドフォード（Millipore, Bedford, MA））を用いて合
成し、NH4OHとTBAFを用いて脱保護し、さらにゲル精製した。この鋳型は、5'末
端に13塩基のRNAを含み、それに、その5'0Hに3'ピューロマイシンが付着した、2
9塩基のDNAが続いていた。RNA配列は、（i）16S rRNAの5塩基に相補的なシャイ
ン-ダルガルノ保存配列（Stomoら、Nucleic Acids Research 10:2971-2996 (198
2); Shine and Dalgarno, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 71: 1342-1346 (1974);およ
びSteitz and Jakes, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72: 4734-4738 (1975)）、（ii
）5塩基のスペーサー、および（iii）1個のAUG開始コドンを含んでいた。「P」
がピューロマイシンの場合には、DNA配列はdA27dCdCPであった。
【図４】 保護されたCPG-結合ピューロマイシンを調製するための好ましい
方法の概要を示している。
【図５】 本発明の鋳型にメチオニンを取り込むことが可能な方式を示した
概要図である。反応（A）で示されているように、鋳型はリボソームに結合し、7
0Sの開始複合体を形成させる。f-met tRNAがPサイトに結合し、鋳型と塩基対を
形成する。鋳型の3'末端のピューロマイシンが、分子内で鋳型のAサイトに入り
込み、ペプチジルトランスフェラーゼの中心を介してN-ホルミルメチオニンとア
ミド結合を形成し、それによって、tRNAを脱アシル化する。反応液をフェノール
/クロロホルム抽出すると、メチオニンが共有的に付着した鋳型が得られる。反
応（B）で示されているのは、鋳型とピューロマイシンを含むオリゴヌクレオチ
ドとの望ましくない分子間反応である。前と同じように、最小鋳型は、Pサイト
に結合したf-met tRNAを含む70Sリボソームの形成を刺激する。この後、もう一
つの鋳型がトランスの形に入ってきて、共有的に付着したメチオニンができる。
【図６】 35Sメチオニン（35S met）の翻訳鋳型への取り込みを示した写真
である。図6Aは、この反応がマグネシウム（Mg2+）依存的であることを示してい
る。図6Bは、産物が塩基安定的であることを示している。すなわち、この図に示
されている移動度の変化は、43-P（「Met鋳型」とも名づけられている）の5'RNA
配列が消失して、30-Pと名づけられたDNA-ピューロマイシン部位が産生されたこ
とに対応している。塩基処理の後も標識を保持していることは、35Sメチオニン
と鋳型の3'ピューロマイシンとの間にペプチド結合が形成されたことと合致して
いた。図6Cは、ペプチジルトランスフェラーゼのインヒビター存在下で、産物形
成が阻害されることを示している。図6Dは、35Sメチオニンの取り込みが、鋳型
コード配列依存的であることを示している。図6Eは、35Sメチオニンの取り込み
が、DNA鋳型の長さに依存することを示している。図6Fは、鋳型43-Pと25-Pを用
いた、シス型対トランス型の産物形成を示している。図6Gは、鋳型43-Pと13-Pを
用いた、シス型対トランス型の産物形成を示している。図6Hは、網状赤血球ライ
セートシステムにおいて鋳型43-Pと30-Pを用いた、シス型対トランス型の産物形
成を示している。
【図７】 ペプチド融合形成と選抜を調べるための構築物の概要を図示した
ものである。図7Aは、LP77（「連結した産物」「77」ヌクレオチド長）（「短い
myc鋳型」とも名づけられている）を示している（配列番号：1）。この配列は、
5'側の開始コドンと3'側のリンカーに隣接したc-mycモノクローナル抗体エピト
ープタグEQKLISEEDL（配列番号：2）を含む（Evansら、Mol. Cell Biol. 5:3610
-3616 (1985)）。5'側領域は、43-Pと同一の細菌シャイン-ダルガルノ配列を含
んでいる。コード配列は、細菌の系で翻訳されるよう最適化した。特に、43-Pと
LP77の5'UTRは、16S rRNAの5塩基に相補的なシャイン-ダルガルノ保存配列（Ste
itz and Jakes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:4734-4738 (1975)）、および
リボソーム蛋白質の配列と同じスペース（Stormoら、Nucleic Acids Res. 10:29
71-2996 (1982)）をもっていた。図7Bは、LP154（154ヌクレオチド長の連結産物
）（「長いmyc鋳型」とも名づけられている）を示している（配列番号：3）。こ
の配列は、c-myc抗体を単離するのに用いたペプチドを生成するためのコードを
含んでいる。5'末端には、一部欠失したTMVの上流配列（「TE」と命名した）を
含んでいる。この5'UTRは、TMVの5'UTRに由来する、2個のACAAAUUAC直列反復配
列（Gallieら、Nucl. Acids Res. 16:883 (1988)）を含む22ヌクレオチドの配列
を含んでいた。図7Cは、ペプチド選抜に用いられる例示的な配列である1号プー
ル（配列番号：4）を示している。鋳型のPCR増幅に必要とされる3'側定常領域と
して利用する鋳型には、最初のmycペプチドから最終的には7つのアミノ酸が含ま
れていた。この配列は、抗体結合エピトープの部分ではないことが分かっている
。
【図８】 鋳型43-P、LP77、およびLP154、ならびに網状赤血球（「Retic」
）およびコムギ胚芽（「Wheat」）の翻訳システムを用いた、RNA-蛋白質融合体
の合成を示す写真である。図の左側半分は、3つの鋳型それぞれにおける、35Sメ
チオニンの取り込みを示している。図の右側半分は、その結果できた産物を、RN
Aのコード領域を除去するために、3つの鋳型それぞれについてRNase Aで処理し
たものを示している：35Sメチオニン標識したDNA-蛋白質融合体が示されている
。それぞれのDNA部分は、オリゴP-30と一致していた。このように、移動度の違
いは、コード領域の長さに比例していて、それぞれの場合に異なった長さの蛋白
質が存在することと合致していた。
【図９】 LP154から合成したRNA-蛋白質融合体の、変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動によって解析したプロテアーゼ感受性を示す写真である。レーン
1は、32Pで標識された30-Pを含んでいる。レーン2〜4、5〜7、および8〜10は、
網状赤血球ライセート反応から回収された、それぞれ、無処理、RNase A処理、
または、RNase AおよびプロテイナーゼK処理のいずれかの、35S標識された翻訳
鋳型を含んでいる。
【図１０】 インビトロで翻訳させた33アミノ酸のmyc-エピトープ蛋白質を
用いた免疫沈降反応の結果を示す写真である。レーン1と2は、それぞれmyc-エピ
トープ蛋白質とβ-グロビンの鋳型の翻訳産物を示している。レーン3〜5は、c-m
ycモノクローナル抗体、ならびに、それぞれ、PBS、DB、およびPBSTDS洗浄用緩
衝液を用いた、myc-エピトープペプチドの免疫沈降の結果を示している。レーン
6〜8は、同じ免疫沈降反応であるが、β-グロビン翻訳産物を用いた結果を示し
ている。
【図１１】 インビトロで翻訳反応させたRNA-蛋白質融合体の免疫沈降反応
の結果を示す写真である。反応において用いられた鋳型のピコモル数が示されて
いる。レーン1〜4はRNA124（LP154融合体のRNA部分）を、レーン5〜7はRNA-蛋白
質融合体LP154を示している。c-mycモノクローナル抗体とプロテインGセファロ
ースを用いた免疫沈降後、サンプルをRNase AとT4ポリヌクレオチドキナーゼで
処理してから、融合体を可視化するために、尿素ポリアクリルアミド変性ゲルで
泳動した。レーン1〜4では、鋳型なしか、長いmyc鋳型（RNA124）のRNA部分だけ
を含むサンプルでは、融合は見られなかった。レーン5〜7では、融合体に相当す
るバンドが明らかに見られた。32P標識された30-Pの位置を示し、図の上部には
、投入した鋳型の量を示す。
【図１２】 インビトロで翻訳反応で得られた融合物質の定量結果を示すグ
ラフである。図11のレーン5〜7における融合体のバンドと30-Pのバンド（dT25で
平行方式で単離された；図示されていない）の強度をホスホールイメージャープ
レートで定量して、LP154の投入濃度の関数としてグラフにした。回収された被
修飾30-P（左側のy軸）は、投入された鋳型（X軸）に直線的に比例したが、リン
カーペプチド融合体（右側のy軸）は一定であった。この解析から、翻訳反応サ
ンプル1 mlについて、〜1012個の融合体が形成されると計算された。
【図１３】 チオプロピルセファロースとdT25アガロース、および、これら
の基質が、本発明のRNA-蛋白質融合体と反応できることを図示したものである。
【図１４】 本発明の融合体を連続して単離した結果を示す写真である。レ
ーン1は、32P標識した30-Pである。レーン2と3は、翻訳反応液から単離して、RN
ase Aで処理したLP154を示している。レーン2では、チオプロピルセファロース
の後dT25アガロースを用いて、LP154を連続的に単離した。レーン3は、dT25アガ
ロースだけを用いて単離したものを示している。この結果から、この産物が、my
cエピトープのコード配列の最後から2番目のシステインと思われる遊離のチオー
ル基を含んでいることが示された。
【図１５】 SDS-トリシン-PAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）によ
って解析されたβ-グロビンを鋳型として用いたときの融合産物の形成を示す写
真である。図15Aは、鋳型なし（レーン1）、合成-β-グロビン鋳型（レーン2〜4
）、またはLP-β-グロビン鋳型（レーン5〜7）のいずれかを用いたときの、35S
の取り込みを示している。図15Bは（図15Aと同じにレーン標識されている）、オ
リゴヌクレオチドアフィニティークロマトグラフィーによって単離された35S標
識物質を示している。30-Pテールがないと、何も単離されなかった（レーン2〜4
）。
【図１６】 インビトロ選抜による、myc dsDNAとプールdsDNAの増幅を示す
表と写真である。図16Aは、選抜プロトコールの概要である。myc鋳型とプール鋳
型の4つの混合液をインビトロで翻訳し、dT25アガロースで分離した後、TPセフ
ァロースで、修飾されなかった鋳型から鋳型融合物を精製した。次に、mRNA-ペ
プチド融合体を逆転写して、鋳型に存在する二次構造または三次構造を抑制した
。各混合液の等量液を、親和性選抜を行う前（図16B）と後（図16C）に取り出し
、標識プライマー存在下でPCRで増幅して、myc DNAのみを切断する制限酵素で制
限酵素消化した。投入した鋳型混合液は、純粋なmyc（レーン1）、またはmyc：
プールが1：20、1：200、もしくは1：2000であった（レーン2〜4）。mycの鋳型
の選択的な翻訳と逆転写が起きたために、非選択的な物質が、投入割合から逸脱
した。選抜の前後におけるプール：mycの比率の変化から、選抜段階の間におけ
るmyc鋳型の増幅を計算した。
【図１７】 myc RNA鋳型の翻訳を示した写真である。次のリンカーを用い
た：レーン1〜4、dA27dCdCP；レーン5〜8、dA27rCrCP；およびレーン9〜12、dA2 1 C9C9C9dAdCdCP。各レーンにおいて、RNA鋳型の濃度は600 nMで、35S-Metを標識
に用いた。反応条件は、以下の通りであった：レーン1、5および9、30℃で1時間
；レーン2、6および10、30℃で2時間；レーン3、7および11、30℃で1時間、-20
℃で16時間；およびレーン4、8および12、30℃で1時間、50mM Mg2+とともに-20
℃で16時間。この図において、「A」は、遊離のペプチドを示し、「B」は、mRNA
-ペプチド融合体を示す。
【図１８】 32P標識されたmyc RNA鋳型の翻訳を示す写真である。用いたリ
ンカーは、dA21C9C9C9dAdCdCPであった。翻訳は、30℃で90分間行い、インキュ
ベーションは、Mg2+を添加せずに-20℃で2日間行った。mRNA鋳型の濃度は、400
nM（レーン3）、200 nM（レーン4）、100 nM（レーン5）、および100 nM（レー
ン6）であった。レーン1は、35S-Metで標識したmRNA-ペプチド融合体を示す。レ
ーン２は、３２P標識されたmRNAを示す。レーン6では、0.5 mMのキャップ類似体
の存在下で反応を行った。
【図１９】 アンビオン社（Ambion）（レーン1）、ノバジェン社（Novagen
）（レーン2）、およびアマシャム社（Amersham）（レーン3）から購入したライ
セートを用いた、myc RNA鋳型の翻訳を示す写真である。用いたリンカーは、dA2 7 dCdCPであった。鋳型の濃度は600 nMで、35S-Metを標識に用いた。翻訳は、30
℃で1時間行い、インキュベーションは、50 mM Mg2+存在下、-20℃で一晩行った
。
【図２０】 6回のインビトロ選抜の間に抗mycモノクローナル抗体9E10と結
合したRNA-ペプチド融合体の濃縮を示すグラフである。
【図２１】 合成mycペプチドを用いた競合アッセイ法を示したグラフであ
る。
【図２２】 ランダム27mer残基ライブラリーから選抜された12個のペプチ
ドアミノ酸配列を示した模式図である。
【図２３】 融合体形成におけるリンカー長に対する効果を示した写真であ
る。この図において、［N］=13ヌクレオチド長、19ヌクレオチド長、25ヌクレオ
チド長、30ヌクレオチド長、35ヌクレオチド長、40ヌクレオチド長、45ヌクレオ
チド長または50ヌクレオチド長（dA10-47dCdCP）のリンカーを含むMyc鋳型をSDS
-PAGEにより融合体形成についてアッセイした。可動リンカーF（dA21[C9]3dAdCd
CP）もまた示す。600nMの鋳型を用いて30℃で90分間翻訳を行い、続いて50mMのM
g2+を添加し、-20℃で2日間インキュベートした。
【図２４】 mycおよびλPPase mRNAの共翻訳を示した写真である。この図
中で、可動リンカーF(dA21[C9]3dAdCdCP)を含む、200nMのλPPase RNA（RNA716
）および/または50nMのmyc RNA（RNA152）を、[35S]-メチオニンを用いて翻訳し
た。Mg2+（75mM）を添加した後、-20℃でインキュベートした。交差産物（λPPa
seタンパク質に対するmyc鋳型融合体）からはバンドは観察されなかった。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年３月１２日（２００２．３．１２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 リウ リヘ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ケ ンブリッジ マサチューセッツ アベニュ ー 2456 アパートメント 102 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA11 HA01 HA03 HA11 4B063 QA01 QA18 QQ52 QQ60 QQ79 QR32 QR36 QR48 QS12 QS24 QS32 4H045 AA10 AA20 AA30 BA14 BA15 BA16 BA17 BA18 BA54 EA50 FA74

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 タンパク質ライブラリーを作製する方法であって、以下の段
    階を含む方法： a）個々がタンパク質コード配列に操作可能に連結された翻訳開始配列および
    開始コドンを含み、個々が該タンパク質コード配列の3'末端でペプチド受容体に
    操作可能に連結された、一群のRNA分子を供給する段階； b）一群のRNA-タンパク質融合体を作製するために、該タンパク質コード配列
    をインビトロにおいて翻訳する段階；および c）高濃度塩条件下で該RNA-タンパク質融合体群をさらにインキュベートし、
    これによってタンパク質ライブラリーを作製する段階。
  2. 【請求項２】 DNAライブラリーを作製する方法であって、以下の段階を含
    む方法： a）個々がタンパク質コード配列に操作可能に連結された翻訳開始配列および
    開始コドンを含み、個々が該タンパク質コード配列の3'末端でペプチド受容体に
    操作可能に連結された、一群のRNA分子を供給する段階； b）一群のRNA-タンパク質融合体を作製するために、該タンパク質コード配列
    をインビトロにおいて翻訳する段階； c）高濃度塩条件下で該RNA-タンパク質融合体群をさらにインキュベートする
    段階；および d）該融合体の各RNA部位からDNA分子を作製し、これによってDNAライブラリー
    を作製する段階。
  3. 【請求項３】 所望のタンパク質、または該タンパク質をコードする核酸を
    選別する方法であって、以下の段階を含む方法： a）個々がタンパク質コード配列に操作可能に連結された翻訳開始配列および
    開始コドンを含み、個々が候補タンパク質コード配列の3'末端でペプチド受容体
    に操作可能に連結された、一群の候補RNA分子を供給する段階； b）一群の候補RNA-タンパク質融合体を作製するために、該候補タンパク質コ
    ード配列をインビトロにおいて翻訳する段階； c）高濃度塩条件下で該候補RNA-タンパク質融合体群をさらにインキュベート
    し、これによってタンパク質ライブラリーを作製する段階；および d）所望のRNA-タンパク質融合体を選別し、これによって該所望のタンパク質
    および該タンパク質をコードする該核酸を選別する段階。
  4. 【請求項４】 高濃度塩が一価陽イオンを含む、請求項1から請求項3のいず
    れか一項記載の方法。
  5. 【請求項５】 一価陽イオンが約125mM〜1.5M間の濃度である、請求項5記載
    の方法。
  6. 【請求項６】 一価陽イオンが300mM〜600mM間の濃度である、請求項4記載
    の方法。
  7. 【請求項７】 一価陽イオンがK+またはNH4 +である、請求項4記載の方法。
  8. 【請求項８】 一価陽イオンがNa+である、請求項4記載の方法。
  9. 【請求項９】 インキュベーション段階がほぼ室温において行われる、請求
    項7記載の方法。
  10. 【請求項１０】 高濃度塩が二価陽イオンを含む、請求項1から請求項3のい
    ずれか一項記載の方法。
  11. 【請求項１１】 二価陽イオンが約25mM〜200mM間の濃度である、請求項10
    記載の方法。
  12. 【請求項１２】 二価陽イオンがMg2+である、請求項10記載の方法。
  13. 【請求項１３】 高濃度塩が一価および二価陽イオンの両方を含む、請求項
    1から請求項3のいずれか一項記載の方法。
  14. 【請求項１４】 各RNA分子が休止配列をさらに含む、またはRNA分子の3'末
    端に共有結合したDNAもしくはDNA類似体配列をさらに含む、請求項1から請求項3
    のいずれか一項記載の方法。
  15. 【請求項１５】 休止配列またはDNAもしくはDNA類似体配列が、解読部位と
    リボソームのペプチジル転移中心の間の距離に及ぶのに十分な長さである、請求
    項14記載の方法。
  16. 【請求項１６】 休止配列またはDNAもしくはDNA類似体配列が、約60A0〜70
    A0の長さである、請求項14記載の方法。
  17. 【請求項１７】 休止配列またはDNAもしくはDNA類似体配列が約80ヌクレオ
    チド未満の長さである、請求項14記載の方法。
  18. 【請求項１８】 休止配列またはDNAもしくはDNA類似体配列が約45ヌクレオ
    チド未満の長さである、請求項14記載の方法。
  19. 【請求項１９】 休止配列またはDNAもしくはDNA類似体配列が約21ヌクレオ
    チド〜30ヌクレオチドの長さである、請求項14記載の方法。
  20. 【請求項２０】 DNAスプリント（splint）を用いて、休止配列またはDNAも
    しくはDNA類似体配列がRNA分子に連結される、請求項14記載の方法。
  21. 【請求項２１】 休止配列またはDNAもしくはDNA類似体配列が非ヌクレオチ
    ド部位を含む、請求項14記載の方法。
  22. 【請求項２２】 非ヌクレオチド部位が、ひとつ又は複数のHO(CH2CH2O)3PO 2 部位である、請求項14記載の方法。
  23. 【請求項２３】 RNA-タンパク質融合体が、可動性を増加させるペプチド受
    容体の近傍に位置する核酸または核酸類似体配列をさらに含む、請求項1から請
    求項3のいずれか一項記載の方法。
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