BR112012027863B1

BR112012027863B1 - Polipeptídeos, arcabouços de proteína, bibliotecas e métodos de construção das mesmas, método para gerar uma ligação de arcabouço de proteína a um alvo específico com uma afinidade de ligação predefinida, moléculas de ácido nucleico isolada, vetores, células hospedeiras, composições, dispositivos médicos, e artigos de fabricação

Info

Publication number: BR112012027863B1
Application number: BR112012027863-0A
Authority: BR
Inventors: Steven Jacobs
Original assignee: Janssen Biotech, Inc
Priority date: 2010-04-30
Filing date: 2011-04-29
Publication date: 2023-03-07
Also published as: RU2603272C2; PT2571531T; JP6356748B2; US9234029B2; US9982253B2; RU2767543C2; EP3103478A1; US8569227B2; JP2017018124A; EP4115911A1; WO2011137319A2; ES2730693T3; IL222573B; CA2797274C; MX2012012653A; JP2013531475A; CN103002923A; AU2011245225B2; RS55163B1; EP2571531A2

Abstract

COMPOSIÇÕES, MÉTODOS E USOS DE DOMÍNIO DE FIBRONECTINA ESTABILIZADA. A presente invenção refere-se a um arcabouço de proteína com base em uma sequência consenso de proteínas de fibronectina tipo III (FN3) tal como a décima repetição FN3 da fibronectina humana (tenascina humana), incluindo ácidos nucleicos isolados que codificam um arcabouço de proteína, vetores, células hospedeiras e métodos para fabricação e uso dos mesmos. As moléculas de arcabouço de proteína da presente invenção exibem estabilidade térmica e estabilidade química acentuadas enquanto apresentam seis domínios de laço modificáveis que podem ser engenheirados para formar um parceiro de ligação capaz de ligar-se a um alvo para aplicações em composições, métodos e dispositivos de diagnóstico e/ou terapêuticos.

Description

ANTECEDENTES Campo da Invenção

[0001] A presente invenção refere-se a arcabouços de proteína com propriedades inovadoras, inclusive a capacidade de ligar-se a alvos celulares. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a um arcabouço de proteína com base em uma sequência consenso de uma repetição da fibronectina tipo III (FN3).

Discussão do Domínio

[0002] Os anticorpos monoclonais são a classe mais amplamente usada de proteínas terapêuticas quando são desejadas alta afinidade e especificidade para uma molécula-alvo. Entretanto, proteínas não anticorpo que possam ser engenheiradas para ligar-se a esses alvos também são também de alto interesse na indústria biofarmacêutica. Essas proteínas de "arcabouço alternativo" podem apresentar vantagens sobre anticorpos tradicionais devido a seu pequeno tamanho, falta de ligações dissulfeto, alta estabilidade e capacidade de serem expressas em hospedeiros procarióticos. Métodos inovadores de purificação são prontamente empregados; eles são facilmente conjugados com fármacos/toxinas, penetram de maneira eficiente em tecidos e são prontamente formatados em ligantes multiespecíficos (Skerra 2000 J Mol Recognit volume 13 número 4, páginas 167 a 187; Binz e Pluckthun 2005 Curr Opin Biotechnol volume 16 número 4 páginas 459 a 469).

[0003] Um desses arcabouços alternativos é a dobra de imunoglobulina (Ig). Essa dobra é encontrada nas regiões variáveis de anticorpos, bem como de milhares de proteínas não anticorpo. Demonstrou-se que uma proteína Ig desse tipo, a décima repetição de fibronectina tipo III (FN3) obtida de fibronectina humana, pode tolerar inúmeras mutações em laços expostos na superfície, ao mesmo tempo em que retém a estrutura geral da dobra de Ig. Dessa forma, bibliotecas de variantes de aminoácido foram integradas a esses laços e ligantes específicos selecionados para um certo número de alvos diferentes (Koide et al. 1998 J Mol Biol, volume 284 número 4 páginas 1141 a 1151; Karatan et al. 2004 Chem Biol, volume 11 número 6 páginas 835 a 844). Descobriu-se, também, que esses domínios FN3 ligam-se com alta afinidade aos alvos, ao mesmo tempo em que retêm importantes propriedades biofísicas (Parker et al. 2005 Protein Eng Des Sel, volume 18, número 9 páginas 435 a 444).

[0004] As propriedades físicas desejáveis de potenciais moléculas de arcabouço alternativo incluem alta estabilidade térmica e reversibilidade de dobragem e desdobragem térmica. Vários métodos foram aplicados para aumentar a estabilidade térmica aparente de proteínas e enzimas, incluindo design racional com base em comparação com sequências termoestáveis altamente similares, design de pontes de dissulfeto estabilizantes, mutações para aumentar a propensão da alfa-hélice, manipulação de pontes salinas, alteração da carga superficial da proteína, evolução dirigida, e composição de sequências consenso (Lechmann e Wyss, 2001, Curr Opin Biotechnol, volume 12, número 4 páginas 371 a 375). A alta estabilidade térmica é uma propriedade desejada desses arcabouços, já que pode aumentar o rendimento da proteína recombinante obtida, otimizar a solubilidade da molécula purificada, otimizar a atividade dos arcabouços intracelulares, diminuir a imunogenicidade, e minimizar a necessidade por uma cadeia fria na fabricação.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0005] A presente invenção apresenta um arcabouço de proteína baseado em uma proteína de repetição da fibronectina tipo III (FN3), ácidos nucleicos codificantes ou complementares, vetores, células hospedeiras, composições, combinações, formulações, dispositivos e métodos para fabricação e uso do mesmo. Em uma modalidade preferencial, o arcabouço de proteína é compreendido por uma sequência consenso de múltiplos domínios FN3 obtidos de Tenascina- C humana (deste ponto em diante do presente documento "Tenascina"). Em uma outra modalidade preferencial, o arcabouço de proteína da presente invenção é uma sequência consenso de 15 domínios FN3 (SEQ ID NO: 1-15) ou uma variante do mesmo. Em um aspecto particular da invenção, o arcabouço de proteína da invenção tem resíduos substitutos que podem fazer com que a proteína do arcabouço demonstre capacidade aumentada para resistir a desnaturação térmica e química. Os arcabouços de proteína da invenção podem ser manipulados por métodos conhecidos na técnica, incluindo inserção de resíduos nas regiões de laço dentro do arcabouço, para formar um domínio de ligação seletivo para um parceiro de ligação. O parceiro de ligação pode ser uma molécula solúvel ou uma molécula ancorada de modo celular, por exemplo, o domínio extracelular de uma proteína receptora.

[0006] Em uma modalidade, substituições específicas na sequência com base em consenso de SEQ ID NO: 16 (Tencon) selecionada para estabilidade térmica e química inerente aqui descritas otimizam a estabilidade térmica do arcabouço de Tencon em até 11°C e alteram o ponto médio de desnaturação induzida por GdmCl de 3,4 M para maior que 5 M. Em uma modalidade, as substituições específicas a SEQ ID NO: 16 (Tencon) são unitárias, como N46V, E14P, e E86I, e, em uma modalidade alternativa as substituições são múltiplas, como N46V e E86I, todas de E14P e N46V e E86I, e todas de L17A e N46V e E86I. Os polipeptídeos baseados em Tencon com estabilidade otimizada fornecem arcabouços com facilidade aprimorada de purificação, formulação, e vida útil. Os parceiros de ligação manipulados com estabilidade total aprimorada podem ser produzidos pela introdução de peptídeos selecionados aleatoriamente em laços do arcabouço estabilizado.

[0007] Os arcabouços de proteína da invençãopodem ser usados como unidades monoméricas ou ligados para formar estruturas poliméricas com especificidade a parceiro de ligação igual ou diferente. As moléculas com base em arcabouço de proteína Tencon podem ser modificadas adicionalmente para melhorar uma ou mais propriedades in vivo relacionadas a biodistribuição, persistência no corpo, ou eficácia terapêutica como a associação com moléculas que alteram a absorção celular, particularmente de célula epitelial, por exemplo, a região Fc de um anticorpo, ou moléculas projetadas para ligar proteínas de soro como um domínio de ligação de albumina. Em modalidades adicionais, os arcabouços de proteína da invenção podem ser ligados a uma molécula de ácido nucleico que possa codificar o arcabouço de proteína.

[0008] A presente invenção apresenta, também, pelo menos um método para expressar pelo menos um polipeptídeo de arcabouço de proteína cuja sequência é relacionada a uma sequência consenso de múltiplos domínios FN3, em uma célula hospedeira, que compreende o cultivo da célula hospedeira conforme descrito na presente invenção, sob condições nas quais pelo menos um arcabouço de proteína é expresso em quantidades detectáveis e/ou recuperáveis.

[0009] A presente invenção apresenta, também, pelo menos uma composição compreendendo: (a) um arcabouço de proteína baseado em uma sequência consenso de múltiplos domínios FN3 e/ou ácido nucleico codificante conforme descrito na presente invenção; e (b) e um veículo ou diluente adequado e/ou farmaceuticamente aceitável.

[00010] A presente invenção compreende, adicionalmente, um método para geração de bibliotecas de um arcabouço de proteína baseado emuma proteína de repetição da fibronectina tipo III (FN3), de preferência uma sequência consenso de múltiplos domínios FN3 e, com mais preferência, uma sequência consenso de múltiplos domínios FN3 de Tenascina humana com estabilidade térmica e química acentuadas. As bibliotecas podem ser geradas pela alteração da composição de aminoácido de um único laço, ou pela alteração simultânea de múltiplos laços ou posições adicionais da molécula de arcabouço. Os laços que são alterados podem ser alongados ou encurtados de acordo com a necessidade. Essas bibliotecas podem ser geradas para incluir, em cada posição, todos os aminoácidos possíveis ou um determinado subconjunto de aminoácidos. Os elementos da biblioteca podem ser usados para triagem por exibição, como por exibição in vitro (exibição de DNA, RNA, ribossoma, etc.), bem como exibição de levedura, bactéria e fago.

[00011] Os arcabouços de proteína da presente invenção fornecem propriedades biofísicas acentuadas, como a estabilidade sob condições de alta resistência osmótica e solubilidade em altas concentrações. Os domínios das proteínas de arcabouço não são ligadas por dissulfeto, tornando-os capazes de expressão e dobragem em sistemas desprovidos de enzimas necessárias para formação de ligação dissulfeto, incluindo sistemas procarióticos, como E. coli, e em sistemas de transcrição/tradução in vitro como sistema de lisado de reticulócito de coelho.

[00012] Em um aspecto adicional, a presente invenção apresenta um método para geração de uma molécula de arcabouço que se liga a um alvo específico percorrendo a biblioteca de arcabouços da invenção com o alvo e ligantes detectores. Em outros aspectos relacionados, a invenção compreende métodos de triagem que podem ser usados para gerar ou amadurecer por afinidade os arcabouços de proteína com a atividade desejada, por exemplo capazes de ligação a proteínas-alvo com uma certa afinidade. A maturação por afinidade pode ser obtida mediante ciclos iterativos de mutagênese e seleção, usando sistemas como exibição de fago ou exibição in vitro. A mutagênese durante esse processo pode ser o resultado de mutagênese direcionada pelo sítio a resíduos de arcabouço específicos, mutagênese aleatória devida a PCR propenso a erro, embaralhamento de DNA e/ou uma combinações dessas técnicas. A presente invenção apresenta, adicionalmente, qualquer invenção aqui descrita.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00013] A figura 1 Análise SDS-PAGE de Tencon purificada realizada em um gel NuPAGE 4 a 12% Bis-Tris (Invitrogen) e corado com azul de coomassie. N corresponde a condições nativas e R a condições reduzidas.

[00014] A figura 2 mostra uma análise de dicroísmo circular de Tencon em PBS.

[00015] A figura 3 mostra uma análise de dicroísmo circular do terceiro domínio FN3 de tenascina e Tencon em PBS onde as temperaturas de fusão de 54°C e 78°C foram obtidas respectivamente.

[00016] A figura 4 mostra o design de um plasmídeo fagomídeo de pTencon-pIX. A expressão é conduzida por um promotor Lac e a secreção através da sequência de sinais OmpA.

[00017] A figura 5 mostra myc-Tencon que pode ser exibida no fago M13 com o uso de ELISA demonstrando a ligação do fago a anti- Myc revestido, CNTO95 revestido, e cavidades não revestidas.

[00018] A figura 6 é um desenho representando a estrutura em laço do terceiro domínio FN3 de Tenascina humana.

[00019] A figura 7 mostra o resultado da triagem por Elisa de seleções de IgG pelo qual clones individuais foram testados para ligação a IgG biotinilado ou HSA biotinilado como controle.

[00020] As figuras 8A e 8B são gráficos mostrando a desnaturação induzida por GdmCl para mutantes únicos (A) e mutantes combinatoriais (B) conforme medido por excitação por fluorescência a 280 nm e uma emissão de 360 nm.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Abreviações

[00021] ADCC = citotoxicidade celular dependente de anticorpos; CDC = citotoxicidade dependente de complemento; DSC = calorimetria de varredura diferencial; ΔG = Energia Livre de Gibbs; IgG = imunoglobulina G; Tm = temperatura de fusão;

Definições & Explicação da terminologia

[00022] O termo "anticorpo" ou "porção de anticorpo" se destina a abranger anticorpos, fragmentos de digestão, porções especificadas e suas variantes, incluindo, sem limitação, mimetismo de anticorpo, ou compreendendo porções de anticorpos que imitam a estrutura e/ou a função de um anticorpo ou fragmento especificado ou porção do mesmo, incluindo, sem limitação, anticorpos de cadeia única, anticorpos de domínio único, minicorpos e fragmentos dos mesmos. Fragmentos funcionais incluem fragmentos de ligação a antígeno que se ligam ao antígeno alvo de interesse. Por exemplo, fragmentos de anticorpo capazes de ligação a um antígeno alvo ou porções do mesmo, incluindo, mas não se limitando a, fragmentos Fab (por exemplo, mediante digestão por papaína), Fab' (por exemplo, mediante digestão por pepsina e redução parcial) e F(ab’)2 (por exemplo, mediante digestão por pepsina), facb (por exemplo, mediante digestão por plasmina), pFc’ (por exemplo, mediante digestão por pepsina ou por plasmina), Fd (por exemplo, mediante digestão por pepsina, redução parcial e reagregação), Fv ou scFv (por exemplo, mediante técnicas de biologia molecular), estão abrangidos pelo termo anticorpo. O anticorpo ou fragmento pode serderivado de qualquer mamífero, como, mas não se limitando a, ser humano, camundongo, coelho, rato, roedor, primata, cabra ou qualquer combinação dos mesmos, inclui anticorpos, imunoglobulinas, produtos de clivagem e outras porções e variantes especificadas de ser humano, primata, roedor, mamífero, quimérico, humanizado e/ou enxertado com CDR.

[00023] O termo "epitopo" significa uma proteína determinante capaz de ligação específica a um anticorpo ou domínio de ligação manipulado como um ou mais laços de uma proteína com base em arcabouço. Os epitopos normalmente consistem em agrupamentos de superfície quimicamente ativos como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e têm usualmente características estruturais tridimensionais específicas, assim como características de carga específicas. Epitopos conformacionais e não conformacionais são distinguidos de modo que a ligação ao primeiro mas não ao último é perdida na presença de solventes desnaturantes. Os epitopos conformacionais resultam de dobragem conformacional da molécula-alvo que surge quando os aminoácidos de diferentes porções da sequência linear da molécula- alvo se reúnem em íntima proximidade no espaço tridimensional. Esses epitopos conformacionais são tipicamente distribuídos no lado extracelular da membrana do plasma.

[00024] Os termos "Fc", "proteína contendo Fc" ou "molécula contendo Fc", para uso na presente invenção, referem-se a uma proteína monomérica, dimérica ou heterodimérica que tem pelo menos um domínio de imunoglobulina CH2 e CH3. Os domínios CH2 e CH3 podem formar pelo menos uma parte da região dimérica da proteína/molécula (por exemplo, anticorpo).

[00025] O termo "estabilidade", para uso na presente invenção, refere-se à capacidade de uma molécula de manter um estado dobrado sob condições fisiológicas, de modo que retenha pelo menos uma de suas atividades funcionais normais, por exemplo, ligando-se a uma molécula-alvo como um citocina ou proteína sérica. A medição da estabilidade da proteína e suscetibilidade de proteína pode ser vista como aspectos iguais ou diferentes da integridade da proteína. As proteínas são sensíveis ou "instáveis" à desnaturação causada pelo calor, por radiação ultravioleta ou ionizante, alterações da osmolaridade ambiente e pH em solução líquida, força de cisalhamento mecânico imposta por filtração por poros pequenos, radiação ultravioleta, radiação ionizante, como irradiação gama, desidratação química ou por calor, ou qualquer outra ação ou força que possa causar a perturbação da estrutura protéica. A estabilidade da molécula pode ser determinada com o uso de métodos padrão. Por exemplo, a estabilidade de uma molécula pode ser determinada pela medição da temperatura de fusão térmica ("TM"). A TM é a temperatura em graus Celsius (°C) em que % das moléculas se tornam desdobradas. Tipicamente, quanto mais alta a TM, mais estável é a molécula. Em adição ao calor, o ambiente químico também altera a capacidade da proteína de manter uma estrutura tridimensional particular.

[00026] A desnaturação química pode, de modo semelhante, ser medida por uma variedade de métodos. Um desnaturante químico é um agente conhecido por perturbar interações não covalentes e ligações covalentes dentro de uma proteína, incluindo ligações de hidrogênio, ligações eletrostáticas, forças de Van der Waals, interações hidrofóbicas ou ligações dissulfeto. Desnaturantes químicos incluem o hidrocloreto de guanidínio, tiocianeto de guanidínio, ureia, acetona, solventes orgânicos (DMF, benzeno, acetonitrilo), sais (brometo de lítio sulfato de amônio, cloreto de lítio, brometo de sódio, cloreto de cálcio, cloreto de sódio); agentes de redução (por exemplo, ditiotreitol, beta-mercaptoetanol, dinitrotiobenzeno, e hidretos, como boroidreto de sódio), detergentes não iônicos e iônicos, ácidos (por exemplo, ácido clorídrico (HCl), ácido acético (CH3COOH), ácidos acéticos halogenados), moléculas hidrofóbicas (por exemplo, fosofolipídeos), e desnaturantes visados (Jain R.K and Hamilton A. D., Angew. Chem., volume 114, número 4, 2002). A quantificação da extensão da desnaturação pode depender da perda de uma propriedade funcional como a capacidade de se ligar a uma molécula- alvo, ou por propriedades fisioquímicas como tendência a agregação, exposição de resíduos de solventes anteriormente inacessíveis, ou perturbação ou formação de ligações dissulfeto.

[00027] Em termos de perda de estabilidade, isto é, "desnaturar" ou "desnaturação" de uma proteína significa o processo onde alguma ou toda a conformação tridimensional que confere as propriedades funcionais da proteína foi perdida com uma consequente perda de atividade e/ou solubilidade. As forças perturbadoras durante a desnaturação incluem ligações intramolecular, incluindo, mas não se limitando a, forças eletrostáticas, hidrofóbicas, de Van der Waals, ligações de hidrogênio, e dissulfetos. A desnaturação de proteína pode ser causada por forças aplicadas à proteína ou uma solução que compreende a proteína como uma força mecânica (por exemplo, compressiva ou força de cisalhamento), térmica, estresse osmótico, mudança no pH, campos elétricos ou magnéticos, radiação ionizante, radiação ultravioleta e desidratação, e por desnaturantes químicos.

[00028] Um tratamento ou quantidade "terapeuticamente eficaz", para uso na presente invenção, refere-se a uma quantidade de volume suficiente para causar uma redução ou atenuação da causa de um distúrbio ou seus sintomas. "Atenuar" refere-se a uma redução do efeito prejudicial do distúrbio no paciente que recebe a terapia. O indivíduo da invenção é de preferência um ser humano, entretanto, pode ser considerado que qualquer animal que necessite de tratamento para condições com efeitos prejudiciais, distúrbio, o doença pode ser tratado com uma proteína com base em arcabouço projetada para aquele propósito.

Visão geral

[00029] A presente invenção apresenta um arcabouço de proteína isolado, recombinante e/ou sintético com base em uma sequência consenso de umaproteína de repetição de fibronectina tipo III (FN3) incluindo, sem limitação, arcabouço derivado de mamífero, bem como composições e moléculas de ácido nucleico codificadas compreendendo pelo menos um polinucleotídeo que codifica um arcabouço de proteína baseado na sequência consenso FN3. A presente invenção inclui adicionalmente, mas não se limita a, métodos para fabricação e uso desses ácidos nucleicos e arcabouços de proteína, incluindo como uma plataforma de descoberta, e para composições, métodos e dispositivos terapêuticos e para diagnóstico.

[00030] Os arcabouços de proteínada da presente invenção oferecem vantagens em relação a vastas bioterapêuticas baseadas em imunoglobulina, devido a seu tamanho pequeno e compacto. Em particular, o tamanho e formato de uma molécula biológica pode ter impacto sobre sua capacidade de ser administrada localmente, oralmente, ou cruzar a barreira hematoencefálica; capacidade de ser expressada em sistemas de baixo custo como E. coli; capacidade de ser projetada em moléculas bi- ou multi-específicas que se ligam a alvos múltiplos ou epítetos múltiplos do mesmo alvo, adequação para conjugação, isto é, a ativos, polímeros, e sondas; capacidade de ser formulada em altas concentrações; e a capacidade dessas moléculas de penetrarem efetivamente em tecidos doentes e tumores.

[00031] Além do mais, os arcabouços de proteína apresentam muitas das propriedades dos anticorpos em relação a sua dobragem, que imita a região variável de um anticorpo. Essa orientação permite que os laços de FN3 sejam expostos de modo similar ao das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) do anticorpo. Os mesmos precisam ser capazes de ligar-se a alvos celulares, e os laços podem ser alterados, por exemplo maturados por afinidade, para otimizar certas propriedades de ligação ou propriedades relacionadas.

[00032] Três dos seis laços do arcabouço de proteína da invenção correspondem topologicamente aos domínios de ligação de um anticorpo posicionado nos laços do domínio variável conhecido por ser de fato hipervariável (os laços de domínios hipervariáveis (HVL), em posições como as definidas por Kabat com os resíduos das regiões determinantes de complementaridade (CDRs), isto é, regiões de ligação a antígeno, de um anticorpo, enquanto os três laços restantes são expostos à superfície de maneira similares aos CDRs de anticorpos. Esses laços abrangem ou são posicionados em ou próximos aos resíduos 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64 e 75-81 da SEQ ID NO:16 conforme mostrado na Tabela 3, abaixo, e na figura 6. De preferência, as regiões de laço nos resíduos 22-28, 51-54 e 75-81, ou em redor dos mesmos, são alteradas para especificidade e afinidade de ligação. Uma ou mais dentre essas regiões de laço são selecionadas aleatoriamente com outras regiões de laço e/ou outras fitas mantendo sua sequência como porções de cadeia principal para povoar uma biblioteca, e ligantes potentes podem ser selecionados a partir da biblioteca tendo alta afinidade por uma proteína-alvo específica. Uma ou mais das regiões de laço podem interagir com uma proteína-alvo, de modo similar a uma interação de CDR de anticorpo com a proteína.

[00033] Os arcabouços da presente invenção podem incorporar outras subunidades, por exemplo via interação covalente. Toda ou uma porção de uma região constante de um anticorpo pode ser ligada ao arcabouço para conferir as propriedades similares às de um anticorpo, especificamente aquelas propriedades associadas com a região Fc, por exemplo, atividade de complemento (ADCC), meia-vida, etc. Por exemplo, uma função efetora pode ser oferecida e/ou controlada, por exemplo, modificando-se ligação C1q e/ou a ligação FCYR e, desse modo, alterando a atividade de CDC e/ou de ADCC. As "funções efetoras" são responsáveis pela ativação ou diminuição de uma atividade biológica (por exemplo, em um indivíduo). Exemplos de funções efetoras incluem, mas não se limitam a: ligação C1q; citotoxicidade dependente de complemento (CDC); ligação ao receptor Fc; citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpo (ADCC); fagocitose; regulação negativa de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B; BCR), etc. As funções desse efetor podem necessitar que a região Fc seja combinada com um domínio de ligação (por exemplo, laços de arcabouço de proteína) e possa ser avaliada com o uso de vários ensaios (por exemplo, ensaios de ligação a Fc, ensaios ADCC, ensaios CDC, etc.).

[00034] Porções adicionais podem ser anexadas ou associadas ao polipeptídeo baseado em arcabouço ou variante como moléculas de uma toxina conjugada, albumina ou ligantes de albumina, polieletilenoglicol (PEG) podem ser anexadas à molécula de arcabouço para conseguir as propriedades desejadas. Essas porções podem ser fusões em linha com a sequência de codificação de arcabouço e podem ser geradas por técnicas padrão, por exemplo, pela expressão da proteína de fusão de uma fusão recombinante que codifica um vetor construído com o uso de sequências de nucleotídeo codificadoras publicamente disponíveis. Alternativamente, métodos químicos podem ser usados para fixar as porções a uma proteína baseada em arcabouço produzida de modo recombinante.

[00035] Os arcabouços da presente invenção podem ser usados como mono-específicos sob forma monomérica, ou como bi ou multi- específicos (para diferentes proteínas-alvo ou diferentes epitopos na mesma proteína-alvo) sob forma multimérica. As anexações entre cada unidade de arcabouço podem ser covalentes ou não covalentes. Por exemplo, um arcabouço biespecífico dimérico tem uma subunidade com especificidade para uma primeira proteína-alvo ou epitopo e uma segunda subunidade com especificidade para uma segunda proteína-alvo ou epitopo. As subunidades do arcabouço podem estar unidas em uma variedade de conformações que podem aumentar a valência e, portanto, a avidez da ligação a antígeno.

Geração e Produção de Proteína de Arcabouço

[00036] Pelo menos uma proteína de arcabouço da presente invenção pode ser opcionalmente produzida por uma linhagem de células, uma linhagem mista de células, uma célula imortalizada ou uma população clonal de células imortalizadas, conforme é bem conhecido na técnica. Consulte, por exemplo, Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, EUA (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor, NY, EUA (1989); Harlow e Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, EUA (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY, EUA (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, EUA, (19972001).

[00037] Os aminoácidos obtidos a partir de uma proteína de arcabouço podem ser alterados, adicionados e/ou deletados para reduzir a imunogenicidade ou reduzir, acentuar ou modificar a ligação, a afinidade, velocidade de associação, velocidade de dissociação, avidez, especificidade, meia-vida, estabilidade, solubilidade ou qualquer outra característica adequada, conforme é conhecido na técnica.

[00038] Proteínas baseadas em arcabouço bioativas podem ser manipuladas com retenção de alta afinidade pelo antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para alcançar esse objetivo, as proteínas de arcabouço podem ser opcionalmente preparadas por meio de um processo de análise das sequências parentais e de vários produtos engenheirados conceituais usando-se modelos tridimensionais das sequências parentais e engenheiradas. Os modelos tridimensionais estão comumente disponíveis e são familiares para os versados na técnica. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e exibem prováveis estruturas conformacionais tridimensionais de sequências candidatas selecionadas, e podem medir a possível imunogenicidade (por exemplo, o programa Immunofilter da Xencor, Inc., de Monrovia, CA, EUA). A inspeção dessas exibições permite a análise do provável papel desempenhado pelos resíduos no funcionamento da sequência candidata, isto é, a análise dos resíduos que influenciam a capacidade da proteína de arcabouço candidata para ligar-se a seu antígeno. Desse modo, os resíduos podem ser selecionados e combinados a partir das sequências parental e de referência, de modo que seja obtida a característica desejada, como afinidade por um ou mais antígenos-alvo. Alternativamente, ou adicionalmente aos procedimentos acima citados, podem ser usados outros métodos de engenharia adequados.

Triagem

[00039] A triagemde proteína com base em arcabouço ou de livrarias de proteína com base em arcabouço, engenheiradas, com resíduos ou domínios variadospara ligação específica a proteínas ou fragmentos similares pode ser alcançada convenientemente com o uso de bibliotecas de exibição de nucleotídeos (exibição de DNA ou RNA) ou peptídeos, por exemplo, exibição in vitro. Esse método envolve a triagem de amplas coleções de peptídeos para membros individuais que tem a função ou estrutura desejada. Os peptídeos exibidos com ou sem sequências de nucleotídeos podem ter um comprimento de 3 a 5.000 ou mais nucleotídeos ou aminoácidos, frequentemente de 5 a 100 aminoácidos e, frequentemente, de cerca de 8 a 25 aminoácidos. Além dos métodos de síntese química direta para geração de bibliotecas de peptídeos, foram descritos vários métodos com DNA recombinante. Um tipo envolve a visualização de uma sequência de peptídeo na superfície de um bacteriófago ou célula. Cada bacteriófago ou célula contém a sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de peptídeo particular visualizada.

[00040] Os arcabouços de proteína da invenção podem ligar-se a proteínas humanas ou de outros mamíferos, com uma ampla gama de afinidades (KD). Em uma modalidade preferencial, pelo menos um arcabouço de proteína da presente invenção pode, opcionalmente, ligar-se a uma proteína-alvo com um grau muito alto de afinidade, por exemplo com uma KD igual a ou menor que cerca de 10-7 M, incluindo, mas não se limitando a, de 0,1 a 9,9 (ou qualquer faixa ou valor nesse intervalo) X 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13, 10-14, 10-15 ou qualquer faixa ou valor nesse intervalo, conforme determinado por ressonância plasmônica de superfície ou pelo método KinExA, conforme praticado pelos versados na técnica.

[00041] A afinidade ou avidez de um arcabouço de proteína por um antígeno pode ser determinada experimentalmente com o uso de qualquer método adequado. (Consulte, por exemplo, Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions", In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, EUA (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, EUA (1992); e métodos aqui descritos). A afinidade medida de uma interação específica entre arcabouço de proteínae antígeno pode variar se for medida sob diferentes condições (por exemplo, osmolaridade, pH). Portanto, as medições de afinidade e outros parâmetros de ligação a antígeno (por exemplo, KD, Kon, Koff) são, de preferência, feitas com soluções padronizadas de arcabouço de proteína e antígeno, e com um tampão padronizado, como o tampão aqui descrito.

[00042] Ensaios competitivos podem ser realizados com o arcabouço de proteína da presente invenção, de modo a determinar quais proteínas, anticorpos e outros antagonistas competem pela ligação a uma proteína-alvo com o arcabouço de proteína da presente invenção, e/ou compartilham a região de epitopo. Esses ensaios, conforme é prontamente conhecido pelos versados na técnica, avaliam a competição entre antagonistas ou ligandos por um número limitado de sítios de ligação em uma proteína. Imobiliza-se ou torna-se insolúvel a proteína e/ou o anticorpo, antes ou depois da competição, e a amostra ligada à proteína-alvo é separada da amostra não ligada, por exemplo mediante decantação (nos casos em que se tenha previamente tornado insolúvel a proteína ou o anticorpo) ou mediante centrifugação (nos casos em que se tenha precipitado a proteína ou o anticorpo após a reação competitiva). Além disso, a ligação competitiva pode ser determinada pelo fato de a função ter sido alterada pela ligação ou pela ausência de ligação do arcabouço de proteína à proteína-alvo, por exemplo, se a molécula do arcabouço de proteína inibe ou potencializa a atividade enzimática de, por exemplo, um marcador. ELISA e outros testes funcionais podem ser usados, conforme é bem conhecido na técnica.

Moléculas de ácido nucleico

[00043] As moléculas de ácido nucleico da presente invenção que codificam arcabouços de proteína podem estar sob a forma de RNA, como mRNA, hnRNA, tRNA ou qualquer outra forma, ou sob a forma de DNA incluindo, mas não se limitando a, cDNA e DNA genômico obtido por clonagem ou produzido sinteticamente, ou qualquer combinação dos mesmos. O DNA pode ser de fita tripla, dupla ou única, ou qualquer combinação das mesmas. Qualquer porção de pelo menos uma fita do DNA ou RNA pode ser uma fita codificante, também conhecida como fita senso, ou pode ser a fita não codificante, também conhecida como fita antissenso.

[00044] As moléculas de ácido nucleico isoladas da presente invenção podem incluir moléculas de ácido nucleico que compreendem um quadro de leitura aberto (ORF), opcionalmente, com um ou mais íntrons, por exemplo, mas não se limitando a, pelo menos uma porção especificada de pelo menos um arcabouço de proteína; moléculas de ácido nucleico que compreendem a sequência de codificação para um arcabouço de proteína ou região de laço que se liga à proteína-alvo; e moléculas de ácido nucleico que compreendem uma sequência de nucleotídeo substancialmente diferente daquelas descritas acima mas que, devido a degenerescência do código genético, ainda codificam oarcabouço de proteína conforme descrito aqui e/ou como conhecido na técnica. Evidentemente, o código genético é bem conhecido na técnica. Portanto, seria rotineiro para o versado na técnica gerar tais variantes degeneradas de ácido nucleico que codificam os arcabouços de proteína da presente invenção. Consulte, por exemplo, Ausubel, et al., acima, e tais variantes de ácido nucleico são incluídos na presente invenção.

[00045] Conforme indicado na presente invenção, as moléculas de ácido nucleico da presente invenção que compreendem um ácido nucleico que codifica um arcabouço de proteínapodem incluir, mas não se limitam a, aqueles que codificam a sequência de aminoácidos de um fragmento dearcabouço de proteínapor si mesmo; a sequência de codificação para oarcabouço de proteínainteiro ou uma porção do mesmo; a sequência de codificação para um arcabouço de proteína, fragmento ou porção, assim como sequências adicionais, como a sequência de codificação de ao menos um líder sinalizador ou peptídeo de fusão, com ou sem as sequências de codificação adicionais supracitadas, como pelo menos um íntron, junto com sequências não codificadoras adicionais, incluindo, mas não se limitando a, sequências não codificadoras 5’ e 3’,como as sequências transcritas não traduzidas que desempenham um papel na transcrição, processamento de mRNA, incluindo emenda e sinais de poliadenilação (por exemplo, ligação de ribossoma e estabilidade de mRNA); uma sequência de codificação adicional que codifica aminoácidos adicionais, como aqueles que fornecem funcionalidades adicionais. Portanto, a sequência que codifica um arcabouço de proteína pode ser fundida a uma sequência de marcador, como uma sequência que codifica um peptídeo que facilita a purificação do arcabouço de proteína fundido que compreende um fragmento ou porção de arcabouço de proteína.

Moléculas de ácido nucleico

[00046] A invenção também fornece ácidos nucleicos que codificam as composições da invenção como polinucleotídeos isolados ou como porções de vetores de expressão, incluindo vetores compatíveis com a expressão, secreção e/ou exibição de fagos procarióticos, eucarióticos ou filamentosos das composições ou os mutágenos direcionados dos mesmos.

[00047] Os ácidos nucleicos isolados da presente invenção podem ser produzidos usando-se (a) métodos recombinantes, (b) técnicas de síntese, (c) técnicas de purificação, e/ou (d) combinações das mesmas, conforme é bem conhecido na técnica.

[00048] Os polinucleotídeos úteis na prática da presente invenção codificarão uma porção funcional do arcabouço de proteína descrito na presente invenção. Os polinucleotídeos da presente invenção abrangem sequências de ácido nucleico que podem ser usadas para hibridização seletiva com um polinucleotídeo que codifica um arcabouço de proteína da presente invenção. A presente invenção apresenta ácidos nucleicos isolados que se hibridizam sob condições de hibridização seletiva em um polinucleotídeo apresentado aqui. Portanto, os polinucleotídeos dessa modalidade podem ser usados para isolar, detectar e/ou quantificar ácidos nucleicos que compreendem tais polinucleotídeos. Por exemplo, os polinucleotídeos da presente invenção podem ser usados para identificar, isolar ou amplificar clones parciais ou de tamanho integral em uma biblioteca depositada. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos são sequências genômicas ou de cDNA isoladas, ou, de outro modo, complementares a um cDNA obtido de uma biblioteca de ácido nucleico humano ou de mamífero.

[00049] Os ácidos nucleicos podem compreender, de modo conveniente, sequências além de um polinucleotídeo da presente invenção. Por exemplo, um sítio de multiclonagem que compreende um ou mais sítios de restrição de endonuclease pode ser inserido no ácido nucleico para auxiliar no isolamento do polinucleotídeo. Ademais, as sequências transladáveis podem ser inseridas para auxiliar no isolamento do polinucleotídeo transladado da presente invenção. Por exemplo, uma sequência marcadora de hexa-histidina fornece um meio conveniente para purificar as proteínas da presente invenção. O ácido nucleico da presente invenção, excluindo-se a sequência de codificação, é opcionalmente um vetor, adaptador ou conector para clonagem e/ou expressão de um polinucleotídeo da presente invenção.

[00050] As sequências adicionais podem ser adicionadas a tais sequências de clonagem e/ou expressão para otimizar sua função em clonagem e/ou expressão para auxiliar no isolamento do polinucleotídeo, ou para otimizar a introdução do polinucleotídeo em uma célula. O uso de vetores de expressão, adaptadores, e conectores é bem conhecido na técnica.

[00051] Conforme indicado na presente invenção, as moléculas de ácido nucleico da presente invenção que compreendem um ácido nucleico que codifica umarcabouço de proteínapodem incluir, mas não se limitam a, aqueles que codificam a sequência de aminoácidos de um fragmento dearcabouço de proteína, por si mesmo; a sequência de codificação para oarcabouço de proteínainteiro ou uma porção do mesmo; a sequência de codificação para um arcabouço de proteína, fragmento ou porção, assim como sequências adicionais, como a sequência de codificação de pelo menos um líder sinalizador ou peptídeo de fusão, com ou sem as sequências de codificação adicionais supracitadas, como pelo menos um íntron, junto com sequências não codificadora adicionais, incluindo, mas não se limitando a, sequências de não codificação 5’ e 3’, como as sequências não traduzidas, transcritas, que desempenham um papel na transcrição, processamento de mRNA, incluindo emenda e sinais de poliadenilação (por exemplo, ligação de ribossoma e estabilidade de mRNA); uma sequência de codificação adicional que codifica para aminoácidos adicionais, como aqueles que fornecem funcionalidades adicionais. Portanto, a sequência que codifica um arcabouço de proteína pode ser fundida a uma sequência de marcador, como uma sequência que codifica um peptídeo que facilita a purificação do arcabouço de proteína fundido, que compreende um fragmento ou porção de arcabouço de proteína.

[00052] Para a expressão bacteriana incluindo bactérias infectadas por fago, um sinal de secreção preferencial é um sinal de secreção pelB ou ompA mas outros domínios de polipeptídeo de sinal de secreção podem ser usados conforme descrito na patente US n° 5.658.727. Na exibição de fago, uma sequência de DNA capaz de tradução a jusante codifica uma proteína de revestimento de fago filamentoso, por exemplo, proteína pIII ou pIX. Proteínas de fago filamentoso preferenciais são obteníveis a partir de fago filamentoso M13, f1, fd, e fagos filamentosos equivalentes. Dessa forma, uma sequência de DNA capaz de tradução a jusante codifica uma sequência de resíduo de aminoácido que corresponde, e é de preferência idêntica, ao polipeptídeo de revestimento do gene III ou gene IX de fago filamentoso. As sequências dessas proteínas de revestimento são conhecidas e acessíveis em bases de dados públicas como a NCBI.

[00053] Uma biblioteca genômica ou de cDNA pode ser triada com o uso de uma sonda baseada na sequência de um polinucleotídeo da presente invenção, como aqueles aqui apresentados. As sondas podem ser usadas para hibridizar em sequências de DNA genômico ou de cDNA para isolar genes homólogos no mesmo organismo ou em diferentes organismos. Os versados na técnica reconhecerão que vários graus de severidade de hibridização podem ser empregados no ensaio; e a hibridização ou meio de lavagem pode ser severo. À medida que as condições para a hibridização se tornam mais severas, deve haver uma grau maior de complementaridade entre a sonda e o alvo para que a formação bidirecional ocorra. O grau de estringência pode ser controlado por um ou mais dentre temperatura, resistência iônica, pH e a presença de um solvente parcialmente desnaturante, como formamida. Por exemplo, a severidade de hibridização é variada convenientemente pela alteração da polaridade da solução reagente através de, por exemplo, manipulação da concentração de formamida dentro da faixa de 0% a 50%. O grau de complementaridade (identidade de sequência) necessário para ligação detectável variará de acordo com a severidade do meio de hibridização e/ou meio de lavagem. O grau de complementaridade será, de modo otimizado, 100%, ou 70 a 100%, ou qualquer faixa ou valor entre os mesmos. Entretanto, deve-se compreender que variações de sequência mínimas nas sondas e nos iniciadores podem ser compensadas mediante a redução da estringência da hibridização e/ou do meio de lavagem.

[00054] Em um aspecto da invenção, os polinucleotídeos são construídos com o uso de técnicas para incorporação de códons selecionados aleatoriamente para variar o polipeptídeo resultante em um ou mais resíduos específicos, ou para adicionar resíduos em locais específicos dentro da sequência. Várias estratégias podem ser usadas para criar bibliotecas de sequências de polipeptídeos alteradas incluindo métodos racionais, semi-racionais e aleatórios. Os métodos racionais e semi-racionais têm a vantagem sobre as estratégias aleatórias visto que se têm mais controle sobre as consequências das alterações introduzidas na sequência de codificação. Além disso, pela focalização da variação em certas regiões do gene, o universo de todas as variantes de aminoácidos possíves podem ser exploradas em posições escolhidas.

[00055] Uma biblioteca construída com o esquema de diversificação NNK ou NNS comum introduz uma possibilidade de 32 códons diferentes em cada posição e todos os 20 aminoácidos. Tal biblioteca cresce teoricamente em 32n para cada número n de resíduos. Em termos práticos, entretanto, a exibição de fago é limitada à amostragem de bibliotecas de 109 a 1010 variantes implicando em que apenas 6-7 resíduos podem ser alvo de variação se é pretendido que a cobertura de sequência inteira seja alcançada na biblioteca. Dessa forma, os métodos semi-racionais ou "focalizados" podem ser aplicados para gerar bibliotecas de variantes de arcabouço mediante e identificação de posições-chave a serem variadas e a escolha do regime de diversificação correspondente. Um "conjunto de códons" refere-se a um conjunto de diferentes sequências de tripleto de nucleotídeos usado para codificar aminoácidos variantes desejados. Uma forma padrão de designação de códon é a do código IUB, que é conhecido na técnica e descrito na presente invenção. Um "conjunto de códons não aleatórios" refere-se a um conjunto de códons que codifica os aminoácidos selecionados. A síntese de oligonucleotídeos com "degenerescência" de nucleotídeo selecionada em certas posições é bem conhecida na técnica, por exemplo, a abordagem TRIM (Knappek et al., J. Mol. Biol. (1999), volume 296, páginas 57 a 86); Garrard & Henner, Gene (1993), volume 128, páginas 103). Esses conjuntos de nucleotídeos que têm certos conjuntos de códons podem ser sintetizados com o uso de reagentes de nucleotídeo e nucleosídeo e aparelhos comercialmente disponíveis.

[00056] Um conjunto de códons é um conjunto de diferentes sequências de tripletos de nucleotídeos usadas para codificar os aminoácidos variantes desejados. Os conjuntos de códons podem ser representados com o uso de símbolos para designar nucleotídeos particulares ou misturas equimolares de nucleotídeos conforme mostrado abaixo de acordo para o código IUB. Códigos IUB G Guanina A Adenina T Tiamina C Citosina R (A ou G) Y (C ou T) M (A ou C) K (G ou T) S (C ou G) W (A ou T) H (A ou C ou T) B (C ou G ou T) V (A ou C ou G) D (A ou G ou T) N (A ou C ou G ou T)

[00057] Por exemplo, no conjunto de códons DVK, D pode ser os nucleotídeos A ou G ou T; V pode ser A ou G ou C; e K pode ser G ou T. Este conjunto de códons pode apresentar 18 códons diferentes e pode codificar os aminoácidos Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly, e Cis.

[00058] Bibliotecas focalizadas (por exemplo, não aleatórias) podem ser geradas com o uso de códons NNK e focalizando a variedade em resíduos selecionados ou, alternativamente, variantes com substituições não aleatórias podem ser gerados com o uso de, por exemplo, códons DVK, que codificam 11 aminoácidos (ACDEGKNRSYW) e um códon de parada. Alternativamente, a mutagênese de Kunkel pode ser usada para variar os resíduos ou regiões desejadas do polipeptídeo (Kunkel et al., Methods Enzymol. volume 154, páginas 367 a 382, 1987).

[00059] Técnicas de clonagem padrão são usadas para clonar as bibliotecas em um vetor de expressão. A biblioteca pode ser expressada com o uso de sistemas conhecidos, por exemplo, expressando a biblioteca como proteínas de fusão. As proteínas de fusão podem ser exibidas na superfície de qualquer fago adequado. Métodos para exibição dos polipeptídeos de fusão que compreendem fragmentos de anticorpo na superfície de um bacteriófago são bem conhecidos (US 6.969.108 concedida a Griffith; US 6.172.197 concedida a McCafferty; US 5.223.409 concedida a Ladner; US 6.582.915 concedida a Griffiths; US 6.472.147 concedida a Janda). As bibliotecas para um novo isolamento de polipeptídeo podem ser exibidas em pIX (WO2009085462A1). As bibliotecas podem também ser traduzidas in vitro, por exemplo, com o uso de exibição de ribossoma (Hanes e Pluckthun, Proc. Natl. Acad. Scie. USA, volume 94, página 4937, 1997), exibição de mRNA (Roberts e Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, volume 94, páginas 12297, 1997), exibição CIS (Odegrip et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, volume 101, páginas 2806, 2004) ou outros sistemas isentos de células (US 5.643.768 concedida a Kawasaki).

[00060] As bibliotecas com regiões diversificadas podem ser geradas com o uso de vetores que compreendem o polinucleotídeo que codifica a sequência Tencon (SEQ ID NO: 16) ou um mutante predeterminado da mesma. O construto modelo pode ter um promotor e sequências de sinais para a cadeia de polipeptídeo. Para criar bibliotecas de arcabouço são usadas reações de mutagênese com o uso de oligonucleotídeos que codificaram regiões de laço (A:B, B:C, C:D, D:E, E:F, e F:G) do arcabouço. Para assegurar a incorporação de todas as posições escolhidas no esquema de seleção aleatória, um códon de parada (como TAA) pode ser incorporado em cada posição desejada que se destina a ser diversificada. Apenas clones onde os códons de parada foram substituídos ocorrerão.

Polipeptídeos de Arcabouço Modificados

[00061] Os arcabouços e fragmentos de proteína modificados da invenção podem compreender uma ou mais porções que estão ligadas de modo covalente, direta ou indiretamente, a outra proteína.

[00062] No caso da adição de resíduos de peptídeo, a criação de uma proteína de fusão em linha, a adição desses resíduos pode ocorrer através de técnicas recombinantes a partir de uma sequência de polinucleotídeo conforme descrito acima. No caso de um peptídeo, proteína, substância química orgânica, substância química inorgânica ou átomo inorgânico fixado, anexado ou conjugado, ou qualquer combinação dos mesmos, a porção adicional que está ligada a um arcabouço ou fragmento de proteína da invenção é ligada tipicamente por outras formas além de ligação peptídica. Os arcabouços de proteína modificados da invenção podem ser produzidos mediante a reação do arcabouço ou fragmento de proteína com um agente modificador. Por exemplo, as porções orgânicas podem ser ligadas a um arcabouço de proteína de forma não específica para um sítio, mediante o uso de um agente modificador amina-reativo, por exemplo um éster NHS de PEG. Arcabouços de proteína modificados e fragmentos que compreendem uma porção orgânica que é ligada a locais específicos de um arcabouço de proteína da presente invenção podem ser preparados com o uso de métodos adequados, como proteólise reversa (Fisch et al., Bioconjugate Chem., volume 3, páginas 147 a 153 (1992); Werlen et al., Bioconjugate Chem., volume 5, páginas 411 a 417 (1994); Kumaran et al., Protein Sci. volume 6, número 10, páginas 2233 a 2241 (1997); Itoh et al., Bioorg. Chem., volume 24, número 1 páginas 59 a 68 (1996); Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., volume 56, número 4, páginas 456 a 463 (1997)), e os métodos descritos em Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, California, EUA (1996).

[00063] Onde um polímero ou uma cadeia é anexada à proteína de arcabouço, o polímero ou cadeia pode ser independentemente um grupo polimérico hidrofílico, um grupo de ácido graxo ou um grupo éster de ácido graxo. Para uso na presente invenção, o termo "ácido graxo" abrange ácidos mono-carboxílicos e ácidos di-carboxílicos. Para uso na presente invenção, o termo "grupo polimérico hidrofílico" refere-se a um polímero orgânico que é mais solúvel em água do que em octano. Por exemplo, polilisina é mais solúvel em água do que em octano. Dessa forma, um arcabouço de proteína modificado pela ligação covalente de polilisina é abrangido pela invenção. Polímeros hidrofílicos adequados para modificar os arcabouços de proteína da invenção podem ser lineares ou ramificados e incluem, por exemplo, polialcano glicóis (por exemplo, PEG, monometóxi-polietileno glicol (mPEG), PPG e similares), carboidratos (por exemplo, dextrano, celulose, oligossacarídeos, polissacarídeos e similares), polímeros de aminoácidos hidrofílicos (por exemplo, polilisina, poliarginina, poliaspartato e similares), óxido de polialcano (por exemplo, óxido de polietileno, óxido de polipropileno e similares) e polivinil pirrolidona. De preferência, o polímero hidrofílico que modifica o arcabouço de proteína da invenção tem um peso molecular de cerca de 800 a cerca de 150.000 Daltons, como uma entidade molecular separada. Podem ser usados, por exemplo, PEG5.000 e PEG20.000, em que o subscrito é o peso molecular médio do polímero em Daltons. O grupo polimérico hidrofílico pode ser substituído por um a cerca de seis grupos de alquila, ácido graxo ou éster de ácido graxo. Os polímeros hidrofílicos que são substituídos por um ácido graxo ou um grupo de éster de ácido graxo pode ser preparado ao empregar métodos adequados. Por exemplo, um polímero que compreende um grupo de amina pode ser acoplado a um carboxilato do ácido graxo ou éster de ácido graxo, e um carboxilato ativado (por exemplo, ativado com N, N-carbonila diimidazol) em um ácido graxo ou éster de ácido graxo pode ser acoplado a um grupo hidroxila em um polímero.

[00064] Os ácidos graxos e ésteres de ácido graxo adequados para modificar os arcabouços de proteína da invenção podem ser saturados ou podem conter uma ou mais unidades de insaturação. Os ácidos graxos que são adequados para modificação de arcabouços de proteína da invenção incluem, por exemplo, n-dodecanoato (C12, laurato), n-tetradecanoato (C14, miristato), n-octadecanoato (C18, estearato), n-eicosanoato (C20, araquidato), n-docosanoate (C22, beenato), n-triacontanoato (C30), n-tetracontanoato (C40), cis-Δ9- octadecanoato (C18, oleato), todos os cis-Δ5,8,11,14-eicosatetraenoato (C20, araquidonato), ácido octanodióico, ácido tetradecanodióico, ácido octadecanodióico, ácido docosanodióico, e similares. Os ésteres de ácido graxo adequados incluem mono-ésteres de ácidos dicarboxílicos que compreendem um grupo alquila inferior linear ou ramificada. O grupo alquila inferior pode compreender de um a cerca de doze, preferencialmente de um a cerca de seis, átomos de carbono.

[00065] Proteínas contendo Fc podem ser comparadas quanto à funcionalidade por vários ensaios in vitro bem conhecidos. Em particular, a afinidade pelos membros da família FCYRI, FCYRII e FcyRIII de receptores FCY pe de interesse. Essas medições poderiam ser feitas usando formas solúveis recombinantes dos receptores de formas associadas com a célula dos receptores. Além disso, a afinidade pelo FcRn, o receptor responsável pela meia-vida circulante prolongada de IgGs, pode ser medida, por exemplo, por BIAcore utilizando FcRn recombinante solúvel. Ensaios funcionais baseados em células, como ensaios ADCC e ensaios CDC, fornecem critérios na probabilidade de consequências funcionais de estruturas variantes particulares. Em uma modalidade, o ensaio ADCC é configurado para ter células NK como a a célula efetora primária, assim refletindo os efeitos funcionais do receptor FCYRIIIA. Ensaios de fagocitose podem ser também utilizados para comparar funções efetoras imunes de diferentes variantes, como ensaios que medem as respostas celulares, como a liberação de superóxido ou de mediador inflamatório. Modelos In vivo podem ser utilizados da mesma forma como, por exemplo, no caso do uso de variantes de anticorpos anti-CD3 para medir a ativação de células T em camundongos, uma atividade que é dependente de domínios Fc que se interconectam aos ligantes específicos, como receptores FCY.

Seleção da Célula Hospedeira ou Manipulação da Célula Hospedeira

[00066] Conforme descrito aqui, a célula hospedeira escolhida para expressão da proteína baseada em arcabouço é um contribuinte importante para a composição final, incluindo, sem limitação, a variação da composição das porções de oligossacarídeos que decoram a proteína, se desejável, por exemplo, no domínio CH2 da imunoglobulina quando presente. Deste modo, um aspecto da invenção envolve a seleção de células hosedeiras apropriadas para uso e/ou desenvolvimento de uma célula de produção expressando a proteína terapêutica desejada.

[00067] Adicionalmente, a célula hospedeira pode ter origem em mamífero ou pode ser selecionada dentre COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, mieloma, linfoma, levedura, células de insetos ou vegetais, ou quaisquer células derivadas, imortalizadas ou transformadas dos mesmos.

[00068] Alternativamente, a célula hospedeira pode ser selecionada de uma espécie ou organismo incapaz de glicosilar polipeptídeos, por exemplo, uma célula ou organismo procariótico, como e de E. coli spp, Klebsiella spp. ou Pseudomonas spp natural ou engenheirado.

Seleção de Domínios de Ligação

[00069] Os polipeptídeos ou as proteínas de fusão ou os componentes e os domínios dos mesmos podem também ser obtidos mediante seleção a partir de bibliotecas desses domínios ou componentes, por exemplo, uma biblioteca de fagos. Uma biblioteca de fagos pode ser criada mediante a inserção de uma biblioteca de oligonucleotídeos aleatórios ou de uma biblioteca de polinucleotídeos contendo sequências de interesse, como domínios de anticorpos de células B de um animal ou ser humano imunizado (Smith, G.P. 1985. Science, volume 228, páginas 1315 a 1317). Bibliotecas de fago de anticorpo contêm pares da região variável de cadeia pesada (H) e leve (L) em um fago que permite a expressão de fragmentos Fv ou fragmentos Fab de cadeia simples (Hoogenboom, et al. 2000, Immunol. Today, volume 21, número 8, páginas 371 a 378. A diversidade de uma biblioteca de fagomídeo pode ser manipulada para aumentar e/ou alterar as especificidades dos polipeptídeos da biblioteca para produzir e subsequentemente identificar propriedades moleculares desejáveis adicionais e os polinucleotídeos que os codificam.

[00070] Outras bibliotecas de componentes de ligação alvo que podem incluir além de regiões variáveis de anticorpos são exibição de ribossoma, exibição CIS, exibição de levedura, exibição bacteriana e exibição de célula de mamífero. A exibição de ribossoma é um método de tradução de mRNAs em suas proteínas cognatas, mantendo ao mesmo tempo a proteína fixada ao RNA. A sequência de codificação do ácido nucleico é recuperada por RT-PCR (Mattheakis, L.C. et al. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, volume 91, página 9022). A exibição CIS é um método de exibição alternativo in vitro no qual a biblioteca é construída como uma proteína de fusão com RepA. Durante a tradução in vitro, o RepA liga-se em cis ao DNA do qual ele foi produzido, fornecendo uma ligação direta entre genótipo e fenótipo. (Odegrip et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, volume 101, página 2806, 2004). A exibição de leveduras tem por base a construção de proteínas de fusão do receptor de adesão à levedura de alfa-aglutinina associada à membrana, aga1 e aga2, uma parte do sistema tipo emparelhamento (Broder, et al. 1997. Nature Biotechnology, volume 15, páginas 553 a 557). Uma exibição bacteriana tem por base a fusão do alvo às proteínas bacterianas exportadas que se associam com a membrana celular ou parede celular (Chen e Georgiou 2002. Biotechnol Bioeng, volume 79, páginas 496 a 503). De modo similar, os sistemas de exibição de mamíferos são baseados na criação de uma proteína de fusão entre o polipeptídeo contendo sequências selecionadas aleatoriamente e uma proteína âncora de membrana secretada.

Usos de Moléculas com Base em Arcabouço

[00071] As composições das moléculas com base em arcabouço aqui descritas e geradas por qualquer um dos métodos descritos acima podem ser usadas para diagnosticar, monitorar, modular, tratar, aliviar, ajudar a evitar a incidência de, ou reduzir os sintomas de doenças humanas ou patologias específicas em células, tecidos, órgãos, fluido, ou em geral, um hospedeiro. Uma molécula com base em arcabouço engenheirada para um propósito específico pode ser usada para tratar uma doença mediada pelo sistema imunológico ou deficiência imunológica, doença metabólica, um distúrbio ou doença cardiovascular; uma doença maligna; distúrbio ou doença neurológica; uma infecção como um infecção bacteriana, viral ou parasítica; ou outra condição relacionada conhecida ou especificada incluindo inchaço, dor, e necrose ou fibrose de tecido.

[00072] Esse tipo de método pode compreender a administração de uma quantidade eficaz de uma composição ou de uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos uma proteína de arcabouço a uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente precisando de tal modulação, tratamento, alívio, prevenção ou redução nos sintomas, efeitos ou mecanismos. A quantidade eficaz pode compreender de cerca de 0,001 a 500 mg/kg por administração única (por exemplo, bolus), múltipla ou contínua, ou o suficiente para atingir uma concentração sérica de 0,01 a 5.000 ug/ml de concentração sérica por administração única, múltipla ou contínua, ou qualquer faixa ou valor eficaz nesse intervalo, conforme realizado e determinado mediante o uso de métodos conhecidos, conforme descrito na presente invenção ou conhecido nas técnicas relevantes.

Composições que Compreendem Proteína com Base em Arcabouço

[00073] As proteínas de arcabouço de ligação a alvo que são modificadas ou não modificadas, monovalentes, bi- ou multivalentes, e mono-, bi- ou multialvo, podem ser isoladas com o uso de procedimentos de separação bem conhecidos na técnica por captura, imobilização, particionamento, ou sedimentação e purificadas na extensão necessária para aplicabilidade comercial.

[00074] Para uso terapêutico, as proteínas com base em arcabouço podem ser formuladas de um modo apropriado de administração que inlcui, mas não se limita a, meio parenteral, subcutâneo, intramuscular, intravenoso, intra-articular, intrabrônquico, intra-abdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitário, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intra-hepático, intramiocárdico, intraostial, intrapélvico, intrapericárdico, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarretal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinal, intrasinovial, intratoráxico, intrauterino, intravesical, intralesional, bolus, vaginal, retal, bucal, subligual, intranasal ou transdérmico. Pelo menos uma composição de arcabouço de proteína pode ser preparada para uso na forma de comprimidos ou cápsulas; pós, gotas ou aerossóis nasais; um gel, pomada, loção, suspensão ou incorporada em uma bandagem terapêutica ou sistema de liberação por "emplastro" conforme conhecido na técnica. A invenção fornece formulações estáveis de uma proteína com base em arcabouço, que é, de preferência, uma solução salina aquosa tamponada com fosfato ou solução de sal mista, assim como soluções e formulações preservadas, assim como formulações preservadas multiuso, adequadas para uso farmacêutico ou veterinário, que compreendem pelo menos uma proteína com base em arcabouço em uma formulação farmaceuticamente aceitável. Veículos adequados e sua formulação, inclusive de outras proteínas humanas, por exemplo, albumina sérica humana, são descritos, por exemplo, em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams e Wilkins, Philadelphia, PA, EUA 2006, Parte 5, Pharmaceutical Manufacturing, páginas 691 a 1092, Consulte especificamente páginas 958 a 989.

[00075] As composições podem ser usadas com, ou incorporadas em uma formulação única, outros ativos conhecidos por serem benéficos para tratamento do distúrbio, condição, ou doença ou pode ser um ativo testado pelo preparo de combinações de proteína com base em arcabouço com composições e ativos inovadores.

[00076] Embora a invenção tenha sido descrita em termos gerais, as modalidades da invenção serão descritas adicionalmente nos exemplos a seguir, que não devem ser compreendidos como limitadores do escopo das reivindicações.

Exemplo 1. Construção de Variantes de Glicosilação Fc Design de Tencon

[00077] O terceiro domínio FN3 de Tenascina humana (SEQ ID NO: 3) pode ser usado como um arcabouço alternativo capaz de ser engenheirado para ligar-se a moléculas-alvo específicas por meio de laços expostos na superfície, estruturalmente análogos às regiões determinantes de complementaridade (CDR) do anticorpo. A temperatura de fusão desse domínio é 54°C em PBS, em sua forma nativa. Para produzir uma molécula de arcabouço com estrutura similar e propriedades físicas aprimoradas, como uma estabilidade térmica otimizada, uma sequência consenso foi projetada com base em um alinhamento de 15 domínios FN3 obtidos de Tenascina humana (SEQ ID NOs: 1 a 15).

[00078] A análise do alinhamento de sequência múltipla na Tabela 1 mostra que estes 15 domínios têm identidades de sequência entre si na faixa de 13 a 80%, com uma identidade de sequência média entre os pares de 29%. Uma sequência consenso (SEQ ID NO: 16) foi projetada pela incorporação do aminoácido mais conservado (frequente) em cada posição do alinhamento mostrado na Tabela 1. Em alinhamentos pareados, a sequência consenso da presente invenção (SEQ ID NO: 16), designada como Tencon, é idêntica aos domínios FN3 da Tenascina em 34 a 59% das posições, com uma identidade de sequência média de 43%.

Expressão e purificação de proteínas

[00079] A sequência de aminoácidos de Tencon (SEQ ID NO: 16) foi retrotraduzida, resultando na sequência de DNA mostrada em SEQ ID NO: 17. Essa sequência foi montada mediante sobreposição de PCR, subclonada em um vetor pET15 modificado, transformada em E. coli BL21 Star(DE3) (Invitrogen) e aplicada sobre placas de ágar LB contendo 75 μg/mL de carbenicilina. Uma única colônia foi selecionada e cultivada de um dia para o outro a 37°C, em 50 ml de meio TB contendo 2% de glicose e 100 μg/mL de carbenicilina. Essa cultura foi usada para semear 500 mL de meio de auto-indução (meio Overnight Express Instant TB, Novagen) em um frasco de 2,5 L Ultra Yield (Thomson Instrument Company). A proliferação e a expressão foram feitas usando-se um programa duplo (3 horas a 37°C, 300 rpm, seguido de 16 horas a 30°C, 250 rpm) em uma incubadora de agitação ATR Multitron.

[00080] A cultura foi coletada e centrifugada a 7.000 rpm durante 15 minutos em um rotor JL8,1 para formar péletes com as células. As células foram ressuspensas em 30 ml de tampão contendo 20 mM de fosfato de sódio, pH 7,5, NaCl 500 mM, glicerol 10%, imidazol 20 mM, 0,37 mg/mL de lisozima, Inibidor de Protease Completo 1X (isento de EDTA; Roche) e Benzonase (Sigma-Aldrich, 0,25 μl/ml final) e lisadas com um sonicador Misonix XL2020 durante 5 minutos em gelo em modo pulso (5 segundos ligado, 30 segundos desligado). O material insolúvel foi removido por centrifugação a 17.000 rpm durante 30 minutos em um rotor JA-17.

[00081] A proteína Tencon foi purificada a partir do lisado solúvel em um processo cromatográfico em duas etapas. Primeiro, a proteína foi capturada por cromatografia de afinidade em metal imobilizado, adicionando 2 mL de microesferas de agarose Ni-NTA (Qiagen) ao lisado e colocando o mesmo em uma plataforma de agitação por 1 hora a 4°C. A resina foi então empacotada em uma coluna Poly-Prep (Bio-Rad) e lavada com 20 mM de fosfato de sódio, pH 7,5, 500 mM de NaCl, 10% de glicerol e 20 mM de imidazol para remover o material não ligado. As proteínas foram eluídas da resina com 20 mM de fosfato sódico, pH 7,5, 500 mM de NaCl, 10% de glicerol e 500 mM de imidazol. As frações foram analisadas por SDS-PAGE, tanto com coloração Coomassie como com Western blot, usando-se anticorpo HRP-conjugado anti-His (Immunology Consultants Laboratory). As frações desejadas foram agrupadas e dialisadas em PBS com pH 7,4. Como uma segunda etapa de purificação, a proteína foi carregada em uma coluna Superdex-75 HiLoad 16/60 (GE Healthcare), equilibrada em PBS. As frações foram analisadas por SDS-PAGE, e aquelas contendo Tencon foram agrupadas e concentradas com o uso de um concentrador Centriprep UltraCel YM-3 (Amicon).

[00082] A concentração de proteína foi determinada usando-se um leitor de placas BioTek, para medir a absorbância da amostra a 280 nm. A preparação final foi analisada por coloração Coomassie (figura 1), Western blot com anticorpo anti-His, e por HPLC-SEC usando-se uma coluna G3000SW-XL (TOSOH Biosciences) equilibrada em PBS. A análise por SDS-PAGE mostra que a Tencon migra entre 6 e 14 kDa, de acordo com a massa esperada de 10,7 kDa para a proteína monomérica. Obteve-se um rendimento de >50 mg de proteína Tencon pura por litro de cultura.

Caracterização biofísica

[00083] A estrutura e a estabilidade da Tencon foram caracterizadas por espectroscopia em dicroísmo circular e calorimetria de varredura diferencial, respectivamente. As medições de dicroísmo circular foram feitas em um espectrômetro AVIV a 20°C em PBS, e com uma concentração de 0,2 mg/mL. O espectro na figura 8 mostra um mínimo a 218 nm, o que sugere uma estrutura em folha-beta, conforme o esperado para uma proteína pertencente à família FN3, conforme projetado. Os dados de calorimetria de varredura diferencial foram obtidos mediante aquecimento de soluções a 0,5 mg/mL do 3° domínio FN3 da Tenascina ou da Tencon em PBS, de 35°C a 95°C, a uma velocidade de 1°C/minuto em um calorímetro N-DSCII (Applied Thermodynamics). Primeiro, a curva para o bloco bruto de tampão foi subtraída para produzir os perfis mostrados na figura 3. A partir desses dados, as temperaturas de fusão de 54°C e 78°C foram calculadas para o 3°domínio FN3 e para a Tencon, respectivamente, com o uso do software CpCalc (Applied Thermodynamics). A dobragem e desdobragem de ambos os domínios é reversível a essas temperaturas.

Análise da imunogenicidade

[00084] Um programa de computador que modela a imunogenicidade de sequências de aminoácido para seres humanos foi usado para comparar a imunogenicidade predita das sequências de aminoácido representando o 3° domínio FN3 da Tenascina humana, Tencon, e vários anticorpos terapêuticos (mostrado na Tabela 2). As mAbs quiméricas e uma mAb humana (adalimumab) analisadas com o programa foram seguidas pela aplicação de um limite de tolerância (remove peptídeos de 9 mer com 100% de identidade para sequência codificada por linhagem germinativa humana). O limite de tolerância não foi aplicado à Tenascin ou à Tencon. O limite de tolerância presume ampla tolerância das células T a sequências de mAb codificadas pela linhagem germinativa, e focaliza a análise em sequências inovadoras, primariamente em CDRs e domínios de flanco.

[00085] Essas análises predizem um baixo risco imunogênico tanto para Tenascin como para Tencon com base na probabilidade de que um peptídeo de 9 mer, derivado da sequência analisada, vá ligar-se a uma ou mais moléculas HLA. A pontuação é ponderada em relação à prevalência de cada alelo HLA. As pontuações para os modelos foram somadas para cada sequência, de modo a se obter um único número descrevendo o PIR geral de cada sequência (soma das pontuações). Os resultados dessa análise estão resumidos na Tabela 2. A Tenascina apresentou a pontuação total mais baixa (11,9). A Tencon, como a Tenascina, pontuou principalmente em não ligantes e agretopos de baixo risco imunogênico predito (pontuação = 13,2). As sequências de Tenascina e Tencon pontuaram favoravelmente em comparação aos anticorpos terapêuticos.

Exibição de Tencon em fago M13 por fusão a pIX

[00086] O gene codificando a sequência de aminoácidos Tencon foi subclonado por PCR no vetor de expressão fagomídio pPep9 e por clonagem com digestão por restrição, resultando no vetor pTencon- pIX. Esse sistema expressa Tencon marcada com Myc no aminoterminal como uma fusão do carbóxi-terminal ao amino-terminal da proteína M13 pIX (figura 4). O promotor Lac permite níveis mais baixos de expressão sem IPTG e expressão aumentada após a adição de IPTG. A sequência de sinais OmpA foi anexada ao amino-terminal da Tencon para promover uma translocação eficiente para o periplasma. Um conector TSGGGGS curto (SEQ ID NO: 141 foi construído entre Tencon e pIX para impedir interações estéricas entre essas proteínas.

[00087] Para confirmação da exibição sobre a superfície das partículas de fago M13, pTencon-pIX foi transformada em E. coli XL1- Blue, e uma única colônia foi usada para inocular uma cultura de 5 mL de LB suplementada com ampicilina. Essa cultura foi cultivada a 37°C até atingir a fase mid-log, ponto no qual 610 UFP de fago auxiliar VCSM13 foram adicionados, sendo a cultura incubada a 37°C durante 10 minutos sem agitação, seguido de 50 minutos sob agitação. A cultura recuperada do fago auxiliar foi, então, diluída em 50 mL de meio 2YT suplementado com ampicilina e canamicina, e cultivada a 37°C sob agitação até a O.D.600 atingir 0,7, ponto no qual se adicionou IPTG até uma concentração final de 1 mM, sendo a temperatura reduzida até 30°C. Após 16 horas, a cultura foi centrifugada a 4.000 X g durante 20 minutos, e o sobrenadante foi coletado e armazenado a 4°C para análise.

[00088] A ligação das partículas de fago a um anticorpo anti-Myc (Invitrogen) foi usada para confirmar a exibição do constructo Myc- Tencon na superfície do fago M13. Uma placa Maxisorp foi revestida de um dia para o outro a uma concentração de 2,5 ug/mL com -Myc ou um anticorpo anti-αv (controle negativo) e bloqueada com SuperBlock T20 (Pierce). Diluições seriais duplas do sobrenadante da cultura de fagomídio descrita acima foram feitas em PBS e adicionadas às cavidades da placa revestida. Após 1 hora, a placa foi lavada com TBST e um anticorpo anti-M13 HRP foi adicionado a cada cavidade e lavado com TBST seguindo uma incubação de 1 hora. Adicionou-se o substrato Roche BD ELISA POD, e foi detectada luminescência em um leitor de placas (Tecan). A figura 5 mostra que as partículas de fago Myc-Tencon se ligam às cavidades revestidas com anti-myc, mas não àquelas com anti-αv ou às cavidades de controle não revestidas na placa, de maneira dependente da concentração, confirmando a exibição específica de Myc-Tencon nas partículas de fago M13.

[00089] Um vetor de fagomídio adicional pode ser construído para exibir Tencon e membros da biblioteca (vide Exemplo 2) sobre o fago M13 como fusões para revestir a proteína pIII. Para esse sistema, o gene para pIX é substituído por um gene que codifica uma versão truncada de pIII (Bass et al., 1990). Alterações adicional, em comparação ao sistema mostrado na figura 4, incluem a reposição da sequência de sinais OmpA pela sequência de sinais para DsbA, já que a secreção com o uso dessa sequência se mostrou benéfica para a exibição de moléculas de arcabouço alternativo estáveis (Steiner et al., 2006).

Exemplo 2: Geração de Bibliotecas de Tencon

[00090] As bibliotecas de variantes de Tencon podem ser feitas com o uso de muitos métodos diferentes, dependendo da complexidade desejada e da localização relativa das mutações na molécula. Os métodos de síntese de DNA são preferenciais para criar as mutações espalhadas por todo o gene Tencon. A clonagem da enzima de restrição também pode ser usada para recombiner os fragmentos de DNA contendo mutações em regiões diferentes do gene. A saturação de mutagênese em uma pequena região definida, como um único laço de Tencon, pode ser introduzida mediante o uso de um oligonucleotídeo degenerado e de uma mutagênese direta do oligonucleotídeo (Kunkel et al., 1987).

[00091] Foi construída uma biblioteca Tencon, a biblioteca FG7, projetada para substituir o laço FG por 7 aminoácidos aleatórios com o uso de mutagênese dirigida por oligonucleotídeo. Um oligonucleotídeo (TconFG7-For-5’pho) foi sintetizado para ter uma sequência degenerada de 21 pares de base (pb) de NNS nas posições que codificam o laço FG e duas sequências de nucleotídeo de flanco com 20 a 27 bp de complementaridade com a sequência de codificação do Tencon. Nesse design, todos os vinte aminoácidos são capazes de representação no laço FG. A diversidade calculada no nível de nucleotídeo é de 1,3 x 109. TconFG7-For5’pho: (SEQ ID NO: 18) GAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNSNNSNNSNNSNNSNNS NNSCCGCTGTCTGCGGAATTCAC

[00092] O molde para mutagênese dirigida por oligonucleotídeo, pDsbA-Tencon-Asc-laço-Myc-pIII, foi construído mediante a substituição do laço F:G da Tencon que codifica a sequência por um sequência haste-laço contendo um sítio de restrição AscI. Esse sistema permite a eliminação do DNA de molde inicial após a mutagênese, mediante digestão do DNA resultante com AscI antes da transformação. Para purificar um molde de DNA de fita única para a mutagênese, uma única colônia de E. coli CJ236 portando pDsbA- Tencon-Asc-laço-Myc-pIII foi colocada em 5 mL de meio de crescimento 2YT com carbenicilina (50 ug/ml de concentração final) e cloranfenicol (10 ug/ml). Após 6 horas, o fago auxiliar VCSM13 foi adicionado até uma concentração final de 1010 UFP/ml, e incubado sem agitação durante 10 minutos, antes de ser transferido para 150 mL de 2YT com carbenicilina (10 ug/ml) e uridina (0,25 ug/ml) e incubado a 37°C sob agitação a 200 rpm, de um dia para o outro. As células foram agrupadas em péletes por centrifugação, o sobrenadante foi coletado e o fago foi agrupado em peletes com PEG NaCl. O DNA de fita única foi purificado a partir desse pélete, usando- se um kit QIAprep Spin M13 (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante.

[00093] Para a ligação por recozimento do oligonucleotídeo degenerado ao molde, 5 ug do DNA de molde foram combinados com oligo TconFG7-For-5-pho a uma razão molar de 10:1 em Tris-HCl (50 mM, pH 7,5) e MgCl2 (10 mM), com incubação a 90°C durante 2 minutos, 60°C durante 3 minutos, e 20°C durante 5 minutos. Após a reação de recozimento, ATP (10 mM), dNTPs (25 mM cada), DTT (100 mM), T4 ligase (7 unidades) e T7 DNA polimerase (10 unidades) foram adicionados à mistura de reação, com incubação a 14°C durante 6 horas, seguida de 20°C durante 12 horas. O DNA resultante foi purificado com o uso de um kit de purificação por PCR (Qiagen), e recuperado em 100 uL de água. O DNA da biblioteca foi digerido com 10 unidades de AscI durante 4 horas e, então, purificado novamente com o kit de purificação por PCR da Qiagen. O DNA final da biblioteca foi recuperado em 50 uL de água. O produto de DNA de fita dupla resultante foi, então, transformado em E. coli MC1061F’ por eletroporação.

[00094] Os transformantes foram coletados em 20 mL de meio SOC, e deixados recuperar durante 1 hora a 37°C. Ao final da recuperação, uma alíquota da transformação foi submetida a diluição serial e aplicada sobre placas com carbenicilina (100 ug/ml) contendo 1% de glicose para avaliar o número total de transformantes. O restante da cultura SOC foi, então, usado para inocular 1 L de meio 2xYT com carbenicilina e 1% de glicose, sendo cultivado até que OD600 atingisse 0,6. Inoculou-se 100 mL dessa cultura com fago auxiliar M13 a 1010/mL, incubando-se a 37°C antes da centrifugação. O pélete de células resultante foi ressuspenso em 500 mL de meio 2xYT sem uso prévio contendo carbenicilina (100 ug/mL) e canamicina (35 ug/mL) e cultivado a 30°C de um dia para o outro, antes da centrifugação. As partículas de fago foram precipitadas mediante a adição de PEG/NaCl e armazenadas a -80°C.

[00095] Uma segunda biblioteca, BC6/FG7, foi projetada para simultaneamente introduzir diversidade nos laços B:C e F:G da Tencon. Para tanto, foram sintetizados dois oligonucleotídeos: Tc- BC6-For-5’phos e POP149. O oligo direto era fosforilado e continha 18 bases de códon NNS em cada posição codificando o laço B:C, enquanto o oligo reverso era biotinilado na extremidade 5’ e continha 21 bases de códon NNS em cada posição codificando o laço F:G. Ambos os oligonucleotídeos são flanqueados por duas sequências de nucleotídeo de 18 pb idênticos à região precedente e seguinte à região a ser mutagenizada (consulte abaixo para obter detalhes sobre o iniciador). Tc-BC6-For-5’phos: (SEQ ID NO: 19) gactctctgcgtctgtcttggNNSNNSNNSNNSNNSNNSTTCGACTCTTTCCT GATCCAGTACC POP 2149: (SEQ ID NO: 20) GTGAATTCCGCAGACAGCGGSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNAAC ACCGTAGATAGAAACGGTG

[00096] Para construir a biblioteca, dezesseis reações de PCR de 100 uL foram realizadas usando os oligos Tc-CB6-For5’phos e POP2149 para amplificar o molde de DNA para Tencon, introduzindo códons NNS nos laços B:C e F:G simultaneamente no processo. O produto de PCR com fitas duplas foi misturado a microesferas magnéticas de estreptavidina (Dynal) em tampão B&W (10 mM Tris- HCl, pH 7,5, 1 mM de EDTA, 2 M de NaCl, 0,1% de Tween-20) e incubado durante 20 minutos, puxado para baixo com um magneto e lavado duas vezes com tampão B&W. A fita direta foi eluída das microesferas com 300 uL de 150 mM NaOH. Esse "megainiciador", uma mistura de iniciadores longos com mais de 8 x 1016 em diversidade teórica, foi usado para a ligação por recozimento a um molde de biblioteca de fita única. A construção da biblioteca foi realizada conforme descrito acima para a biblioteca FG7.

Exemplo 3: Seleção de Ligantes IgG

[00097] Para realizar as seleções dos membros da biblioteca Tencon que se ligam a IgG, um IgG recombinante (subtipo IgG1 humano) foi biotinilado com o uso de sulfo-NHS-LC-biotina (Pierce) antes de diálise em PBS. Para as seleções, 200 uL de fagos exibindo as bibliotecas FG7 ou BC6/FG7 foram bloqueados com 200 uL de bloqueador químico antes da adição de IgG biotinilado a concentrações de 500 nM (ciclo 1) ou 100 nM (ciclos 2 e 3). Os fagos ligados foram recuperados por microesferas magnéticas com neutravidina (Seradyne) no ciclo 1, ou com microesferas magnéticas com estreptavidina (Promega) nos ciclos 2 e 3. Os fagos não ligados foram lavados das microesferas com o uso de 5 a 10 lavagens com 1 mL de solução salina Tris tamponada com Tween (TBST), seguido de duas lavagens de 1 mL com solução salina Tris tamponada (TBS). Os fagos ligados foram eluídos a partir de microesferas pela adição de fase mid-log de E. coli MC1061F’. As células infectadas foram plaqueadas em placas de ágar LB suplementado com carbenicilina e glucose. No próximo dia, as células foram raspadas da placa e cultivadas até a fase mid-log, antes de recuperação com fago auxiliar VCSM13 e cultivo de um dia para o outro. As partículas de fago foram isoladas por precipitação em PEG/NaCl e usadas para o ciclo de seleções seguinte.

[00098] Após 3 ciclos de panning contra IgG, o resultado foi subclonado em um vetor pET27 modificado para incluir um sítio de clonagem independente de ligase, mediante amplificação por PCR do gene Tencon. Esse produto de PCR foi ligado por recozimento ao vetor e transformado em células BL21-GOLD(DE3) (Stratagene). As colônias individuais foram coletadas em culturas de 1 mL em placas com 96 cavidades profundas (Corning) e cultivadas até a saturação de um dia para o outro, a 37°C. No dia seguinte, 50 microL da cultura feita de um dia para o outro foram usados para inocular uma cultura de 1 mL sem uso prévio. As culturas foram cultivadas a 37°C durante 2 horas antes da adição de IPTG a 1 mM e da redução da temperatura para 30°C. As células foram coletadas por centrifugação 16 horas após a indução, e lisadas com 100 microL de BugBuster (Novagen). Os lisados resultantes foram clarificados por centrifugação e usados para testar quanto à ligação a IgG por meio de ELISA.

[00099] Placas Maxisorp (Nunc) foram revestidas com 0,1 μg de anticorpos anti-HIS (Qiagen), deixadas de um dia para o outro, lavadas com TBST e bloqueadas com Starting Block T20 (Thermo Scientific). Os lisados clarificados diluídos a 1:4 em Starting Block foram adicionados às placas e deixados ligar durante 1 hora antes da lavagem com TBST. Adicionou-se IgG biotinilado ou HSA biotinilado a uma concentração de 1 ug /ml, lavando-se com TBST após 1 hora de incubação. A detecção de IgG ou HSA ligado foi obtida pela adição de estreptavidina-HRP (Jackson Immunoresearch), seguida de detecção com substrato POD para quimioluminescência. Os resultados do teste ELISA são mostrados na figura 7. Foram sequenciados os constructos que se ligaram a IgG biotinilado mais de 10 vezes em comparação ao HSA biotinilado, conforme julgado pelo sinal do ensaio ELISA. Após o término de vários experimentos de seleção, 60 sequências de ligação exclusivas da biblioteca FG7 e 10 sequência exclusivas da biblioteca BC6FG7 foram obtidas; A Tabela 4 mostra sequências representativas de ligantes of IgGαem que os laços B:C e/ou F:G são mostrados até o ponto em que eles se tornam diferentes daqueles da SEQ ID NO: 16. Na Tabela 4 são mostradas, também, numerosas mutações em outras regiões do arcabouço.

[000100] A proteína Tencon projetada, expressa e purificada na presente invenção tem uma estabilidade térmica aprimorada em 26°C em relação àquela do 3° domínio FN3 da Tenascina humana, a qual foi usada como uma molécula de arcabouço alternativo. Com base nesse aumento de estabilidade, essa molécula de arcabouço está propensa a ser mais compatível com a substituição de aminoácidos, e mais fácil de fabricar. As mutações que diminuem a estabilidade da proteína tendem a ser melhor toleradas no contexto de um arcabouço mais estável e, portanto, um arcabouço com estabilidade otimizada está propenso a produzir ligantes mais funcionais e bem dobrados a partir de uma biblioteca de variantes de arcabouço.

Tabela 3. Laços

Tabela 4. Arcabouços ligados a IgG

Sequências: SEQ ID NO. 1: sppkdlvvtevteetvnlawdnemrvteylvvytpthegglemqfrvpgdqtstiiqelepgveyfir vfailenkksipvsarvat SEQ ID NO. 2: tylpapeglkfksiketsvevewdpldiafetweiifrnmnkedegeitkslrrpetsyrqtglapgqe yeislhivknntrgpglkrvtttrld SEQ ID NO. 3: dapsqievkdvtdttalitwfkplaeidgieltygikdvpgdrttidltedenqysignlkpdteyevsli srrgdmssnpaketftt SEQ ID NO. 4 tgldaprnlrrvsqtdnsitlewrngkaaidsyrikyapisggdhaevdvpksqqattkttltglrpgte ygigvsavkedkesnpatinaateldtpkd SEQ ID NO. 5 dtpkdlqvsetaetsltllwktplakfdryrlnyslptgqwvgvqlprnttsyvlrglepgqeynvlltae kgrhkskpakskparvk SEQ ID NO. 6 qapelenltvtevgwdglrlnwtaadqayehfiiqvqeankveaarnltvpgslravdipglkaatp ytvsiygviqgyrtpvlsaeastge SEQ ID NO. 7 etpnlgevvvaevgwdalklnwtapegayeyffiqvqeadtveaaqnltvpgglrstdlpglkaat hytitirgvtqdfsttplsvevlte SEQ ID NO. 8 evpdmgnltvtevswdalrlnwttpdgtydqftiqvqeadqveeahnltvpgslrsmeipglragt pytvtlhgevrghstrplavevvte SEQ ID NO. 9 dlpqlgdlavsevgwdglrlnwtaadnayehfviqvqevnkveaaqnltlpgslravdipgleaat pyrvsiygvirgyrtpvlsaeastakepe SEQ ID NO. 10 kepeignlnvsditpesfnlswmatdgifetftieiidsnrlletveynisgaertahisglppstdfivyl sglapsirtktisatatte SEQ ID NO. 11 alpllenltisdinpygftvswmasenafdsflvtvvdsgklldpqeftlsgtqrklelrglitgigyevm vsgftqghqtkplraeivte SEQ ID NO. 12 aepevdnllvsdatpdgfrlswtadegvfdnfvlkirdtkkqsepleitllapertrdltglreateyeiel ygiskgrrsqtvsaiattam SEQ ID NO. 13 gspkevifsditensatvswraptaqvesfrityvpitggtpsmvtvdgtktqtrlvklipgveylvsiia mkgfeesepvsgsfttal SEQ ID NO. 14 dgpsglvtanitdsealarwqpaiatvdsyvisytgekvpeitrtvsgntveyaltdlepateytlrifa ekgpqksstitakfttdl SEQ ID NO. 15 dsprdltatevqsetalltwrpprasvtgyllvyesvdgtvkevivgpdttsysladlspsthytakiqa lngplrsnmiqtifttigl SEQ ID NO. 16 LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLT VPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT SEQ ID NO. 17 ctgccggcgccgaaaaacctggttgtttctgaagttaccgaagactctctgcgtctgtcttggaccg cgccggacgcggcgttcgactctttcctgatccagtaccaggaatctgaaaaagttggtgaagcg atcaacctgaccgttccgggttctgaacgttcttacgacctgaccggtctgaaaccgggtaccgaa tacaccgtttctatctacggtgttaaaggtggtcaccgttctaacccgctgtctgcggaattcaccac c Sequência de Tencon mostrando laços (SEQ ID NO: 16) A-B B-C C-D 1-LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEA-44 D-E E-F F-G 45-IN LTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSN PLSAEFTT- 89

Exemplo 4: Estabilização de Mutações de Tencon

[000101] Os mutantes foram projetados para otimizar a estabilidade de dobragem do arcabouço de Tencon anteriormente descrito neste documento (SEQ ID NO: 16). Várias mutações pontuais foram feitas para produzir a substituição de resíduos individuais da SEQ ID NO: 16, como N46V (Tencon17 - SEQ ID NO:142), E14P (Tencon18 - SEQ ID NO:143), E11N (Tencon19 - SEQ ID NO:144), E37P (Tencon20 - SEQ ID NO:145), e G73Y (Tencon21 - SEQ ID NO: 146) que foram preditas para melhorar a estabilidade pelo programa PoPMuSiC v2.0 (Dehouck, Grosfils et al. 2009). Descobriu-se anteriormente que o mutante E86I (Tencon22 - SEQ ID NO: 147) estabiliza uma proteína homóloga, o 3° domínio FN3 da Tenascina humana (WO2009/086116A2). Finalmente, descobriu-se que a mutação de L17A estabiliza significativamente Tencon durante experimentos de varredura de alanina em que todos os resíduos de laços de Tencon foram substituídos com alanina independentemente (dados não mostrados). Seguindo uma rodada inicial de ensaios de estabilidade (consulte abaixo), os mutantes combinatoriais N46V/E86I (Tencon 23 - SEQ ID NO: 148), E14P/N46V/E86I (Tencon24 - SEQ ID NO: 149), e L17A/N46V/E86I (Tencon25 - SEQ ID NO: 150) foram produzidos para aumentar adicionalmente a estabilidade.

Expressão e purificação

[000102] Mutações na sequência de codificação de Tencon foram feitas com o uso de um kit de mutagênese QuikChange (Stratagene). Os plasmídeos resultantes foram transformados em BL21-GOLD (DE3) E. coli (Stratagene) para expressão. Uma única colônia foi selecionada e cultivada de um dia para o outro a 37°C, em 2 mL de meio TB contendo 100 μg/ml de ampicilina Essa cultura foi usada para semear 100 mL de meio de autoindução (meio Overnight Express Instant TB, Novagen) em um frasco de 500 mL com obstrutores de fluxo para mistura de conteúdo e cultivados a 37°C durante 16 horas.

[000103] A cultura foi coletada por centrifugação a 4000xg durante 20 minutos e as células peletizadas ressuspensas em 5 mL de BugBuster HT (Novagen) por grama de pélete de célula molhada. Após 30 minutos de incubação à temperatura ambiente, os lisados foram clarificados por centrifugação a 30.000xg durante 20 minutos e carregados em uma coluna de superfluxo de 3 mL Ni-NTA (Novagen) por gravidade. Após o carregamento, cada coluna foi lavada com 15 mL de um tampão contendo 50 mM de fosfato de sódio em pH 7,4, NaCl 500 mM, e 10 mM imidazol. A proteína ligada foi então eluída da coluna com o uso de 10 mL de um tampão contendo fosfato de sódio 50 mM e pH 7,4, NaCl 500 mM, e 250 mM de imidazol. A pureza da proteína foi avaliada por SDS-PAGE. Antes da análise biofísica, cada mutante foi dialisado completamente em PBS em pH 7,4. Foram obtidos 28 a 33 mg de proteína purificada para cada mutante a partir de 100 mL de cultura.

Caracterização da Estabilidade Térmica

[000104] As estabilidades térmicas do Tencon de origem e de cada mutante foram medidas por calorimetria de varredura diferencial por capilaridade (CVD). Cada amostra foi dialisada extensivamente em contato com PBS em pH 7,4 e diluída em uma concentração de 2-3 mg/mL. As temperaturas de fusão foram medidas para essas amostras com o uso de um instrumento VP-DSC equipado com um autoamostrador (MicroCal, LLC). As amostras foram aquecidas de 10°C a 95°C ou 100°C em uma taxa de 1°C por minuto. Uma varredura em solução tampão apenas foi completada entre cada varredura de amostra para calcular uma linha de base para integração dos dados. Os dados foram ajustados a um modelo de desdobramento de dois estados seguido de subtração do sinal apenas do tampão. A reversibilidade de desnaturação térmica foi determinada pela repetição da varredura para cada amostra sem removê-lo da célula. A reversibilidade foi calculada pela comparação da área sob a curva da 1a varredura com a 2a varredura. Os resultados dos experimentos de DSC são apresentados na Tabela 5 como os valores derivados a partir de curvas de fusão completas. Os mutantes simples Tencon17, Tencon18, Tencon19, e Tencon22 otimizaram a estabilidade térmica em comparação à sequência de tencon de origem. Apenas o Tencon21 foi significativamente desestabilizador. As amostras de mutantes combinatoriais Tencon23, Tencon24, e Tencon25 tiveram todas uma melhora significativamente maior na estabilidade, indicando que as mutações projetadas são aditivas em relação à otimização da estabilidade térmica.

Desnaturação por Cloridrato de Guanidina

[000105] As capacidades de Tencon e de cada mutante de permanecer dobrado no tratamento com concentrações crescentes de cloridrato de guanidina (GdmCl) conforme medido pela fluorescência de triptofano foram usadas para avaliar a estabilidade. O tencon contém apenas um resíduo de triptofano. O resíduo de triptofano é enterrado no núcleo hidrofóbico e dessa forma a emissão de fluorescência a 360 nm é uma medida sensível do estado dobrado desta proteína. 200 uL de uma solução contendo fosfato de sódio 50 mM em 7,0, NaCl 150 mM, e concentrações variáveis de GdmCl de 0,48 a 6,63 M foram pipetados em placas de 96 cavidades pretas, sem ligação (Greiner) para produzir uma titulação de 17 pontos. 10 uL de uma solução contendo os mutantes tencon foram adicionados a cada cavidade em toda a placa para produzir uma concentração de proteína final de 23 uM, e misturados por pipetagem, gentilmente, para cima e para baixo. Após incubação à temperatura ambiente durante 24 horas, a fluorescência foi lida com o uso de um leitor de placa Spectramax M5 (Molecular Devices) com excitação a 280 nm e emissão a 360 nm. Os dados gerados a partir dessas curvas são mostrados na figura 8. O sinal de fluorescência foi convertido a uma fração desdobrada com o uso da equação (Pace 1986 Methods Enzymol, volume 131, páginas 266 a 280): fu = (yf - y)/(yf-yu)

[000106] Onde yF é o sinal de fluorescência da amostra dobrada e yu da amostra desdobrada.

[000107] Os pontos médios da transição de desdobramento e coeficiente angular da transição foram determinados pelo ajuste com a equação abaixo (Clarke, Hamill et al. 1997):

[000108] Onde F é a fluorescência em uma determinada concentração de desnaturante, αN e αD são as interceptações em y do estado nativo e desnaturado, βN e βD são os coeficientes angulares das linhas de base para o estado nativo e desnaturado, [D] é a concentração de GdmCl, [D]50% a concentração de GdmCl no ponto em que 50% da amostra é desnaturada, m o coeficiente angular da transição, R a constante de gás, e T a temperatura. A energia livre de dobragem para cada amostra foi estimado com o uso da equação (Pace 1986 supra; Clarke, Hamill et al. 1997 J Mol Biol, volume 270, número 5 páginas 771 a 778):

[000109] Com frequência é difícil medir exatamente o coeficiente angular da transição, m, para tais curvas. Adicionalmente, não se espera que as mutações aqui descritas alterem o mecanismo de dobragem de tencon. Dessa forma, o valor m para cada mutante foi medido e calculou-se a média dos valores (Pace 1986 supra) para produzir um m = 14,83 kJ/mol/M (3544 cal/mol/M) usado para todos os cálculos de energia livre. Os resultados desses cálculos são apresentados na Tabela 5. Os resultados para os experimentos de desdobramento de GdmCl demonstraram que os mesmos mutantes que estabilizam Tencon no que diz respeito à estabilidade térmica também estabilizam a proteína contra a desnaturação induzida por GdmCl.

Cromatografia de Exclusão de Tamanho

[000110] A cromatografia de exclusão por tamanho (CET) foi usada para avaliar o estado de agregação de WT tencon e de cada mutante. 5 uL de cada amostra foram injetados em uma coluna Superdex 75 5/150 (GE Healthcare) em uma vazão de 0,3 mL/min com uma fase de PBS móvel. A eluição a partir da coluna foi monitorada por absorbância a 280 nm. Para avaliar o estado de agregação, a coluna foi calibrada anteriormente com padrões de peso molecular globular (Sigma). Todas as amostras foram testadas, com exceção de Tencon21, eluídas em um pico a um volume de eluição consistente com aquele de uma amostra monomérica. O Tencon21 foi eluído com 2 picos, indicando a presença de agregados.

[000111] Ficará claro que a invenção pode ser posta em prática de modo diferente daquele particularmente descrito na descrição e exemplos acima mencionados. Numerosas modificações e variações da presente invenção são possíveis à luz dos ensinamentos acima e estão, portanto, dentro do escopo das reivindicações em anexo.

Claims

1. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula baseada em arcabouço compreendendo domínios de alça topologicamente semelhantes aos domínios do terceiro domínio de fibronectina, o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos com base em uma sequência de consenso de terceiros domínios de fibronectina tendo: (i) a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16, em que resíduos específicos da SEQ ID NO: 16 são substituídos e aumentam a estabilidade térmica e a estabilidade química da molécula baseada em arcabouço, em que a molécula baseada em arcabouço compreende uma ou mais substituições selecionadas do grupo que consiste em N46V, E14P, L17A e E86I; ou (ii) a sequência de aminoácidos de uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 142, 143 e 147-151.

2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que tem alças capazes de contatar um alvo, em que as regiões de alça foram modificadas para abranger resíduos alternativos em posições selecionadas do grupo que consiste em 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64 e 75-81 de uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 16 e 142, 143 e 147-151, opcionalmente em que o referido arcabouço se liga a um alvo com pelo menos uma afinidade selecionada de um KD de pelo menos 10-9M, pelo menos 10-10M, pelo menos 10-11M, pelo menos 10-12M, pelo menos 10-13M, pelo menos 1014M, e pelo menos 10-15M, conforme determinado pela ressonância plasmônica de superfície ou o método Kinexa.

3. Arcabouço de proteína isolada com base em um domínio de fibronectina tipo III (FN3), Tencon 16 (SEQ ID NO: 16), como definido na reivindicação 1 (i), caracterizado pelo fato de que tem uma substituição selecionada do grupo que consiste em N46V, E14P, E861, N46V e E86, todos de E14P e N46V e E86, e todos de L17A e N46V e E86l, e que compreende ainda: uma porção da estrutura principal com uma sequência de aminoácidos idêntica à SEQ ID NO: 16 nos resíduos 1-21, 29-74 e 8289; uma porção da alça B:C entre os resíduos 21 e 29 da SEQ ID NO: 16 tendo qualquer uma das SEQ ID NOS: 21-45; e uma porção da alça F:G entre os resíduos 74 e 82 da SEQ ID NO: 16 tendo qualquer uma das SEQ ID NOS: 46-140, em que o arcabouço da proteína é capaz de se ligar a IgG humana.

4. Arcabouço de proteína isolada, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o referido arcabouço se liga a um alvo com pelo menos uma afinidade selecionada a partir de um KD menor ou igual a 10-9M, menor ou igual a 10-10M, menor ou igual a 10-11M, menor ou igual a 10-12M, menor ou igual a 10-13M, menor ou igual a 10-14M, e menor ou igual a 10-15M, conforme determinado pela ressonância plasmônica de superfície ou o método Kinexa, tal como em que as alças formam sítios para ligação a IgG.

5. Método de construção de uma biblioteca de proteínas baseadas em arcabouço, como definidas na reivindicação 3, que são derivadas de uma sequência consenso de estabilidade aprimorada de um domínio FN3 incorporando códons randomizados a fim de produzir variantes de polipeptídeos, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: fornecer um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo em que a sequência consenso de estabilidade aumentada é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 142, 143 e 147-151; e introduzir códons de randomização na sequência polinucleotídica em posições selecionadas; e propagar cópias do polinucleotídeo para formar uma biblioteca de polinucleotídeos que codificam proteínas de arcabouço variantes.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que os códons de randomização são selecionados do grupo NNS e NNK, tal como em que os códons de randomização são incorporados em posições que codificam pelo menos uma região de alça selecionada do grupo que consiste em resíduos em ou cerca de posições 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64 e 75-81 das SEQ ID NO: 142, 143 e 147-151.

7. Biblioteca, caracterizada pelo fato de que é produzida pelo método, como definido na reivindicação 5 ou 6, opcionalmente em que: (i) os polinucleotídeos da biblioteca são operativamente ligados a uma sequência de codificação de proteína de exibição e introduzidos em um vetor de expressão para exibição e expressos como uma proteína de fusão; ou (ii) a proteína de exibição é selecionada a partir de uma proteína ancorada à membrana de células eucarióticas, uma proteína de células procarióticas e uma proteína de revestimento de fago.

8. Método para gerar uma ligação de arcabouço de proteína a um alvo específico com uma afinidade de ligação predefinida, caracterizado pelo fato de que compreende o contato da biblioteca como definida na reivindicação 7, com o alvo específico e o isolamento de uma ligação de arcabouço de proteína ao alvo específico com a afinidade predefinida, opcionalmente em que: (i) a etapa de isolamento compreendendo isolar moléculas de arcabouço que se ligam ao alvo específico e testar as moléculas de arcabouço isoladas quanto à afinidade de ligação ao alvo específico, tal como em que a etapa de isolamento compreende panoramizar a biblioteca com o alvo específico, capturando moléculas de arcabouço ligadas ao alvo específico e isolamento das moléculas de arcabouço de ligação; (ii) a afinidade medida por KD é menor ou igual a cerca de 10-7M.

9. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de que codifica o arcabouço de proteína, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a molécula de ácido nucleico tem a SEQ ID NO: 17, em que os ácidos nucleicos específicos da SEQ ID NO: 17 são substituídos e aumentam a estabilidade térmica e a estabilidade química da molécula baseada em arcabouço.

10. Vetor de ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico isolada, como definida na reivindicação 9.

11. Célula hospedeira procariótica ou eucariótica, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico isolada, como definida na reivindicação 9, opcionalmente, em que a referida célula hospedeira é pelo menos uma selecionada de E. coli BL21Star (DE3), outra célula de E. coli, ou levedura.

12. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o arcabouço de proteína, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e pelo menos um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável, opcionalmente compreendendo ainda pelo menos um composto ou polipeptídeo selecionado de um marcador detectável ou repórter, um antagonista de TNF, um medicamento anti-infeccioso, um medicamento para o sistema cardiovascular (CV), um medicamento para o sistema nervoso central (SNC), um medicamento para o sistema nervoso autônomo (ANS), um medicamento para o trato respiratório, um medicamento para o trato gastrointestinal (GI), um medicamento hormonal, um fármaco para equilíbrio de fluidos ou eletrólitos, um fármaco hematológico, um antineoplásico, um fármaco de imunomodulação, um fármaco oftálmico, ótico ou nasal, um fármaco tópico, um alimento funcional ativo, uma citocina e um antagonista de citocina.

13. Dispositivo médico, caracterizado pelo fato de que compreende o arcabouço de proteína, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o referido dispositivo é adequado para contatar ou administrar o referido arcabouço de proteína por pelo menos uma maneira selecionado de parenteral, subcutânea, intramuscular, intravenosa, intrarticular, intrabrônquica, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitária, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intra-hepática, intramiocárdica, intraosteal, intrapelvic, intraperebelar, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intra-hepática, intramiocárdica, intraosteal, intrapelvic, intraperebelar intracerebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intra-hepático, intramiocárdico, intraosteal, intrapelvic, intraperebellar, intra-espacardial, intrapero-facial, intraperitoneal, intra-epilétero-facial, intraperitoneal, intraperenopetural, intraperonapetural, intraperenapetural, intraperitoneal, intrarmonalapetural, intraperitoneal, intraperenapetural, intratorácica, intrauterina, intravesical, intralesional, bolo, vaginal, retal, bucal, sublingual, intranasal e transdérmica.

14. Artigo de fabricação para uso farmacêutico ou diagnóstico humano, caracterizado pelo fato de que compreende material de embalagem e um recipiente que compreende uma solução ou uma forma liofilizada do arcabouço de proteína, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, opcionalmente em que o referido recipiente é um componente de um dispositivo ou sistema de entrega parenteral, subcutâneo, intramuscular, intravenoso, intrarticular, intrabrônquico, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitário, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intra- hepático, intracartilaginoso, intramiocárdico, intra-peritoneal- apocalíptico, intraperitoneal, intramiocárdico, intraperitoneal-apical, intraperitoneal, intraperitoneal, intramiocárdico, intraperitonealapulárico, intrarretal, intrarrenal, intra-retiniano, intraespinhal, intrassinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, intralesional, bolus, vaginal, retal, bucal, sublingual, intranasal ou transdérmico.

15. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula baseada em arcabouço compreendendo domínios de alça topologicamente semelhantes aos domínios do terceiro domínio de fibronectina, o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos com base em uma sequência consenso de terceiros domínios de fibronectina tendo: (i) a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16, em que resíduos específicos da SEQ ID NO: 16 são substituídos e aumentam a estabilidade térmica e a estabilidade química da molécula com base em arcabouço, em que a molécula com base em arcabouço compreende uma substituição E11N; ou (ii) a sequência de aminoácidos de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 144.

16. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que tem alças capazes de contatar um alvo, em que as regiões de alça foram modificadas para abranger resíduos alternativos em posições selecionadas do grupo que consiste em 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64 e 75-81 de uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 16 e 144, opcionalmente em que o referido arcabouço se liga a um alvo com pelo menos uma afinidade selecionada de um KD de pelo menos 10-9M, pelo menos 10-10M, pelo menos 10-11M, pelo menos 10-12M, pelo menos 10-13M, pelo menos 1014M, e pelo menos 10-15M, conforme determinado pela ressonância plasmônica de superfície ou o método Kinexa.

17. Arcabouço de proteína isolado com base em um domínio de fibronectina tipo III (FN3), Tencon 16 (SEQ ID NO: 16), como definido na reivindicação 15 (i), caracterizado pelo fato de que tem uma substituição, E11N, e que compreende ainda: uma porção da estrutura principal com uma sequência de aminoácidos idêntica à SEQ ID NO: 16 nos resíduos 1-21, 29-74 e 8289; uma porção de alça B:C entre os resíduos 21 e 29 da SEQ ID NO: 16 tendo qualquer uma das SEQ ID NOS: 21-45; e uma porção de alça F:G entre os resíduos 74 e 82 da SEQ ID NO: 16 tendo qualquer uma das SEQ ID NOS: 21-45, em que o arcabouço da proteína é capaz de se ligar a IgG humana, opcionalmente, em que o referido arcabouço se liga a um alvo com pelo menos uma afinidade selecionada a partir de um KD menor ou igual a 10-10M, menor ou igual a 10-11M, menor ou igual a 1012M, menor ou igual a 10-13M, menor ou igual a 10-14M, e menor ou igual a 10-15M, conforme determinado por ressonância plasmônica de superfície ou o método Kinexa, como em que as alças formam sítios para ligação a IgG.

18. Método para construção de uma biblioteca de proteínas baseadas em arcabouço que são derivadas de uma sequência consenso de estabilidade aumentada de um domínio FN3 que incorpora códons randomizados para produzir variantes de polipeptídeos, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: fornecer um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo em que a sequência consenso de estabilidade aumentada é SEQ ID NO: 144; e introduzir códons de randomização na sequência polinucleotídica em posições selecionadas; e propagar cópias do polinucleotídeo para formar uma biblioteca de polinucleotídeos que codificam proteínas de arcabouço variantes.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que os códons de randomização são selecionados do grupo NNS e NNK, tal como em que os códons de randomização são incorporados em posições que codificam pelo menos uma região de alça selecionada do grupo que consiste em resíduos em ou cerca de posições 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64 e 75-81 da SEQ ID NO: 144.

20. Biblioteca, caracterizada pelo fato de que é produzida pelo método, como definido na reivindicação 18 ou 19, opcionalmente em que: (i) os polinucleotídeos da biblioteca são operativamente ligados a uma sequência de codificação de proteína de exibição e introduzidos em um vetor de expressão para exibição e expressos como uma proteína de fusão; ou (ii) a proteína de exibição é selecionada a partir de uma proteína ancorada à membrana de células eucarióticas, uma proteína de células procarióticas e uma proteína de revestimento de fago.

21. Método para gerar uma ligação de arcabouço de proteína a um alvo específico com uma afinidade de ligação predefinida, caracterizado pelo fato de que compreende o contato da biblioteca de acordo com a reivindicação 20 com o alvo específico e o isolamento de uma ligação de arcabouço de proteína ao alvo específico com a afinidade predefinida, opcionalmente em que: (i) a etapa de isolamento compreendendo isolar moléculas de arcabouço que se ligam ao alvo específico e testar as moléculas de arcabouço isoladas quanto à afinidade de ligação ao alvo específico, tal como em que a etapa de isolamento compreende panoramizar a biblioteca com o alvo específico, capturando moléculas de arcabouço ligadas ao alvo específico e isolamento das moléculas de suporte de ligação; (ii) a afinidade medida por KD é menor ou igual a cerca de 10-7M.

22. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de que codifica o arcabouço de proteína, como definido em de qualquer uma das reivindicações 15 a 17, em que a molécula de ácido nucleico tem a SEQ ID NO: 17, em que os ácidos nucleicos específicos da SEQ ID NO: 17 são substituídos e aumentam a estabilidade térmica e a estabilidade química da molécula baseada em arcabouço.

23. Vetor de ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico isolada, como definida na reivindicação 22.

24. Célula hospedeira procariótica ou eucariótica, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico isolada, como definida na reivindicação 22, opcionalmente, em que a referida célula hospedeira é pelo menos uma selecionada de E. coli BL21Star (DE3), outra célula de E. coli, ou levedura.

25. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o arcabouço de proteína, como definido em qualquer uma das reivindicações 15 a 17, e pelo menos um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável, opcionalmente compreendendo ainda pelo menos um composto ou polipeptídeo selecionado a partir de um marcador detectável ou repórter, um antagonista de TNF, um medicamento anti-infeccioso, um medicamento para o sistema cardiovascular (CV), um medicamento para o sistema nervoso central (SNC), um medicamento para o sistema nervoso autônomo (ANS), um medicamento para o trato respiratório, um medicamento para o trato gastrointestinal (GI), um medicamento hormonal, um fármaco para equilíbrio de fluidos ou eletrólitos, um fármaco hematológico, um antineoplásico, um fármaco de imunomodulação, um fármaco oftálmico, ótico ou nasal, um fármaco tópico, um alimento funcional ativo, uma citocina e um antagonista de citocina.

26. Dispositivo médico, caracterizado pelo fato de que compreende o arcabouço de proteína, como definido em qualquer uma das reivindicações 15 a 17, em que o referido dispositivo é adequado para contatar ou administrar o referido esqueleto de proteína por pelo menos uma maniera selecionada de parenteral, subcutâneo, intramuscular, intravenoso, intrarticular, intrabrônquica, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitária, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intra-hepática, intramiocárdica, intraosteal, intrapelvic, intraperebelar, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intra-hepática, intramiocárdica, intraosteal, intrapelvic, intraperebelar intracerebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intra-hepático, intramiocárdico, intraosteal, intrapelvic, intraperebellar, intra-espacardial, intrapero-facial, intraperitoneal, intra-epilétero-facial, intraperitoneal, intraperenopetural, intraperonapetural, intraperenapetural, intraperitoneal, intrarmonalapetural, intraperitoneal, intraperenapetural, intratorácica, intrauterina, intravesical, intralesional, bolo, vaginal, retal, bucal, sublingual, intranasal e transdérmica.

27. Artigo de fabricação para uso farmacêutico ou diagnóstico humano, caracterizado pelo fato de que compreende material de embalagem e um recipiente que compreende uma solução ou uma forma liofilizada do arcabouço de proteína, como definido em qualquer uma das reivindicações 15 a 17, opcionalmente em que o referido recipiente é um componente de um dispositivo ou sistema de administração parenteral, subcutâneo, intramuscular, intravenoso, intrarticular, intrabrônquico, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitário, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intra- hepático, intracartilaginoso, intramiocárdico, intra-peritoneal- apocalíptico, intraperitoneal, intramiocárdico, intraperitoneal-apical, intraperitoneal, intraperitoneal, intramiocárdico, intraosteal, intrapélvico, intrapericárdico, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intraretal, intrarenal, intraretinal, intraespinal, intra-sinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, intralesional, bolus, intrapulmonar, intraretal, intra-renal, intra-retinal, intraespinal, intra-sinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, intralesional, bolus, vaginal, retal ou subcutâneo.

28. Arcabouço de proteína isolado com base em um domínio de fibronectina tipo III (FN3), caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 144, compreendendo ainda substituições em B:C (resíduos 22-28) ou F:G ( resíduos 75-81) em que a proteína arcabouço foi selecionada por ligação a uma proteína alvo, opcionalmente em que a proteína alvo é IgG humana ou TNFalfa humano ou um fragmento dos mesmos, por exemplo, em que o B:C (resíduos 22-28) ou F:G (resíduos 75-81) são representados por uma ou mais das SEQ ID NOs: 21-140 e o arcabouço da proteína se liga a IgG humana, tal como em que: (i) o arcabouço compreende 7 fitas e 6 alças entre as fitas; ou (ii) o arcabouço compreende a sequência de aminoácidos de qualquer um de uma alça B:C ou F:G de SEQ ID NOs: 21-140, em que o arcabouço de proteína forma alças nos ou em torno dos resíduos 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64 e 75-81.