JP2018183143A

JP2018183143A - 安定したフィブロネクチンドメイン組成物、方法及び用途

Info

Publication number: JP2018183143A
Application number: JP2018112762A
Authority: JP
Inventors: ヤコブ，スティーブン; Jacobs Steven
Original assignee: Janssen Biotech Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 2010-04-30
Filing date: 2018-06-13
Publication date: 2018-11-22
Also published as: US20140018519A1; IL222573B; BR112012027863A2; KR101863033B1; KR20130122518A; US8569227B2; HRP20161117T1; US20160244744A1; US20110274623A1; CA2797274A1; EP3103478B1; BR112012027863B1; WO2011137319A3; SMT201600309B; EP2571531B1; SI2571531T1; CN103002923B; JP2021010368A; RU2016142690A; ES2592511T3

Abstract

【課題】増強された熱及び化学安定性を呈すると同時に、診断用及び／又は治療用組成物、方法及びデバイスにおける用途用に、標的に結合することができる結合パートナーを形成するように改変されることができるタンパク質スカフォールドの提供。【解決手段】フィブロネクチン３型（ＦＮ３）タンパク質の繰り返し体などの特定の共通アミノ酸配列に基づき、かつ、その熱安定性及び化学安定性が増強されるように特異残基が置換されているポリペプチド。【選択図】なし

Description

本発明は、細胞内標的に対する結合能を含む、新しい特徴を有するタンパク質スカフォ
ールドに関する。より詳細には、本発明は、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）リピー
トの共通配列に基づくタンパク質スカフォールドを目的とする。

モノクローナル抗体は、標的分子に対する高親和性及び特異性が欲しい時に最も広く使
用されるクラスの治療用タンパク質である。しかし、かかる標的に結合するように改変で
きる非抗体タンパク質も、生物医薬品業界で関心が高い。これら「代替スカフォールド」
タンパク質は、それらの低い分子量、ジスルフィド結合の欠如、高い安定性、及び原核細
胞宿主での発現可能性から、従来の抗体に優る利点を有する場合がある。新規精製法が容
易に適用され、それらは、簡便に薬剤／毒素と抱合され、組織内に効率よく侵入し、かつ
多特異的なバインダーに容易に形成される（Ｓｋｅｒｒａ２０００ＪＭｏｌＲｅ
ｃｏｇｎｉｔ１３（４）：１６７〜８７；ＢｉｎｚａｎｄＰｌｕｃｋｔｈｕｎ２
００５ＣｕｒｒＯｐｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１６（４）：４５９〜６９）。

このような代替スカフォールドの１つが免疫グロブリン（Ｉｇ）フォールドである。こ
のフォールドは、抗体の可変領域、並びに数千もの非抗体タンパク質において見られる。
１つのそのようなＩｇタンパク質である、ヒトフィブロネクチンの１０番目のフィブロネ
クチンＩＩＩ型（ＦＮ３）繰り返し体は、全体的なＩｇフォールド構造を保持しつつ、表
面に露出したループにおける多数の突然変異に耐えることができるということが示されて
いる。したがって、複数の異なる標的に対して選択されたこれらループ及び特異的バイン
ダーにおいて、アミノ酸変異体のライブラリーが構築されている（Ｋｏｉｄｅｅｔａ
ｌ．１９９８ＪＭｏｌＢｉｏｌ２８４（４）：１１４１〜５１；Ｋａｒａｔａｎ
ｅｔａｌ．２００４ＣｈｅｍＢｉｏｌ１１（６）：８３５〜４４）。そのよう
な改変されたＦＮ３ドメインは、重要な生物物理学的特性を保持しつつ、高い親和性で標
的に結合することが見出されている（Ｐａｒｋｅｒｅｔａｌ．２００５Ｐｒｏｔｅ
ｉｎＥｎｇＤｅｓＳｅｌ１８（９）：４３５〜４４）。

潜在的代替スカフォールド分子の望ましい物理学的特性としては、高い熱安定性及び熱
による折り畳み及び非折り畳みからの可逆性が挙げられる。タンパク質及び酵素の見かけ
の熱安定性を高めるため、極めて類似性の高い熱安定性配列との比較に基づく理論的設計
、ジスルフィド架橋の安定化設計、α−ヘリックス性を増加させる変異、塩橋の設計、タ
ンパク質の表面電荷の変化、定方向進化、及び共通配列の組成物など、様々な方法が応用
されている（ＬｅｃｈｍａｎｎａｎｄＷｙｓｓ２００１ＣｕｒｒＯｐｉｎＢ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１２（４）：３７１〜５）。高い熱安定性は、得られる組み換えタ
ンパク質の収量を増し、精製した分子の溶解度を改善し、細胞内スカフォールドの活性を
向上し、免疫原性を低下させ、かつ製造におけるコールドチェーンの必要性を最低限にで
きるため、かかるスカフォールドに望まれる特性である。

本発明は、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）リピートタンパク質に基づくタンパク
質スカフォールド、コード化又は相補的核酸、ベクター、宿主細胞、組成物、混合物、処
方、デバイス、並びにこれらの製造及び使用法を提供する。好ましい実施形態において、
タンパク質スカフォールドは、ヒトテネイシン−Ｃ（以下「テネイシン」）の複数のＦＮ
３ドメインの共通配列からなる。更に好ましい実施形態において、本発明のタンパク質ス
カフォールドは、１５のＦＮ３ドメイン（配列番号１〜１５）の共通配列又はその変異型
である。本発明の特定の態様において、本発明のタンパク質スカフォールドは、スカフォ
ールドタンパク質が熱及び化学変性に抵抗する増強された能力を示すようにする置換残基
を有する。本発明のタンパク質スカフォールドは、スカフォールド内の所定のループ領域
に残基を挿入して、結合パートナーに対して選択性が高い結合ドメインを形成するといっ
た、当該技術分野において既知の方法により改変され得る。結合パートナーは、可溶性分
子又は細胞結合分子、例えば、受容タンパク質の細胞外ドメインである。

一実施形態において、本明細書に記載の固有の熱及び化学安定性のために選択された配
列番号１６（Ｔｅｎｃｏｎ）の配列のコンセンサスベースの特異的置換は、Ｔｅｎｃｏｎ
スカフォールドの熱安定性を最大１１℃改善し、ＧｄｍＣｌ誘発変性の中間点を３．４Ｍ
から５Ｍ超過へとシフトさせる。一実施形態において、配列番号１６（Ｔｅｎｃｏｎ）の
特異的置換は、Ｎ４６Ｖ、Ｅ１４Ｐ、及びＥ８６Ｉなどのように単一であり、代替実施形
態では、置換は、Ｎ４６Ｖ及びＥ８６Ｉ、Ｅ１４Ｐ及びＮ４６Ｖ及びＥ８６Ｉの全て、並
びにＬ１７Ａ及びＮ４６Ｖ及びＥ８６Ｉの全てのように複数である。安定性が増強された
Ｔｅｎｃｏｎベースのポリペプチドは、精製、調製の容易性が改善され、かつ保管寿命が
延長されたスカフォールドを提供する。総合安定性が改善された改変結合パートナーは、
ランダムなペプチドを安定化スカフォールドのループに導入することによって産生され得
る。

本発明のタンパク質スカフォールドは、モノマー単位として使用されてもよく、あるい
は、結合されて、同一又は異なる結合パートナー特異的なポリマー構造を形成してもよい
。Ｔｅｎｃｏｎタンパク質スカフォールドベースの分子は、更に修飾されて、生体内分布
、体内残留性、又は分子との会合などの治療効果と関連した１つ以上のインビボの特性を
高めることができ、該分子は、細胞、特に、上皮細胞取り込みを変化させる分子、例えば
、抗体のＦｃ領域などであり、血清タンパク質に結合するように設計された分子、例えば
、アルブミン結合ドメインなどである。更なる実施形態では、本発明のタンパク質スカフ
ォールドは、タンパク質スカフォールドをコードできる核酸分子に結合してよい。

本発明はまた、宿主細胞中で、その配列が複数のＦＮ３ドメインの共通配列に関係して
いる少なくとも１つのタンパク質スカフォールドを発現するための少なくとも１つの方法
であって、少なくとも１つのタンパク質スカフォールドが検出可能及び／又は回収可能な
量で発現する条件下で、本明細書に記載のように宿主細胞を培養することを含む方法も提
供する。

本発明はまた、（ａ）本明細書に記載のような複数のＦＮ３ドメイン及び／又はコード
化核酸の共通配列に基づくタンパク質スカフォールドと、（ｂ）好適な及び／又は医薬的
に許容できる担体又は希釈剤と、を含む、少なくとも１つの組成物も提供する。

本発明は、フィブロネクチン３型（ＦＮ３）繰り返し体タンパク質、好ましくは、複数
のＦＮ３ドメインの共通配列、より好ましくはヒトテネイシンの複数のＦＮ３ドメインの
共通配列に基づく、熱及び化学安定性が増強されたタンパク質スカフォールドのライブラ
リーの作成方法を更に含む。単一ループのアミノ酸組成物を変化させること、又は複数ル
ープ若しくはスカフォールド分子の更なる位置を同時に変化させることにより、ライブラ
リーを作成することができる。変化の生じるループは、変化に応じて延長あるいは短縮さ
れ得る。このようなライブラリーを作成し、それぞれの位置において可能性のあるアミノ
酸を全て、又は意図されたアミノ酸サブセットを含ませることができる。このライブラリ
ーメンバーを、ディスプレイ、例えばインビトロディスプレイ（ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボソ
ームディスプレイなど）、酵母、細菌、及びファージディスプレイによるスクリーニング
に用いることができる。

本発明のタンパク質スカフォールドは、高濃度における高浸透力及び溶解度条件下での
安定性といった、増強された生物物理学的特性を提供する。スカフォールドタンパク質の
ドメインは、ジスルフィド結合されないので、ジスルフィド結合形成に必要な酵素を欠い
た系（例えば、大腸菌などの原核細胞系、及びウサギ網状赤血球系などのインビトロ転写
／翻訳系）の中で該領域を発現及び折り畳むのが可能となる。

更なる態様において、本発明は、標的及び検出バインダーで本発明のスカフォールドラ
イブラリーをパニングすることによる、特定の標的に対して結合するスカフォールド分子
の作成方法を提供する。別の関連する態様では、本発明は、所望の活性、例えば、一定の
親和性での標的タンパク質への結合能を有する、親和性成熟タンパク質スカフォールドを
製造するのに用いることができるスクリーニング法を含む。親和性成熟は、ファージディ
スプレイ又はインビトロディスプレイなどの系を用いて、突然変異誘発及び選択を反復す
ることにより達成することができる。このプロセス中の突然変異誘発は、特定のスカフォ
ールド残基に対する部位特異的突然変異誘発、変異性ＰＣＲによるランダム変異誘発、Ｄ
ＮＡシャフリング、及び／又はこれらの手技の組み合わせの結果であってよい。本発明は
更に、本明細書に記載する任意の発明を提供する。

図１ＮｕＰＡＧＥ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で泳動し、クマシーブルーで染色した精製ＴｅｎｃｏｎのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。Ｎはそのままの状態を、Ｒは還元状態を意味する。ＰＢＳ中でのＴｅｎｃｏｎの円偏光二色性分析を示す。ＰＢＳ中でのテネイシンの第３ＦＮ３ドメイン及びＴｅｎｃｏｎの円偏光二色性分析を示し、それぞれ、５４℃及び７８℃の融解温度を得た。ｐＴｅｎｃｏｎ−ｐＩＸのファージミドプラスミド設計を示す。Ｌａｃプロモーターにより発現が、ＯｍｐＡシグナル配列を介して分泌が、促進される。ｍｙｃ−ＴｅｎｃｏｎがＭ１３ファージ上にディスプレイされ得ることをＥＬＩＳＡを用いて示し、抗−Ｍｙｃコーティング、ＣＮＴＯ９５コーティング、及び非コーティングウェルへのファージの結合を示す。ヒトテネイシンの第３ＦＮ３ドメインのループ構造を描いた図。ＥＬＩＳＡによるＩｇＧセレクションの結果のスクリーニングを示し、それぞれのクローンのビオチン化ＩｇＧ又は対照としてビオチン化ＨＳＡへの結合を試験した。２８０ｎｍの蛍光励起及び３６０ｎｍの放出によって測定した場合の、単一の突然変異体のＧｄｍＣｌ誘発変性を示すグラフ。２８０ｎｍの蛍光励起及び３６０ｎｍの放出によって測定した場合の、コンビナトリアル突然変異体（Ｂ）のＧｄｍＣｌ誘発変性を示すグラフ。

略語
ＡＤＣＣ＝抗体依存性の細胞傷害性；ＣＤＣ＝補体依存性の細胞毒性；ＤＳＣ＝示差走
査熱量計；ΔＧ＝ギブス自由エネルギー；ＩｇＧ＝免疫グロブリンＧ；Ｔｍ＝融解温度；

用語の定義＆説明
用語「抗体」又は「抗体部分」は、抗体、その消化断片、特定部分及び変異型を含むこ
とを意図し、これには抗体模倣薬が非限定的に挙げられ、又は抗体の構造及び／若しくは
機能を模倣する抗体の部分又はその特定断片若しくは一部を含み、単鎖抗体、単一ドメイ
ン抗体、小体、及びその断片が非限定的に挙げられる。機能的断片は、関心対象の標的抗
原に結合する、抗原結合断片を含む。例えば、Ｆａｂ（例えば、パパイン消化による）、
Ｆａｂ’（例えば、ペプシン消化及び部分的還元による）、及びＦ（ａｂ’）₂（例えば
、ペプシン消化による）、ｆａｃｂ（例えば、プラスミン消化による）、ｐＦｃ’（例え
ば、ペプシン又はプラスミン消化による）、Ｆｄ（例えば、ペプシン消化、部分的還元、
及び再集合による）、Ｆｖ又はｓｃＦｖ（例えば、分子生物学的技術による）断片が挙げ
られるが、これらに限定されない、標的抗原又はその一部に結合できる抗体断片が、用語
「抗体」に含まれる。抗体又は断片は、非限定的に、ヒト、マウス、ウサギ、ラット、げ
っ歯類、霊長類、ラクダ類、ヤギ、又はそれらの任意の組み合わせ等に由来することがで
き、また、単離したヒト、霊長類、げっ歯類、哺乳類、キメラ、ヒト化、及び／又はＣＤ
Ｒ移植等の抗体、免疫グロブリン、開裂産物及び他の指定部分、並びにそれらの変異を含
む。

用語「エピトープ」は、抗体又はスカフォールドベースタンパク質の１つ以上のループ
などの改変結合ドメインに対して特異的に結合することができるタンパク質決定基を意味
する。エピトープは通常、アミノ酸又は糖側鎖などの化学的に活性な分子表面基で構成さ
れており、通常、特定の３次元構造特性並びに特定の電荷特性を有する。構造的及び非構
造的エピトープは、後者ではなく前者に対する結合が、変性溶媒の存在下で損失するとい
う点で区別される。立体構造エピトープは、標的分子の線形配列の様々な部分からのアミ
ノ酸が、３次元空間内でごく近接して集まるときに発生する、標的分子の立体構造的折り
畳みの結果もたらされる。かかる構造的エピトープは、典型的には、原形質膜の細胞外側
上で分散される。

本明細書で使用されるところの「Ｆｃ」、「Ｆｃ含有タンパク質」、又は「Ｆｃ含有分
子」という用語は、少なくとも免疫グロブリンＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する、単量
体、二量体、又はヘテロ二量体タンパク質を意味する。ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、タ
ンパク質／分子（例えば、抗体）の二量体領域の少なくとも一部を形成することができる
。

本明細書で用いられる「安定性」という用語は、正常な機能活性（例えば、サイトカイ
ン又は血清タンパク質などの標的分子に対する結合など）の少なくとも１つを維持するよ
うに、生理学的条件下で折り畳み状態を維持する分子の能力を指す。タンパク質安定性及
びタンパク質不安定性の測定は、タンパク質完全性の同じ又は異なる態様として見ること
ができる。タンパク質は、熱、紫外線又は電離放射線、溶液中の場合には周囲の浸透圧モ
ル濃度及びｐＨの変化、小さな孔寸法での濾過、紫外線放射、γ線照射によるなどの電離
放射線、化学的又は熱脱水、あるいはタンパク質構造の破壊を引き起こす可能性のあるそ
の他の任意の作用又は力によって引き起こされる変性に対して感受性がある、つまり「不
安定」である。分子の安定性は、標準方法を用いて決定することができる。例えば、分子
の安定性は、熱融解（「ＴＭ」）温度を測定することにより決定することができる。ＴＭ
は、分子の半分が非折畳み状態になる温度（℃）である。典型的には、ＴＭが高いほど、
分子はより安定している。熱に加えて、化学環境もまた、タンパク質が特有の三次元構造
を維持する能力を変化させる。

化学変性も同様に、様々な方法によって測定することができる。化学的変性剤は、例え
ば水素結合、静電結合、ファン・デル・ワールス力、疎水性相互作用、又はジスルフィド
結合などの、タンパク質内の非共有相互作用及び共有結合を破壊することで知られた薬剤
である。化学的変性剤としては、グアニジン塩酸塩、チオシアン酸グアニジニウム、尿素
、アセトン、有機溶媒（ＤＭＦ、ベンゼン、アセトニトリル）、塩類（硫酸アンモニウム
、臭化リチウム、塩化リチウム、臭化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム）、
還元剤（例えば、ジチオスレイトール、βメルカプトエタノール、ジニトロチオベンゼン
（dinitrothiobenzene）、及び水素化物、例えば水素化ホウ素ナトリウム）、非イオン性
及びイオン性洗剤、酸類（例えば、塩酸（ＨＣｌ）、酢酸（ＣＨ₃ＣＯＯＨ）、ハロゲン
化酢酸）、疎水性分子（例えば、リン脂肪酸）、及び標的変性剤（ＪａｉｎＲ．Ｋａ
ｎｄＨａｍｉｌｔｏｎＡ．Ｄ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１１４（４），２００２）
が挙げられる。変性の範囲の定量化は、標的分子に結合する能力などの機能特性の消失、
あるいは凝集する、これまで溶媒が到達しにくかった残基が露出する、又はジスルフィド
結合が破壊又は形成する傾向などの生理化学的性質による消失に依存し得る。

安定性の消失に関しては、即ち、タンパク質が「変性する」又はタンパク質の「変性」
とは、タンパク質の機能特性を付与する三次元コンフォメーションのいくつか又は全てが
、活性及び／又は溶解度の不随損失と共に消失する過程を意味する。変性中に破壊される
力としては、静電力、疎水性力、ファン・デル・ワールス力、水素結合、及びジスルフィ
ドなどであるがこれらに限定されない分子内結合が挙げられる。タンパク質の変性は、タ
ンパク質又はタンパク質を含む溶液に加えられる力、例えば、機械力（例えば、圧縮力又
は剪断力）、熱応力、浸透ストレス、ｐＨ、電界又は磁界の変化、電離放射線、紫外線放
射及び脱水など、及び化学的変性剤によって引き起こされ得る。

本明細書で用いられる「治療上有効な」処置又は量とは、疾患又はその症状の原因の検
出可能な緩和又は改善を引き起こすのに十分な分量の量を指す。「改善する」とは、治療
を受ける患者の疾患の有害な影響の緩和を指す。本発明の被験者は好ましくはヒトである
が、有害な状態、疾患、又は疾病の治療が必要な任意の動物を、その目的のために設計さ
れたスカフォールドベースタンパク質で治療することができることを想定し得る。

概論
本発明は、フィブロネクチン３型（ＦＮ３）繰り返し体タンパク質の共通配列に基づく
、哺乳類由来スカフォールドを非限定的に含む、単離された組み換え及び／又は合成タン
パク質スカフォールド、並びに組成物、及び共通ＦＮ３配列に基づくタンパク質スカフォ
ールドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むコード化核酸分子を提供す
る。本発明は、例えば発見プラットホームとして、また診断用組成物、治療用組成物、方
法及びデバイスを目的として、このような核酸及びタンパク質スカフォールドを製造しか
つ使用する方法を非限定的に含む。

本発明のタンパク質スカフォールドは、小さくて小型であるため、より広範な免疫グロ
ブリンに基づく生物学的療法剤に利点を提供する。特に、生体分子の寸法及び形状は、局
所的に、経口で、又は血液脳関門を横断して投与される能力；大腸菌などの低コスト系で
発現される能力；複数の標的又は同じ標的の複数のエピトープに結合する二重特異的又は
特異的な分子に改変される能力；結合に対する適合性、即ち、活性物質、ポリマー、及び
プローブに対する適合性；高濃度に調製される能力；及びかかる分子が病変組織及び腫瘍
に効果的に浸透する能力、に影響を与え得る。

更に、タンパク質スカフォールドは、抗体の可変領域を模倣するフォールドとの関連で
、抗体の特性の多くを有する。この方法により、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）に類似
するＦＮ３ループを露出できるようにする。これらは細胞内標的に結合できるはずであり
、このループを変化させ、例えば、親和性成熟し、特定の結合特性又は関連する特性を改
善することができる。

本発明のタンパク質スカフォールドの６つのループのうちの３つは、性質上超可変であ
ることが分かっている可変ドメインのループに位置する抗体の結合ドメインに位相的に対
応し（Ｋａｂａｔにより抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）、即ち、抗原結合領域の残基と
定義される位置の超可変ドメインループ（ＨＶＬ））、残りの３つのループは、抗体ＣＤ
Ｒと同様の方法で露出される表面である。これらのループは、以下の表３及び図６に示す
ように、配列番号１６の残基１３〜１６、２２〜２８、３８〜４３、５１〜５４、６０〜
６４、及び７５〜８１又はその付近に及ぶ又は位置する。好ましくは、残基２２〜２８、
５１〜５４、及び７５〜８１又はその付近のループ領域を、結合特異性及び親和性のため
に変化させる。１つ以上のこれらループ領域を、他のループ領域及び／又はストランドと
してその配列を維持する他のストランドとランダム化してライブラリーに配置し、特定の
タンパク質標的に高い親和性を有するライブラリーから、有効なバインダーを選択するこ
とができる。タンパク質との抗体ＣＤＲの相互作用と同様に、１つ以上のループ領域は標
的タンパク質と相互作用することができる。

本発明のスカフォールドは、例えば、共有結合性相互作用を介して、他のサブユニット
を組み入れることができる。抗体定常領域の全て又は一部は、スカフォールドに付着して
、抗体様特性、特に、例えば、補体活性（ＡＤＣＣ）、半減期などのＦｃ領域に関連する
抗体様特性を付与することができる。例えば、エフェクター機能は、例えば、Ｃ１ｑ結合
及び／又はＦｃγＲ結合を改変し、それによってＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性を変
えることにより提供及び／又は制御されることができる。「エフェクター機能」は、（例
えば、被験体における）生物活性を活性化又は低減させる役割を果たす。エフェクター機
能の例としては、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依
存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞の表面にある受容体の下方制御（例え
ば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）等が挙げられるが、これらに限定されない。このようなエフ
ェクター機能は、結合ドメイン（例えば、タンパク質スカフォールドループ）と結合する
Ｆｃ領域を必要とする場合があり、様々な試験法（例えば、Ｆｃ結合アッセイ、ＡＤＣＣ
アッセイ、ＣＤＣアッセイなど）を用いて評価することができる。

追加部分は、スカフォールドベースポリペプチドに付加又は関連付けられてもよく、所
望の特性のため、毒素複合体、アルブミン又はアルブミンバインダー、ポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ）分子などの変異型をスカフォールド分子に結合してよい。これらの部分
は、スカフォールドのコード配列とインラインで融合してもよく、標準的な手法、例えば
、公表されているコードヌクレオチド配列を用いて構成された組み換え融合コード化ベク
ターによる融合タンパク質の発現により作成されてもよい。あるいは、化学的手法を用い
て、該部分を組み換えにより作り出されたスカフォールドベースタンパク質に結合しても
よい。

本発明のスカフォールドは、単量体型で単一特異的に、又は、多量体型で二重特異的若
しくは多特異的（異なる標的タンパク質又は同一の標的タンパク質上のエピトープに対し
て）に使用できる。各スカフォールドユニット間の結合は、共有結合であるか又は非共有
結合であってもよい。例えば、二量体の二重特異的スカフォールドは、第１標的タンパク
質又はエピトープに対して特異性を有する１つのサブユニット、かつ第２標的タンパク質
又はエピトープに対して特異性を有する２つ目のサブユニットを有する。スカフォールド
サブユニットは、結合価、つまり抗原の結合活性を増加することができる、様々な立体構
造で連結してよい。

スカフォールドタンパク質の産生及び作製
本発明の少なくとも１つのスカフォールドタンパク質は、所望により、当該技術分野に
おいて周知の細胞株、混合細胞株、不死化細胞又は不死化細胞のクローン集団によって産
生することができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ
ＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌ
ｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ（１９８７〜２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ
，ｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭ
ａｎｕａｌ，２^nd Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ（１
９８９）；ＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；
Ｃｏｌｌｉｇａｎ，ｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９
９４〜２００１）；Ｃｏｌｌｉｇａｎｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏ
ｌｓｉｎＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，
ＮＹ，ＮＹ，（１９９７〜２００１）を参照されたい。

当該技術分野において既知のように、スカフォールドタンパク質から、アミノ酸を変更
、付加、及び／又は欠失して、免疫原性を低減する、又は結合、親和性、会合速度、解離
速度、結合活性、特異性、半減期、安定性、溶解度、若しくは任意のその他好適な特性を
低減、増強、若しくは変化させることができる。

生理活性スカフォールドベースタンパク質を、抗原に対する高い親和性及びその他の好
適な生物学的特性を伴うように設計することができる。この目的を達成するため、スカフ
ォールドタンパク質を、所望により親配列及び改変配列の三次元モデルを使用して、親配
列及び様々な概念的改変産物の分析プロセスによって調製することができる。三次元モデ
ルが一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補配列の考えら
れる三次元立体構造を図示し表示するコンピュータプログラムが使用可能であり、潜在的
な免疫原性を計測することができる（例えば、Ｘｅｎｃｏｒ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｎｒｏｖｉ
ａ，ＣＡ）のＩｍｍｕｎｏｆｉｌｔｅｒプログラム）。これらの表示を調べることにより
、候補配列の機能における残基の役割として可能性の高いものの分析、すなわち、候補の
スカフォールドタンパク質が、その抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能
となる。このようにして、標的抗原に対する親和性などの望ましい特性が達成されるよう
に、親配列及び参照配列から残基を選択し組み合わせることができる。上記手順の別の方
法として、又はそれに加えて、その他好適な改変方法を使用できる。

スクリーニング
類似するタンパク質又は断片に特異的に結合する変化に富んだ残基又はドメインを有す
るスカフォールドベースタンパク質を含む改変スカフォールドベースタンパク質又はライ
ブラリーのスクリーニングを、ヌクレオチド（ＤＮＡ若しくはＲＮＡディスプレイ）又は
ペプチドディスプレイライブラリー、例えば、インビトロディスプレイを用いて便利に達
成することができる。この方法は、望ましい機能又は構造をもつ個々のメンバーについて
ペプチドの大規模コレクションをスクリーニングすることを含む。ヌクレオチド配列を有
する又は有さない表示されるペプチドの長さは、３〜５０００個又はそれ以上のヌクレオ
チド又はアミノ酸、しばしば５〜１００個のアミノ酸、更にしばしば約８〜２５個のアミ
ノ酸であり得る。ペプチドライブラリーを作成するための直接的な化学合成方法に加えて
、複数の組換えＤＮＡ法も記述されている。１つのタイプには、バクテリオファージ又は
細胞の、表面上のペプチド配列のディスプレイが関与している。各バクテリオファージ又
は細胞は、特定のディスプレイされたペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含有
する。

本発明のタンパク質スカフォールドは、ヒト又はその他哺乳類のタンパク質に、広範な
親和性（Ｋ_D）で結合することができる。好ましい実施形態では、少なくとも１つの本発
明のタンパク質スカフォールドは、所望により、高い親和性、例えば、当業者により実施
されるように、表面プラズモン共鳴又はＫｉｎｅｘａ法で測定されるとき、Ｋ_Dが約１０^-
⁷Ｍ以下、例えば、以下には限定されないが、０．１〜９．９（又はこのうちの任意の範
囲若しくは値）Ｘ１０^-8、１０^-9、１０^-10、１０^-11、１０^-12、１０^-13、１０^-14、
１０^-15又はこのうちの任意の範囲若しくは値で、標的タンパク質に結合することができ
る。

抗原に対する抗体の親和性又は結合活性は、任意の適切な方法を使用して実験的に決定
することができる。（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，ｅｔａｌ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ
−ＡｎｔｉｇｅｎＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，」ＩｎＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＩｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ：ＮｅｗＹ
ｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）；Ｋｕｂｙ，ＪａｎｉｓＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆ
ｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ：ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ（１９９２）；及び本
明細書に記載の方法を参照のこと。）特定のタンパク質スカフォールド−抗原相互作用の
測定される親和性は、異なる条件（例えば、浸透圧モル濃度、ｐＨ）下で測定される場合
に異なる場合がある。したがって、親和性及びその他抗原結合パラメータ（例えば、Ｋ_D
、Ｋ_on、Ｋ_off）の測定は、好ましくは、タンパク質スカフォールド及び抗原の標準化溶
液、及び本明細書で記載される緩衝液などの標準化緩衝液を用いて行われる。

本発明のタンパク質スカフォールドと標的タンパク質への結合を競合するのは、及び／
又はエピトープ領域を共有するのは、どのタンパク質、抗体、及びその他拮抗物質である
のかを確認するため、本発明のタンパク質スカフォールドについて競合アッセイを実施す
ることができる。容易に当業者に知られるように、これらのアッセイは、タンパク質上の
限られた結合部位に対する、拮抗物質又はリガンド間の競合を評価する。競合の前後でタ
ンパク質及び／又は抗体を固定化、単離、又は捕捉し、また、例えば、デカント（タンパ
ク質／抗体を予め不溶化した場合）又は遠心分離（競合反応後タンパク質／抗体を沈殿さ
せた場合）により、標的タンパク質に結合したサンプルを未結合のサンプルから分離する
。また、タンパク質スカフォールドの標的タンパク質への結合したこと、又は結合しなか
ったことにより機能が変わるかどうか、例えば、タンパク質スカフォールド分子が、例え
ば、ラベルの酵素活性を阻害又は強化するかどうかにより、競合結合を決定してもよい。
当該技術分野において周知のような、ＥＬＩＳＡ及びその他機能性アッセイを使用してよ
い。

核酸分子
本発明のタンパク質スカフォールドをコードする核酸分子は、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、
ｔＲＮＡ若しくは任意の他の形態などのＲＮＡの形態、又はクローニングにより得られる
若しくは合成的に生成されるｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡが挙げられるがこれらに限定され
ないＤＮＡの形態、又はこれらの任意の組み合わせであってよい。ＤＮＡは、三本鎖、二
本鎖、若しくは一本鎖、又はこれらの任意の組み合わせであってもよい。ＤＮＡ又はＲＮ
Ａの少なくとも１本の鎖の任意の部分は、センス鎖としても知られるコード鎖であっても
よく、又はアンチセンス鎖と呼ばれる、非コード鎖であってもよい。

本発明の単離核酸分子には、本明細書に記載のように、及び／又は当該技術分野におい
て既知のように、１つ以上のイントロン（例えば、限定するものではないが、少なくとも
１つのタンパク質スカフォールドの少なくとも１つの特定の部位）を任意に有するオープ
ンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸分子、標的タンパク質に結合するタンパク
質スカフォールド又はループ領域のコード配列を含む核酸分子、及び上述のものとは実質
的に異なるヌクレオチド配列を含むが、遺伝コードの縮重に起因して、タンパク質スカフ
ォールドを依然としてコードする核酸分子を含むことができる。当然のことながら、遺伝
子コードは、当該技術分野においてよく知られている。したがって、当業者には、本発明
の特異的なタンパク質スカフォールドをコードする、これらの変性核酸変異体を作成する
ことは、日常的であるであろう。例えば上記のオースベル（Ausubel）らを参照されたく
、かかる核酸変異体は、本発明に含まれる。

本明細書に記されているように、タンパク質スカフォールドをコードする核酸を含む本
発明の核酸分子には、単独でタンパク質スカフォールド断片のアミノ酸配列をコードする
もの、全タンパク質スカフォールド又はその一部分についてのコード配列、タンパク質ス
カフォールド、断片又は一部分についてのコード配列、並びに付加的配列、例えばスプラ
イシング及びポリアデニル化シグナルを含む、転写、ｍＲＮＡプロセシングにおいて役割
を果たす転写された非翻訳配列（例えば、リボソーム結合及びｍＲＮＡの安定性）といっ
た非コード５’及び３’配列を含むが、これらに限定されない、付加的な非コード配列を
伴う、少なくとも１つのイントロンなどの、前述の付加的なコード配列を伴うか否かを問
わない、少なくとも１つのシグナルリーダー又は融合ペプチドのコード配列、付加的なア
ミノ酸（例えば付加的な機能を提供するものなど）をコードする付加的なコード配列、を
含んでよいが、これらに限定されない。したがって、タンパク質スカフォールドをコード
する配列は、マーカー配列、例えばタンパク質スカフォールド断片又は一部分を含む融合
タンパク質スカフォールドの精製を容易にするペプチドをコードする配列と融合させてよ
い。

核酸分子
本発明はまた、単離したポリヌクレオチドとして、又は原核細胞、真核性、又は繊維状
のファージ発現、組成物の分泌及び／又はそれらの定方向突然変異誘発物質又は組成物の
ディスプレイと適合するベクターを含む発現ベクターの部分として、本発明の組成物をコ
ードする核酸を提供する。

本発明の単離核酸は、
（ａ）組換え方法、（ｂ）合成方法、（ｃ）精製方法、及び／又は、
（ｄ）これらの組み合わせ、を使用して作ることができる。

本発明の実施に際して有用なポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるタンパク質ス
カフォールドの機能部分をコードする。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のタンパク
質スカフォールドをコードするポリヌクレオチドに対する選択的ハイブリダイゼーション
のために利用可能な核酸配列を含む。本発明は、本明細書で開示されるポリヌクレオチド
に対して、選択的なハイブリダイゼーション条件下で、ハイブリダイズする単離核酸を提
供する。したがって、本実施形態のポリヌクレオチドは、このようなポリヌクレオチドを
含む核酸を単離、検出、及び／又は定量するために使用することができる。例えば、本発
明のポリヌクレオチドを使用して、蓄積されたライブラリーにおける部分又は全長クロー
ンを同定、単離、又は増幅することができる。一部の実施形態においては、ポリヌクレオ
チドは、単離された、又はそうでなければヒト又は哺乳類核酸ライブラリーからのｃＤＮ
Ａに相補的なゲノム配列又はｃＤＮＡ配列である。

核酸は、本発明のポリヌクレオチドに加えて、便利に配列を含むことができる。例えば
、１つ以上のエンドヌクレアーゼ制限酵素認識部位を含むマルチクローニングサイトを、
核酸に挿入して、ポリヌクレオチドの単離に役立てることができる。また、翻訳可能な配
列を挿入して、本発明の翻訳されたポリヌクレオチドの単離に役立てることができる。例
えば、ヘキサヒスチジンマーカー配列は、本発明のタンパク質を精製するための便利な手
段を提供する。本発明の核酸（コード配列を除く）は、所望により、本発明のポリヌクレ
オチドのクローニング及び／又は発現のためのベクター、アダプター、又はリンカーであ
る。

追加の配列をかかるクローン化及び／又は発現配列に追加して、クローン化及び／又は
発現におけるそれらの機能を最適化して、ポリヌクレオチドの単離を助けることができる
か、又は細胞へのポリヌクレオチドの導入を改善することができる。クローン化ベクター
、発現ベクター、アダプター、及びリンカーの使用は、当該技術分野においてよく知られ
ている。

ファージ感染細菌などの細菌発現では、好ましい分泌シグナルは、ｐｅｌＢ又はｏｍｐ
Ａ分泌シグナルであるが、米国特許第５，６５８，７２７号に記載のように、他の分泌シ
グナルポリペプチドドメインを使用してもよい。ファージディスプレイでは、下流の翻訳
可能なＤＮＡ配列は、糸状ファージ外膜タンパク質、例えば、ｐＩＩＩ又はｐＩＸタンパ
ク質をコードする。好ましいファージタンパク質は、糸状ファージＭ１３、ｆ１、ｆｄ等
、及び同等の糸状ファージから得られる。したがって、下流の翻訳可能なＤＮＡ配列は、
糸状ファージ遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＩＸ外膜ポリペプチドに対応する、及び好ましくは
これと同一であるアミノ酸残基配列をコードする。かかる外膜タンパク質の配列は既知で
あり、ＮＣＢＩなどの公開データベースで入手することができる。

本明細書で開示されているような、本発明のポリヌクレオチドの配列に基づいたプロー
ブを用いて、ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。同じ
又は異なるインビボの相同遺伝子を単離するため、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列とハイ
ブリッド形成するためにプローブを使用することができる。当業者であれば、アッセイ中
でさまざまな度合のハイブリダイゼーションストリンジェンシーを用いることができ、ハ
イブリダイゼーション又は洗浄培地のいずれかがストリンジェントであり得るということ
は明らかだろう。ハイブリダイゼーションのための条件がストリンジェントになるにつれ
て、二重鎖形成が生じるための、プローブと標的の間に必要な相補性の程度は大きくなる
。ストリンジェンシーの程度は、温度、イオン強度、ｐＨ、及びホルムアミドなどの部分
的変性溶媒の存在のうちの、１つ以上によって制御することができる。例えば、ハイブリ
ダイゼーションのストリンジェンシーは、例えば０％〜５０％の範囲内のホルムアミド濃
度の操作を通して反応溶液の極性を変えることにより都合良く変更される。検出可能な結
合のために必要な相補性（配列同一性）の程度は、ハイブリダイゼーション媒質及び／又
は洗浄媒質のストリンジェンシーに応じて変化する。相補の程度は、最適には１００％、
又は７０〜１００％、又はその中の任意の範囲若しくは値である。しかしながら、プロー
ブ及びプライマー内のわずかな配列変動は、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄培地
のストリンジェンシーを低減させることで補償できるということを理解すべきである。

本本発明の一態様において、ポリヌクレオチドは、１つ以上特定の残基の得られたポリ
ペプチドを多様化する、又は配列内の特定の位置に残基を加えるために、ランダム化コド
ンを導入する技術を用いて構築される。ランダム法、反合理的な方法、及び合理的な方法
などの様々な戦略を用いて、変化したポリペプチド配列のライブラリーを作製することが
できる。合理的及び半合理的な方法は、コード配列に導入された変化の影響をより正確に
制御するという点で、ランダム戦略に勝る利点を有する。加えて、遺伝子の特定領域の変
異に集中することにより、考えられるあらゆる全てのアミノ酸変異型を、選択した位置で
調査することができる。

共通のＮＮＫ又はＮＮＳ多様化スキームで構築されたライブラリーは、全ての位置及び
アミノ酸２０個全てにおいて３２の異なるコドンを導入する。かかるライブラリーは、理
論上は、残基の数ｎ毎に３２ｎ増加する。しかしながら、実質的に、ファージディスプレ
イは、１０⁹〜１０¹⁰の変異型のサンプリングライブラリーに制限され、そのライブラリ
ーに完全な配列を収録しようとする場合、これは、６〜７個の残基のみを標的にできるこ
とを意味する。したがって、多様化されるべき主要な位置を特定し、それに沿って多様化
計画を選択することによって、スカフォールド変異型のライブラリーを作製する半合理的
な又は「集中的な」方法を適用することができる。「コドンセット」は、所望される変異
アミノ酸をコードするために使用される様々なヌクレオチドトリプレット配列の１つのセ
ットを指す。コドン表示の標準的な形態はＩＵＢコードのコドン表示であり、これは当該
分野で公知であり、本明細書中に記載される。「無作為ではないコドンセット」は、選択
されたアミノ酸をコードするコドンセットを指す。特定の位置に選択されたヌクレオチド
「縮重」を有するオリゴヌクレオチドの合成は当該分野で周知であり、例えば、ＴＲＩＭ
手法が知られている（Ｋｎａｐｐｅｋｅｔａｌ．；Ｊ．Ｍｏｌ．（１９９９），２９
６：５７〜８６）；Ｇａｒｒａｒｄ＆Ｈｅｎｎｅｒ，Ｇｅｎｅ（１９９３），１２８
：１０３）。特定のコドンセットを有しているヌクレオチドのそのようなセットは、市販
されているヌクレオチド又はヌクレオシド試薬、及び装置を使用して合成することができ
る。

コドンセットは、所望の変異アミノ酸をコードするのに使用する様々なヌクレオチドト
リプレット配列のセットである。コドンセットは、ＩＵＢコードに従って以下に示される
ような、特定のヌクレオチド又はヌクレオチドの等モル混合物を表す記号を使用して表わ
されることができる。

ＩＵＢコード
Ｇ：グアニン
Ａ：アデニン
Ｔ：チミン
Ｃ：シトシン
Ｒ（Ａ又はＧ）
Ｙ（Ｃ又はＴ）
Ｍ（Ａ又はＣ）
Ｋ（Ｇ又はＴ）
Ｓ（Ｃ又はＧ）
Ｗ（Ａ又はＴ）
Ｈ（Ａ又はＣ又はＴ）
Ｂ（Ｃ又はＧ又はＴ）
Ｖ（Ａ又はＣ又はＧ）
Ｄ（Ａ又はＧ又はＴ）
Ｎ（Ａ又はＣ又はＧ又はＴ）

例えば、コドンセットＤＶＫにおいて、ＤはヌクレオチドＡ又はＧ又はＴであり得、Ｖ
はＡ又はＣ又はＧであり得、ＫはＧ又はＴであり得る。このコドンセットは、１８の異な
るコドンを表し、アミノ酸Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、
Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、及びＣｙｓをコードすることができる。

集中された（例えば、無作為ではない）ライブラリーは、ＮＮＫコドンを使用し、かつ
選択された残基の変異（varigation）に集中することによって作成されることができ、あ
るいは、無作為ではない置換を有する変異型は、例えば、１１個のアミノ酸（ＡＣＤＥＧ
ＫＮＲＳＹＷ）をコードするＤＶＫコドン及び１つの終止コドンを使用して作成されるこ
とができる。あるいは、クンケル型変異誘発を用いて、ポリペプチドの所望の残基又は領
域を多様化することができる（Ｋｕｎｋｅｌｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙ
ｍｏｌ．１５４：３６７〜３８２，１９８７）。

標準のクローニング法を用いて、ライブラリーをベクターにクローニングして発現させ
る。ライブラリーは、既知のシステムを用いて発現させることができ、例えば、融合タン
パク質としてそのライブラリーを発現することができる。融合タンパク質は、任意の好適
なファージの表面にディスプレイすることができる。バクテリオファージの表面上に抗体
断片を含む融合ポリペプチドをディスプレイする方法は周知である（米国特許第６，９６
９，１０８号（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ）、米国特許第６，１７２，１９７号（ＭｃＣａｆｆｅ
ｒｔｙ）、米国特許第５，２２３，４０９号（Ｌａｄｎｅｒ）、米国特許第６，５８２，
９１５号（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ）、米国特許第６４７２１４７号（Ｊａｎｄａ））。新規
ポリペプチドの単離のためのライブラリーは、ｐＩＸ上にディスプレイされ得る（ＷＯ２
００９０８５４６２Ａ１）。該ライブラリーは、例えば、リボソームディスプレイ（Ｈａ
ｎｅｓａｎｄＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉｅ．ＵＳＡ，９４：４９３７，１９９７）、ｍＲＮＡディスプレイ（Ｒｏｂ
ｅｒｔｓａｎｄＳｚｏｓｔａｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
９４：１２２９７，１９９７）、ＣＩＳディスプレイ（Ｏｄｅｇｒｉｐｅｔ．ａｌ．，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１：２８０６，２００４）、又は
他の無細胞系（ＵＳ５，６４３，７６８ｔｏＫａｗａｓａｋｉ）を用いてインビト
ロで翻訳することもできる。

多様化領域を有するライブラリーは、Ｔｅｎｃｏｎ配列（配列番号１６）をコードする
ポリヌクレオチド又はその所定の突然変異体を含むベクターを用いて作成され得る。鋳型
構築物は、プロモーターとポリペプチド鎖のシグナル配列とを有し得る。スカフォールド
ライブラリーを作製するために、スカフォールドのループ領域（Ａ：Ｂ、Ｂ：Ｃ、Ｃ：Ｄ
、Ｄ：Ｅ、Ｅ：Ｆ、及びＦ：Ｇ）をコードしたオリゴヌクレオチドを用いた突然変異誘発
反応を用いる。全ての選択された位置のランダム化スキームへの導入を確実にするために
、多様化されることが意図されるのが望ましい各領域に、終止コドン（例えばＴＡＡ）を
組み込むことができる。終止コドンが置換されたクローンのみが生じる。

修飾されたスカフォールドポリペプチド
本発明の修飾されたタンパク質スカフォールド及び断片は、直接的又は間接的に別のタ
ンパク質に共有結合される１つ以上の部分を含むことができる。

ペプチド残基を付加する、又はインラインで融合タンパク質を作成する場合、かかる残
基の付加は、本明細書に記載のようなポリヌクレオチド配列の組み換え技術によって行わ
れてもよい。付加、結合又は共役ペプチド、タンパク質、有機化学薬品、無機化学薬品、
若しくは原子、又はそれらの任意の組み合わせの場合、本発明のタンパク質のスカフォー
ルド又は断片に結合する付加部分は、典型的には、ペプチド結合以外のものによる。修飾
された本発明のタンパク質スカフォールドは、タンパク質のスカフォールド又は断片を改
変剤と反応させることにより製造することができる。例えば、有機部分は、アミン反応性
改変剤、例えば、ＰＥＧのＮＨＳエステルを利用することによって、非部位特異的方式で
タンパク質スカフォールドに結合させることができる。本発明のタンパク質スカフォール
ドの特定の部位に結合された有機部分を含む修飾されたタンパク質スカフォールド及び断
片は、逆タンパク質分解などの好適な方法を用いて調製され得る（Ｆｉｓｃｈｅｔａ
ｌ．，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．，３：１４７〜１５３（１９９２）；Ｗｅ
ｒｌｅｎｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．，５：４１１〜４１７
（１９９４）；Ｋｕｍａｒａｎｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ．６（１０）：
２２３３〜２２４１（１９９７）；Ｉｔｏｈｅｔａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．
，２４（１）：５９〜６８（１９９６）；Ｃａｐｅｌｌａｓｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，５６（４）：４５６〜４６３（１９９７）），ａｎｄｔ
ｈｅｍｅｔｈｏｄｓｄｅｓｃｒｉｂｅｄｉｎＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂ
ｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ：Ｓａ
ｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９６）。

スカフォールドタンパク質にポリマー又は鎖が結合される場合、ポリマー又は鎖は、独
立して、親水性ポリマー基、脂肪酸基、又は脂肪酸エステル基であり得る。本明細書で使
用されるところの「脂肪酸」という用語は、モノカルボン酸及びジカルボン酸を包含する
。本明細書で使用されるところの「親水性ポリマー基」という用語は、オクタンよりも水
への可溶性の高い有機ポリマーを意味する。例えばポリリシンは、オクタンに対するより
も水に対する溶解度が高い。そのため、ポリリシンを共有結合することによって修飾され
たタンパク質スカフォールドは、本発明に含まれる。本発明のタンパク質スカフォールド
を修飾するのに適した親水性ポリマーは、直鎖又は分枝であることができ、例えば、ポリ
アルカングリコール（例えば、ＰＥＧ、モノメトキシ−ポリエチレングリコール（ｍＰＥ
Ｇ）、ＰＰＧ等）、炭水化物（例えば、デキストラン、セルロース、オリゴ糖、多糖類等
）、親水性アミノ酸のポリマー（例えば、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリアスパルテ
ート等）、ポリアルカンオキシド（例えば、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキ
シド等）及びポリビニルピロリドンを挙げることができる。好ましくは、本発明のタンパ
ク質スカフォールドを修飾する親水性ポリマーは、個別の化合物として、約８００〜約１
５０，０００ダルトンの分子量を有する。例えば、ＰＥＧ₅₀₀₀及びＰＥＧ_20,000を使用す
ることができ、下付き文字は、ポリマーの平均分子量（ダルトン）である。親水性ポリマ
ー基は、１〜約６アルキル、脂肪酸、又は脂肪酸エステル基と置換され得る。脂肪酸又は
脂肪酸エステル基と置換される親水性ポリマーは、適切な方法を採用することによって調
製することができる。例えば、アミン基を含むポリマーを、脂肪酸又は脂肪酸エステルの
カルボン酸塩にカップリングさせることができ、脂肪酸又は脂肪酸エステル上の活性化カ
ルボン酸塩（例えばＮ、Ｎ−カルボニルジイミダゾールで活性化されている）をポリマー
上のヒドロキシル基にカップリングさせることができる。

本発明のタンパク質スカフォールドを修飾するのに好適な脂肪酸及び脂肪酸エステルは
飽和状態であってよく、又は１つ以上の不飽和単位を含有してよい。本発明のタンパク質
スカフォールドを修飾するために好適な脂肪酸としては、例えば、ｎ−ドデカン酸（Ｃ₁₂
、ラウリン酸）、ｎ−テトラデカン酸（Ｃ₁₄、ミリスチン酸）、ｎ−オクタデカン酸（Ｃ
₁₈、ステアリン酸）、ｎ−エイコサン酸（Ｃ₂₀、アラキジン酸）、ｎ−ドコサン酸（Ｃ₂₂
、ベヘン酸）、ｎ−トリアコンタン酸（Ｃ₃₀）、ｎ−テトラコンタン酸（Ｃ₄₀）、シス−
Δ９−オクタデカン酸（Ｃ₁₈、オレイン酸）、全てのシス−Δ５，８，１１，１４−エイ
コサテトラエン酸（Ｃ₂₀、アラキドン酸）、オクタンジオン酸、テトラデカンジオン酸、
オクタデカンジオン酸、ドコサンジオン酸などが挙げられる。適切な脂肪酸エステルは、
直線状又は分岐状の低級アルキル基を含む、ジカルボキシル酸のモノエステルを含む。低
級アルキル基は、１〜約１２個、好ましくは１〜約６個の炭素原子を含んでよい。

Ｆｃ含有タンパク質は、いくつかの周知のインビトロアッセイによって、機能性を比較
され得る。具体的には、Ｆｃγ受容体のＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩ
ファミリーのメンバー対する親和性が対象となる。これらの測定値は、受容体の組み換え
可溶型又は受容体の細胞結合型を使用して形成することができる。更に、ＦｃＲｎに対す
る親和性、ＩｇＧの延長された循環半減期に応答可能な受容体は、組み換え可溶型ＦｃＲ
ｎを使用して、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅによって測定することができる。ＡＤＣＣアッセ
イ及びＣＤＣアッセイ等の細胞ベースの機能性アッセイは、特定の変異型構造の可能な機
能性の結果に関する見識を提供する。一実施形態において、ＡＤＣＣアッセイは、主要な
エフェクター細胞であるＮＫ細胞を有するように構成され、それによって、ＦｃγＲＩＩ
ＩＡ受容体上で機能的効果を反映させる。過酸化又は炎症媒介放出等の細胞応答を測定で
きるように、食作用アッセイを使用して、異なる変異型の免疫エフェクター機能を比較す
ることもできる。インビボモデルも同様に、例えば、抗ＣＤ３抗体の変異型を使用して、
マウスにおけるＴ細胞活性を測定する場合に使用することができ、活性は、Ｆｃγ受容体
等の特定リガンドを係合するＦｃドメインに依存する。

宿主細胞選択又は宿主細胞工学
本明細書に記載されるように、スカフォールドベースタンパク質の発現に対して選択さ
れる宿主細胞は、最終組成物に対する重要な寄与因子であり、存在する場合に、例えば免
疫グロブリンＣＨ２ドメインにおいてタンパク質を修飾するオリゴ糖部分の組成物におけ
る変異を含むが、これに限定されない。したがって、本発明の１つの態様は、所望の治療
用タンパク質を発現する産生細胞の使用及び／又は開発のために適切な、宿主細胞の選択
を含む。

更に、宿主細胞は、哺乳類起源であってもよく、又はＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ
２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、ＨｅｐＧ２，６５３、ＳＰ２／０、２９３
、ＨｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫若しくは植物細胞、又はそれらの任意の誘導
体、不死化細胞、若しくは形質転換細胞から選択され得る。

あるいは、別の方法としては、宿主細胞は、ポリペプチドのグリコシル化が不可能であ
る種又は有機体、例えば、原核細胞又は有機体、及び天然又は工学的大腸菌ｓｐｐ、クレ
ブシェラｓｐｐ、又はシュードモナスｓｐｐから選択されてもよい。

結合ドメインの選択
ポリペプチド又は融合タンパク質あるいはその成分及びドメインは、そのようなドメイ
ン又は成分のライブラリー、例えば、ファージライブラリーから選択することにより得ら
れてもよい。ファージライブラリーは、免疫化された動物又はヒトのＢ細胞から抗体ドメ
インのような、ランダムオリゴヌクレオチドのライブラリー又は目的の配列を含有するポ
リヌクレオチドのライブラリーを挿入することによって、作成され得る（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ
．Ｐ．１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８：１３１５〜１３１７）。抗体ファージライブ
ラリーは、１つのファージに重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）可変領域対を含有し、単鎖Ｆｖ断
片又はＦａｂ断片の発現を可能にする（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，ｅｔａｌ．２０００，
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ２１（８）３７１〜８）。ファージミドライブラリーの多
様性は、後に追加の、望ましい分子特性及びそれらをコードするポリヌクレオチドを生成
しその後同定するために、ライブラリーのポリペプチドの特異性を増大及び／又は変更す
るように操作することができる。

抗体可変領域以外を含み得る標的結合成分の他のライブラリーは、リボソームディスプ
レイ、ＣＩＳディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイ、及び哺乳類細胞ディ
スプレイである。リボソームディスプレイは、タンパク質のＲＮＡとの付着を保ちつつ、
ｍＲＮＡをそれらの同属タンパク質へと翻訳する方法である。核酸コード配列は、ＲＴ−
ＰＣＲによって回復される（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ，Ｌ．Ｃ．ｅｔａｌ．１９９４．Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１，９０２２）。ＣＩＳディスプレイは、ライブ
ラリーがＲｅｐＡを有する融合タンパク質として構築される代替インビボデイスプレイ法
である。インビトロ翻訳の間、ＲｅｐＡは、ＲｅｐＡが作られたＤＮＡにシスで結合し、
遺伝子型と表現型との間の直接結合を提供する（Ｏｄｅｇｒｉｐｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１：２８０６，２００４）。酵母ディス
プレイは、膜結合αアグルチニン酵母接着受容体の融合タンパク質の構築物ａｇａ１及び
ａｇａ２に基づき、接合型システムの一部である（Ｂｒｏｄｅｒ，ｅｔａｌ．１９９７
．ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：５５３〜７）。細菌ディスプレイ
は、細胞膜又は細胞壁に関係している、標的と排出された細菌タンパク質との融合に基づ
く（ＣｈｅｎａｎｄＧｅｏｒｇｉｏｕ２００２．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅ
ｎｇ，７９：４９６〜５０３）。同様に、哺乳類ディスプレイ系は、ランダム化された配
列を含むポリペプチドと分泌された膜アンカータンパク質との間の融合タンパク質の形成
に基づく。

スカフォールドベースの分子の用途
本明細書に記載され、上述の方法のいずれかで作成されるスカフォールドベースの分子
の組成物は、ヒトの疾病の症状、又は細胞、組織、臓器、体液、若しくは一般には宿主の
特定の病変を、診断し、監視し、調節し、治療し、緩和し、発生の防止を助け、又は軽減
するために使用され得る。特定の目的のために改変されたスカフォールドベースの分子を
使用して、免疫介在疾患又は免疫不全症、代謝性疾患、心臓血管傷害又は疾患；悪性疾患
；神経障害又は疾患；細菌感染症、ウイルス感染症又は寄生虫感染症などの感染症；ある
いは、腫脹、疼痛、及び組織壊死又は線維症などのその他の既知又は特定の関連疾患、を
治療することができる。

このような方法は、このような症状の調節、治療、軽減、予防、若しくは低減する効果
、又は機序を必要としている細胞、組織、器官、動物又は患者に、少なくとも１つのスカ
フォールドタンパク質を含む組成物又は医薬組成物を有効量投与することを含み得る。有
効量は、本明細書に記載のように、又は関連分野で既知のように、既知の方法を用いて行
い決定するとき、単回（例えば、ボーラス）、複数回、若しくは持続投与あたり約０．０
０１〜５００ｍｇ／ｋｇの量、又は単回、複数回、若しくは持続投与あたり０．０１〜５
０００μｇ／ｍＬの血清濃度を達成する量、あるいはこの中の任意の有効範囲若しくは値
を含んでよい。

スカフォールドベースタンパク質を含む組成物
修飾されている又は修飾されていない、一価、二価、又は多価の、単一標的、重標的、
多標的である標的結合スカフォールドタンパク質は、捕捉、固定化、分割、又は沈殿のた
めの当該技術分野において周知の分離法を用いて単離され、商業的応用に必要な程度まで
精製され得る。

治療上の使用目的で、スカフォールドベースのタンパク質は、非経口、皮下、筋肉内、
静脈内、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結
腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内
、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、膀胱内、病巣内
、ボーラス、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮手段などであるが、これらに
限定されない適切な投与方法に基づいて調製され得る。少なくとも１種のタンパク質スカ
フォールド組成物は、錠剤又はカプセル；粉末、点鼻薬又はエアゾール；ジェル、軟膏、
ローション、懸濁液の形態で使用すために調製されることができ、あるいは、当該技術分
野において既知のような治療用包帯又は「貼付剤」送達システムに組み込まれることがで
きる。本発明は、スカフォールドベースのタンパク質の安定な製剤を提供するものであっ
て、好ましくは、水性リン酸緩衝生理食塩水又は混合塩水だけでなく、保存加工された溶
液及び製剤、並びに、医薬的用途又は家畜への使用に適した多目的の保存加工された製剤
であり、製薬上許容できる製剤には少なくとも１つの少なくとも１つのスカフォールドベ
ースのタンパク質が含まれている。好適な媒体及びその製剤（ヒトタンパク質、例えば、
ヒト血清アルブミンを含む）は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅ
ａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，２１^st Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒ
ｏｙ，Ｄ．Ｂ．ｅｄ．，ＬｉｐｉｎｃｏｔｔＷｉｌｌｉａｍｓａｎｄＷｉｌｋｉｎ
ｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ２００６，Ｐａｒｔ５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ
ｉｃａｌＭａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇｐｐ６９１〜１０９２，Ｓｅｅｅｓｐｅｃ
ｉａｌｌｙｐｐ．９５８〜９８９に記載されている。

該組成物は、単一製剤、又は示された疾患、症状、若しくは疾病の治療に有効であるこ
とが知られているその他の活性物質と共に使用されてもよく、又は組み込まれてもよく、
あるいは、スカフォールドベースタンパク質と新規組成物及び活性物質との組み合わせを
調製することによって試験されてもよい。

本発明は一般論として記述されてきているが、本発明の実施形態は、特許請求の範囲を
限定するように解釈されるべきではない以下の実施例で更に開示される。

実施例１．Ｆｃグリコシル化変異型の構成
Ｔｅｎｃｏｎの設計
ヒトテネイシンの第３ＦＮ３ドメイン（配列番号３）を、抗体の相補性決定領域（Ｃ
ＤＲ）に構造的に類似する表面露出ループを介して特定の標的分子に結合するよう改変す
ることができる代替スカフォールドとして使用することができる。天然型のこのドメイン
の融解温度はＰＢＳ中で５４℃である。類似構造及び改善された物理学的特性、例えば改
善された熱安定性を有するスカフォールド分子を製造するため、ヒトテネイシンの１５の
ＦＮ３ドメイン（配列番号１〜１５）の配列比較に基づいて共通配列を設計した。

表１に示す重複配列比較解析により、これら１５のドメインが１３〜８０％の範囲で互
いに配列同一性を有しており、対間の平均配列同一性が２９％であることが示される。共
通配列（配列番号１６）を、表１に示される配列のそれぞれの位置における最も保存され
た（高頻度の）アミノ酸を組み入れることにより設計した。対で配列比較すると、Ｔｅｎ
ｃｏｎと表わされた本発明の共通配列（配列番号１６）は、テネイシンのＦＮ３ドメイン
に対して３４〜５９％の位置で同一であり、平均配列同一性は４３％である。

タンパク質の発現及び精製
Ｔｅｎｃｏｎのアミノ酸配列（配列番号１６）を逆翻訳すると、配列番号１７に示すＤ
ＮＡ配列が得られた。この配列をオーバーラッピングＰＣＲにより構築し、修飾されたｐ
ＥＴ１５ベクターにサブクローンし、ＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）大腸菌（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ）に形質転換し、７５μｇ／ｍＬカルベニシリン含有ＬＢ寒天平板上で培養した
。コロニーを１つ取り、３７℃で、２％グルコース及び１００μｇ／ｍＬカルベニシリン
を含有するＴＢ培地５０ｍＬ中で一晩培養した。この培養液を用いて、２．５Ｌ容のＵｌ
ｔｒａＹｉｅｌｄフラスコ（ＴｈｏｍｓｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔＣｏｍｐａｎｙ
）中の自己誘導培地（ＯｖｅｒｎｉｇｈｔＥｘｐｒｅｓｓＩｎｓｔａｎｔＴＢｍ
ｅｄｉａ，Ｎｏｖａｇｅｎ）５００ｍＬに播種した。増殖及び発現は、ＡＴＲＭｕｌｔ
ｉｔｒｏｎ振盪培養機の二重プログラム（３７℃、３００ｒｐｍで３時間、続いて３０℃
、２５０ｒｐｍで１６時間）を用いて行った。

培養液を回収し、ＪＬ８．１ローターで７０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、細胞を
沈殿させた。細胞を、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのＮａＣ
ｌ、１０％グリセロール、２０ｍＭのイミダゾール、０．３７ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、
１ＸＣｏｍｐｌｅｔｅＰｒｏｔｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＥＤＴＡ−フリー、
Ｒｏｃｈｅ）、及びＢｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、０．２５μＬ／
ｍＬ最終濃度）を含有する緩衝剤３０ｍＬに再懸濁し、ＭｉｓｏｎｉｘＸＬ２０２０超
音波処理器を用いて、氷上で５分間、パルスモード（５秒オン、３０秒オフ）で溶解させ
た。ＪＡ−１７ローターで、１７，０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離して、不溶性物質を
除去した。

Ｔｅｎｃｏｎタンパク質を、２段階クロマトグラフィー法で可溶性ライセートから精製
した。まず、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）２ｍＬをライセートに加え
、４℃で１時間にわたって振動台上に置いて、固定化金属アフィニティクロマトグラフィ
ーによりタンパク質を捕捉した。続いて、Ｐｏｌｙ−Ｐｒｅｐカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
に樹脂を充填し、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、５００ｍＭＮａＣｌ、
１０％グリセロール、及び２０ｍＭイミダゾールで洗浄して未結合の物質を除去した。２
０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、５００ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロール
、及び５００ｍＭイミダゾールで樹脂からタンパク質を溶出した。ＨＲＰ抱合抗Ｈｉｓ抗
体（ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＣｏｎｓｕｌｔａｎｔｓＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いた
クマシー染色及びウエスタンブロットの両方により、画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した
。所望の画分をプールし、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に透析した。精製の第２のステップと
して、ＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５ＨｉＬｏａｄ１６／６０カラム（
ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）にタンパク質をのせた。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し
、Ｔｅｎｃｏｎを含む画分をプールし、ＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐＵｌｔｒａＣｅｌＹＭ
−３濃縮機（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて濃縮した。

２８０ｎｍにおけるサンプルの吸光度を測定するＢｉｏＴｅｋプレートリーダーを用い
てタンパク質濃度を決定した。クマシー染色（図１）、抗Ｈｉｓ抗体を用いたウエスタン
ブロット、及びＰＢＳで平衡化したＧ３０００ＳＷ−ＸＬカラム（ＴＯＳＯＨＢｉｏｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたＨＰＬＣ−ＳＥＣにより、最終調製物を分析した。ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ分析では、Ｔｅｎｃｏｎが、単量体タンパク質についての予測質量である１０．７
ｋＤａに一致して、６ｋＤａと１４ｋＤａとの間に泳動することを示す。培養液１Ｌにつ
き収率＞５０ｍｇの精製Ｔｅｎｃｏｎタンパク質が得られた。

生物物理学的特徴
Ｔｅｎｃｏｎの構造及び安定性を、それぞれ円偏光二色性分光法及び示差走査熱量測定
法によって特徴づけた。ＰＢＳ中濃度０．２ｍｇ／ｍＬで、２０℃において、ＡＶＩＶ分
光計でＣＤ測定を実施した。図８のスペクトルは２１８ｎｍで最小を示し、設計したとお
り、ＦＮ３ファミリーに属するタンパク質に予測されるβシート構造が示唆される。溶液
のテネイシン第３ＦＮ３ドメイン又はＴｅｎｃｏｎのＰＢＳ溶液０．５ｍｇ／ｍＬを、
Ｎ−ＤＳＣＩＩ熱量計（ＡｐｐｌｉｅｄＴｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ）において、３
５℃から９５℃まで、１℃／分の速度で加熱することによりＤＳＣデータを得た。最初に
、緩衝剤のみの曲線を差し引き、図３に示す特性を得た。このデータから、第３ＦＮ３
ドメイン及びＴｅｎｃｏｎそれぞれについて、ＣｐＣａｌｃ（ＡｐｐｌｉｅｄＴｈｅｒ
ｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ）ソフトウェアを用い、５４℃及び７８℃の融解温度が計算された
。両ドメインの折り畳み及び変性は、これらの温度で可逆的である。

免疫原性解析
ヒトに対するアミノ酸配列の免疫原性をモデリングするコンピュータプログラムを用い
、ヒトテネイシンの第３ＦＮ３ドメイン、Ｔｅｎｃｏｎ、及び種々の治療用抗体（表２
に示す）を表すアミノ酸配列の予測される免疫原性を比較した。このプログラムで解析し
たキメラｍＡｂ及びヒトｍＡｂ（アダリムマブ）に、続いて寛容限界を適用した（ヒト生
殖細胞系にコードされた配列に１００％同一である９マーのペプチドを除去する）。寛容
限界は、テネイシン又はＴｅｎｃｏｎに適用しなかった。寛容限界は、ヒト生殖細胞系に
コードされたｍＡｂ配列に対する幅広いＴ細胞寛容を仮定し、主にＣＤＲ及び隣接ドメイ
ンにおける新規配列に関する解析に焦点を当てる。

解析した配列に由来する９マーペプチドが１つ以上のＨＬＡ分子に結合する可能性に基
づき、これらの解析では、テネイシン及びＴｅｎｃｏｎの両者において免疫原性リスクが
低いことを予測する。スコアは、それぞれのＨＬＡ対立遺伝子の保有率に関して重みづけ
される。モデルに対するスコアをそれぞれの配列について合計し、それぞれの配列の総合
ＰＩＲ（スコア合計）を示す１つの数字を提供する。この解析結果を表２にまとめる。テ
ネイシンが、一番低い総合スコア（１１．９）を有することが示された。テネイシン同様
に、Ｔｅｎｃｏｎは、本質的に非バインダーで、予測免疫原性リスクが低いアグレトープ
であるとスコア化された（スコア＝１３．２）。テネイシン及びＴｅｎｃｏｎの配列は、
治療用抗体と比較して有利であるとスコア化された。

ｐＩＸ融合によるＭ１３ファージにおけるＴｅｎｃｏｎのディスプレイ
Ｔｅｎｃｏｎのアミノ酸配列をコードする遺伝子を、ＰＣＲ及び制限消化クローニング
によりファージミド発現ベクターｐＰｅｐ９にサブクローニングし、ベクターｐＴｅｎｃ
ｏｎ−ｐＩＸを得た。この系は、Ｃ末端がＭ１３ｐＩＸタンパク質のＮ末端に融合する
Ｎ末端Ｍｙｃ−タグ化Ｔｅｎｃｏｎを発現する（図４）。Ｌａｃプロモーターにより、Ｉ
ＰＴＧがない状態で発現レベルが低く、ＩＰＴＧの添加後に発現を増加することができる
。ＯｍｐＡシグナル配列をＴｅｎｃｏｎのＮ末端に追加し、周辺質への効率的な移動を促
進した。短いＴＳＧＧＧＧＳリンカー（配列番号１４１）をＴｅｎｃｏｎとｐＩＸとの間
に構築し、これらのタンパク質間における立体相互作用を防止した。

Ｍ１３ファージ粒子表面上のディスプレイの確認には、ｐＴｅｎｃｏｎ−ｐＩＸでＸＬ
１−Ｂｌｕｅ大腸菌を形質転換し、コロニー１つを用い、アンピシリンが追加されたＬＢ
培地５ｍＬに接種した。この培養液を対数期の中間部に達するまで３７℃で増殖し、この
時点で６¹⁰ｐｆｕのＶＣＳＭ１３ヘルパーファージを加え、この培養液を３７℃で１０分
間、振盪せずにインキュベートし、続いて振盪しながら５０分間培養した。続いてヘルパ
ーファージで救出した培養液をアンピシリン及びカナマイシンを追加した２ＹＴ培地５０
ｍＬで希釈し、Ｏ．Ｄ．₆₀₀が０．７に達するまで振盪しながら３７℃で増殖させ、この
時点でＩＰＴＧを添加して最終濃度１ｍＭとし、温度を３０℃に下げた。１６時間後、４
０００×ｇで２０分間培養液を遠心分離し、上清を回収し、分析用に４℃で保管した。

ファージ粒子の抗Ｍｙｃ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）への結合を利用して、Ｍ１３フ
ァージ表面のＭｙｃ−Ｔｅｎｃｏｎ構築物のディスプレイを確認した。Ｍａｘｉｓｏｒｐ
プレートを２．５μｇ／ｍＬの濃度の抗−Ｍｙｃ又は抗αｖ抗体（陰性対照）で一晩コー
ティングし、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋＴ２０（Ｐｉｅｒｃｅ）でブロッキングした。上述
のファージミド培養液の上清を、ＰＢＳで２倍ずつ連続希釈し、コーティングしたプレー
トのウェルに加えた。１時間後、プレートをＴＢＳＴで洗浄し、抗−Ｍ１３ＨＲＰ抗体
をそれぞれのウェルに添加し、１時間のインキュベーション後ＴＢＳＴで洗浄した。Ｒｏ
ｃｈｅＢＤＥＬＩＳＡＰＯＤ基質を加え、プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）で発光
を検出した。図５は、Ｍｙｃ−Ｔｅｎｃｏｎファージ粒子が、プレートの抗αｖ抗体でコ
ーティングしたウェル又は未コーティング対照ウェルには結合しないが、抗−Ｍｙｃに濃
度依存的に結合し、Ｍ１３ファージ粒子上のＭｙｃ−Ｔｅｎｃｏｎの特異的ディスプレイ
が確認されることを示している。

更なるファージミドベクターを構築し、コーティングタンパク質ｐＩＩＩとの融合とし
て、Ｍ１３ファージ上にＴｅｎｃｏｎ及びライブラリーメンバー（実施例２参照）をディ
スプレイすることができる。この系において、ｐＩＸ遺伝子は、切断型ｐＩＩＩをコード
する遺伝子と置換される（Ｂａｓｓｅｔａｌ．１９９０）。図４に示す系と比較して
更なる変化としては、ＯｍｐＡシグナル配列のＤｓｂＡシグナル配列との置換が挙げられ
るが、これはこの配列を用いる分泌が、安定な代替スカフォールド分子のディスプレイに
有用であることが示されているからである（Ｓｔｅｉｎｅｒｅｔａｌ．，２００６）
。

実施例２：Ｔｅｎｃｏｎライブラリーの作成
Ｔｅｎｃｏｎ変異体ライブラリーを所望の複雑度、及び分子内における変異体の相対位
置に応じて、様々な方法で作成することができる。Ｔｅｎｃｏｎ遺伝子全体に点在する変
異体を作るには、ＤＮＡ合成法が好ましい。遺伝子の異なる領域に変異を含有するＤＮＡ
断片を組み換えるための、制限酵素クローニングも用いることができる。単一のＴｅｎｃ
ｏｎループなど、小さく定められた領域における飽和突然変異誘発は、縮重オリゴヌクレ
オチド及びオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発を用いて導入することができる（Ｋｕｎ
ｋｅｌｅｔａｌ．，１９８７）。

オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発を用いてＦＧループを７つのランダムアミノ酸で
置換するよう設計された、Ｔｅｎｃｏｎライブラリー（ライブラリーＦＧ７）を構築した
。ＦＧループをコードする位置にＮＮＳである２１塩基対（ｂｐ）の縮重配列、及び隣接
する２か所に２０〜２７ｂｐのＴｅｎｃｏｎコード配列に相補的なヌクレオチド配列をも
つように、オリゴヌクレオチド（ＴｃｏｎＦＧ７−Ｆｏｒ−５’ｐｈｏ）を合成した。こ
の設計では、２０種全てのアミノ酸をＦＧループに提示できる。ヌクレオチドレベルにお
ける計算された多様度は１．３×１０⁹である。

ＴｃｏｎＦＧ７−Ｆｏｒ５’ｐｈｏ：（配列番号１８）
ＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳ
ＮＮＳＮＮＳＮＮＳＣＣＧＣＴＧＴＣＴＧＣＧＧＡＡＴＴＣＡＣ

オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発の鋳型である、ｐＤｓｂＡ−Ｔｅｎｃｏｎ−Ａｓ
ｃ−ｌｏｏｐ−Ｍｙｃ−ｐＩＩＩを、ＴｅｎｃｏｎのＦ：Ｇループをコードする配列を、
ＡｓｃＩ制限部位を含むステムループ配列で置換することにより構築した。この系では、
生じたＤＮＡを形質転換前にＡｓｃＩで消化することにより、突然変異誘発後の鋳型ＤＮ
Ａのバックグラウンドを排除することができる。突然変異誘発において１本鎖ＤＮＡ鋳型
を精製するため、ｐＤｓｂＡ−Ｔｅｎｃｏｎ−Ａｓｃ−ｌｏｏｐ−Ｍｙｃ−ｐＩＩＩをも
つ大腸菌ＣＪ２３６のコロニーを１つ、カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ最終濃度）及び
クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）を含む２ＹＴ増殖培地５ｍＬに取った。６時間
後、ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージを最終濃度１０¹⁰ｐｆｕ／ｍＬになるよう加え、振盪
せずに１０分間インキュベートし、カルベニシリン（１０μｇ／ｍＬ）及びウリジン（０
．２５μｇ／ｍＬ）を含む２ＹＴ１５０ｍＬに移して２００ｒｐｍで振盪しながら３７
℃で一晩インキュベートした。細胞を遠心分離で沈殿させ、上清を回収し、ファージをＰ
ＥＧＮａＣｌで沈殿させた。ＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭ１３キット（Ｑｉａｇｅｎ
）をメーカーの使用説明書にしたがって用い、この沈殿物から１本鎖ＤＮＡを精製した。

縮重オリゴヌクレオチドを鋳型にアニーリングするため、５μｇの鋳型ＤＮＡを、Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）及びＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）中でオリゴＴｃｏｎ
ＦＧ７−Ｆｏｒ−５−ｐｈｏとモル比１０：１で混合し、９０℃で２分間、６０℃で３分
間、及び２０℃で５分間インキュベートした。アニーリング反応後、ＡＴＰ（１０ｍＭ）
、ｄＮＴＰ（それぞれの２５ｍＭ）、ＤＴＴ（１００ｍＭ）、Ｔ４リガーゼ（７単位）、
及びＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（１０単位）を反応混合液に加え、１４℃で６時間、その
後２０℃で１２時間インキュベートした。生じたＤＮＡをＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅ
ｎ）を用いて精製し、１００μＬの水に回収した。ライブラリーＤＮＡを１０単位のＡｓ
ｃＩで４時間消化し、続いてＱｉａｇｅｎのＰＣＲ精製キットを用いて再度精製した。最
終ライブラリーＤＮＡを５０μＬの水に回収した。次に、生じた２本鎖ＤＮＡ生成物を、
電気穿孔法により大腸菌ＭＣ１０６１Ｆ’に形質転換した。

形質転換体を２０ｍＬのＳＯＣ培地に採取し、３７℃で１時間回復させた。回復終了時
点で、形質転換液の一定分量を連続希釈し、１％グルコースを含有するカルベニシリン（
１００μｇ／ｍＬ）プレートで培養し、総形質転換体数を評価した。続いて残りのＳＯＣ
培養液を用い、カルベニシリン及び１％グルコースを含む２ｘＹＴ培地１Ｌに播種し、Ｏ
Ｄ₆₀₀が０．６に達するまで増殖させた。この培養液１００ｍＬにＭ１３ヘルパーファー
ジを１０¹⁰／ｍＬになるように播種し、３７℃でインキュベート後、遠心分離した。生じ
た細胞沈殿物をカルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）及びカナマイシン（３５μｇ／ｍＬ
）を含む新しい２ｘＹＴ培地５００ｍＬに再懸濁し、３０℃で一晩増殖後遠心分離した。
ファージ粒子をＰＥＧ／ＮａＣｌを添加して沈殿させ、−８０℃で保管した。

第２のライブラリー（ＢＣ６／ＦＧ７）を設計し、ＴｅｎｃｏｎのＢ：Ｃ及びＦ：Ｇル
ープ内に同時に多様性を導入した。これを行うため、２つのオリゴヌクレオチド、Ｔｃ−
ＢＣ６−Ｆｏｒ−５’ｐｈｏｓ及びＰＯＰ１４９を合成した。順方向オリゴはリン酸化さ
れ、Ｂ：Ｃループをコードするそれぞれの位置にＮＮＳコドン１８塩基を含み、一方、逆
方向オリゴは５’末端でビオチン化され、Ｆ：Ｇループをコードするそれぞれの位置にＮ
ＮＳコドン２１塩基を含んだ。両オリゴヌクレオチドとも、変異させられる領域に先行及
び後続する領域と同一である２つの１８ｂｐヌクレオチド配列で隣接させた（プライマー
の詳細は以下を参照）。

Ｔｃ−ＢＣ６−Ｆｏｒ−５’ｐｈｏｓ：（配列番号１９）
ｇａｃｔｃｔｃｔｇｃｇｔｃｔｇｔｃｔｔｇｇＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳ
ＴＴＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣ

ＰＯＰ２１４９：（配列番号２０）
ＧＴＧＡＡＴＴＣＣＧＣＡＧＡＣＡＧＣＧＧＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳ
ＮＮＡＡＣＡＣＣＧＴＡＧＡＴＡＧＡＡＡＣＧＧＴＧ

ライブラリーを構築するため、オリゴＴｃ−ＣＢ６−Ｆｏｒ５’ｐｈｏｓ及びＰＯＰ２
１４９を用いて１００μＬのＰＣＲ反応を１６回実施し、ＴｅｎｃｏｎＤＮＡ鋳型を増
幅し、このプロセスにおいて、Ｂ：Ｃ及びＦ：Ｇループに同時にＮＮＳコドンを導入した
。２本鎖ＰＣＲ生成物を、磁気ストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｌ）とＢ＆Ｗ緩衝剤
（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ、２ＭＮａＣｌ、０
．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）内で混合し、２０分間インキュベート後、磁石で落とし、Ｂ
＆Ｗ緩衝剤で２回洗浄した。順方向鎖を１５０ｍＭＮａＯＨ３００μＬでビーズから
溶出した。この「メガプライマー」（理論的多様性において８×１０¹⁶を超える長いプラ
イマーの混合物）を用い、１本鎖ライブラリー鋳型をアニーリングした。ライブラリー構
築は、ＦＧ７ライブラリーについて上述のとおりに実施した。

実施例３：ＩｇＧバインダーの選択
ＩｇＧに結合するＴｅｎｃｏｎライブラリーメンバーの選択を実施するため、組み換え
ＩｇＧ（ヒトＩｇＧ１サブタイプ）をスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）
を用いてビオチン化し、ＰＢＳ内に透析した。選択には、２００μＬのファージディスプ
レイライブラリーＦＧ７又はＢＣ６／ＦＧ７を２００μＬのケミブロッカーでブロッキン
グした後、５００ｎＭ（１回目）又は１００ｎＭ（２回目及び３回目）の濃度のビオチン
化ＩｇＧを添加した。結合したファージを、１回目はＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ磁気ビーズ
（Ｓｅｒａｄｙｎｅ）で、２回目及び３回目はストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ）で回収した。未結合のファージを、ｔｗｅｅｎ含有Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（Ｔ
ＢＳＴ）１ｍＬで５〜１０回洗浄し、続いてＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）１ｍＬで
２回洗浄し、ビーズから洗い流した。対数増殖期中期の大腸菌ＭＣ１０６１Ｆ’を添加す
ることにより、結合したファージをビーズから溶出させた。カルベニシリンとグルコース
とを添加したＬＢ寒天プレート上に感染細胞を蒔いた。翌日、細胞をプレートからかき取
り、対数期の中間部まで増殖させた後、ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージで回復させ、一晩
増殖した。ＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿で単離したファージ粒子を、次の選択回で用いた。

ＩｇＧに対して３回全体を調べた後、Ｔｅｎｃｏｎ遺伝子をＰＣＲで増幅することによ
り、その結果をリガーゼ非依存性クローニング部位を含むよう修飾されたｐＥＴ２７ベク
ターにサブクローンした。このＰＣＲ生成物をベクターにアニーリングし、ＢＬ２１−Ｇ
ＯＬＤ（ＤＥ３）細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。別々のコロニーを９６
深ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の１ｍＬの培養液内に取り、３７℃で一晩、飽和す
るまで増殖させた。翌日、一晩培養液５０μＬを用いて、新しい１ｍＬ培養液に播種した
。培養液を３７℃で２時間増殖させた後、ＩＰＴＧを１ｍＭになるよう加え、温度を３０
℃に低下させた。誘導１６時間後、細胞を遠心分離で回収し、１００μＬのＢｕｇＢｕｓ
ｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）で溶解した。生じたライセートを遠心分離によりきれいにし、
ＥＬＩＳＡによるＩｇＧへの結合試験に使用した。

Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）を０．１μｇの抗Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）
μｇで一晩コーティングし、ＴＢＳＴで洗浄し、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋＴ２０
（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でブロッキングした。澄明なライセートをＳｔ
ａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋで１：４に希釈し、プレートに加え、１時間結合させた後、Ｔ
ＢＳＴで洗浄した。ビオチン化ＩｇＧ又はビオチン化ＨＳＡを１μｇ／ｍＬの濃度で添加
し、１時間インキュベートした後、ＴＢＳＴで洗浄した。ストレプトアビジン−ＨＲＰ（
ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）の添加、及びＰＯＤ化学発光基質によ
る検出により、結合ＩｇＧ又はＨＳＡの検出を達成した。ＥＬＩＳＡの結果を図７に示す
。ＥＬＩＳＡシグナルで判断するとき、ビオチン化ＨＳＡよりもビオチン化ＩｇＧに１０
倍強く結合する構築物の配列を決定した。複数回の選択実験の完了後、ライブラリーＦＧ
７から６０個の固有の結合配列が、ライブラリーＢＣ６ＦＧ７から１０個の固有の配列が
得られ、表４では、Ｂ：Ｃ及び／又はＦ：Ｇループの配列番号１６と異なる程度が示され
る、ＩｇＧバインダーの代表的な配列を示す。また、表４では、スカフォールドの他の領
域における多くの変異も示す。

本明細書で設計され、発現され、及び精製されたＴｅｎｃｏｎタンパク質は、代替スカ
フォールド分子として用いられているヒトテネイシンの第３ＦＮ３ドメインに対して、
２６℃改善された熱安定性を有する。この安定性向上に基づき、本スカフォールド分子は
、アミノ酸置換により適しており、より製造が容易と考えられる。タンパク質の安定性を
低下させる変異は、より安定なスカフォールドという意味において、より寛容であると考
えられ、したがって向上した安定性を有するスカフォールドは、スカフォールド変異体ラ
イブラリーから、より機能的で、よく折り畳まれたバインダーをもたらすと考えられる。

配列：
配列番号１：
ｓｐｐｋｄｌｖｖｔｅｖｔｅｅｔｖｎｌａｗｄｎｅｍｒｖｔｅｙｌｖｖｙｔｐｔｈｅｇ
ｇｌｅｍｑｆｒｖｐｇｄｑｔｓｔｉｉｑｅｌｅｐｇｖｅｙｆｉｒｖｆａｉｌｅｎｋｋｓｉ
ｐｖｓａｒｖａｔ

配列番号２：
ｔｙｌｐａｐｅｇｌｋｆｋｓｉｋｅｔｓｖｅｖｅｗｄｐｌｄｉａｆｅｔｗｅｉｉｆｒｎ
ｍｎｋｅｄｅｇｅｉｔｋｓｌｒｒｐｅｔｓｙｒｑｔｇｌａｐｇｑｅｙｅｉｓｌｈｉｖｋｎ
ｎｔｒｇｐｇｌｋｒｖｔｔｔｒｌｄ

配列番号３：
ｄａｐｓｑｉｅｖｋｄｖｔｄｔｔａｌｉｔｗｆｋｐｌａｅｉｄｇｉｅｌｔｙｇｉｋｄｖ
ｐｇｄｒｔｔｉｄｌｔｅｄｅｎｑｙｓｉｇｎｌｋｐｄｔｅｙｅｖｓｌｉｓｒｒｇｄｍｓｓ
ｎｐａｋｅｔｆｔｔ

配列番号４
ｔｇｌｄａｐｒｎｌｒｒｖｓｑｔｄｎｓｉｔｌｅｗｒｎｇｋａａｉｄｓｙｒｉｋｙａｐ
ｉｓｇｇｄｈａｅｖｄｖｐｋｓｑｑａｔｔｋｔｔｌｔｇｌｒｐｇｔｅｙｇｉｇｖｓａｖｋ
ｅｄｋｅｓｎｐａｔｉｎａａｔｅｌｄｔｐｋｄ

配列番号５
ｄｔｐｋｄｌｑｖｓｅｔａｅｔｓｌｔｌｌｗｋｔｐｌａｋｆｄｒｙｒｌｎｙｓｌｐｔｇ
ｑｗｖｇｖｑｌｐｒｎｔｔｓｙｖｌｒｇｌｅｐｇｑｅｙｎｖｌｌｔａｅｋｇｒｈｋｓｋｐ
ａｋｓｋｐａｒｖｋ

配列番号６
ｑａｐｅｌｅｎｌｔｖｔｅｖｇｗｄｇｌｒｌｎｗｔａａｄｑａｙｅｈｆｉｉｑｖｑｅａ
ｎｋｖｅａａｒｎｌｔｖｐｇｓｌｒａｖｄｉｐｇｌｋａａｔｐｙｔｖｓｉｙｇｖｉｑｇｙ
ｒｔｐｖｌｓａｅａｓｔｇｅ

配列番号７
ｅｔｐｎｌｇｅｖｖｖａｅｖｇｗｄａｌｋｌｎｗｔａｐｅｇａｙｅｙｆｆｉｑｖｑｅａ
ｄｔｖｅａａｑｎｌｔｖｐｇｇｌｒｓｔｄｌｐｇｌｋａａｔｈｙｔｉｔｉｒｇｖｔｑｄｆ
ｓｔｔｐｌｓｖｅｖｌｔｅ

配列番号８
ｅｖｐｄｍｇｎｌｔｖｔｅｖｓｗｄａｌｒｌｎｗｔｔｐｄｇｔｙｄｑｆｔｉｑｖｑｅａ
ｄｑｖｅｅａｈｎｌｔｖｐｇｓｌｒｓｍｅｉｐｇｌｒａｇｔｐｙｔｖｔｌｈｇｅｖｒｇｈ
ｓｔｒｐｌａｖｅｖｖｔｅ

配列番号９
ｄｌｐｑｌｇｄｌａｖｓｅｖｇｗｄｇｌｒｌｎｗｔａａｄｎａｙｅｈｆｖｉｑｖｑｅｖ
ｎｋｖｅａａｑｎｌｔｌｐｇｓｌｒａｖｄｉｐｇｌｅａａｔｐｙｒｖｓｉｙｇｖｉｒｇｙ
ｒｔｐｖｌｓａｅａｓｔａｋｅｐｅ

配列番号１０
ｋｅｐｅｉｇｎｌｎｖｓｄｉｔｐｅｓｆｎｌｓｗｍａｔｄｇｉｆｅｔｆｔｉｅｉｉｄｓ
ｎｒｌｌｅｔｖｅｙｎｉｓｇａｅｒｔａｈｉｓｇｌｐｐｓｔｄｆｉｖｙｌｓｇｌａｐｓｉ
ｒｔｋｔｉｓａｔａｔｔｅ

配列番号１１
ａｌｐｌｌｅｎｌｔｉｓｄｉｎｐｙｇｆｔｖｓｗｍａｓｅｎａｆｄｓｆｌｖｔｖｖｄｓ
ｇｋｌｌｄｐｑｅｆｔｌｓｇｔｑｒｋｌｅｌｒｇｌｉｔｇｉｇｙｅｖｍｖｓｇｆｔｑｇｈ
ｑｔｋｐｌｒａｅｉｖｔｅ

配列番号１２
ａｅｐｅｖｄｎｌｌｖｓｄａｔｐｄｇｆｒｌｓｗｔａｄｅｇｖｆｄｎｆｖｌｋｉｒｄｔ
ｋｋｑｓｅｐｌｅｉｔｌｌａｐｅｒｔｒｄｌｔｇｌｒｅａｔｅｙｅｉｅｌｙｇｉｓｋｇｒ
ｒｓｑｔｖｓａｉａｔｔａｍ

配列番号１３
ｇｓｐｋｅｖｉｆｓｄｉｔｅｎｓａｔｖｓｗｒａｐｔａｑｖｅｓｆｒｉｔｙｖｐｉｔｇ
ｇｔｐｓｍｖｔｖｄｇｔｋｔｑｔｒｌｖｋｌｉｐｇｖｅｙｌｖｓｉｉａｍｋｇｆｅｅｓｅ
ｐｖｓｇｓｆｔｔａｌ

配列番号１４
ｄｇｐｓｇｌｖｔａｎｉｔｄｓｅａｌａｒｗｑｐａｉａｔｖｄｓｙｖｉｓｙｔｇｅｋｖ
ｐｅｉｔｒｔｖｓｇｎｔｖｅｙａｌｔｄｌｅｐａｔｅｙｔｌｒｉｆａｅｋｇｐｑｋｓｓｔ
ｉｔａｋｆｔｔｄｌ

配列番号１５
ｄｓｐｒｄｌｔａｔｅｖｑｓｅｔａｌｌｔｗｒｐｐｒａｓｖｔｇｙｌｌｖｙｅｓｖｄｇ
ｔｖｋｅｖｉｖｇｐｄｔｔｓｙｓｌａｄｌｓｐｓｔｈｙｔａｋｉｑａｌｎｇｐｌｒｓｎｍ
ｉｑｔｉｆｔｔｉｇｌ

配列番号１６
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥ
ＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲ
ＳＮＰＬＳＡＥＦＴＴ

配列番号１７
ｃｔｇｃｃｇｇｃｇｃｃｇａａａａａｃｃｔｇｇｔｔｇｔｔｔｃｔｇａａｇｔｔａｃｃ
ｇａａｇａｃｔｃｔｃｔｇｃｇｔｃｔｇｔｃｔｔｇｇａｃｃｇｃｇｃｃｇｇａｃｇｃｇｇ
ｃｇｔｔｃｇａｃｔｃｔｔｔｃｃｔｇａｔｃｃａｇｔａｃｃａｇｇａａｔｃｔｇａａａａ
ａｇｔｔｇｇｔｇａａｇｃｇａｔｃａａｃｃｔｇａｃｃｇｔｔｃｃｇｇｇｔｔｃｔｇａａ
ｃｇｔｔｃｔｔａｃｇａｃｃｔｇａｃｃｇｇｔｃｔｇａａａｃｃｇｇｇｔａｃｃｇａａｔ
ａｃａｃｃｇｔｔｔｃｔａｔｃｔａｃｇｇｔｇｔｔａａａｇｇｔｇｇｔｃａｃｃｇｔｔｃ
ｔａａｃｃｃｇｃｔｇｔｃｔｇｃｇｇａａｔｔｃａｃｃａｃｃ

実施例４：Ｔｅｎｃｏｎの安定化突然変異
本明細書で上述されたＴｅｎｃｏｎスカフォールド（配列番号１６）の折畳み安定性を
改善するために突然変異体を設計した。点突然変異を生じさせて、配列番号１６の個々の
残基の置換、例えば、Ｎ４６Ｖ（Ｔｅｎｃｏｎ１７−配列番号１４２）、Ｅ１４Ｐ（Ｔｅ
ｎｃｏｎ１８−配列番号１４３）、Ｅ１１Ｎ（Ｔｅｎｃｏｎ１９−配列番号１４４）、Ｅ
３７Ｐ（Ｔｅｎｃｏｎ２０−配列番号１４５）、及びＧ７３Ｙ（Ｔｅｎｃｏｎ２１−配列
番号１４６）を生じさせ、これらはプログラムＰｏＰＭｕＳｉＣｖ２．０（Ｄｅｈｏｕ
ｃｋ，Ｇｒｏｓｆｉｌｓｅｔａｌ．，２００９）によって安定性を改善すると予想さ
れた。突然変異体Ｅ８６Ｉ（Ｔｅｎｃｏｎ２２−配列番号１４７）は、相同タンパク質、
ヒトテネイシンの第３ＦＮ３ドメインを安定させることが以前に見出されている（ＷＯ
２００９／０８６１１６Ａ２）。最後に、Ｔｅｎｃｏｎの全てのループ残基が独立してア
ラニンで置換されるアラニン走査実験中に、Ｌ１７Ａ変異体がＴｅｎｃｏｎを有意に安定
させることが見出された（データは示されず）。安定性アッセイの初回の後（下記参照）
、安定性を更に増加させるために、コンビナトリアル突然変異体Ｎ４６Ｖ／Ｅ８６Ｉ（Ｔ
ｅｎｃｏｎ２３−配列番号１４８）、Ｅ１４Ｐ／Ｎ４６Ｖ／Ｅ８６Ｉ（Ｔｅｎｃｏｎ２
４−配列番号１４９）、及びＬ１７Ａ／Ｎ４６Ｖ／Ｅ８６Ｉ（Ｔｅｎｃｏｎ２５−配列番
号１５０）を生成した。

発現及び精製
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、Ｔｅｎｃ
ｏｎコード配列の突然変異体を生成した。得られたプラスミドをＢＬ２１−ＧＯＬＤ（Ｄ
Ｅ３）大腸菌（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換して発現させた。単一コロニーを取り
、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＴＢ培地２ｍＬ中で３７℃で一晩培養した。
この培養液を用いて、５００ｍＬのバッフルフラスコ中の自己誘導培地（Ｏｖｅｒｎｉｇ
ｈｔＥｘｐｒｅｓｓＩｎｓｔａｎｔＴＢｍｅｄｉａ，Ｎｏｖａｇｅｎ）１００ｍ
Ｌに播種し、３７℃で１６時間培養した。

４０００×ｇにて２０分遠心分離することにより培養液を回収し、ペレット化された細
胞を、１グラムのウェット細胞ペレット当り５ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒＨＴ（Ｎｏｖ
ａｇｅｎ）で再懸濁した。室温で３０分間インキュベーションした後、３０，０００×ｇ
にて２０分遠心分離することにより溶解物を浄化し、３ｍＬのＮｉ−ＮＴＡｓｕｐｅｒ
ｆｌｏｗカラム（Ｎｏｖａｇｅｎ）に重力により充填した。充填後、５０ｍＭのリン酸ナ
トリウム（ｐＨ７．４）、５００ｍＭのＮａＣｌ、及び１０ｍＭのイミダゾールを含有
する１５ｍＬの緩衝液で各カラムを洗浄した。次に、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ
７．４）、５００ｍＭのＮａＣｌ、及び２５０ｍＭのイミダゾールを含有する１０ｍＬ
の緩衝液を使用して、結合タンパク質をカラムから溶出した。タンパク質の純度をＳＤＳ
−ＰＡＧＥで評価した。生物物理学的解析に先立って、各突然変異体を、ＰＢＳ（ｐＨ
７．４）の中に十分に透析した。１００ｍＬの培養液から各突然変異体ごとに２８〜３３
ｍｇの精製タンパク質を得た。

熱安定性の特性評価
本発明のＴｅｎｃｏｎ及び各突然変異体の熱安定性を、毛細示差走査熱量法（ＤＳＣ）
によって測定した。各サンプルをＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して透析し、２〜３ｍｇ／
ｍＬの濃度まで希釈した。オートサンプラー（ＭｉｃｒｏＣａｌ，ＬＬＣ）を備えたＶＰ
−ＤＳＣ機器を使用して、これらサンプルの融解温度を測定した。サンプルを１０℃から
９５℃又は１００℃まで毎分１℃の速度で加熱した。積分のためのベースラインを計算す
るために、各サンプルの走査の間に緩衝液のみの走査を行った。データは、緩衝液のみの
シグナルを差し引いた後の二状態変性モデルに合致していた。各サンプルをセルから取り
出すことなく走査を繰り返すことによって、熱変性の可逆性を決定した。可逆性は、１回
目の走査曲線の下の面積を２回目の走査曲線の下の面積と比較することによって計算され
た。ＤＳＣ実験の結果は、完全な融解曲線から導かれた値として表５に示されている。単
一の突然変異体Ｔｅｎｃｏｎ１７、Ｔｅｎｃｏｎ１８、Ｔｅｎｃｏｎ１９、及びＴｅｎｃ
ｏｎ２２は、親Ｔｅｎｃｏｎ配列と比べて熱安定性を改善した。Ｔｅｎｃｏｎ２１だけが
有意に不安定化した。コンビナトリアル突然変異体サンプルＴｅｎｃｏｎ２３、Ｔｅｎｃ
ｏｎ２４、及びＴｅｎｃｏｎ２５は全て、安定性の向上が有意に大きく、設計された変異
は熱安定性の改善に対して相加的に作用することが示された。

塩酸グアニジン（Guandine）による変性
トリプトファン蛍光で測定した場合の、高濃度の塩酸グアニジン（ＧｄｍＣｌ）で処理
された際にＴｅｎｃｏｎ及び各突然変異体が折り畳みを維持するの能力を用いて、安定性
を評価した。Ｔｅｎｃｏｎはトリプトファン残基を１個だけ含有している。トリプトファ
ン残基は疎水性コアの中に埋め込まれ、したがって、３６０ｎｍの蛍光放射は、このタン
パク質の折り畳み状態の感度の高い測定となる。１７点滴定のために、５０ｍＭのリン酸
ナトリウム（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．４８〜６．６３Ｍの可変
濃度のＧｄｍＣｌを含有する２００μＬの溶液を、黒色で非結合の９６個のウェルプレー
ト（Ｇｒｅｉｎｅｒ）にピペットで入れた。Ｔｅｎｃｏｎ突然変異体を含有している１０
μＬの溶液を、最終タンパク質濃度が２３ｕＭになるようにプレートにわたり各ウェルに
加え、ピペットをゆっくりと上下に操作することによって混合した。室温で２４時間イン
キュベーションした後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒＤｅｖｉｃｅｓ）によって、２８０ｎｍでの励起及び３６０ｎｍでの発光により蛍
光を読み取った。かかる曲線から作成されたデータが図８に示されている。次の式（Ｐａ
ｃｅ１９８６ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ１３１：２６６〜８０）を用いて蛍
光シグナルを折り畳みが壊れた割合に変換した。

式中、ｙ_Fは、折り畳みサンプルの蛍光シグナルであり、ｙ_uは非折り畳みサンプルの蛍
光シグナルである。

非折り畳みへの移行の中間点、及び移行傾斜を、次の式（Ｃｌａｒｋｅ，Ｈａｍｉｌｌ
ｅｔａｌ．，１９９７）に当てはめて決定した。

式中、Ｆは、所与の変性剤濃度における蛍光であり、α_N及びα_Dは、元の状態と変性状
態のｙ切片であり、β_N及びβ_Dは、元の状態と変性状態のベースラインの傾斜であり、［
Ｄ］はＧｄｍＣｌの濃度であり、［Ｄ］_50%は、サンプルの５０％が変性している時点の
ＧｄｍＣｌ濃度であり、Ｍは移行の傾斜であり、Ｒは気体定数であり、Ｔは温度である。
各サンプルの折り畳みの自由エネルギーを次の式を用いて推定した（Ｐａｃｅ１９８６
ｓｕｐｒａ；Ｃｌａｒｋｅ，Ｈａｍｉｌｌｅｔａｌ．１９９７ＪＭｏｌＢｉ
ｏｌ２７０（５）：７７１〜８）。

このような曲線の移行傾斜ｍを正確に測定するのは困難な場合が多い。加えて、本明細
書に記載の突然変異は、Ｔｅｎｃｏｎの折り畳み機構を変更させるものとは期待されない
。したがって、各突然変異体のｍ値を測定し、この値を平均して（上記Ｐａｃｅ１９８
６参照）、全ての自由エネルギー計算で使用するｍ＝１４．８３ｋＪ／モル／Ｍ（３５４
４カロリー／モル／Ｍ）を生成した。これらの計算の結果が表５に示されている。Ｇｄｍ
Ｃｌ変性実験の結果は、熱安定性に関してＴｅｎｃｏｎを安定させる同じ突然変異体は、
ＧｄｍＣｌ誘発変性に対してもタンパク質を安定させることを証明している。

サイズ排除クロマトグラフィー
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて、ＷＴＴｅｎｃｏｎ及び各突然変
異体の凝集状態を評価した。５μＬの各サンプルを、ＰＢＳ移動相を用いて０．３ｍＬ／
分の流量でＳｕｐｅｒｄｅｘ７５５／１５０カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）
上に注入した。カラムからの溶出を２８０ｎｍの吸光度でモニターした。凝集状態を評価
するために、球状分子量標準品（globular molecular weight standards）（Ｓｉｇｍａ
）でカラムを予め較正した。Ｔｅｎｃｏｎ２１を除く試験した全てのサンプルは、モノマ
ーサンプルの溶出体積と一致する溶出体積で単一ピークに溶出された。Ｔｅｎｃｏｎ２１
は２つのピークに溶出され、凝集の存在を示していた。

以上の記述及び実施例中で特に記されたものとは別な形で本発明を実施できることは明
白であろう。以上の教示に照らして、本発明の数多くの修正及び変形形態が可能であり、
したがってこれらは、添付の特許請求の範囲内に入るものである。

Claims

第三フィブロネクチンドメインのドメインと位相的に類似のループドメインを含むスカ
フォールドベースの分子を含み、かつ、配列番号１６のアミノ酸配列を有する第三フィブ
ロネクチンドメインの共通配列に基づくアミノ酸配列を有する、ポリペプチドであって、
配列番号１６の特異残基が置換され、前記スカフォールドベースの分子の熱安定性及び化
学安定性を増強する、ポリペプチド。
前記熱安定性が、示差走査熱量計によって融解温度（Ｔｍ）として測定され、前記化学
安定性が、塩化グアニジニウム変性に対する抵抗性により［Ｄ］として測定される、請求
項１に記載のポリペプチド。
前記Ｔｍが、配列番号１６のアミノ酸配列を有する前記スカフォールドベースの分子と
比べて、約４．１８ｋＪ（１Ｋｃａｌ）〜約５０．２１ｋＪ（１２Ｋｃａｌ）増加する、
請求項２に記載のポリペプチド。
前記［Ｄ］_50%が、配列番号１６のアミノ酸配列を有する前記スカフォールドベースの
分子と比べて、約０．１〜約２．０Ｍ増加し、自由エネルギー（ΔＧ）が、配列番号１６
のアミノ酸配列を有する前記スカフォールドベースの分子と比べて、０．４１８〜約４１
．８ｋＪ／モル（０．１〜約１０Ｋｃａｌ／モル）増加する、請求項２に記載のポリペプ
チド。
第三フィブロネクチンドメインのドメインと位相的に類似のループドメインを含むスカ
フォールドベースの分子を含み、かつ、配列番号１４２〜１５１からなる群から選択され
る１つのアミノ酸配列のアミノ酸配列を有する第三フィブロネクチンドメインの共通配列
に基づくアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。
第三フィブロネクチンドメインのドメインと位相的に類似のループドメインを含むスカ
フォールドベースの分子を含み、かつ、配列番号１６のアミノ酸配列を有する第三フィブ
ロネクチンドメインの共通配列に基づくアミノ酸配列を有する、ポリペプチドであって、
配列番号１６の特異残基が置換され、前記スカフォールドベースの分子の熱安定性及び化
学安定性を増強し、前記スカフォールドベースの分子が、Ｎ４６Ｖ、Ｅ１１Ｎ、Ｅ１４Ｐ
、Ｌ１７ＡＥ８６Ｉ、Ｇ７３Ｙ、Ｅ３７Ｐ、及びＥ８６Ｉからなる群から選択される１
つ以上の置換を含む、ポリペプチド。
標的と接触することができるループを有し、前記ループ領域が、配列番号１６、及び１
４２〜１５１からなる群から選択されるアミノ酸配列の１３〜１６、２２〜２８、３８〜
４３、５１〜５４、６０〜６４、及び７５〜８１からなる群から選択される位置に代替残
基を含むように修飾されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
前記スカフォールドが、表面プラズモン共鳴又はＫｉｎｅｘａ法で測定されるとき、少
なくとも１０^-9Ｍ以下、少なくとも１０^-10Ｍ以下、少なくとも１０^-11Ｍ以下、及び少な
くとも１０^-12Ｍ以下、少なくとも１０^-13Ｍ以下、少なくとも１０^-14Ｍ以下、及び少な
くとも１０^-15ＭであるＫ_Dから選択される少なくとも１つの親和性で標的に結合する、請
求項６に記載のタンパク質スカフォールド。
ポリペプチド変異型を製造するためにランダム化コドンを導入するＦＮ３ドメインの安
定性が強化された共通配列に由来するスカフォールドベースタンパク質のライブラリーの
構築方法であって、
ＦＮ３ドメインの共通配列に由来するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提
供するステップと、
ランダム化コドンを選択した位置において前記ポリヌクレオチド配列に導入するステッ
プと、
変異スカフォールドタンパク質をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを形成す
るために、ポリヌクレオチドのコピーを伝播するステップと、を含む方法。
前記安定性が強化された共通配列が、配列番号１４２〜１５１からなる群から選択され
るアミノ酸配列からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
前記ランダム化コドンが、ＮＮＳ及びＮＮＫからなる群から選択される、請求項９に記
載の方法。
前記ランダム化コドンが、配列番号１４２〜１５１の１３〜１６、２２〜２８、３８〜
４３、５１〜５４、６０〜６４、及び７５〜８１の位置又はその付近の残基からなる群か
ら選択される少なくとも１つのループ領域をコードする位置に導入される、請求項１０に
記載の方法。
請求項１１に記載の方法によって製造されたライブラリー。
前記ライブラリーの前記ポリヌクレオチドが、ディスプレイタンパク質をコードする配
列に機能的に連結され、ディスプレイのための発現ベクターに導入され、かつ融合タンパ
ク質として発現される、請求項１２に記載のライブラリー。
前記ディスプレイタンパク質が、真核細胞膜に結合したタンパク質、原核細胞タンパク
質、及びファージ外膜タンパク質から選択される、請求項１２に記載のライブラリー。
所定の結合親和性で特定の標的に結合するタンパク質スカフォールドを生成する方法で
あって、請求項１２に記載のライブラリーを前記特定の標的と接触させるステップと、前
記所定の親和性で前記特定の標的に結合するタンパク質スカフォールドを単離するステッ
プと、を含む方法。
前記単離ステップが、前記特定の標的に結合するスカフォールド分子を単離するステッ
プと、前記単離したスカフォールド分子の前記特定の標的に対する結合親和性を検査する
ステップと、を含む、請求項１５に記載の方法。
前記単離ステップが、前記特定の標的でライブラリーをパニングするステップと、前記
特定の標的に結合するスカフォールド分子を捕捉するステップと、該結合スカフォールド
分子を単離するステップと、を含む、請求項１６に記載の方法。
Ｋ_Dによって測定された前記親和性が、約１０^-7Ｍ以下である、請求項１５に記載の方
法。
請求項５に記載のタンパク質スカフォールドをコードする単離核酸分子。
請求項２０に記載の単離核酸分子を含む、単離核酸ベクター。
請求項２０に記載の単離核酸分子を含む、原核又は真核宿主細胞。
前記宿主細胞は、大腸菌ＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）、その他の大腸菌細胞、酵母、昆
虫細胞、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈ
ｅｐＧ２、６５３、ＳＰ２／０、２９３、ＨｅＬａ、骨髄腫、又はリンパ腫細胞、ある
いはこれらの任意の誘導体、不死化細胞若しくは形質転換細胞から少なくとも１つ選択さ
れたものである、請求項２２に記載の宿主細胞。
請求項５に記載のタンパク質スカフォールドと、少なくとも１つの医薬的に許容できる
担体又は希釈剤と、を含む、組成物。
検出可能な標識又はリポーター、ＴＮＦ拮抗薬、抗感染症薬、循環器（ＣＶ）系薬、中
枢神経系（ＣＮＳ）薬、自律神経系（ＡＮＳ）薬、呼吸器薬、消化（ＧＩ）管薬、ホルモ
ン薬、体液又は電解質平衡薬、血液製剤、抗腫瘍薬、免疫調節薬、眼、耳又は鼻用薬、局
所作用薬、機能性食品活性物質（functional food active）、サイトカイン、及びサイト
カイン拮抗薬から選択される少なくとも１つの化合物又はポリペプチドを更に含む、請求
項２４に記載の組成物。
医療デバイスであって、請求項５に記載のタンパク質スカフォールドを含み、前記デバ
イスが、非経口、皮下、筋内、静脈内、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞
内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心
膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、
胸郭内、子宮内、膀胱内、病巣内、ボーラス、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、及び
経皮から選択される少なくとも１つの方式により、前記タンパク質スカフィールドを接触
又は投与するのに好適な、医療デバイス。
ヒトの製薬学的用途又は診断用途のための製品であって、包装材と、請求項５に記載の
タンパク質スカフォールドの溶液又は凍結乾燥形態を含む容器と、を含む、製品。
前記容器が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟
骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨
盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑
液嚢内、胸郭内、子宮内、膀胱内、病巣内、ボーラス、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔
内、又は経皮的送達デバイス又は系の構成要素である、請求項２７に記載の製品。
配列番号１４２〜１５１からなる群から選択され、Ｂ：Ｃ（残基２２〜２８）又はＦ：
Ｇ（残基７５〜８１）に置換を更に含む、テネイシンのＦＮ３ドメインの共通配列に由来
するアミノ酸配列を含むフィブロネクチン３型（ＦＮ３）ドメインに基づく単離されたタ
ンパク質スカフォールドであって、前記スカフォールドタンパク質が、標的タンパク質に
結合することによって選択された、単離されたタンパク質スカフォールド。
前記標的タンパク質が、ヒトＩｇＧ若しくはヒトＴＮＦａｌｐｈａ又はその断片である
、請求項２９に記載の単離されたスカフォールドタンパク質。
前記Ｂ：Ｃ（残基２２〜２８）又はＦ：Ｇ（残基７５〜８１）が、配列番号２１〜１４
０の１つ以上で表わされ、前記タンパク質スカフォールドがヒトＩｇＧに結合する、請求
項３０に記載の単離されたスカフォールドタンパク質。
前記スカフォールドが、７つのストランドと、該ストランド間に６つのループと、を含
む、請求項３１に記載のタンパク質スカフォールド。
配列番号２１〜１４０のＢ：Ｃ又はＦ：Ｇループの任意の１つのアミノ酸配列を含み、
前記タンパク質スカフォールドが、残基１３〜１６、２２〜２８、３８〜４３、５１〜５
４、６０〜６４、及び７５〜８１又はその付近にループを形成する、請求項３１に記載の
タンパク質スカフォールド。
フィブロネクチン３型（ＦＮ３）ドメインに基づく単離されたタンパク質スカフォール
ドであるＴｅｎｃｏｎ１６（配列番号１６）は、Ｎ４６Ｖ、Ｅ１１Ｎ、Ｅ１４Ｐ、Ｅ８６
Ｉ、Ｎ４６Ｖ及びＥ８６Ｉ、Ｅ１４Ｐ及びＮ４６Ｖ及びＥ８６Ｉの全て、並びにＬ１７Ａ
及びＮ４６Ｖ及びＥ８６Ｉの全てからなる群から選択される置換を有し、かつ、
残基１〜２１、２９〜７４、及び８２〜８９で配列番号１６に同一のアミノ酸配列を有
する骨格部分と、
配列番号２１〜４５の任意の１つに対して少なくとも７５％の同一性を有する、配列番
号１６の残基２１と２９との間のＢ：Ｃループ部分と、
配列番号４６〜１４０の任意の１つに対して少なくとも７５％の同一性を有する、配列
番号１６の残基７４と８２との間のＦ：Ｇループ部分と、を含み、前記タンパク質スカフ
ォールドが、ヒトＩｇＧに結合できる、タンパク質スカフォールド。
前記スカフォールドが、表面プラズモン共鳴又はＫｉｎｅｘａ法で測定されるとき、１
０^-9Ｍ以下、１０^-10Ｍ以下、１０^-11Ｍ以下、１０^-12Ｍ以下、１０^-13Ｍ以下、１０^-14
Ｍ以下、１０^-15Ｍ以下であるＫ_Dから選択される少なくとも１つの親和性で標的に結合す
る、請求項３４に記載のタンパク質スカフォールド。
前記ループが、ＩｇＧに結合する部位を形成する、請求項３５に記載のタンパク質スカ
フォールド。
テネイシンのＦＮ３ドメインの共通配列に由来するアミノ酸配列を含むフィブロネクチ
ン３型（ＦＮ３）ドメインに基づく単離されたタンパク質スカフォールドであって、該タ
ンパク質スカフォールドが、ヒトＩｇＧと結合できる、タンパク質スカフィールド。
本明細書に記載されたいずれかの発明。