BR112014029409B1 - Domínio de ligação a albumina isolado não natural, método para produção do mesmo, polinucleotídeo isolado, vetor isolado, célula hospedeira isolada, proteína de fusão e composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

DOMÍNIOS DE LIGAÇÃO DE ALBUMINA CONSENSO NÃO NATURAIS. A presente invenção refere-se a domínios de ligação de albumina não naturais, polinucleotídeos que codificam o mesmo e métodos para produzir e usar esses domínios e polinucleotídeos são úteis em controlar a meia-vida de moléculas terapêuticas para pacientes.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere a métodos para produzir e usar domínios de ligação de albumina. Mais particularmente, a presente invenção é direcionada a uma sequência de domínios de ligação consenso não naturais de albumina e variantes do mesmo conforme descrito aqui.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A rápida eliminação de moléculas bioterapêuticas por meio de depuração renal contribui para a eficácia clínica limitada ou dosagem mais frequente para o paciente. A depuração renal devido a filtração glomerular é mais associada com bioterapêuticos menores, já que as taxas de filtração de rim são muito reduzidas para moléculas com um peso molecular maior do que 50.000 daltons (Kontermann, Curr Opin Biotechnol 22:868-76, 2011). Diversos medicamentos bioterapêuticos aprovados contém porções ativas que por si caem abaixo do limite de filtração e deste modo são eliminadas rapidamente. Para superar essa limitação, uma variedade de tecnologias foi introduzida para efetivamente aumentar o tamanho da molécula terapêutica para reduzir a filtração dos rins e sua meia-vida resultante.

[003] A peguilação (PEG) de terapêuticos é uma maneira eficaz de aumentar o raio hidrodinâmico da proteína e reduzir a filtração glomerular. Uma ou várias cadeias PEG podem ser acopladas à proteína, mais comumente através de conjugação ao tiol livre ou grupos amina na superfície da proteína. Versões pegiladas de adenosina deaminase, L-Asparaginase, Interferon alfa-2b, G-CSF, Hormônio do crescimento humano, Eritropoietina, Uricase, e um fragmento de anticorpo anti-TNFalfa foram todas aprovadas para terapia humana (Kontermann, Curr Opin Biotechnol 22:868-76, 2011). Limitações da peguilação incluem a produção de produtos heterogêneos e dificuldade para controlar o número de moléculas PEG fixadas a certas proteínas. A peguilação introduz etapas de conjugação adicional, bem como de purificação para a produção de proteínas terapêuticas, resultando em produção reduzida e maiores custos dos produtos. A peguilação pode também levar a vacuolização tubular renal em animais e pacientes já que as cadeias PEG não se degradam nos rins (Gaberc-Porekar et al., Curr Opin Drug Discov Devel 11:242-250, 2008).

[004] O acoplamento de um terapêutico à região Fc de um anticorpo para gerar proteínas de fusão Fc pode ser usada para aumentar a meia-vida do soro de moléculas terapêuticas. Imunoglobulinas podem exibir meia-vida mais longa na ordem de várias semanas em seres humanos devido a seu maior tamanho e reciclagem através de FcRn (Kuo et al., J Clin Immunol 30:777-789, 2010). O receptor para TNF 2, LFA-3, CTLA-4, IL-1R, e moléculas de peptídeo mimético TPO são terapias aprovadas produzidas como fusões Fc (Kontermann, Curr Opin Biotechnol 22:868-76, 2011). Proteínas de fusão Fc não são ideais para todas as classes terapêuticas por diversas razões. A natureza homodimérica da região Fc resulta na produção de uma proteína terapêutica dimérica, possivelmente levando a ativação celular devido ao agrupamento do receptor. Fusões Fc também devem ser feitas em sistemas de expressão em mamíferos, o que pode ser mais dispendioso do que sistemas procarióticos.

[005] Adicionalmente a Fc, a albumina exibe uma longa meia- vida in vivo devido à reciclagem FcRn. A uma concentração de aproximadamente 40 g/L, a albumina sérica humana (HSA) é a proteína mais abundante encontrada no sangue. A reciclagem FcRn leva a uma longa meia-vida de aproximadamente 19 dias em seres humanos. Adicionalmente, estudos de biodistribuição sugerem que a albumina pode ser distribuída no corpo humano para áreas importantes visando doenças, como juntas inflamadas ou tumores (Wunder et al., J Immunol 170:4793-4801, 2003). Dessa forma, a meia-vida sérica de uma variedade de proteínas foi aumentada ao produzi-las como fusões C-terminal ou N-terminal ao HSA. Fusões bem sucedidas incluem interferon alfa (Flisiak e Flisiak, Expert Opin Biol Ther 10:1509-1515, 2010), hormônio do crescimento humano (Osborn et al., Eur J Pharmacol 456:149-158, 2002), fator de necrose tumoral (Muller et al., Biochem Biophys Res Commun 396:793-799, 2010), fator de coagulação IX (Metzner et al., Thromb Haemost 102: 634-644, 2009), fator de coagulação VIIa (Schulte, Thromb Res 122 Suppl 4: S14-19, 2008), insulina (Duttaroy et al., Diabetes 54:251-258, 2005), uroquinase (Breton et al., Eur J Biochem 231:563-569, 1995), hirudina (Sheffield et al., Blood Coagul Fibrinolysis 12:433-443, 2001), e fragmentos de anticorpos biespecíficos (Muller et al, J Biol Chem 282:12650-12660, 2007). Proteínas de fusão HSA podem ter meia- vida sérica longa, entretanto a produção em larga escala destas proteínas de fusão é limitada predominantemente a sistemas de expressão em levedura. Adicionalmente, o grande tamanho da HSA pode levar a uma perda na atividade terapêutica devido ao impedimento estérico.

[006] Proteínas terapêuticas podem também ser produzidas como proteínas de fusão a peptídeos ou proteínas que se ligam à albumina sérica na corrente sanguínea para aumentar sua meia-vida. Tais peptídeos de ligação à albumina incluem peptídeos constritos por cisteína ou fragmentos de anticorpos para albumina. A expressão de um fragmento de anticorpo Fab como uma fusão a peptídeos constritos por cisteína aumentou significativamente a meia-vida sérica do Fab (Dennis et al., J Biol Chem 277:35035-35043, 2002; US2004/0253247A1). O acoplamento do peptídeo constrito por cisteína a um fragmento de anticorpo levou a um melhor acúmulo de tumor de pico e uma distribuição mais homogênea de tumor, comparado a moléculas Fab e mAb visando o mesmo antígeno (Dennis et al., Cancer Res 67:254-261, 2007; US2005/0287153A1). Adicionalmente, uma variedade de fragmentos de anticorpos que se ligam especificamente à albumina foram ligados a porções terapêuticas para aumentar a meia-vida do terapêutico. Um fragmento de anticorpo VHH camelid (Nanobodies®) que se liga ao HSA foi fundido a outro Nanobody® que se liga ao TNF alfa (Coppieters et al., Arthritis Rheum 54: 1856-1866, 2006) ou EGFR Nanobodies® (Tijink et al., Mol Cancer Ther 7:2288-2297, 2008). Foram gerados anticorpos de domínio anti-albumina (dAbs) que se ligam à albumina e foram fundidos, por exemplo ao, por exemplo, receptor de interleucina-1 (Holt et al., Protein Eng Des Sel 21:283-288, 2008) e interferon alfa 2b (Walker et al., Protein Eng Des Sel 23:271-278, 2010) para melhorar sua meia-vida.

[007] Sabe-se que uma variedade de domínios protéicos de ocorrência natural de bactérias interagem com albumina, presumidamente para ajudar tal bactéria a propagar pelo organismo hospedeiro. Estes são domínios proteicos em feixe de 3 hélices de aproximadamente 6 kDa de tamanho que usam uma face do feixe de 3 hélices para interagir com a albumina sérica (Cramer et al., FEBS Lett 581:3178-3182, 2007; Lejon et al., Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun 64:64-69, 2008; Johansson et al., FEBS Lett 374:257261, 1995; Johansson et al., J Mol Biol 266:859-865, 1997; Johansson et al., J Biol Chem 277:8114-8120,2002). Tal domínio de ligação de albumina derivado da proteína estreptocócica G (Jonsson et al., Protein Eng Des Sel 21:515-527, 2008) foi mais amplamente utilizado para estender a meia-vida sérica de proteínas. A fusão a este domínio mostrou um aumento na meia-vida do receptor complementar solúvel tipo 1 (Makrides et al., J Pharmacol Exp Ther 277:534-542, 1996), um anticorpo específico (Stork et al., Protein Eng Des Sel 20:569-576, 2007), CD4 (Nygren et al., Vaccines 91:363-368, 1991; US 6267,964B1), Pf155/RESA (Stahl et al., J Immunol Methods 124:43-52, 1989), G-CSF (Frejd, F. PEGS Europa, 5 de outubro, 2010), e moléculas affibody se ligando a diversos alvos (Andersen et al., J Biol Chem 286:5234-5241, 2011) (Frejd, F. PEGS Europa, 5 de outubro, 2010). Entretanto, a produção de anticorpos contra o domínio foi relatada em pacientes, dessa forma, o uso da molécula para aplicações terapêuticas pode ser desafiador (Goetsch et al., Clin Diagn Lab Immunol 10:125-132, 2003; Libon et al., Vaccine 17:406-414, 1999).

[008] Diversos domínios de proteína ou peptídeos que se ligam à albumina são capazes de estender a meia-vida sérica e produzir um padrão de biodistribuição mais benéfico de proteínas terapêuticas. Para poder usar estes domínios de ligação à albumina em aplicações terapêuticas, um número de exigências biofísicas devem ser cumpridas, como altos níveis de expressão em um hospedeiro, solubilidade e estabilidade, e imunogenicidade mínima. A porção de ligação à albumina deve se ligar à albumina sérica com uma afinidade que efetivamente balanceia a meia-vida sérica e a biodistribuição com atividade da porção terapêutica quando ligada e não ligada à albumina.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[009] Um aspecto da invenção é uma proteína que compreende um domínio de ligação isolado, não natural, à albumina que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:21. Outro aspecto da invenção é um domínio de ligação isolado não natural de albumina caracterizado pelo fato de compreender uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidosda SEQ ID NO: 21.

[0010] Ainda outro aspecto da invenção é um domínio de ligação isolado não natural à albumina, que possui a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 21 com substituições nos resíduos 1, 2, 3, 4, 5, e/ou 6, e, de preferência, em que as substituições nos resíduos 1, 2, 3, 4, 5, e/ou 6 possa ocorrer nas posições Y21, Y22, L25, K30, T31, E33, G34, A37, L38, E41, I42 e/ou A45 do aminoácido da SEQ ID NO: 21 ou nas posições Y21, Y22, K30, T31, A37, e/ou E41 do aminoácido da SEQ ID NO: 21.

[0011] Um outro aspecto da invenção é um domínio de ligação isolado não natural à albumina compreendendo uma sequência de aminoácido:LKEAKEKAIEELKKAGITSDX1X2FDLINKAX3X4VEGVNX5LKDX6ILKA (SEQ ID NO: 22); onde X1, X2, X3, X4, X5, e X6 pode ser qualquer aminoácido ou subconjunto de certos aminoácidos.

[0012] Em outro aspecto da invenção, o domínio de ligação isolado não natural de albumina compreende uma extensão de 5 aminoácidos em seu N-terminal.

[0013] Em outro aspecto da invenção é mostrado um método para produzir um domínio de ligação não natural de albumina desta invenção que compreende fornecer um polinucleotídeo codificando o domínio de ligação não natural de albumina; expressar o polinucleotídeo em um hospedeiro ou in vitro; e recuperar o domínio de ligação não natural de albumina. Um outro aspecto da invenção é um polinucleotídeo isolado codificando os domínios de ligação de albumina da invenção. Um outro aspecto da invenção é um polinucleotídeo isolado que compreende um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 35.

[0014] Um outro aspecto da invenção é um vetor isolado compreendendo o polinucleotídeo isolado da invenção e uma célula de hospedeiro compreendendo o vetor isolado da invenção.

[0015] Um outro aspecto da invenção é uma proteína de fusão compreendendo uma proteína de ligação de albumina da invenção e um agente bioativo.

[0016] Um outro aspecto da invenção é uma composição farmacêutica que compreende a proteína de fusão da invenção e pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável ou diluente.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0017] A Figura 1 mostra a análise SDS-PAGE de ABDCon purificado. As amostras são como a seguir raia 1) SeeBlue mais 2 marcadores, 2) lisato celular total, 3) lisato celular solúvel, 4) distribuição de coluna, 5-12) frações eluídas. Pesos moleculares de algumas das bandas marcadoras são mostradas na esquerda.

[0018] A Figura 2 mostra espectrometria de massa por ionização de eletrospray de uma amostra ABDCon purificada.

[0019] A Figura 3 mostra análise de cromatografia de exclusão de tamanho de ABDcon purificada como executada em PBS.

[0020] A Figura 4 mostra a temperatura de fusão A) e reversibilidade do desdobramento de ABDCon B) como medido por DSC em PBS. Os dados subtraídos de nível basal normalizado para a primeira varredura é mostrada em A. Após a primeira varredura, a amostra foi resfriada a 20°C e a varredura repetida para determinar a reversibilidade do dobramento. Os traços de dados puros para a primeira e a segunda varredura são mostrados na parte B.

[0021] A Figura 5 mostra a farmacocinética de uma proteína de fusão Tencon25-ABDCon em camundongos quando dosada a 2 mg/kg via intravenosa.

[0022] A Figura 6 mostra a farmacocinética de uma molécula Tencon25 (resíduos 1-90 da SEQ ID NO: 39) fundida à ABDCon (SEQ ID NO: 21), ABDCon3 (SEQ ID NO: 26), ABDcon5 (SEQ ID NO: 28), ABDCon7 (SEQ ID NO: 30) e ABDCon9 (SEQ ID NO: 32) em camundongos quando dosados a 2 mg/kg via intravenosa.

[0023] A Figura 7 mostra a estabilidade de A) Certos ABDCon de domínio FN3 (SEQ ID NO: 1) proteínas de fusão e B) ABDCon12 de domínio FN3 (SEQ ID NO: 46) proteínas de fusão que tem hélice N- terminal estendida em ABDCon quando incubadas a 37°C por 0 ou 28 dias em PBS.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0024] O termo "domínio de ligação de albumina" ou "domínio" como usado aqui, se refere a um polipeptídeo que liga a albumina in vivo ou in vitro. A albumina pode ser derivada de qualquer espécie animal, por exemplo, humana, macaco ou roedor.

[0025] O termo "KD," como usado aqui, se refere à constante de dissociação entre a albumina e o domínio de ligação da albumina.

[0026] O termo "Kon," como usado aqui, se refere à constante de taxa para associação de um domínio de ligação de albumina a albumina para formar um complexo de albumina/domínio de ligação de albumina.

[0027] O termo "Koff," como usado aqui, se refere à constante de taxa para a dissociação de um domínio de ligação de albumina do complexo de albumina/domínio de ligação de albumina.

[0028] O termo "não natural" como usado aqui, se refere a um domínio sintético, isto é, que tem uma sequência de aminoácido que não está presente em polipeptídeos nativos.

[0029] O termo "substituindo" ou "substituições" como usado aqui se refere à alteração, deleção ou inserção, ou alterações, deleções ou inserções de um ou mais aminoácidos ou nucleotídeos em uma sequência de polipeptídeo ou polinucleotídeo para gerar uma variante daquela sequência.

[0030] O termo "variante", como usado neste documento, se refere a um polipeptídeo ou um polinucleotídeo que difere de um polipeptídeo de referência ou um polinucleotídeo de referência por uma ou mais modificações, por exemplo, substituições, inserções ou deleções.

[0031] O termo "agente bioativo" como usado aqui, se refere a proteínas, anticorpos, peptídeos, nucleotídeos, pequenos farmacêuticos moleculares e similares, que, quando administrados a um animal fornece um benefício a aquele animal. Porções sinteticamente produzidas, naturalmente derivadas ou recombinantemente produzidas estão incluídas neste termo. Agentes bioativos podem ser análogos, derivados, agonistas, antagonistas, enantiômeros ou sais farmaceuticamente aceitáveis de agentes bioativos.

[0032] O termo "estabilidade", conforme usado neste documento se refere à capacidade de uma molécula manter um estado dobrado em condições fisiológicas de modo que a mesma retenha pelo menos uma de suas atividades funcionais normais, por exemplo, meia-vida.

[0033] O termo "vetor" significa um polinucleotídeo capaz de ser duplicado dentro de um sistema biológico ou que pode ser movido entre esses sistemas. Polinucleotídeos vetores contêm tipicamente elementos, como as origens de replicação, sinais de poliadenilação ou marcadores de seleção, que funcionam para facilitar a duplicação ou manutenção desses polinucleotídeos em um sistema biológico. Exemplos destes sistemas biológicos podem incluir uma célula, bactéria, vírus, animal, planta, e sistemas biológicos reconstituídos que utilizam componentes biológicos capazes de duplicar um vetor. O polinucleotídeo que compreende um vetor pode ser moléculas de DNA ou RNA ou um híbrido das mesmas.

[0034] O termo "vetor de expressão" significa um vetor que pode ser utilizado em um sistema biológico ou em um sistema biológico reconstituído para direcionar a translação de um polipeptídeo codificado por uma sequência de polinucleotídeo presente no vetor de expressão.

[0035] O termo "ligado de maneira funcional" como usado aqui, se refere a um posicionamento de componentes de modo que funcionem da maneira desejada.

[0036] Aminoácidos são aqui referenciados usando seus códigos padronizados de três ou uma letra:

Composições de domínio de ligação de albumina

[0037] A presente invenção fornece um domínio de ligação de albumina sintético (ABDCon) (SEQ ID NO: 21) e variantes do mesmo. ABDCon pode ser ligado de maneira funcional a um agente bioativo para aprimoramento da meia-vida sérica e biodistribuição do agente terapêutico. ABDCon e suas variações podem ser expressados em altos níveis em E. coli, são solúveis e têm alta estabilidade térmica. A presente invenção apresenta polinucleotídeos que codificam ABDCon e suas variantes, ácidos nucleicos complementares, vetores, células hospedeiras e métodos de preparo e uso dos mesmos.

[0038] A presente invenção adicionalmente fornece um domínio de ligação de albumina sintético (ABDCon) que tem uma extensão de 5 aminoácidos no N-terminal. A extensão aprimora a estabilidade de ABDCon.

[0039] O domínio de ligação ABDCon foi projetado calculando uma sequência de consenso de aminoácido de certas sequências de domínio de ligação de albumina de feixe de 3 hélices (ABD) depositada no banco de dados de proteína não redundante usando ABD da proteína G de Streptococcus sp. G148 (SEQ ID NO: 1) como um molde, e selecionando o aminoácido mais prevalente em cada posição de sequência (tabela 6). ABDCon tem uma alta afinidade para a albumina humana com um KD de 75 pM e Koff de 3,02x10-5 1/s quando testada nas condições aqui especificadas, e portanto agentes bioativos ligados de maneira funcional a ABDCon podem ser amplamente ligados à albumina, uma vez administrados a um paciente animal. Em um paciente humano, as moléculas ligando a albumina sérica fracamente terão uma meia-vida sérica curta devido à filtração renal (Hopp et al., Protein Eng Des Sel 23:827-834, 2010), ao passo que albumina sérica ligando moléculas de modo muito rígido não será liberada da albumina no local preferido de ação, e assim, em alguns casos poderá ter habilidade reduzida para modular a atividade do alvo desejado e fornecer um benefício terapêutico. Deste modo, é um aspecto da invenção ter, e ser capaz de gerar variantes de ABDCon e domínios de ligação que possuem um espectro de afinidades com a albumina e então fornecer a habilidade para modular a meia-vida do agente bioativo ligado de maneira funcional às variantes de ABDCon e domínios de ligação.

[0040] Uma modalidade da invenção é um domínio de ligação isolado não natural de albumina que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 21 (ABDCon):LKEAKEKAIEELKKAGITSDYYFDLINKAKTVEGVNALKDEILKA.

[0041] Outra modalidade da invenção é um domínio de ligação à albumina isolado que compreende uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 21 que tem substituições nos resíduos 1, 2, 3, 4, 5, ou 6.

[0042] Variantes ABDCon podem ser projetadas examinando a estrutura de cristal de uma proteína de ligação à albumina com feixe de 3 hélices em complexo com albumina e presumindo que ABDCon pode ligar a albumina de modo similar à proteína exemplificadora. Uma estrutura de cristal exemplificadora que pode ser utilizada é a de um módulo GA (módulo de ligação albumina relacionado à proteína G) da proteína PAB de uma bactéria anaeróbica Finegoldia magna (anteriormente Peptostreptococcus magnus) em complexo com albumina humana (código 1TF0 do banco de dados de proteína (PDB) (Leion et al., J Biol Chem 279:42924-42928, 2004).

[0043] Variantes ABDCon que possuem afinidade reduzida para albumina podem ser projetadas por várias estratégias, como interrupção dos contatos hidrofóbicos previstos, interrupção de empilhamentos pi previstos entre resíduos aromáticos, introdução de conflito estérico por substituição com aminoácidos maiores, interrupção de pontes salinas por remoção de resíduos carregados e interrupção de ligações de hidrogênio previstas que ocorram entre ABDCon e albumina. Mudanças introduzidas são projetadas para diminuir a afinidade de ligação sem mudar a superfície de ligação de uma maneira que possa rejeitar uma ligação. Por exemplo, o resíduo Y21 pode ser substituído por aminoácidos carregados (Lys, Arg, Asp, Glu) ou aminoácidos menores (Ala, Gly) para reduzir as interações hidrofóbicas entre este resíduo e os resíduos de albumina V325 e F326. Além disso, o Y21 de ABDCon forma uma ligação de hidrogênio com a cadeia principal de resíduos de albumina N318 e D324 de modo que mudanças menores como mutação ao Phe possam enfraquecer levemente interações. É previsto que o resíduo Y22 de ABDCon forme interações hidrofóbicas e também de empilhamento pi com os resíduos de albumina F309 e F326. Portanto a substituição de Y22 por aminoácidos neutros menores Ala, Ser, Val ou aminoácidos carregados Lys, Arg, Asp, ou Glu podem diminuir os contatos hidrofóbicos e reduzir a afinidade da variante de ABDCon à albumina.É previsto que o resíduo K30 em ABDCon forme uma ponte salina com o resíduo de albumina E227 e, dessa forma, K30 pode ser substituído po Asp ou Glu para introduzir cargas repulsivas e potencialmente reduzir a afinidade de ABDCon à albumina. Mutação em qualquer aminoácido não carregado pode também reduzir a afinidade eliminando a ponte salina. É previsto que o resíduo T31 de ABDCon forme uma ligação de hidrogênio intermolecular com o resíduo de albumina N267 e substituições para Ala ou Gly podem ser usadas para interromper a ligação de hidrogênio sem introduzir um grande conflito estérico que possa desestabilizar de modo significativo a interação. O resíduo A37 de ABDCon pode ser substituído por Val, Tyr, ou outro aminoácido maior, para assim introduzir conflitos estéricos. O resíduo E41 pode ser substituído por Gln ou Asn para remover a carga. A introdução de resíduos carregados positivamente como Lys ou Arg tem o efeito esperado de reduzir adicionalmente a afinidade de ligação. É previsto que os resíduos L25, E33, G34, L38, I42, e A45 de ABDCon formem contato direto com albumina, e substituições nestes resíduos têm a capacidade de modular a afinidade de ABDCon às posições dos resíduos de albumina, consulte ABDCon na sequência SEQ ID NO: 21 e albumina humana da SEQ ID NO: 36.

[0044] Alternativamente, um coquetel aleatório de aminoácidos pode ser usado, utilizando por exemplo códons NNK para substituições em posições identificadas, e as variantes resultantes têm sua ligação medida usando métodos padrão e os métodos descritos nesta invenção.

[0045] Variantes ABDCon exemplificadoras são variantes que têm substituições em pelo menos um resíduo selecionado dentre Y21, Y22, L25, K30, T31, E33, G34, A37, L38, E41, I42 e A45 da SEQ ID NO: 21.

[0046] Variantes ABDCon exemplificadoras são variantes que têm substituições em pelo menos um resíduo selecionado dentre Y21, Y22, K30, T31, A37, e E41 da SEQ ID NO: 21.

[0047] Uma variação exemplificadora de ABDCon compreende uma sequência de aminoácido LKEAKEKAIEELKKAGITSDX1X2FDLINKAX3X4VEGVNX5LKDX6ILKA (SEQ ID NO: 22; onde X1, X2, X3, X4, X5, e X6 podem ser qualquer aminoácido.

[0048] Em outras modalidades, uma variante ABDCon exemplificadora compreende uma sequência de aminoácido LKEAKEKAIEELKKAGITSDX1X2FDLINKAX3X4VEGVNX5LKDX6ILKA (SEQ ID NO: 23), em que

[0049] i) X1 é lisina (K), arginina (R), aspartato (D), glutamato (E),alanina (A), glicina (G), fenilalanina (F) ou tirosina (Y);

[0050] ii) X2 é alanina (A), serina (S), valina(V), lisina (K), arginine (R), aspartato (D), glutamato (E) ou tirosina (Y);

[0051] iii) X3 é aspartato (D), glutamato (E) ou lisina (K);

[0052] iv) X4 é alanina (A), glicina (G) ou treonina (T);

[0053] v) X5 é valina (V), tirosina (Y) ou alanina (A); e

[0054] vi) X6 é glutamina (Q), asparagina (N), lisina (K), arginina (R) ou glutamato (E).

[0055] Em outras modalidades, uma variante ABDCon exemplificadora compreende uma sequência de aminoácido LKEAKEKAIEELKKAGITSDX1X2FDLINKAX3X4VEGVNX5LKDX6ILKA (SEQ ID NO: 24), em que

[0056] i) X1 é lisina (K), alanina (A) ou tirosina (Y);

[0057] ii) X2 é alanina (A), serina (S), valina(V) ou tirosina (Y);

[0058] iii) X3 é aspartato (D) ou lisina (K);

[0059] iv) X4 é alanina (A) ou treonina (T);

[0060] v) X5 é valina (V), tirosina (Y) ou alanina (A); e

[0061] vi) X6 é glutamina (Q) ou glutamato (E).

[0062] Variantes ABDCon exemplificadoras compreendem sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 25-34. Variantes ABDCon são testadas por sua ligação à albumina usando métodos bem conhecidos, por exemplo, um ensaio in vitro usando ressonância de plasmon (BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Suécia). A afinidade medida de uma interação específica entre uma variante ABDCon/albumina pode variar se for medida sob diferentes condições (por exemplo, osmolaridade, pH). Portanto, as medições de afinidade e outros parâmetros de ligação (por exemplo, KD, Kon, Koff) são, de preferência, feitas com soluções padronizadas de variante ABDCon e albumina e um tampão padronizado, como o tampão aqui descrito. A afinidade de variantes ABDCon pode estar na faixa de cerca de ao menos 1x10-5 M, ao menos cerca de 1x10-6 M, ao menos cerca de 1x10-7 M, ao menos cerca de 1x10-8 M, ao menos cerca de 1x10-9 M, ao menos cerca de 1x10-10 M, ao menos cerca de 1x10-11 M, ao menos cerca de 1x10-12 M, ou ao menos cerca de 1x10-13 M. Por exemplo, várias substituições em Y22 de ABDCon (SEQ ID NO: 21) reduziram a afinidade das variantes para albumina cerca de 300 - 1,000 vezes, dependendo de uma substituição (tabela 4). Variantes adicionais que têm substituições em posições definidas ou em combinações de posições podem ser projetadas e geradas pelos versados na técnica e testados por uma afinidade de ligação à albumina desejada, usando métodos de rotina.

[0063] ABDCon e suas variantes podem adicionalmente ser modificadas através da adição de uma extensão de 5 aminoácidos ao N-terminal de ABDCon ou da variante ABDCon. A extensão de 5 aminoácidos pode consistir de uma sequência de aminoácido TIDEWL (SEQ ID NO: 43), ou qualquer outra sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NOs: 42 ou 45-55. Incorporar a extensão de aminoácido de 5 N-terminal no ABDCon e suas variantes pode aumentar a estabilidade da molécula. A extensão de aminoácido de 5 N-terminal pode ser estruturalmente ordenada como parte da primeira hélice alfa de ABDCon e suas variantes. A estabilidade aprimorada das moléculas estendidas em N-terminal pode portanto resultar da estabilização da estrutura geral da hélice. As variantes de ABDCon N- terminal podem ser feitas usando métodos padrão e sua estabilidade, por exemplo, estabilidade térmica, avaliada conforme aqui descrito. Um domínio de ligação de albumina (ABD) pode ser modificado com a adição dos aminoácidos de 5 N-terminal para estabilizar a estrutura ABD e aprimorar a estabilidade, como a estabilidade térmica da molécula resultante.

[0064] ABDCon e suas variantes podem ser adicionalmente modificadas nos resíduos, não afetando a ligação à albumina para o propósito de exemplo de aprimorar a estabilidade, reduzir a imunogenicidade, aprimorar a solubilidade ou qualquer outra característica adequada. De modo a alcançar esse objetivo, a ABDCon e suas variantes podem ser opcionalmente preparadas por um processo de análise das sequências parentais e vários produtos manipulados conceituais com o uso de modelos tridimensionais das sequências parentais e manipuladas. Os modelos tridimensionais estão comumente disponíveis e são familiares para os versados na técnica. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e exibem prováveis estruturas conformacionais tridimensionais de sequências candidatas selecionadas, e podem medir a possível imunogenicidade (por exemplo, o programa Immunofilter da Xencor, Inc., de Monrovia, CA, EUA). A inspeção destas exibições permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência candidata, por exemplo, resíduos que influenciam a estabilidade do domínio ABDCon. Deste modo, os resíduos podem ser selecionados e combinados desde as sequências parentais e de referência de modo que as características desejadas, como estabilidade aprimorada, seja alcançada. Alternativa ou adicionalmente aos procedimentos acima, outros métodos adequados de engenharia podem ser usados conforme conhecido na técnica.

[0065] Propriedades físicas desejadas de domínios de ligação à albumina desta invenção incluem alta estabilidade térmica e reversibilidade de dobramento e desdobramento térmico. Vários métodos foram aplicados para aumentar a estabilidade térmica aparente de proteínas e enzimas, incluindo modelo racional com base em comparação a sequências termoestáveis altamente similares, modelo de pontes de dissulfeto estabilizantes, mutações para aumentar a propensão da alfa-hélice, manipulação de pontes salinas, alteração da carga de superfície da proteína, evolução dirigida e composição de sequências consenso (Lehmann and Wyss, Curr Opin Biotechnol 12:371-375, 2001). A alta estabilidade térmica pode aumentar o rendimento da proteína expressa, aperfeiçoar a solubilidade ou atividade, diminuir a imunogeneicidade e minimizar a necessidade por uma cadeia fria na fabricação.

[0066] Resíduos que podem ser substituídos para aprimorar quaisquer características dos domínios de ligação de albumina da invenção podem ser determinados realizando-se a substituição e testes das características desejadas do domínio de ligação à albumina. Por exemplo, a varredura de alanina pode ser empregada para identificar as posições em ABDCon e suas variantes que possam afetar a estabilidade do domínio de ligação da albumina.

[0067] Em termos de perda de estabilidade, isto é, "desnaturar" ou "desnaturação" de uma proteína, significa-se o processo em que alguma ou toda a conformação tridimensional que confere as propriedades funcionais da proteína foi perdida com uma consequente perda de atividade e/ou solubilidade. As forças perturbadoras durante a desnaturação incluem ligações intramolecular, por exemplo, forças eletrostáticas, hidrofóbicas, de Van der Waals, ligações de hidrogênio e dissulfetos. A desnaturação de proteína pode ser causada por forças aplicadas à proteína ou uma solução que compreende a proteína, como uma força mecânica (por exemplo, compressiva ou força de cisalhamento), térmica, estresse osmótico, mudança no pH, campos elétricos ou magnéticos, radiação ionizante, radiação ultravioleta e desidratação, e por desnaturantes químicos.

[0068] A medição da estabilidade da proteína e suscetibilidade de proteína pode ser vista como aspectos iguais ou diferentes da integridade da proteína. As proteínas são sensíveis ou "instáveis" à desnaturação causada pelo calor, por radiação ultravioleta ou ionizante, alterações da osmolaridade ambiente e pH em solução líquida, força de cisalhamento mecânico imposta por filtração por poros pequenos, radiação ultravioleta, radiação ionizante, como irradiação gama, desidratação química ou por calor, ou qualquer outra ação ou força que possa causar a perturbação da estrutura protéica. A estabilidade da molécula pode ser determinada com o uso de métodos padrão. Por exemplo, a estabilidade de uma molécula pode ser determinada mediante a medição da temperatura de fusão térmica (Tm), a temperatura em ° Celsius (°C) na qual metade das moléculas se tornam desdobradas, com o uso de métodos padrão. Tipicamente, quanto mais alta Tm a, mais estável é a molécula. Em adição ao calor, o ambiente químico também altera a capacidade da proteína de manter uma estrutura tridimensional particular.

[0069] A desnaturação química pode, de modo semelhante, ser medida por uma variedade de métodos. Desnaturantes químicos incluem o hidrocloreto de guanidínio, tiocianeto de guanidínio, ureia, acetona, solventes orgânicos (DMF, benzeno, acetonitrilo), sais (brometo de lítio sulfato de amônio, cloreto de lítio, brometo de sódio, cloreto de cálcio, cloreto de sódio); agentes de redução (por exemplo, ditiotreitol, beta-mercaptoetanol, dinitrotiobenzeno e hidretos, como boroidreto de sódio), detergentes não iônicos e iônicos, ácidos (por exemplo, ácido clorídrico (HCl), ácido acético (CH3COOH), ácidos acéticos halogenados), moléculas hidrofóbicas (por exemplo, fosofolipídeos), e desnaturantes alvejados. A quantificação da extensão da desnaturação pode depender da perda de uma propriedade funcional, como a capacidade de se ligar a uma molécula- alvo, ou por propriedades fisioquímicas, como a tendência a agregação, exposição de resíduos de solventes anteriormente inacessíveis, ou perturbação ou formação de ligações dissulfeto.

[0070] O domínio de ligação ABDcon e suas variantes pode ser ligado de maneira funcional a um agente bioativo. Agentes bioativos exemplificadores são peptídeos e proteínas que podem ser ligados de maneira funcional a ABDCon e suas variantes usando ligantes bem conhecidos, por exemplo, um ligante que contenha poli-glicina, glicina e serina (ligante Gly-Ser), ou alanina e prolina. O uso de ligantes de peptídeo de ocorrência natural e também artificiais é bem conhecido na literatura (Hallewell et al., J Biol Chem 264:5260-5268, 1989; Alfthan et al., Protein Eng. 8:725-731, 1995; Robinson & Sauer, Biochemistry 35:109-116, 1996; patente US n° 5,856,456). O agente bioativo pode ser ligado à ABDCon ou sua variante a partir de seu terminal C ou N. Agentes bioativos multi-específicos podem também ser ligados à ABDCon. Nestes casos, ABDCon pode ser ligado ao N- terminal ou C-terminal da molécula. ABDCon pode também ser posicionado internamente de modo que um agente multiespecífico, como um que é ligado ao C-terminal de um agente e ao N-terminal de outro. Agentes bioativos podem também ser acoplados aos domínios de ligação à albumina da invenção usando reticulação química bem conhecida na técnica, por exemplo, usando ligação por hidrazona ou semicarbazona. Agentes bioativos exemplificadores são proteínas especificamente ligando um antígeno alvo como proteínas identificadas de bibliotecas de proteínas de repetição tipo III da fibronectina (FN3), como bibliotecas de base Tencon25, descritas em WO2011/137319A2 e WO2010/093627A2.

[0071] Porções químicas adicionais podem ser incorporadas em ABDCon ou suas variantes desta invenção, como conjugados de toxina, moléculas de polietilenoglicol (PEG) como PEG5000 ou PEG20.000, ácidos graxos e ésteres de ácido graxo de diferentes comprimentos de cadeia, por exemplo, laurato, miristato, estearato, araquidato, beenato, oleato, araquidonato, ácido octanodioico, ácido tetradecanodioico, ácido octanodecanodioico, ácido docossanodioico e similares, polilisina, octano, carboidratos (dextrano, celulose, oligo- ou polissacarídeos) para as propriedades desejadas. Essas porções podem ser fusões diretas com as sequências de codificação de ABDCon e podem ser geradas por clonagem e técnicas de expressão padrão. Alternativamente, métodos de acoplamento químico bem conhecidos podem ser usados para fixar as porções ABDCon produzido de modo recombinante da invenção.

[0072] ABDCon e suas variantes, bem como fusões de proteínas de agentes bioativos e ABDCon podem ser avaliadas por sua meia- vida usando propriedades farmacocinéticas em modelos in vivo. Exemplos de ABDCon e suas variantes ligam albumina com KD de cerca de entre 1 pM - 1 μM, entre 75 pM - 860 nM, entre 100 pM - 500 nM, ou entre 1 nM - 100 nM.

Geração e produção de ABDCon e suas variantes

[0073] A geração de domínios de ligação de albumina da invenção é tipicamente alcançada no nível de ácido nucleico usando métodos padrão. As variantes ABDCon que tem códons substituídos em um ou mais resíduos em particular pode ser sintetizada por exemplo usando métodos de clonagem PCR padrão, ou síntese genética química de acordo com os métodos descritos na patente US n°. 6.521.427 e patente US n°. 6.670.127, ou usando a mutagênese Kunkel (Kunkel et al., Methods Enzymol 154:367-382, 1987). Se códons aleatórios devem ser usados para qualquer posição de resíduo, a randomização pode ser alcançada utilizando métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, degeneração de oligonucleotídeos correspondendo à diversidade projetada, ou por exemplo usando códons NNK, que codificam todos os 20 aminoácidos de ocorrência natural. Em outros esquemas de diversificação, códons DVK podem ser usados para codificar aminoácidos Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly, e Cys. Alternativamente, códons NNS podem ser usados para dar origem a todos os 20 resíduos de aminoácidos e simultaneamente reduzir a frequência de códons de parada. As designações de códon são de acordo com a bem conhecida codificação IUB (International Union of Biochemistry).

[0074] A síntese de oligonucleotídeos com "degenerescência" de nucleotídeo selecionada em certas posições é bem conhecida naquela técnica, por exemplo, a abordagem TRIM (Knappek et al., J Mol Biol 296:57-86, 1999; Garrard & Henner, Gene 128:103-109, 1993). Esses conjuntos de nucleotídeos que têm certos conjuntos de códons podem ser sintetizados com o uso de reagentes de nucleotídeo e nucleosídeo e aparelhos comercialmente disponíveis.

[0075] A clonagem padrão e técnicas de expressão são usadas para clonar ABDCon ou suas variantes em um vetor ou sintetizar cDNA de filamento duplo de ABDCon para expressar ou traduzir a proteína in vitro. Agentes bioativos podem ser ligados de maneira funcional à ABDCon ou suas variantes usando métodos bem conhecidos na técnica.

Vetores e moléculas de ácido nucleico

[0076] A invenção fornece ácidos nucleicos que codificam ABDCon ou suas variantes nesta invenção como polinucleotídeos isolados ou como porções de vetores de expressão ou como porções de sequências de DNA linear, incluindo sequências de DNA linear usadas para transcrição/tradução in vitro, vetores compatíveis com expressão de fago procariótico, eucariótico ou filamentoso, secreção e/ou exibição das composições. Certos polinucleotídeos exemplificadores são apresentados aqui, entretanto, outros polinucleotídeos que, dada a degeneração do código genético ou preferências de códon em um dado sistema de expressão, codificam ABDCon ou suas variantes desta invenção, também estão no escopo da invenção.

[0077] Os polinucleotídeos da invenção podem ser produzidos por síntese química, como síntese de polinucleotídeo de fase sólida em um sintetizador de polinucleotídeo automatizado e montados em moléculas de ramificação simples ou dupla completas. Alternativamente, os polinucleotídeos da invenção podem ser produzidos por meio de outras técnicas como PCR, seguido de clonagem de rotina. As técnicas para produção ou obtenção de polinucleotídeos de uma dada sequência são bem conhecidos na técnica.

[0078] Os polinucleotídeos da invenção podem compreender pelo menos uma sequência não codificadora, como uma sequência promotora ou intensificadora, íntron, sinal de poliadenilação e similares. As sequências de polinucleotídeo também podem compreender sequências adicionais que codificam aminoácidos adicionais que codificam, por exemplo, um marcador ou uma sequência de etiqueta como uma etiqueta de hexa-histidina ou uma etiqueta de HA para facilitar a purificação ou a detecção da proteína, uma sequência de sinais, um parceiro de proteína de fusão, como RepA codificando um agente bioativo, e similares.

[0079] Um polinucleotídeo exemplificador compreende sequências codificando ABDCon, sequências para um local de ligação de ribossomo, sequência promotora, sequência terminadora, gene para resistência a antibióticos, e uma origem de replicação bacteriana (ori). Polinucleotídeos exemplificadores codificando domínios de ligação de albumina da invenção são mostrados na SEQ ID NO: 35.

[0080] Outra modalidade da invenção é um vetor que compreende pelo menos um polinucleotídeo da invenção. Tais vetores podem ser vetores de plasmídeo, vetores virais, vetores para expressão de baculovirus, vetores à base de transpóson ou quaisquer outros vetores adequados para a introdução dos polinucleotídeos da invenção em um dado organismo ou antecedente genético por quaisquer meios. Tais vetores podem ser vetores de expressão que compreendem elementos de sequência de ácidos nucleicos que podem controlar, regular, ocasionar ou permitir a expressão de um polipeptídeo codificado por tal vetor. Esses elementos podem compreender sítios de ligação de intensificadores transcricionais, sítios de iniciação de RNA polimerase, sítios de ligação de ribossomas, e outros sítios que facilitam a expressão de polipeptídeos codificados em um dado sistema de expressão. Tais sistemas de expressão podem ser à base de célula, ou sistemas isentos de célula bem conhecidos na técnica.

Seleção de células hospedeiras ou engenharia de células hospedeiras

[0081] ABDCon e suas variantes na presente invenção podem ser opcionalmente produzidas por uma linhagem celular, uma linhagem celular mista, uma célula imortalizada ou população clonal de células imortalizadas, como já é conhecido na técnica. Consulte, por exemplo, Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, EUA (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor, NY, EUA (1989); Harlow e Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, EUA (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY, EUA (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, EUA, (1997-2001).

[0082] A célula hospedeira escolhida para a expressão pode ser de origem de mamífero ou pode ser selecionada dentre COS-1, COS- 7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, HeLa, mieloma, linfoma, levedura, células de inseto ou vegetais, ou qualquer célula derivada, imortalizada ou transformada disso. Alternativamente, a célula hospedeira pode ser selecionada dentre uma espécie ou organismo que não tem a capacidade de glicolisar polipeptídeos, por exemplo, uma célula ou organismo procariótico, como BL21, BL21(DE3), BL21-GOLD(DE3), XL1-Blue, JM109, HMS174,HMS174(DE3), e qualquer uma das cepas de E. coli spp, Klebsiella spp., ou Pseudomonas spp naturais ou manipuladas.

Usos de domínios de ligação de albumina da invenção

[0083] As composições do domínio de ligação não natural de albumina ABDCon e variantes desta invenção podem ser usadas para modular a meia vida e/ou biodistribuição de um agente bioativo dentro do tecido de um animal, ao ligar operacionalmente ABDCon e o agente bioativo, e onde a administração da composição a um animal resulta em uma meia vida e/ou biodistribuição do agente bioativo, que é diferente da distribuição de tecido obtida mediante a administração do agente ativo sozinho.

Composições farmacêuticas compreendendo ABDCon ou variações deste

[0084] O ABDCon ou variações deste ligando albumina operacionalmente ligada a agentes bioativos pode ser isolada usando procedimentos de separação bem conhecidos na técnica para captura, imobilização, particionamento ou sedimentação, e purificada durante o tempo necessário para sua aplicação comercial.

[0085] Para uso terapêutico, as proteínas de fusão de molécula- ABDCon bioativas podem ser preparadas como composições farmacêuticas contendo uma quantidade eficaz da proteína de fusão de molécula-ABDCon bioativa como um ingrediente ativo em um veículo farmaceuticamente aceitável. O termo "veículo" se refere a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual o composto ativo é administrado. Tais veículos podem ser líquidos, como água e óleos, inclusive aqueles derivados de petróleo, animal, origem vegetal ou sintética, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares. Por exemplo, podem ser usadas solução salina a 0,4% e glicina a 0,3%. Estas soluções são estéreis e, em geral, livres de matéria particulada. As mesmas podem ser esterilizadas através de técnicas de esterilização bem conhecidas (por exemplo, filtração). As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis conforme exigido para aproximá-las das condições fisiológicas como agentes de tamponamento e de ajuste de pH, de estabilização, espessantes, lubrificantes e corantes, etc. A concentração da proteína de fusão ABDCon-agente bioativo em tal formulação farmacêutica pode variar amplamente, isto é, de menos que cerca de 0,5%, geralmente em ou pelo menos cerca de 1% até tanto quanto 15 ou 20%, em peso, e será selecionada primariamente com base na dosagem exigida, volume do fluido, viscosidades, etc., de acordo com o modo particular de administração selecionado. Veículos adequados e formulações são descritas, por exemplo, em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams e Wilkins, Philadelphia, PA, EUA 2006, Parte 5, Pharmaceutical Manufacturing, páginas 691 a 1092, Consulte especificamente páginas 958 a 989.

[0086] O modo de administração para o uso terapêutico do agente bioativo-proteína de fusão ABDCon pode ser qualquer rota adequada que leve o agente ao hospedeiro, como uma administração parenteral, por exemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa ou subcutânea, pulmonar; transmucosa (oral, intranasal, intravaginal, retal); utilizando a formulação em um comprimido, cápsula, solução, suspensão, pó, gel, partícula; e contido em uma seringa, dispositivo implantado, bomba osmótica, cartucho, microbomba; ou outros meios conhecidos pelo versado na técnica, assim como bem conhecidas na técnica. A administração sítio-específica pode ser alcançada, por exemplo, por aplicação intrarticular, intrabronquial, intra-abdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitária, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intra-hepática, intracardíaca, intraosteal, intrapélvica, intrapericardíaca, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarretal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinhal, intrassinovial, intratorácica, intrauterina, intravascular, intravesical, intralesional, vaginal, retal, bucal, sublingual, intranasal ou transdérmica.

[0087] Embora a invenção tenha sido descrita em termos gerais, as modalidades da invenção serão descritas adicionalmente nos exemplos a seguir, os quais não devem ser compreendidos como limitadores do escopo das reivindicações.

Exemplo 1. Geração de domínio de ligação de albumina não natural Projeto de consenso de domínio de ligação de albumina não natural (ABDCon)

[0088] Um domínio de ligação de albumina (ABD) não natural foi projetado calculando uma sequência de consenso de aminoácido de sequências ABD de feixe de 3 hélices depositada no banco de dados de proteína não redundante. Para determinar a sequência de consenso, o ABD da proteína G de Streptococcus sp. G148 (SEQID NO: 1) foi usado como uma sequência de modelo para uma pesquisa BLAST contra o banco de dados de proteína NCBI não redundante (http:_//blast_ncbi_nlm_nih_gov/Blast_cgi). Todas as configurações padrão foram usadas para a pesquisa BLAST; Limite esperado = 10, tamanho da palavra = 3, matriz = BLOSUM62, custos intervalo = existência 11, extensão 1, e ajustes composicionais = ajuste de matriz de pontuação composicional condicional. A partir desta pesquisa, os 20 domínios de proteína relacionados mais aproximados, listados na tabela 1 (SEQ ID NOs: 1-20), foram selecionados para serem incluídos em um alinhamento de sequência múltipla para determinar um consenso. Somente sequências não redundantes foram selecionadas. Diversos números de acesso de proteínas são listados múltiplas vezes na tabela 1, indicando que algumas proteínas contém vários domínios ABD com relações aproximadas. A SEQ ID NO:4 é uma ABD não natural derivada por exibição de bacteriófago e embaralhamento genético. (He et al., Protein Sci 16::1490-1494, 2007). Tabela 1

[0089] Um alinhamento de sequência múltipla foi gerado das sequências listadas usando o sofware AlignX (usando todas as configurações padrão). O alinhamento da sequência mostrado na tabela 6 foi usado para selecionar o aminoácido mais prevalente em cada posição de sequência para derivar a sequência de consenso de domínio de ligação de albumina, ABDCon (SEQID NO: 21, tabela 6). Tyr foi escolhido ao invés de Ile para a posição 21 já que não surgiu consenso claro para esta posição e os resíduos aromáticos Tyr e Phe foram bem representados. Identidades sequenciais em pares entre ABDCon se situam entre 45% (SEQID NO: 3) a 82% (SEQID NOs: 8, 13, 14, e 16). Síntese genética

[0090] A sequência de aminoácidos do consenso de domínio de ligação de albumina (ABDCon) foi retraduzido em uma codificação de sequência de ácido nucleico para ABDCon usando códons preferenciais para a expressão de E. coli conforme abaixo (SEQID NO: 35) e um gene sintético foi produzido (BlueHeron Biotechnologies). As sequências de DNA 5' e 3' foram adicionadas à sequência de gene sintético da SEQID NO: 34 para assim adicionar locais NdeI e XhoI para subclonagem, bem como sequências de codificação de DNA para uma etiqueta N-terminal 8-His para purificação de proteína. Este gene foi clonado em um vetor pET26 (Novagen) para expressão ativada por uma sequência promotora T7 e transformada em uma linhagem E. coli BL21(DE3) (Novagen).

Expressão e purificação

[0091] Para expressão de ABDcon, 50 mL de meio LB suplementado com 30 μg/mL de canamicina foi inoculado com 1 colônia e cultivado de um dia para o outro a 37°C, com agitação de 220 rpm. No dia seguinte, 10 mL da cultura foi adicionada a 100 mL de caldo Terrific suplementado com 30 μg/mL de canamicina e então cultivada a 37°C, 220 rpm durante 2 horas e meia. IPTG foi adicionado na concentração final de 1 mM e a temperatura foi reduzida a 30°C para induzir a expressão protéica. Células foram retiradas 14 horas depois por centrifugação a 4000 X g por 20 minutos e as péletes celulares foram armazenadas a -20°C. Péletes celulares congelados foram ressuspensos em 5 mL de BugBuster HT (Novagen) por grama de pélete úmida e gentilmente misturados à temperatura ambiente durante 30 minutos. A molécula ABDCon etiquetada com poli-histidina foi purificada por cromatografia Ni-NTA (GE Healthcare), eluída em um tampão de 50 mM de fosfato de sódio com pH 7,4, 500 mM de cloreto de sódio com um gradiente de 10-250 mM de imidazol. Frações contendo ABDCon foram agrupadas e adicionalmente purificadas por cromatografia de exclusão de tamanho usando uma coluna Superdex75 16/60 (GE Healthcare) com uma fase móvel de PBS. A pureza foi avaliada por análise SDS-PAGE (Figura 1). Espectrometria de massa determinou a massa como 6383 Da, em concordância com a massa teórica de 6382 Da (Figura 2). A cromatografia de exclusão de tamanho analítica usando uma coluna Superdex 75 5/150 (GE Healthcare) mostra que a preparação do ABDCon está livre de agregados e eluentes em um tempo consistente com uma proteína monomérica (Figura 3).

Exemplo 2. Caracterização de ABDCon Estabilidade térmica de ABDCon

[0092] ABDCon foi concentrado a 2,175 mg/mL em PBS com pH 7,4 e a estabilidade térmica foi avaliada por calorimetria de varredura diferencial (CVD). Dados de estabilidade foram gerados por aquecimento de 400 μL da solução de ABDCon de 25°C a 100°C a uma taxa de varredura de 1°C por minuto em um instrumento VP-DSC (MicroCal). Uma segunda varredura idêntica foi completada na amostra para poder avaliar a reversibilidade do dobramento/desdobramento térmico. Dados foram adaptados a um modelo de desdobramento de 2 estados para poder calcular a temperatura de fusão. A Figura 4 mostra que ABDCon tem uma alta estabilidade térmica de 81,5°C em PBS e que o dobramento é totalmente reversível.

Ligação de ABDCon à albumina

[0093] A cinética da ligação de ABDCon à albumina sérica humana e albumina sérica em ratos foi medida em um sistema de matriz de interação protéica ProteOn™ XPR-36 (Bio-Rad) usando chips sensores de GLC. seres humanos (SEQ ID NO: 36), rhesus (SEQ ID NO: 37), e murinos (SEQ ID NO: 38) albuminas séricas foram obtidas junto à Sigma (Catálogo # A4327 para seres humanos, #A3559 para murinos e #A4297 para rhesus) e ressuspensas em PBS em diferentes concentrações. Cada albumina sérica foi diretamente imobilizada em um canal ligante na orientação vertical de um chip GLC por meio de acoplamento de amina padrão a 2,1 μg/mL e pH 5,0 para obter superfícies com densidades ligantes de 500-1000 unidades de ressonância. A ligação do ABDCon recombinante foi testada fluindo cinco concentrações diferentes (por exemplo 1 μM diluído em uma série de concentração de 3 vezes) como analitos simultaneamente na orientação horizontal sobre as superfícies de albumina sérica imobilizada. As fases de dissociação para todas as concentrações foram monitoradas por duas horas a uma taxa de fluxo de 100 μL/min usando PBST (PBS, 0,005% Tween20) como o tampão de uso. Uma sexta amostra (somente tampão) foi injetada para monitorar a estabilidade de nível basal. As superfícies foram regeneradas usando 1 pulso curto (18 μL) de 0,8% de ácido fosfórico.Tabela 2

[0094] Os dados de resposta puros foram primeiro processados subtraindo somente as respostas do tampão e a ligação não específica entre os analitos e o chip. Dados processados de todas as cinco concentrações foram adequados globalmente a um modelo de ligação langmuir 1:1 simples para cada superfície ligante. A tabela 2 descreve as cinéticas de ligação determinadas para cada espécie de albumina. Meia-vida sérica de fusão ABDCon em camundongos

[0095] A habilidade de ABDCon para estender a meia-vida de uma proteína de fusão foi avaliada pela produção de um gene sintético codificando uma fusão de ABDCon ao c-terminal de Tencon25. Tencon25 é um arcabouço de proteína com base em uma sequência de consenso de proteínas de repetição tipo III da fibronectina (FN3) que têm uma sequência mostrada nos resíduos 1-90 da SEQ ID NO: 39, e descrito na US2011/0274623A1. Os domínios de proteína Tencon25 e ABDCon foram fundidos por um ligante de peptídeo (G4S)2 (SEQ ID NO: 40). A proteína de fusão resultante tem uma sequência de polipeptídeo mostrada na SEQ ID NO: 39. Uma etiqueta de polihistidina foi incorporada no C-terminal para propósitos de purificação. Sessenta e nove camundongos fêmea BALB/c foram divididos em 3 grupos (N=3 grupo 1 de controle não tratado e N= 33 grupos 2-3). Os camundongos foram tratados com uma única dose intravenosa da proteína de fusão Tencon25-ABDCon a 2 mg/kg. A dosagem foi baseada no peso dos animais no dia da administração. Os camundongos foram eutanasiados nos seguintes pontos de tempo após a injeção: 10 minutos, 30 minutos, 1, 4, 6 horas e 1, 2, 3, 7, 10, 14 dias. Amostras sanguíneas foram tomadas de cada animal por meio de punção cardíaca. Permitiu-se a coagulação das amostras sanguíneas em temperatura ambiente por 30 minutos, mas não mais do que 1 hora. As amostras sanguíneas foram então centrifugadas a aproximadamente 3.500 rpm durante 15 minutos. Amostras sorológicas foram analisadas usando um sanduíche ELISA homogêneo na plataforma de mesoescala de descoberta (MSD, do inglês Meso scale Discovery). Placas com estreptavidina-ouro (MSD) foram bloqueadas por 1 hora com Superblock (TBS) Tween-20 (térmico). Anticorpo policlonal anti-Tencon25 foi usado para ambas captura (biotinilado) e detecção (marcado com sulfo-etiqueta MSD) a 0,625 μg/mL. O antígeno e anticorpos foram adicionados às placas, que foi então encubada por 2 horas com agitação vigorosa em RT. As placas foram lavadas com TBS-T (Sigma) e o tampão de leitura MSD com tensoativo foi adicionado. As placas foram lidas utilizando o MSD Sector Imager 6000. Os dados foram analisados usando o prisma GraphPad. Estudos anteriores mostraram que uma molécula similar não fundida de Tencon é eliminada rapidamente da corrente sanguínea com uma meia-vida sorológica de aproximadamente 20 minutos em camundongos. A fusão de Tencon25 ao ABDCon estende a meia-vida sorológica em mais de 60 horas (Figura 5).

Exemplo 3: Engenharia de ABDCon para afinidade variada à albumina sérica

[0096] A afinidade de ligação à albumina sérica pode ditar não somente a meia-vida sérica de uma proteína terapêutica, mas também a habilidade daquela molécula para se ligar e neutralizar seu alvo. Por exemplo, uma molécula que se liga à albumina sérica humana de modo muito fraco terá uma meia-vida sérica curta devido à filtragem renal, se não estiver ligada à albumina (Hopp et al., Protein Eng Des Sel 23:827-834, 2010). Do lado contrário, uma molécula que se liga à albumina de modo muito forte não será liberada da albumina no local preferencial de ação, podendo ser incapaz de neutralizar o alvo desejado em alguns casos. É, portanto, preferencial alcançar uma extensão de meia-vida por meio de ligação à albumina de uma maneira que a interação com a albumina seja somente forte o suficiente para obter a meia-vida sérica desejada. Como a sequência ABDCon descrita aqui se liga à albumina sérica humana com uma afinidade de 75 pM e uma taxa de dissociação de 3,02x10-5 1/s (sob condições experimentais descritas aqui), moléculas fundidas à ABDCon serão amplamente ligadas à albumina uma vez administradas a um animal ou paciente. Para alguns alvos e fusões, pode ser desejável ser ligado de modo mais fraco à albumina sérica. Dez versões mutadas de ABDCon foram desenvolvidas para reduzir a afinidade de ligação de ABDCon com a albumina. A tabela 3 resume estas mutações:Tabela 3

[0097] As mutações ABDCon foram selecionadas examinando a estrutura de cristal do módulo GA (módulo de ligação à albumina relacionado à proteína G) ligada à albumina sérica humana (código PDB 1TF0) (Lejon et al., Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun 64:64-69, 2008) e assumindo que ABDCon se liga à albumina de modo muito similar à GA. Mutantes foram projetados para diminuir a afinidade de ABDCon à albumina interrompendo os contatos hidrofóbicos, introduzindo conflitos estéricos, interrompendo pontes salinas e interrompendo ligação ao hidrogênio (tabela 3). Mudanças introduzidas foram projetadas para diminuir a afinidade de ligação sem mudar a superfície de ligação de modo dramático para que não fosse eliminada a ligação. Cada mutante foi expressado e purificado a partir de E. coli conforme descrito para ABDCon. ABDCon11 mutante foi verificado como sendo insolúvel e assim foi excluído de análises posteriores. As afinidades de cada variação para a albumina sérica humana, de ratos e rhesus foram determinadas por ressonância de plasma de superfície e mostradas na tabela 4. Adicionalmente às posições listadas na tabela 3, resíduos L25, E33, G34, L38, I42 e A45 podem ser mutados para aumentar ou diminuir a afinidade de ABDCon para albumina já que é assumida sua formação de contato direto com albumina.Tabela 4.

Exemplo 4: Meia-vida sérica de proteínas de fusão variantes de ABDCon

[0098] Tencon25 (aminoácidos 1-90 da SEQ ID NO: 39) foi fundido à variantes de ABDCon 3, 5, 7 e 9 (tabela 3) para poder avaliar a correlação entre a afinidade de ABDCon para a albumina com extensão de meia-vida. Estas moléculas foram dosadas em camundongos a 2 mg/kg conforme descrito acima em estudos anteriores utilizando métodos idênticos aos descritos para as fusões Tencon25-ABDCon. Um resumo dos parâmetros PK obtidos para estas moléculas é mostrado na tabela 5 e a Figura 6. Aqui é demonstrado que a taxa de liberação é reduzida conforme a afinidade com albumina é aumentada, até alcançar uma afinidade de 103 nM, ponto no qual grandes diferenças nos parâmetros PK não são obtidas. Os dados na tabela 5 demonstram a habilidade para ajustar propriedades como meia-vida, taxa de liberação e exposição total (AUC) mediante a variação da afinidade da molécula de ABDCon para albumina.Tabela 5

Tabela 6

Exemplo 5: Estabilização de domínios de ligação de albumina

[0099] Estudos foram completados para determinar a estabilidade de ABDCon (SEQID NO: 21) quando produzidos como proteínas de fusão com diversos domínios de fibronectinas tipo III (FN3) (consulte, por exemplo, a patente US N°. US2010/0216708). As proteínas de fusão ABDCon de domínio FN3 foram geradas usando técnicas de clonagem padrão. A sequência de aminoácidos de uma das proteínas de fusão, Tencon-ABDCon é mostrada na SEQ ID NO: 41. Outras proteínas de fusão ABDCon de domínio FN3 criadas foram Tencon25- ABDCon, 83-ABDCon e 71-ABDCon. Estas proteínas foram produzidas com etiquetas de polihistidina c-terminal e purificadas por uma combinação de afinidade ao níquel e cromatografia de exclusão de tamanho usando métodos padrão. Cada molécula purificada foi incubada em PBS pH 7,4 a 37°C durante 28 dias antes de análise por SDS-PAGE e espectrometria de massa. A Figura 7A demonstra que foi verificado que cada proteína de fusão ABDCon de domínio FN3 sofria degradação durante esta incubação, como evidenciado pela aparência de bandas de baixo peso molecular no gel SDS-PAGE. A análise por espectrometria de massa confirmou que o padrão de degradação principal foi o recorte destas moléculas nos resíduos L1, K2, e E3 da sequência ABDCon (SEQ ID NO: 21). Além disso, foi observado que a proteína nativa G ABD de Streptococcus (SEQ ID NO: 1) fundida a um domínio FN3 exibiu um padrão similar de degradação com recorte no resíduo L1 quando incubada a 4°C durante 6 a 8 meses (dados não mostrados). Finalmente, diversos lotes purificados de ABD nativo (SEQ ID NO:1) e ABDCon (SEQID NO: 21) foram observados como inativos e indetectáveis na solução por SDS-PAGE uma vez armazenados por diversos meses a 4°C, indicativo de degradação severa.

[00100] As observações acima sugeriram que a hélice alfa N- terminal de ABDCon e estruturas nativas ABD como usadas para extensão de meia-vida sorológica são instáveis. Esta falta de estabilidade para tais proteínas de fusão não é desejável já que potencialmente limita a vida útil de tais moléculas para pesquisa bem como aplicações terapêuticas. Deste modo, uma estratégia foi desenvolvida para aprimorar a estabilidade destas moléculas. A análise de estruturas tridimensionais de domínios de ligação à albumina depositados no banco de dados de proteínas mostra que a sequência N-terminal de aminoácido TIDQWL (SEQ ID NO: 42) encontrada até o início do ABD nativo (SEQ ID NO: 1) é ordenada estruturalmente como parte da primeira hélice alfa desta molécula em diversas estruturas cristalinas (e.g. PDB 2VDB, Acta Cryst 2008 F64, 64-69). Isto ocorre em contraste à estrutura NMR original de ABD que mostrou esta região desordenada em solução (PDB 1GAB, Johansson et al., J.Mol.Biol. 266: 859-865, 1997). Deste modo, pensou-se que estender esta primeira hélice alfa das sequências de ABD e ABDCon poderia conferir maior estabilidade a esta região, já que estender as hélices alfa pode conferir maior estabilidade a tal hélice (Su et al., Biochemistry 33:15501-15510, 1994).

[00101] Um alinhamento de sequências múltiplas dos domínios de ligação naturais à albumina apresentados na tabela 1 não revelaram uma sequência de consenso clara para estes resíduos N-terminais. Entretanto, uma sequência de peptídeo, TIDEWL (SEQ ID NO: 43), está presente no N-terminal para 5 destes domínios de proteínas. Dessa forma, um novo construto de ABDCon, ABDCon12 (SEQ ID NO: 44) foi gerado, adicionando a sequência TIDEWL ao N-terminal de ABDCon. Esta proteína foi expressada com uma etiqueta de polihistidina N-terminal e purificada até a homogeneidade usando métodos padrão para cromatografia por afinidade ao níquel e cromatografia de exclusão de tamanho. A ABDCon12 purificada foi incubada a 37°C em PBS durante 28 dias e a estabilidade foi avaliada por SDS-PAGE e espectrometria de massa. SDS-PAGE mostrou um padrão de migração levemente mais rápido após o dia 14, indicativo de degradação. A análise de massa total, entretanto, demonstrou que esta degradação ocorre exclusivamente na etiqueta de polihistidina e não na sequência de ABDCon12, indicando que a sequência TIDEWL aprimorou a estabilidade de ABDCon. Provas posteriores de estabilidade foram demonstradas na estabilidade de uma proteína de fusão ABDCon12 de domínio FN3 gerada (Figura 7B) que mostrou significativamente menos produtos de degradação quando comparada às moléculas originais ABDCon de domínio FN3 (Figura 7A) quando incubadas a 37°C em PBS durante 28 dias.

[00102] A temperatura de fusão de ABDCon12 foi determinada por calorimetria de varredura diferencial usando os procedimentos descritos no exemplo 2 acima, para investigar o mecanismo de estabilização para esta molécula. Uma temperatura de fusão de 90,9°C foi obtida em PBS, um aumento de 9,4° comparado à molécula ABDcon original, sugerindo que a redução em proteólise/degradação observada para as proteínas de fusão ABDCon12 e ABDCon12 é o resultado de estabilidade conformacional aprimorada, proporcionada pela extensão da hélice alfa N-terminal. SEQ ID NO 41: Tencon-ABDCon MLPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINL TVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTTGGGGS GGGGSLKEAKEKAIEELKKAGITSDYYFDLINKAKTVEGVNALKDEILK AGGHHHHHH SEQ ID NO: 42: Sequência N-terminal de Strep G. ABD TIDQWL SEQ ID NO: 43: Sequência N-terminal anexada a ABDCon TIDEWL SEQ ID NO: 44: ABDCon12 TIDEWLLKEAKEKAIEELKKAGITSDYYFDLINKAKTVEGVNALKDEILK A

Exemplo 6: Caracterização de ABDCon12

[00103] A afinidade de ABDCon12 purificada para se ligar à albumina humana e de murinos foi determinada por ressonância de plasmon de superfície usando os mesmos métodos como descritos acima no exemplo 2. Constantes de dissociação de 0,7 nM e 8,2 nM foram obtidas para ligação de ABDCon12 à albumina humana e de murinos, respectivamente. A habilidade de ABDCon12 para estender a meia-vida sérica de uma molécula de fusão foi demonstrada ao fundir ABDCon12 ao C-terminal de um domínio FN3 especificamente ligando um antígeno. Esta molécula foi administrada a camundongos via injeção IP a 2 mg/kg e analisada conforme descrito acima no exemplo 4. Uma meia-vida terminal de 55 horas foi medida para a proteína de fusão ABDCon12 de domínio FN3.

Exemplo 7: domínios de ligação de albumina estabilizante

[00104] Com base na análise de sequências de domínios de ligação de albumina de ocorrência natural, é previsto que outras sequências adicionadas ao N-terminal de domínios de ligação de albumina possam torná-las mais estável. Por exemplo, uma variedade de diferentes sequências são encontradas como N-terminal para estes domínios naturais de ligação de albumina, por exemplo, mas não se limitando a APAVDV (SEQ ID NO: 45), IAKEKA (SEQ ID NO: 46), TIDQWL (SEQ ID NO: 42), VPAADV (SEQ ID NO: 47), TVKSIE (SEQ ID NO: 48), TPAVDA (SEQ ID NO: 49), TLKSIK (SEQ ID NO: 50), WEKAAA (SEQ ID NO: 51), AVDANS (SEQ ID NO: 52), QLAAEA (SEQ ID NO: 53), ALKAAA (SEQ ID NO: 54), EKLAAA (SEQ ID NO: 55). A adição destas sequências nos domínios de ligação de albumina pode aumentar a estabilidade se estas sequências produzirem hélices alfa maiores. Além disso, peptídeos não naturais que aumentam o comprimento da hélice alfa ou estabilidade são também previstos como estabilizadores de domínios de ligação de albumina.

[00105] Variantes com sequências N-terminal adicionais podem ser geradas usando técnicas padronizadas e suas propriedades testadas conforme descrito supra.

[00106] Ficará claro que a invenção pode ser posta em prática de outro modo do que aquele particularmente descrito na descrição e exemplos acima mencionados. Modificações numerosas e variações da presente invenção são possíveis à luz dos ensinamentos acima e, portanto, estão dentro do escopo das reivindicações em anexo.

Claims (13)

1. Domínio de ligação a albumina isolado não natural, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo que consiste em SEQ ID NOs: 21-34.

2. Domínio de ligação a albumina isolado não natural, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma extensão de 6 aminoácidos em seu N- terminal

3. Domínio de ligação a albumina isolado não natural, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a extensão de 5 aminoácidos compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 42, 43 e 45 a 55.

4. Domínio de ligação a albumina isolado não natural, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a extensão de 5 aminoácidos compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43.

5. Domínio de ligação a albumina isolado não natural, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação a albumina apresenta: (a) uma constante de dissociação (KD) de ligação a albumina humana entre cerca de 50 pM a 1 μM utilizando ressonância de plasmon de superfície em uma vazão de 100 μL/min com o uso de PBST (PBS, 0,005% Tween20) como tampão de corrida; e/ou (b) uma constante de taxa de desconexão (Koff) de ligação a albumina humana em 3,6 x 10-5 a 1,1 x 10-1 usando ressonância de plasmon de superfície a uma taxa de fluxo de 100 μL/min usando PBST (PBS, 0,005% Tween20) como tampão de corrida.

6. Método para produção do domínio de ligação de albumina isolado não natural, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer um polinucleotídeo que codifica o domínio de ligação de albumina isolada não natural; (b) expressar o polinucleotídeo em um hospedeiro ou in vitro; e (c) recuperar o domínio de ligação de albumina isolada.

7. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que codifica o domínio de ligação de albumina não natural, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, compreendendo: (a) um polinucleotídeo que codifica um domínio de ligação a albumina não natural selecionado dentre o grupo que consiste em SEQ ID NOs: 21 a 34 ou 44; ou (b) um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 35.

8. Vetor isolado, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo isolado como definido na reivindicação 7.

9. Célula hospedeira isolada, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor isolado como definido na reivindicação 8, sendo que a célula hospedeira é uma célula transgênica de levedura ou bacteriana.

10. Proteína de fusão, caracterizada pelo fato de que compreende um domínio de ligação a albumina não natural como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e um agente bioativo selecionado dentre o grupo que consiste em proteínas, anticorpos, peptídeos, nucleotídeos e produtos farmacêuticos de moléculas pequenas, em que o agente bioativo se liga especificamente a uma molécula alvo.

11. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o agente bioativo é uma estrutura de proteína que liga especificamente a uma molécula alvo, em que a estrutura da proteína é baseada em Tencon25 compreendendo os resíduos de aminoácidos 1-90 da SEQ ID NO: 39.

12. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o a proteína de ligação a albumina e o agente bioativo são ligados de maneira funcional com o uso de um ligante, em que o ligante compreende um ligante Gly-Ser, tal como em que o ligante compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40.

13. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a proteína de fusão como definida na reivindicação 10 e pelo menos um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

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