ES2841173T3

ES2841173T3 - Variantes de Protoxina-II y métodos de uso

Info

Publication number: ES2841173T3
Application number: ES14790422T
Authority: ES
Inventors: Mack Flinspach; Alan Wickenden; Ross Fellows; Robert Neff; Yi Liu; Rebecca Hagan; Qinghao Xu
Original assignee: Janssen Biotech Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 2013-10-03
Filing date: 2014-10-03
Publication date: 2021-07-07
Anticipated expiration: 2034-10-03
Also published as: WO2015051216A1; JP6676523B2; JP2020096606A; JP2022008319A; HK1224307A1; EP3052519B1; AU2014329454A1; EP3825323A1; CN105793277A; JP2016533710A; MX2016004282A; KR20160064192A; US20150099705A1; CN105793277B; US9624280B2; PH12016500598A1; US10975129B2; BR112016007062A2; EP3052519A1; AU2014329454B2

Abstract

Una variante de Protoxina-II aislada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 40, 44, 56, 59, 65, 78, 109, 110, 111, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 129, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 138, 139, 140, 141, 142, 145, 146, 147, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 156, 158, 159, 172, 173, 175, 177, 178, 183, 184, 185, 186, 189, 190, 193, 196, 197, 199, 205, 207, 210, 211, 216, 217, 224, 230, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 297, 298, 299, 301, 302, 304, 305, 307, 308, 309, 310, 312, 314, 315, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, y 326, en donde la variante inhibe la actividad de Nav1.7 humana con un valor de IC50 de 30x10-9 o menos, en donde el valor de IC50 se mide usando un ensayo de despolarización de membrana FLIPR Tetra, el ensayo comprendiendo transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) en presencia de 3-veratroilveracevina 25x10-6 M en células HEK293 que expresan de manera estable Nav1.7 humano y usando bis-1,3(ácido dietiltiobarbitúrico)trimetina oxonol como un aceptor de electrones y 8-octadeciloxipireno-1,3,6-trisulfonato trisódico como un donante excitando el donante a 390- 420 nm y midiendo FRET a 515-575 nm.

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes de Protoxina-II y métodos de uso

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a variantes de Protoxina-II, polinucleótidos sintéticos que las codifican, y métodos para elaborar y usar lo anterior.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los canales de sodio dependientes de voltaje (VGSC) están presentes en todas las células excitables, incluyendo las células del músculo cardíaco y esquelético y las neuronas centrales y periféricas. En las células neuronales, los canales de sodio son responsables de amplificar las despolarizaciones por debajo del umbral y generar el rápido aumento del potencial de acción. Como tal, los canales de sodio son esenciales para el inicio y propagación de señales eléctricas en el sistema nervioso. Se cree que la función del canal de sodio aberrante subyace en una variedad de trastornos médicos (Hübner y Jentsch, Hum Mol Genet 11:2435-45, 2002), incluyendo la epilepsia (Yogeeswari et al., Curr Drug Targets 5:589-602, 2004), arritmia (Tfelt-Hansen et al., J Cardiovasc Electrophysiol 21:107-15, 2010), miotonía (Cannon y Bean, J Clin Invest 120:80-3, 2010) y dolor (Cregg et al., J Physiol 588:1897-904, 2010). Los canales de sodio son típicamente un complejo de varias subunidades, la principal siendo la subunidad alfa formadora de poros, que por sí sola es suficiente para funcionar.

En los seres humanos existen nueve miembros conocidos de la familia de subunidades alfa de los canales de sodio dependientes de voltaje, Nav1.1-Nav1.9. La subfamilia Nav1.x puede subdividirse farmacológicamente en dos grupos, el sensible a la tetrodotoxina (TTX) y el resistente a TTX. Nav1.7 (también conocido como PN1 o hNE) está codificado por el gen SCN9A, es sensible a TTX y se expresa principalmente en neuronas sensoriales y simpáticas periféricas. Nav1.7 se acumula en las terminaciones de las fibras nerviosas y amplifica las despolarizaciones por debajo del umbral pequeñas y actúa como un canal de umbral que regula la excitabilidad.

La función de Nav1.7 está implicada en varios estados de dolor, incluyendo el dolor agudo, inflamatorio y/o neuropático. En el hombre, las mutaciones de ganancia de función de Nav1.7 se han relacionado con la eritermalgia primaria (PE), una enfermedad caracterizada por dolor ardiente e inflamación de las extremidades (Yang et al., J Med Genet 41:171-4, 2004), y trastorno de dolor extremo paroxístico (PEPD) (Fertleman et al., Neuron 52:767-74, 2006). Consistente con esta observación, los bloqueadores de los canales de sodio no selectivos lidocaína, mexiletina y carbamazepina pueden proporcionar alivio sintomático en estos trastornos dolorosos (Legroux-Crespel et al., Ann Dermatol Venereol 130:429-33, 2003; Fertleman et al., Neuron 52:767-74, 2006).

Las mutaciones con pérdida de función de Nav1.7 en humanos provocan indiferencia congénita al dolor (CIP), un trastorno autosómico recesivo raro caracterizado por una indiferencia o insensibilidad completa a los estímulos dolorosos (Cox et al., Nature 444:894-8, 2006; Goldberg et al., Clin Genet 71:311-9, 2007; Ahmad et al., Hum Mol Genet 16:2114-21, 2007).

Los polimorfismos de un solo nucleótido en la región codificante de SCN9A se han asociado con una excitabilidad de los nociceptores y sensibilidad al dolor aumentadas. Por ejemplo, un polimorfismo rs6746030 que da como resultado la sustitución de R1150W en Nav1.7 humano se ha asociado con dolor de osteoartritis, dolor de discectomía lumbar, dolor fantasma y dolor de pancreatitis (Reimann et al., Proc Natl Acad Sci USA 107:5148-53, 2010). Las neuronas DRG que expresan el Nav1.7 mutante R1150W muestran una frecuencia de descarga aumentada en respuesta a la despolarización (Estacion et al., Ann Neurol 66:862-6, 2009). Una forma incapacitante de fibromialgia se ha asociado con el polimorfismo del canal de sodio SCN9A rs6754031, lo que indica que algunos pacientes con fibromialgia grave pueden tener una canalopatía de sodio de los ganglios de la raíz dorsal (Vargas-Alarcon et al., BMC Musculoskelet Disord 13:23, 2012).

En ratones, la deleción del gen SCN9A en neuronas nociceptivas lleva a la reducción en los umbrales de dolor mecánico y térmico y a la reducción o supresión de las respuestas de dolor inflamatorio (Nassar et al., Proc Natl Acad Sci uSa 101:12706-11, 2004). La ablación de SCN9A en todas las neuronas sensoriales suprimió el dolor mecánico, el dolor inflamatorio y las respuestas de abstinencia refleja al calor. La eliminación de SCN9A en las neuronas tanto sensoriales como simpáticas suprimió el dolor mecánico, térmico y neuropático, y recapituló el fenotipo indoloro observado en humanos con mutaciones de pérdida de función de Nav1.7 (Minett et al., Nat Commun 3:791, 2012). Por lo tanto, los inhibidores o bloqueadores de Nav1.7 pueden ser útiles en el tratamiento de una amplia gama de dolores asociados con varios trastornos.

Se sabe que los venenos de araña contienen una gran cantidad de péptidos bloqueadores de los canales de sodio, incluyendo Huwentoxin-IV (HwTx-IV) (Peng et al., J Biol Chem 277:47564-71, 2002), Protoxina-I, Protoxina-II (Middleton et al., Biochemistry 41:14734-47, 2002) y Frixotoxina-III (Bosmans et al., Mol Pharmacol 69:419-29, 2006). La WO 2012/004664 y Yang et. al. (Yang et. al., Proc Natl Acad Sci USA, 110(43), 17534-17539, 2013) se refieren a péptidos que inhiben el canal de sodio de Nav1.7. Hay una necesidad de identificar bloqueadores

de Nav1.7 adicionales para el tratamiento de una amplia gama de indicaciones de dolor. En particular, hay una

necesidad de nuevos bloqueadores de Nav1.7 con selectividad para Nav1.7 sobre otras isoformas de canales de

sodio dependientes del voltaje.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona una variante de Protoxina-II aislada que comprende una secuencia de

aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID N°:

40, 44, 56, 59, 65, 78, 109, 110, 111, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 129, 131, 132, 133, 134, 135,

136, 138, 139, 140, 141, 142, 145, 146, 147, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 156, 158, 159, 183, 184, 185, 186,

189, 190, 193, 196, 197, 199, 205, 207, 210, 211, 216, 217, 224, 230, 274, 275, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 297, 298, 307, 308, 309, 310, 312, 314, 315, 318, 319,320, 321,322, 323, 324, 325, y 326,

en donde la variante inhibe la actividad de Nav1.7 humana con un valor de IC⁵⁰de 30x10-9 o menos, en donde el

valor de IC⁵⁰se mide usando un ensayo de despolarización de membrana FLIPR Tetra, el ensayo comprendiendo

transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) en presencia de 3-veratroilveracevina 25x10-6 M en

células HEK293 que expresan de manera estable Nav1.7 humano y usando bis-1,3(ácido dietiltiobarbitúrico)trimetina

oxonol como un aceptor de electrones y 8-octadeciloxipireno-1,3,6-trisulfonato trisódicocomo un donante excitando

el donante a 390- 420 nm y midiendo FRET a 515-575 nm.

La invención también proporciona el conjugado de proteínas que comprende la variante de Protoxina-II

como se define por las reivindicaciones conjugada con una fracción de extensión de la vida media; en donde el

conjugado es una proteína de fusión que comprende la variante de Protoxina-II y una albúmina de suero humana

(HSA), dominio de unión a albúmina (ABD), o un polipéptido de Fc, o el conjugado comprende polietilenglicol (PEG)

acoplado químicamente a la variante de Protoxina-II.

La invención también proporciona un polinucleótido aislado que codifica la variante de Protoxina-II como se

define en las reivindicaciones.

La invención también proporciona un vector que comprende el polinucleótido aislado como se define en las

reivindicaciones.

La invención también proporciona una célula huésped que comprende el vector como se define en las

reivindicaciones.

La invención también proporciona un método para producir una variante de Protoxina-II aislada, que

comprende cultivar la célula huésped como se define en las reivindicaciones y recuperar la variante de Protoxina-II

por la célula huésped.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende la variante de Protoxina-II

aislada como se define en las reivindicaciones y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

La invención también proporciona la variante de Protoxina-II como se define en las reivindicaciones para su

uso en el tratamiento de dolor mediado por Nav1.7 en un sujeto con necesidad de ello.

La divulgación proporciona una variante de Protoxina-II aislada que comprende la secuencia

X¹X²X³CX⁴X⁵WX⁶QX⁷CX⁸X⁹X¹⁰X¹¹X¹²CCX¹³X¹⁴FX¹⁵CX¹⁶LWCX¹⁷KKLW (SEQ ID NO: 403), en donde

X^Ies G, P, A o eliminado;

X²es P, A o eliminado;

X³es S, Q, A, R o Y;

X4 es Q, R, K, A o S;

X5 es K, S, Q o R;

X6 es M o F;

X7 es T, S, R, K o Q;

X8 es D o T;

X9 es S, A o R;

X¹⁰es E, R, N, K, T o Q;

X^{I I}es R o K;

X¹²es K, Q, S o A;

X13 es E, Q o D;

X14 es G o Q;

X¹⁵es V o S;

X¹⁶es R o T; y

X¹⁷es K o R;

opcionalmente teniendo una extensión N-terminal o una extensión C-terminal,

en donde el polipéptido inhibe la actividad de Nav1.7 humano con un valor de IC⁵⁰de aproximadamente 1x10-7 M o menos, en donde el valor de IC⁵⁰se mide usando un ensayo de despolarización de membrana FLIPR® Tetra usando transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) en presencia de 3-veratroilveracevina 25x10-6 M en células HEK293 que expresan de manera estable Nav1.7 humano. La divulgación también proporciona una variante de Protoxina-II aislada que comprende la secuencia de aminoácidos que es un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ iD nO: 78 (GPQCQKWMQTCDRERKCCEGFVCTLWCRKKLW-COOH),en donde

la secuencia de aminoácidos tiene Q en la posición 1, Q en la posición 7 y F en la posición 19, cuando la numeración de los residuos es de acuerdo a la SEQ ID NO: 1;

el polipéptido inhibe la actividad de Nav1.7 humana con un valor de IC⁵⁰de aproximadamente 30x10-9 M o menos, en donde el valor de IC⁵⁰se mide usando un ensayo de despolarización de membrana FLIPR® Tetra usando transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) en presencia de 3-veratroilveracevina 25x10-6 M en células HEK293 que expresan de manera estable Nav1.7 humano; y

el polipéptido inhibe selectivamente Nav1.7.

Otra realización de la invención es un polinucleótido que codifica la variante de Protoxina-II de la invención. Otra realización de la invención es un vector que comprende el polinucleótido aislado de la invención. Otra realización de la invención es una célula huésped que comprende el vector de la invención.

Otra realización de la invención es un método para producir la variante de Protoxina-II de la invención, que comprende cultivar la célula huésped de la invención y recuperar la variante de Protoxina-II de la célula.

Otra realización de la invención es una composición farmacéutica que comprende la variante de Protoxina-II aislada de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Otra realización de la invención es una variante de Protoxina-II como se define en las reivindicaciones para su uso en un método para tratar el dolor mediado por Nav1.7 en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de la variante de Protoxina-II de la invención para tratar el dolor mediado por Nav1.7.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos de género de variantes de Protoxina-II que inhiben Nav1.7 con un valor de IC⁵⁰de 30 nM o menos en un ensayo de FLIPR Tetra. La numeración de los residuos es de acuerdo con la Protoxina-II de tipo salvaje de la SEQ ID NO: 1. Género SEQ ID NO: 403.

La Figura 2 muestra los valores de IC⁵⁰para la inhibición de Nav1.7 y Nav1^.6en un ensayo QPatch, y la selectividad de cada variante calculada por la proporción de IC⁵⁰(Nav¹.⁶)/IC50 (Nav1.7) obtenida en el ensayo QPatch. SE: error estándar.

La Figura 3 muestra las secuencias y la secuencia de género de variantes de Protoxina-II que inhiben Nav1.7 con un valor de IC⁵⁰de 30 nM o menos en un ensayo de FLIPR Tetra, y son 30 veces más selectivas sobre Nav1.⁶. La selectividad de cada variante se calculó por la proporción de IC⁵⁰(Nav1.⁶)/IC509av1.7) obtenida en el ensayo de QPatch. La numeración de los residuos es de acuerdo con la Protoxina-II de tipo salvaje de la SEQ ID NO: 1.

La Figura 4A muestra la eficacia de NV1D3034 (NV1D3034-OH) (SEQ ID NO: 78) contra la hiperalgesia térmica inducida por CFA evaluada mediante la medición de la latencia de retirada de la pata en la prueba de Hargreaves antes (pre-CFA) y después de la inyección de CFA (0) y 1 día después de la administración del péptido (1). ***P<^{0 ,0 0 1}frente a PBS, ANOVA de dos vías seguido de la comparación múltiple de Bonferroni.

La Figura 4B muestra la eficacia de NV1D3034 (NV1D3034-OH) (SEQ ID NO: 78) en la hiperalgesia térmica inducida por CFA expresada como porcentaje de MPE (efecto máximo posible) (MPE%) en cada dosis el día 1 después de la administración del péptido. *P<0,05 frente a PBS, ANOVA de una vía seguido de la comparación múltiple de Bonferroni.

La Figura 5A muestra la eficacia de NV1D3368 (NV1D3368-OH) (SEQ ID NO: 198) contra la hiperalgesia térmica inducida por CFA evaluada mediante la medición de la latencia de retirada de la pata en la prueba de Hargreaves antes (pre-CFA) y después de la inyección de CFA (0) y 1 día después de la administración del péptido (1). **P<0,01 y ****P<0,0001 frente a PBS, ANOVA de dos vías seguido de la comparación múltiple de Bonferroni

La Figura 5B muestra la eficacia de NV1D3368 (NV1D3368-OH) (SEQ ID NO: 198) en la hiperalgesia térmica inducida por CFA expresada como porcentaje de MPE (MPE%) en cada dosis el día 1 después de la administración del péptido. *P<0,05 y **P<^{0 ,0 1}frente a PBS, ANOVA de una vía seguido de la comparación múltiple de Bonferroni.

La Figura 6A muestra la eficacia de NV1D2775-OH (SEQ ID NO: 56) contra la hiperalgesia térmica inducida por CFA evaluada mediante la medición de la latencia de retirada de la pata en la prueba de Hargreaves antes (pre-CFA) y después de la inyección de CFA (0) y 1 día después de la administración del péptido (1). ****P<0,0001 frente a PBS, ANOVA de dos vías seguido de la comparación múltiple de Bonferroni.

La Figura 6B muestra la eficacia de NV1D2775-OH (SEQ ID NO: 56) en la hiperalgesia térmica inducida por CFA expresada como porcentaje de MPE (MPE%) en cada dosis el día 1 después de la administración del péptido. ***P<0,001 y ****P<0,0001 frente a PBS, ANOVA unidireccional seguido de la comparación múltiple de Bonferroni.

La Figura 6C muestra la eficacia de NV1D2775-OH (SEQ ID NO: 56) contra la alodinia táctil inducida por CFA. Los umbrales táctiles de la pata trasera antes (pre-CFA) y después de CFA (0) y 1 día después de la administración del péptido (1). ****P<0,0001 frente a PBS, ANOVA de dos vías seguido de la comparación múltiple de Bonferroni.

La Figura 6D muestra la eficacia de NV1D2775-OH (SEQ ID NO: 56) contra la alodinia táctil inducida por CFA expresada como porcentaje de MPE (MPE%) el día 1 después del péptido. ***P<0,001 frente a PBS, ANOVA de una vía seguido de la comparación múltiple de Bonferroni.

La Figura 7A muestra el curso temporal de la reversión de la hiperalgesia térmica mediada por NV1D2775-OH en el modelo CFA evaluado mediante la medición de la latencia de retirada de la pata en la prueba de Hargreaves antes y después del CFA y en varios puntos temporales después de la administración del péptido. **P<0,01 frente a PBS, ANOVA de dos vías seguido de la comparación múltiple de Bonferroni. Las áreas sombreadas indican el período de administración del compuesto (^{0 - 2 4}h).

La Figura 7B muestra el curso temporal de la inversión de la alodinia táctil mediada por NV1D2775-OH en el modelo de CFA evaluado mediante la medición del umbral táctil antes y después del CFA y en varios puntos temporales después de la administración del péptido. **P<0,01 frente a PBS, ANOVA de dos vías seguido de la comparación múltiple de Bonferroni. Las áreas sombreadas indican el período de administración del compuesto (0-24 h).

La Figura 8 muestra que NV1D2775-OH produjo una analgesia significativa en la prueba de la placa calefactora. La latencia de retirada térmica se evaluó a 50 y 55° C antes y después de la implantación de la bomba. La implantación de la bomba no tuvo ningún impacto sobre la latencia en el grupo de control de PBS. Un día después de la bomba, los ratones tratados con NV1D2775-OH mostraron una latencia prolongada en comparación con el grupo de PBS. *P<0,05 y ****P<0,0001 frente a PBS, ANOVA de una vía seguido de la comparación múltiple de Bonferroni.

La Figura 9 muestra que el pretratamiento con NV1D2775-OH protegió a los animales de la hiperalgesia térmica inducida por carragenina. Las latencias de retirada de las patas se midieron antes y el día 1 después de la bomba antes de la inyección de carragenina intraplantar. Las latencias se midieron de nuevo a las 2, 3 y 4 horas después de la carragenina.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Como se usa en la presente y en las reivindicaciones, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen la referencia plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece una invención. Aunque cualquier composición y método similar o equivalente a los descritos en la presente puede usarse en la puesta en práctica o ensayo de la invención, en la presente se describen composiciones y métodos ejemplares.

El término "polipéptido" significa una molécula que comprende por lo menos dos residuos de aminoácidos enlazados por un enlace peptídico para formar un polipéptido. A los polipéptidos pequeños de menos de 50 aminoácidos puede hacerse referencia como "péptidos". A los polipéptidos también puede hacerse referencia como "proteínas".

El término "polinucleótido" significa una molécula que comprende una cadena de nucleótidos enlazados covalentemente por una estructura principal de azúcar-fosfato u otra química covalente equivalente. Los ADN y ARN de cadena doble y sencilla son ejemplos típicos de polinucleótidos.

El término "secuencia complementaria" significa una segunda secuencia de polinucleótidos aislada que es antiparalela a una primera secuencia de polinucleótidos aislada y que comprende nucleótidos complementarios a los nucleótidos en la primera secuencia de polinucleótidos.

El término "vector" significa un polinucleótido no natural capaz de duplicarse dentro de un sistema biológico o que puede moverse entre tales sistemas. Los polinucleótidos de vector contienen típicamente un ADNc que codifica una proteína de interés y elementos adicionales, como orígenes de replicación, señal de poliadenilación o marcadores de selección, que funcionan para facilitar la duplicación o mantenimiento de estos polinucleótidos en un sistema biológico. Los ejemplos de tales sistemas biológicos pueden incluir una célula, virus, animal, planta y sistemas biológicos reconstituidos que utilizan componentes biológicos capaces de duplicar un vector. El polinucleótido que comprende un vector puede ser moléculas de ADN o ARN o un híbrido de estas.

El término "vector de expresión" significa un vector que puede utilizarse en un sistema biológico o un sistema biológico reconstituido para dirigir la traducción de un polipéptido codificado por una secuencia de polinucleótidos presente en el vector de expresión.

El término "variante", como se usa en la presente, se refiere a un polipéptido o un polinucleótido que difiere del polipéptido de Protoxina-II de tipo salvaje de la SEQ ID NO: 1 o el polinucleótido que codifica la Protoxina-II de tipo salvaje que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 107 por una o más modificaciones, por ejemplo, sustituciones, inserciones o deleciones de nucleótidos o aminoácidos.

A lo largo de la especificación, los residuos que están sustituidos en las variantes de Protoxina-II se numeran de acuerdo con su posición en la Protoxina-II de tipo salvaje de la SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, "Y1A" en la memoria descriptiva se refiere a la sustitución de tirosina en la posición del residuo que corresponde a la posición ¹en la Protoxina-II de tipo salvaje de la SEQ ID NO: 1 con alanina.

"ADN complementario" o "ADNc" se refiere a un polinucleótido sintético bien conocido que comparte la disposición de los elementos de secuencia encontrados en especies de ARNm maduras nativas con exones contiguos, eliminándose los intrones intermedios presentes en el ADN genómico. Los codones que codifican la metionina iniciadora pueden estar presentes o no en el ADNc. El ADNc puede sintetizarse, por ejemplo, mediante transcripción inversa o ensamblaje de genes sintética.

"Sintético" o "no natural" como se usa en la presente se refiere a un polinucleótido o una molécula de polipéptidos que no está presente en la naturaleza.

"Nav1.7" (también referido como hNE o PN1) o "hNav1.7" como se usa en la presente se refiere a la bien conocida subunidad alfa de la proteína del canal de sodio humano tipo 9 que tiene una secuencia mostrada en el número de registro de GenBank NP 002968.1 y en la SEQ ID NO: 79.

El término "Protoxina-II de tipo salvaje" o "ProTx-II de tipo salvaje" como se usa en la presente se refiere al péptido de la toxina de la tarántula Thrixopelma pruriens (tarántula de terciopelo verde peruana) que tiene la secuencia de aminoácidos YCQKWMWTCDSERKCCEGMVCRLWCKKKLW-COOH (SEQ ID NO: 1) como se describe en Middleton et al., Biochemistry 41 (50):14734-47, 2002.

El término "Protoxina-II recombinante" o “ProTx-II recombinante” como se usa en la presente se refiere a la Protoxina-II recombinante obtenida a partir de la expresión y posterior escisión de una proteína de fusión de Protoxina-II que tiene la secuencia de GPYCQKWMWTCDSERKCCEGMVCRLWCKKKLW-OH como se muestra en la SEQ ID NO: 2. La Protoxina-II recombinante incorpora una extensión N-terminal de dos aminoácidos (residuos G y P) cuando se compara con la Protoxina-II de tipo salvaje.

“Bloquea la actividad de Nav1.7 humano” o “inhibe la actividad de Nav1.7 humano” como se usa en la presente se refiere a la capacidad de la variante de Protoxina-II de la invención para reducir la despolarización de la membrana inducida por veratridina (3-veratroilveracevina) con un valor de IC⁵⁰de aproximadamente 1x10-7 M o menos en un ensayo de despolarización de membrana FLIPR® Tetra usando transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), donde la despolarización inducida por veratridina se mide como una reducción en la señal FRET usando DISBAC2(3) ([bis-(ácido 1,3-dietiltiobarbitúrico)trimetino oxonol]) como aceptor y PTS18 (8-octadeciloxipireno-1,3,6-trisulfonato trisódico) como donante excitando al donante a 390-420 nm y midiendo FRET a 515-575 nm en una línea celular que expresa de forma estable Nav1.7 humana.

"Ensayo de despolarización de membrana FLIPR® Tetra", como se usa en la presente, es el ensayo descrito en el Ejemplo 3.

El término "sustancialmente idéntico" como se usa en la presente significa que las dos secuencias de aminoácidos de variantes de Protoxina-II que se comparan son idénticas o tienen "diferencias insustanciales". Las diferencias insustanciales son sustituciones de 1, 2, 3, 4, 5, ⁶o 7 aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la variante de Protoxina-II que no afectan negativamente a las propiedades del péptido. Las secuencias de aminoácidos sustancialmente idénticas a las variantes de Protoxina-II divulgadas en la presente están dentro del alcance de la solicitud. En algunos casos, la identidad de secuencia puede ser de aproximadamente el 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, ^{8 6}%, 87%, ^{8 8}%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más. El porcentaje de identidad puede determinarse, por ejemplo, mediante una alineación por pares usando la configuración predeterminada del módulo AlignX de Vector NTI v.9.0.0 (Invitrogen, Carslbad, CA). Las secuencias de proteínas de la presente invención pueden usarse como una secuencia de consulta para realizar una búsqueda en bases de datos públicas o de patentes, por ejemplo, para identificar secuencias relacionadas. Los programas ejemplares usados para realizar tales búsquedas son los programas XBLAST o BLASTP (http_//www_ncbi_nlm/nih_gov), o el paquete GenomeQuest™ (GenomeQuest, Westborough, MA) usando la configuración predeterminada.

En la presente se usan los códigos de aminoácidos convencionales de una y tres letras como se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1.

La presente invención proporciona polipéptidos de variantes de Protoxina-II (ProTx-II) aislados como se define en las reivindicaciones que inhiben la actividad Nav1.7 humana, polinucleótidos que los codifican, vectores, células huésped y métodos de uso de los polinucleótidos y polipéptidos de la invención. Los polipéptidos de la invención inhiben la despolarización resultante de la activación de Nav1.7 y, por lo tanto, pueden ser útiles en el tratamiento de varias afecciones asociadas con el dolor y afecciones asociadas con la disfunción de las neuronas sensoriales o simpáticas.

Las variantes de la invención son potentes inhibidores de Nav1.7. La presente invención se basa, por lo menos en parte, en el descubrimiento de que ciertas sustituciones de residuos en la Protoxina-II mejoran la selectividad, el rendimiento sintético y/o la homogeneidad sin afectar adversamente a la potencia de las variantes de Protoxina-II generadas, específicamente W7 y M19, y adicionalmente los residuos Y1 y S11, y además adicionalmente los residuos E12, R22 y (numeración de residuos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1).

Una realización de la invención es una variante de Protoxina-II aislado, en donde la actividad la variante de Protoxina-II inhibe la actividad de Nav1.7 humano con un valor de IC⁵⁰de aproximadamente 1x10-7 M o menos, aproximadamente 1x10-9 M o menos, aproximadamente 1x10-9 M o menos, aproximadamente 1x10-10 M o menos, aproximadamente 1x10-11 M o menos, o aproximadamente 1x10-12 M o menos, en donde el valor de IC⁵⁰se mide usando un ensayo de despolarización de membrana FLIPR® Tetra que usa transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) en presencia de 3-veratroilveracevina 25x10-6 M en células HEK293 que expresan establemente Nav1.7 humano y usando bis-1,3(ácido dietiltiobarbitúrico) trimetina oxonol como un aceptor de electrones y 8-octadeciloxipireno-1,3,6-trisulfonato trisódico como un donante excitando el donante a 390-420 nm y midiendo FRET a 515-575 nm.

La divulgación proporciona una variante de Protoxina-II aislada que comprende la secuencia X¹X²X³CX⁴X⁵WX⁶QX⁷CX⁸X⁹X¹⁰X¹¹X¹²CCX¹³X¹⁴FX¹⁵CX¹⁶LWCX¹⁷KKLW (SEQ ID NO: 403), en donde

X^Ies G, P, A o eliminado;

X²es P, A o eliminado;

X³es S, Q, A, R o Y;

X⁴es Q, R, K, A o S;

X5 es K, S, Q o R;

X6 es M o F;

X7 es T, S, R, K o Q;

X8 es D o T;

X9 es S, A o R;

X¹⁰es E, R, N, K, T o Q;

X^{I I}es R o K;

X¹²es K, Q, S o A;

X13 es E, Q o D;

X¹⁴es G o Q;

X15 es V o S;

X¹⁶es R o T; y

X17 es K o R;

opcionalmente teniendo una extensión N-terminal o una extensión C-terminal,

en donde el polipéptido inhibe la actividad de Nav1.7 humano con un valor de IC⁵⁰de aproximadamente 1x10-7 M o menos, en donde el valor de IC⁵⁰se mide usando un ensayo de despolarización de membrana FLIPR® Tetra usando transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) en presencia de 3-veratroilveracevina 25x10-6 M en células HEK293 que expresan de manera estable Nav1.7 humano

La extensión N-terminal comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384 o 385.

La extensión C-terminal comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 374, 386, 387, 388, 389, 390, 391,392, 393, 394, 395, 396 o 397.

La extensión N-terminal y/o C-terminal puede conjugarse con la variante de Protoxina-II a través de un conector.

El conector puede comprender la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 383, 392, 398, 399, 400, 401 o 402.

La extensión N-terminal puede consistir de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381,382, 383, 384 o 385.

La extensión C-terminal puede consistir de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 374, 386, 387, 388, 389, 390, 391,392, 393, 394, 395, 396 o 397.

El conector puede consistir de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 383, 392, 398, 399, 400, 401 o 402.

Las variantes de Protoxina-II de la invención son potentes inhibidores de Nav1.7. La Protoxina-II recombinante (SEQ ID NO: 2) tiene un valor de IC⁵⁰de aproximadamente 4x10-9 M para Nav1.7 humano en un ensayo de inhibición de la despolarización inducida por veratridina que mide la disminución de FRET (transferencia de energía de resonancia de fluorescencia) en las células que expresan de manera estable Nav1.7 usando el instrumento FLIPR® Tetra (Molecular Devices) usando los detalles experimentales descritos en el Ejemplo 3. Una variante de Protoxina-II es un inhibidor de Nav1.7 "potente" cuando el valor de IC⁵⁰en el ensayo descrito anteriormente y en el Experimento 3 es de aproximadamente 30x10-9 M o menos, es decir, dentro de 10 veces de la Protoxina-II recombinante. Para mayor claridad, una IC⁵⁰de 30x10-9 M es idéntica a la IC⁵⁰de 3,0x10-8 M.

Los polipéptidos de variantes de Protoxina-II de la invención pueden producirse mediante síntesis química, como síntesis de péptidos en fase sólida, en un sintetizador de péptidos automatizado. Alternativamente, los polipéptidos de la invención pueden obtenerse a partir de polinucleótidos que codifican los polipéptidos mediante el uso de sistemas de expresión libres de células como sistemas de expresión basados en lisados de reticulocitos, o mediante sistemas de expresión recombinantes. Los expertos en la técnica reconocerán otras técnicas para obtener los polipéptidos de la invención. En un método ejemplar, las variantes de Protoxina-II de la invención se generan expresándolas como proteínas de fusión de albúmina de suero humano (HSA) utilizando un conector rico en glicina como (GGGGS)4 (SEQ ID NO: 80) o (GGGGS)6 (SEQ ID NO: 81) acoplado a un conector escindible por proteasa como una secuencia de reconocimiento para la proteasa HRV3C (proteasa recombinante tipo 14 3C de rinovirus humano) LEVLFQGP (conector HRV3C) (SEQ ID NO: 82), y escindiendo las proteínas de fusión expresadas con la proteasa HRV3C para liberar los péptidos de variantes de Protoxina-II recombinantes. Puede usarse hexahistidina (SEQ ID NO: 108) u otras etiquetas para facilitar la purificación usando métodos bien conocidos.

Las variantes de la Protoxina-II de la invención pueden purificarse usando los métodos descritos en la presente. En un método ejemplar, las variantes de Protoxina-II de la invención expresadas como proteínas de fusión de HSA y escindidas con proteasa HRV3C pueden purificarse usando extracción en fase sólida (SPE) como se describe en la presente.

La generación de las variantes de Protoxina-II que tienen opcionalmente extensiones N-terminales y/o C-terminales, y proteínas de fusión de variantes de Protoxina-II se logra típicamente a nivel de ácido nucleico. Los polinucleótidos pueden sintetizarse usando síntesis química de genes de acuerdo con los métodos descritos en las Patentes de Estados Unidos N° 6.521.427 y 6.670.127, utilizando oligonucleótidos degenerados para generar las variantes deseadas, o mediante clonación y mutagénesis por PCR estándar. Pueden generarse bibliotecas de variantes mediante técnicas de clonación estándar para clonar los polinucleótidos que codifican las variantes de Protoxina-II en el vector para la expresión.

Las variantes de Protoxina-II pueden incorporar aminoácidos N- y/o C-terminales adicionales cuando se comparan con la Protoxina-II de tipo salvaje de la SEQ ID NO: 1, por ejemplo como resultado de esquemas de clonación y/o expresión. Por ejemplo, la escisión de HSA después de la expresión de la variante como HSA-conector-péptido escindible HRV3C-proteína de fusión de variante de Protoxina-II puede resultar en la incorporación de dos residuos adicionales al extremo N-terminal de cada variante de Protoxina-II, como G y P.

Las variantes de Protoxina-II de la invención se prueban para determinar su capacidad para inhibir Nav1.7 humano usando los métodos descritos en la presente. Un ensayo ejemplar es un ensayo de inhibición de despolarización inducida por veratridina que mide la disminución de FRET (transferencia de energía de resonancia de fluorescencia) en células que expresan de manera estable Nav1.7. Otro ensayo ejemplar emplea registros electrofisiológicos para medir cambios en las corrientes mediadas por Nav1.7 usando técnicas de fijación en parche de membrana bien conocidas y como se describe en la presente.

Los ejemplos de variantes de Protoxina-II aisladas son aquellos que comprenden la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 3, 4, 5, ⁶, 7, ⁸, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, ^{6 6}, 67, ^{6 8}, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154 ,155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225,226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 35, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368367, 370 o 371.

Las variantes de Protoxina-II de la invención pueden inhibir Nav1.7 humano con un valor de IC⁵⁰de aproximadamente 1x10-7 M o menos, aproximadamente 1x10-8 M aproximadamente 1x10-9 o menos, aproximadamente 1x10-10 M o menos, aproximadamente 1x10-11 M o menos, o aproximadamente 1x10-12 M o menos. Variantes ejemplares que demuestran el intervalo de valores de IC⁵⁰son variantes que tienen secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEQ ID NO: 30, 40, 44, 52, 56, 56, 59, 65, 78, 109, 110, 111, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, ^{1 4 4}, ^{1 4 5}, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 162, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 180, 182, 183, 184, 185, 186, 189, 190, 193, 195, 197, 199, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 224, 226, 227, 231, 232, 243, 244, 245, 247, 249, 252, 255, 258, 261, 263, 264, 265, 266, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 332, 334, 335, 336, 337, 339, 340, 341,342, 346, 351,358, 359, 364, 366, 367, o 368.

La Tabla 2 y la Tabla 3 muestran las secuencias de variantes de Protoxina-II seleccionadas.

Tabla 2.

continuación

(continuación)

Tabla 3.

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(continuación)

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(continuación)

(continuación)

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Las variantes de Protoxina-II aisladas inhiben la actividad de Nav1.7 humano con un valor de IC⁵⁰de aproximadamente 3x10-8 M o menos.

Las variantes de Protoxina-II aisladas inhiben la actividad de Nav1.7 humano con un valor de IC⁵⁰de entre aproximadamente 3x10-8 M y aproximadamente 1x10-9 M.

La divulgación también proporciona una variante de Protoxina-II aislada que comprende la secuencia de aminoácidos GPQCX¹x²WX³QX⁴Cx⁵x⁶x⁷x⁸x⁹CCX¹⁰xnFX¹²CX¹³LWCXuKKLW (SEQ ID NO: 404), en donde

X^Ies Q, R, K, A o S;

X²es K, S, Q o R;

X3 es M o F;

X⁴es T, S, R, K o Q;

X5 es D o T;

X6 es S, A o R;

X⁷es E, R, N, K, T o Q;

X8 es R o K;

X⁹es K, Q, S o A;

X¹⁰es E, Q o D;

X^{I I}es G o Q;

X¹²es V o S;

X13 es R o T; y

X¹⁴es K o R.

Las variantes de Protoxina-II ejemplares que inhiben la actividad de Nav1.7 humano con un valor de IC⁵⁰de aproximadamente 30x10-9 M o menos son variantes que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 56, 78, 111, 114, 117, 118, 119, 122, 123, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 138, 139, 140, 141, 142, 145,146, 147, 149 ,150, 151, 152, 153, 154, 156, 158, 159, 165, 172, 173, 175, 177, 178, 183, 184, 185, 186, 189, 190, 193, 197, 199, 207, 210, 211,216, 217, 224, 266, 273, 282 o 335.

En algunas realizaciones, la variante de Protoxina-II aislada inhibe selectivamente la Nav1.7 humana. Las variantes de Protoxina-II de la invención pueden ser más selectivas hacia Nav1.7 en comparación con la Protoxina-II recombinante (SEQ ID NO: 2). En el ensayo de electrofisiología QPatch, la Protoxina II recombinante tiene una IC⁵⁰de aproximadamente 2,2x10-9 M para Nav1.7 y una IC⁵⁰de aproximadamente 62x10-9 M para Nav1^.6y, por lo tanto, la proporción de IC⁵⁰para Nav1^.6con la IC⁵⁰para Nav1.7 es de aproximadamente 28 veces. "Selectividad" o "selectiva" o "más selectiva" o "bloquea selectivamente" o "inhibe selectivamente" cuando se usan en la presente se refieren a una variante de Protoxina-II que tiene una proporción de IC⁵⁰para Nav1.6 con la IC⁵⁰para Nav1.7 (IC50(Nav¹.⁶)/IC50(Nav¹.⁷)) igual o superior a aproximadamente 30. La IC⁵⁰para Nav1.6 puede ensayarse en un ensayo electrofisiológico QPatch usando líneas celulares que expresan de manera estable Nav1.6 usando métodos similares a los descritos para Nav1.7.

Las posiciones de residuos en la Protoxina-II que pueden mutagenizarse para mejorar la selectividad incluyen los residuos 7 y 19, y opcionalmente los residuos 1 y 11, y además opcionalmente los 12, 20, 22 y 26 (numeración de residuos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1). Las sustituciones ejemplares para mejorar la selectividad son Y1Q, W7Q, S11R, S11A, E12T, M19F, V20S, R22T y K26R. Las variantes de Protoxina-II ejemplares con selectividad mejorada son variantes de las S^eQ ID NO: 56, 59, 65, 78, 111, 114, 117, 118, 119, 121,

122, 123, 129, 130, 133, 150, 190, 217, 281,324, 325 o 326.

Una variante de Protoxina-II aislada puede comprender la secuencia GPX¹CQKWMQX²CDX³x⁴RKCCX⁵GFX⁶CX⁷LWCXeKKLW (SEQ ID NO: 405); en donde

X¹es Y, Q, A, S o R;

X²es T o S;

X³es S, R o A;

X⁴es E, T o N;

X5 es E o Q;

X6 es V o S;

X7 es R o T; y

X8 es K o R;

en donde la variante de Protoxina-II inhibe la actividad Nav1.7 humano con un valor de IC⁵⁰de aproximadamente

3x10-8 M o menos, y de manera selectiva inhibe Nav1.7 humano.

Una variante de Protoxina-II aislada puede comprender la secuencia GPQCQKWMQX1CDX2xaRKCCX4GFX5CX6LWCX8KKLW (SEQ ID NO: 406); en donde

X¹es T o S;

X²es S, R o A;

X³es E, T o N;

X4 es E o Q;

X5 es V o S;

X6 es R o T; y

X7 es K o R.

Una variante de Protoxina-II aislada puede comprender la secuencia de aminoácidos que es un 90%, 91%,

92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 78 (GPQCQKWMQTCDRERKCCEGFVCTLWCRKKLW-COOH); en donde

la secuencia de aminoácidos tiene Q en la posición 1, Q en la posición 7 y F en la posición 19, cuando la numeración de los residuos es de acuerdo con la SEQ ID NO: 1;

el polipéptido inhibe la actividad Nav1.7 humano con un valor de IC⁵⁰de aproximadamente 30x10-9 M o menos, en donde el valor de IC⁵⁰se mide usando un ensayo de despolarización de membrana FLIPR® Tetra usando transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) en presencia de 3-veratroilveracevina 25x10-6 M en células HEK293 que expresan establemente Nav1.7 humano; y

el polipéptido inhibe selectivamente Nav1.7.

En algunas realizaciones, la variante de Protoxina-II aislada tiene un grupo de ácido carboxílico, amida, metilamida o butilamida C-terminal libre, que se generan mediante métodos sintéticos de rutina.

La divulgación también proporciona una proteína de fusión aislada que comprende la variante de Protoxina-II de las SEQ ID NO: 5, ⁶, 7, ⁸, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,

32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62,

63, 64, 65, ^{6 6}, 67, ^{6 8}, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119,

121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143,

^{1 4 4}, ^{1 4 5}, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154 ,155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166,

167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189,

190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212,

213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225,226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 256, 257, 258, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 352, 353, 354, 355, 35, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368367, 370 o 371.Tales segundos polipéptidos pueden ser secuencias señal líder o secretoras bien conocidas, o secuencias sintéticas resultantes, por ejemplo, de pasos de clonación, o etiquetas como la etiqueta de hexahistidina (SEQ ID NO: 108). Dicho segundo polipéptido puede ser una fracción que extiende la vida media. En una realización, la proteína de fusión aislada comprende la variante de Protoxina-II de la invención conjugada con una fracción que extiende la vida media.

Las fracciones que extienden la vida media ejemplares que pueden usarse incluyen albúmina de suero humano bien conocida, transtiretina (TTR), una globulina de unión a tiroxina (TGB), dominios de unión a albúmina o un Fc o fragmentos de los mismos. También pueden usarse polímeros o copolímeros biológicamente adecuados, por ejemplo, moléculas de etilenglicol o polietilenglicol (PEG), como PEG5000 o PEG20000, dextrano, polilisina, ácidos grasos y ésteres de ácidos grasos de diferentes longitudes de cadena, por ejemplo, laurato, miristato, estearato, araquidato, behenato, oleato, araquidonato, ácido octanodioico, ácido tetradecanodioico, ácido octadecanodioico, ácido docosanodioico y similares, octano, o carbohidratos (dextrano, celulosa, oligo- o polisacáridos). Estas fracciones pueden ser fusiones directas con los polipéptidos de variantes de Protoxina-II y pueden generarse mediante técnicas estándar de clonación y expresión. Alternativamente, pueden usarse métodos de acoplamiento químico bien conocidos para unir las fracciones a las variantes de Protoxina-II producidas de manera recombinante de la invención.

En otra realización, la fracción que extiende la vida media de la proteína de fusión de la invención es albúmina de suero humana, dominio de unión a albúmina (ABD) o polietilenglicol (PEG).

En otra realización, la fracción que extiende la vida media de se conjuga con la variante de Protoxina-II mediante un conector. Los conectores adecuados son bien conocidos e incluyen conectores que tienen la secuencia mostrada en las SEQ ID NO: 80 u 81.

Las proteínas de fusión ejemplares que incorporan variantes de Protoxina-II de la invención son aquellas que tienen la secuencia de polipéptidos de las SEQ ID NO: 83, 85, 87 o 103.

Las variantes de Protoxina-II de la invención que incorporan fracciones adicionales pueden compararse en cuanto a funcionalidad mediante varios ensayos bien conocidos. Por ejemplo, las propiedades farmacocinéticas de las variantes de Protoxina-II acopladas a PEG pueden evaluarse en modelos in vivo bien conocidos.

Pueden realizarse sustituciones adicionales a las variantes de Protoxina-II siempre que la variante o la proteína de fusión resultante conserve características similares en comparación con el péptido original. Las modificaciones ejemplares son, por ejemplo, sustituciones conservadoras que darán como resultado variantes de Protoxina-II con características similares a las de las moléculas originales. Los reemplazos conservadores son aquellos que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos codificados genéticamente pueden dividirse en cuatro familias: (1) ácidos (aspartato, glutamato); (2) básicos (lisina, arginina, histidina); (3) no polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano); y (4) polares no cargados (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina). La fenilalanina, el triptófano y la tirosina a veces se clasifican conjuntamente como aminoácidos aromáticos. Alternativamente, el repertorio de aminoácidos puede agruparse como (1) ácidos (aspartato, glutamato); (2) básicos (lisina, arginina histidina), (3) alifáticos (glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina), con serina y treonina agrupadas opcionalmente por separado como hidroxilo alifáticos; (4) aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptófano); (5) amidas (asparagina, glutamina); y (⁶) que contienen azufre (cisteína y metionina) (Stryer (ed.), Biochemistry, 2a ed. WH Freeman and Co., 1981). Pueden realizarse sustituciones no conservadoras a las variantes de Protoxina-II que implican sustituciones de residuos de aminoácidos entre diferentes clases de aminoácidos para mejorar las propiedades de las variantes de Protoxina-II y proteínas de fusión de variantes de Protoxina-II. Si un cambio en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido o fragmento del mismo da como resultado un homólogo funcional, puede determinarse fácilmente evaluando la capacidad del polipéptido o fragmento modificado para producir una respuesta de una manera similar a la del polipéptido o fragmento no modificado usando los ensayos descritos en la presente. Los péptidos, polipéptidos o proteínas en los que tiene lugar más de un reemplazo pueden probarse fácilmente de la misma manera.

Otra realización de la invención es un polinucleótido sintético aislado que comprende un polinucleótido que codifica la variante de Protoxina-II de la invención.

En la presente se divulgan ciertos polinucleótidos sintéticos ejemplares, sin embargo, otros polinucleótidos sintéticos que, dada la degeneración del código genético o las preferencias de codones en un sistema de expresión dado, codifican las variantes de Protoxina-II y las proteínas de fusión de variantes de Protoxina-II de la invención también se encuentran dentro del alcance de la invención. Los polinucleótidos sintéticos ejemplares son, por ejemplo, secuencias de polinucleótidos mostradas en las SEQ ID NO: 84, ^{8 6}, ^{8 8}, y 104, que codifican las proteínas de fusión de variantes de Protoxina-II de la invención. Los expertos en la técnica pueden identificar fácilmente los segmentos de polinucleótidos en las proteínas de fusión que codifican la propia variante de Protoxina-II. Las secuencias de polinucleótidos sintéticos que codifican las variantes de Protoxina-II o proteínas de fusión de la invención pueden enlazarse operativamente con uno o más elementos reguladores, como un promotor y un potenciador, que permiten la expresión de la secuencia de nucleótidos en la célula huésped pretendida. El polinucleótido sintético puede ser un ADNc.

Los polinucleótidos de la invención pueden producirse mediante síntesis química como síntesis de polinucleótidos en fase sólida en un sintetizador de polinucleótidos automatizado. Alternativamente, los polinucleótidos de la invención pueden producirse mediante otras técnicas como duplicación basada en PCR, duplicación basada en vectores o técnicas de manipulación de ADN basadas en enzimas de restricción. Las técnicas para producir u obtener polinucleótidos de secuencias conocidas son bien conocidas.

Los polinucleótidos de la invención también pueden comprender por lo menos una secuencia no codificante, como secuencias transcritas pero no traducidas, señales de terminación, sitios de unión a ribosomas, secuencias de estabilización de ARNm, intrones y señales de poliadenilación. Las secuencias de polinucleótidos también pueden comprender secuencias adicionales que codifican aminoácidos adicionales. Estas secuencias de polinucleótidos adicionales pueden, por ejemplo, codificar un marcador o secuencias de etiquetas bien conocidas como una hexa-histidina (SEQ ID NO: 108) o una etiqueta HA que facilitan la purificación de polipéptidos fusionados.

Otra realización de la invención es un vector que comprende el polinucleótido de la invención. Tales vectores pueden ser vectores plasmídicos, vectores virales, vectores para la expresión de baculovirus, vectores basados en transposones o cualquier otro vector adecuado para la introducción del polinucleótido de la invención en un organismo o trasfondo genético dado por cualquier medio. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican las variantes de Protoxina-II o las proteínas de fusión de variantes de Protoxina-II de la invención se insertan en un vector de expresión y pueden enlazarse operativamente a secuencias de control en el vector de expresión para asegurar una expresión eficiente, como secuencias señal, promotores (por ejemplo, promotores naturalmente asociados o heterólogos), elementos potenciadores y secuencias de terminación de la transcripción, y se eligen para que sean compatibles con la célula huésped elegida para expresar la variante de Protoxina-II o la proteína de fusión de la variante de Protoxina-II de la invención. Una vez que el vector se ha incorporado en el huésped apropiado, el huésped se mantiene en condiciones adecuadas para una expresión de alto nivel de las proteínas codificadas por los polinucleótidos incorporados.

Los vectores de expresión adecuados son típicamente replicables en los organismos hospedadores como episomas o como parte integral del ADN cromosómico del huésped. Comúnmente, los vectores de expresión contienen marcadores de selección como resistencia a ampicilina, resistencia a higromicina, resistencia a tetraciclina, resistencia a kanamicina o resistencia a neomicina para permitir la detección de aquellas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas.

Los elementos promotores y potenciadores adecuados son conocidos en la técnica. Para la expresión en una célula bacteriana, los promotores adecuados incluyen, pero no están limitados a, lacl, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P y trc. Para la expresión en una célula eucariota, los promotores adecuados incluyen, pero no se limitan a, elementos promotores y potenciadores del gen de inmunoglobulina de cadena ligera y/o pesada; promotor temprano inmediato de citomegalovirus; promotor de timidina quinasa del virus del herpes simple; promotores SV40 tempranos y tardíos; promotor presente en repeticiones terminales largas de un retrovirus; promotor de metalotioneína-I de ratón; y varios promotores específicos de tejido conocidos en la técnica. Para la expresión en una célula de levadura, un promotor adecuado es un promotor constitutivo como un promotor ADH1 PGK1, ENO o PYK1 y similares, o un promotor regulable como un promotor GAL1 o GAL10. La selección del vector y promotor adecuados está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica.

Los expertos en la técnica conocen un gran número de vectores y promotores adecuados; muchos están disponibles comercialmente para generar constructos recombinantes. Los siguientes vectores se proporcionan a modo de ejemplo. Bacterianos: pBs, phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene, La Jolla, Calif., USA); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, and pRIT5 (Pharmacia, Uppsala, Suecia). Eucariotas: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG and pSVL (Pharmacia).

Un vector ejemplar para la expresión de las variantes de Protoxina-II o proteínas de fusión de variantes de Protoxina-II es un vector que tiene marcador de selección de resistencia a ampicilina, promotor de CMV, intrón de CMV, péptido señal, resistencia a neomicina, origen de replicación de f1, señal de poliadenilación de SV40 y ADNc que codifica la variante de Protoxina-II o la proteína de fusión de la variante de Protoxina-II de la invención.

Otra realización de la invención es una célula huésped que comprende el vector de la invención. El término "célula huésped" se refiere a una célula en la que se ha introducido un vector. Se entiende que el término célula huésped pretende referirse no solo a la célula objeto particular sino también a la progenie de dicha célula. Como pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido a mutaciones o influencias ambientales, tal progenie puede no ser idéntica a la célula original pero aún están incluidas dentro del alcance del término "célula huésped" como se usa en la presente. Tales células huésped pueden ser células eucariotas, células procariotas, células vegetales o células arqueales.

Escherichia coli, bacilos, como Bacillus subtilis, y otras enterobacteriáceas, como Salmonella, Serratia y varias especies de Pseudomonas, son ejemplos de células huésped procariotas. Otros microbios, como la levadura, también son útiles para la expresión. Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae) y Pichiason ejemplos de células huésped de levadura adecuadas. Las células eucariotas ejemplares pueden ser de origen mamífero, insecto, aviar u otro animal. Las células eucariotas de mamíferos incluyen líneas celulares inmortalizadas como hibridomas o líneas celulares de mieloma como las líneas celulares murinas SP2/0 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, CRL-1581), NS0 (European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, UK, ECACC N° 85110503), FO (ATCC CRL-1646) y Ag653 (ATCC CRL-1580). Una línea celular de mieloma humano ejemplar es U266 (ATTC CRL-TIB-196). Otras líneas celulares útiles incluyen las derivadas de células de ovario de hámster chino (CHO) como CHO-K1SV (Lonza Biologics, Walkersville, MD), CHO-K1 (ATCC CRL-61) o DG44.

La introducción de un polinucleótido, como un vector, en una célula huésped puede efectuarse mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Los métodos ejemplares son transfección con fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos y electroporación.

Otra realización de la invención es un método para producir la variante de Protoxina-II de la invención que comprende los pasos de proporcionar una célula huésped de la invención; cultivar la célula huésped en condiciones suficientes para la expresión de por lo menos una variante de Protoxina-II de la invención; y recuperar la variante de Protoxina-II producida por la célula huésped.

Las células huésped pueden cultivarse en cualquier condición adecuada para mantener o propagar un tipo dado de célula huésped y suficiente para expresar un polipéptido. Las condiciones de cultivo, los medios y los métodos relacionados suficientes para la expresión de polipéptidos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, muchos tipos de células de mamíferos pueden cultivarse aeróbicamente a 37° C usando medio DMEM apropiadamente tamponado mientras que las bacterias, levaduras y otros tipos de células pueden cultivarse a 37° C en condiciones atmosféricas apropiadas en medio LB.

En los métodos de la invención, la expresión de la variante de Protoxina-II puede confirmarse usando una variedad de métodos bien conocidos. Por ejemplo, la expresión de un polipéptido puede confirmarse usando reactivos de detección, como SDS-PAGE o HPLC.

Otro aspecto de la divulgación es un método para modular la actividad de Nav1.7 en un tejido biológico, el método comprendiendo poner en contacto el tejido biológico que expresa Nav1.7 con una cantidad moduladora de Nav1.7 de la variante de Protoxina-II de la invención.

USOS DE VARIANTES DE PROTOXINA-II

Las variantes de la Protoxina II de la invención pueden utilizarse en cualquier terapia en la que se desee tratar, reducir o aliviar los síntomas del dolor u otros trastornos de la disfunción de las neuronas sensoriales o simpáticas.

El dolor tratado con las variantes de Protoxina-II de la invención puede ser cualquier tipo de dolor, como dolor crónico, dolor agudo, dolor neuropático, dolor nociceptivo, dolor visceral, dolor de espalda, dolor asociado con afecciones inflamatorias, dolor posoperatorio, dolor térmico o dolor asociado con enfermedades y degeneración.

El dolor tratado con las variantes de Protoxina-II de la invención puede ser un dolor mediado por Nav1.7. El dolor mediado por Nav1.7, como se usa en la presente, se refiere al dolor resultante por lo menos parcialmente de la actividad del canal Nav1.7 aumentada.

Las variantes de Protoxina-II de la invención pueden usarse para tratar a un paciente animal que pertenezca a cualquier clasificación. Los ejemplos de tales animales incluyen mamíferos como humanos, roedores, perros, gatos y animales de granja.

El dolor y/o el dolor mediado por Nav1.7 pueden ser el resultado de una o más causas, como neuropatía periférica, neuropatía central, compresión nerviosa o síndromes de atrapamiento, como síndrome del túnel carpiano, síndrome del túnel del tarso, atrapamiento del nervio cubital, radiculopatía por compresión, estenosis espinal lumbar, compresión del nervio ciático, compresión de la raíz espinal, neuralgia intercostal, radiculopatía por compresión y dolor lumbar radicular, lesiones de la raíz espinal, neuritis, enfermedades autoinmunes, inflamación general, afecciones inflamatorias crónicas, artritis, enfermedades reumáticas, lupus, osteoartritis, trastornos gastrointestinales generales, colitis, ulceración gástrica, úlceras duodenales, trastornos inflamatorios del intestino, síndrome del intestino irritable, dolor asociado con diarrea, trastornos inflamatorios de los ojos, trastornos de la vejiga inflamatorios o inestables, psoriasis, trastornos de la piel con componentes inflamatorios, quemaduras solares, carditis, dermatitis, miositis, neuritis, enfermedades vasculares del colágeno, dolor inflamatorio e hiperalgesia y alodinia asociadas, dolor neuropático e hiperalgesia y alodinia asociadas, esclerosis múltiple, enfermedades desmielinizantes, diabetes, dolor por neuropatía diabética, causalgia, dolor resultante de amputación o absceso, dolor de miembro fantasma, dolor por fractura, lesión ósea, trauma directo, infección por VIH, síndrome de inmunodeficiencia adquirida ("SIDA"), infección por viruela, infección por herpes, exposición a toxinas u otras partículas o moléculas extrañas, cáncer invasivo, cáncer, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, quemaduras, defecto congénito, dolor dental, dolor por gota, fibromialgias, encefalitis, alcoholismo crónico, hipotiroidismo, uremia y deficiencias de vitaminas, neuralgia del trigémino, ataque cerebral, síndrome de dolor talámico, dolor de cabeza general, migraña, cefalea en racimos, cefalea tensional, síndromes mixtos vasculares y no vasculares, dolor mantenido simpáticamente, síndromes de desaferenciación, asma, daño o disfunción del tejido epitelial, alteraciones de la motilidad visceral a nivel respiratorio, genitourinario, gastrointestinal o de regiones vasculares, heridas, quemaduras, reacciones cutáneas alérgicas, prurito, rinitis vasomotora o alérgica o trastornos bronquiales, dismenorrea, dolor durante el nacimiento y el alumbramiento, dispepsia, reflujo gastroesofágico, pancreatitis y visceralgia.

Otros trastornos de la disfunción de las neuronas sensoriales o simpáticas que pueden aliviarse mediante las variantes de Protoxina-II de la invención incluyen picor, tos y asma. En ratones, la deleción global del gen SCN9A lleva a una insensibilidad completa al picor inducido por histaminas (Gingras et al., American Pain Society Meeting Abstract 2013 y Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2012/0185956). Este descubrimiento sugiere que los bloqueadores del péptido Nav1.7 pueden tener utilidad en el tratamiento del picor, que puede surgir de varias fuentes, como trastornos dermatológicos o inflamatorios; o trastornos inflamatorios como trastornos renales o hepatobiliares, trastornos inmunológicos, reacciones a medicamentos y afecciones desconocidas/idiopáticas, que incluyen dermatitis, psoriasis, eccema, picadura o mordedura de insecto. Nav1.7 también se expresa en los nervios sensoriales que inervan las vías respiratorias (Muroi et al., J Physiol. 1 de diciembre de 2011; 589(Pt 23): 5663-76; Muroi et al., Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 10 de abril de 2013), lo que sugiere que los bloqueadores del péptido Nav1.7 pueden ser beneficiosos en el tratamiento de la tos, por ejemplo, tos aguda o crónica, o tos provocada por la irritación de la enfermedad por reflujo gastroesofágico y enfermedades inflamatorias de las vías respiratorias como el asma y respuestas inmunes relacionadas con alergias, broncoespasmo, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, bronquitis crónica, enfisema e hipo (hipo, singultus). Silenciar Nav1.7 in vivo en ganglios nudosos de cobayas usando ARNhc casi suprimió el reflejo de la tos inducido por sonda mecánica (Muroi et al., Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 10 de abril de 2013).

Las variantes de Protoxina-II de la invención pueden usarse en un método para aliviar o tratar el picor, la tos o el asma en un sujeto mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la variante de Protoxina-II de la invención a un sujeto con necesidad de ello durante un tiempo suficiente para aliviar el picor, tos o asma.

Las variantes de Protoxina-II de la invención pueden usarse en un método para aliviar o tratar el picor mediado por Nav1.7, la tos mediada por Nav1.7 o el asma mediada por Nav1.7 en un sujeto mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la variante de Protoxina II de la invención a un sujeto con necesidad de ello durante un tiempo suficiente para aliviar el picor, la tos o el asma.

El picor mediado por Nav1.7, como se usa en la presente, se refiere al picor que resulta por lo menos parcialmente de una actividad del canal Nav1.7 aumentada.

La tos mediada por Nav1.7, como se usa en la presente, se refiere a la tos que resulta, por lo menos parcialmente, de una actividad del canal Nav1.7 aumentada.

El asma mediada por Nav1.7, como se usa en la presente, se refiere al asma que resulta por lo menos parcialmente de una actividad del canal Nav1.7 aumentada.

Las variantes de la Protoxina-II de la invención pueden probarse para determinar su efecto en la reducción o alivio del dolor y/o el dolor mediado por Nav1.7 usando modelos animales descritos en la presente, y modelos tales como el modelo de ligadura del nervio espinal (SNL) de rata de dolor neuropático, el modelo de alodinia inducida por carragenina, el modelo de alodinia inducida por adyuvante completo de Freund (CFA), el modelo de lesión térmica, el modelo de formalina y el modelo de Bennett, y otros modelos como se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2011/0124711 y la Patente de Estados Unidos N° 7.998.980. La alodinia inducida por carragenina y la alodinia inducida por CFA son modelos de dolor inflamatorio. El modelo de Bennett proporciona un modelo animal para el dolor crónico que incluye dolor posoperatorio, síndrome de dolor regional complejo y distrofia simpática refleja.

Cualquiera de los modelos animales anteriores puede usarse para evaluar la eficacia de las variantes de Protoxina-II del inhibidor de la invención en el tratamiento del dolor y/o el dolor mediado por NAv1.7. La eficacia de las variantes de Protoxina-II de la invención puede compararse con un control sin tratamiento o con placebo. Adicional o alternativamente, la eficacia puede evaluarse en comparación con uno o más medicamentos conocidos para aliviar el dolor.

La presente invención proporciona variantes de Protoxina-II para su uso en el tratamiento del dolor mediado por Nav1.7 usando las variantes de Protoxina-II de la invención. Se ha descubierto en la solicitud pendiente de los inventores (Solicitud de Patente de los Estados Unidos N° 61/781.276) que la administración de péptidos bloqueadores de Nav1.7 es eficaz para tratar y/o aliviar el dolor en varios modelos animales de dolor, al contrario de lo que se había divulgado y sugerido en la bibliografía. Aunque se ha demostrado que los inhibidores de péptido de Nav1.7 son potentes y/o selectivos hacia Nav1.7 en modelos de cultivo celular in vitro usando Nav1.7 sobreexpresado o en neuronas aisladas en las que la barrera hematoencefálica se subvierte mediante la eliminación de la vaina o inyección de solución salina hipertónica, hasta ahora han demostrado no ser eficaces en modelos animales in vivo de dolor, donde se ha informado que la falta de eficacia es el resultado de la incapacidad de los péptidos para atravesar la barrera hematoencefálica. Varias publicaciones describen la falta de eficacia de los péptidos bloqueadores de Nav1.7 en modelos animales de dolor o en nervios aislados. Por ejemplo, Hackel et al., Proc Natl Acad Sci 109:E2018-27, 2012, describe la incapacidad de ProTx-II para inhibir la activación del potencial de acción en nervios aislados a menos que la barrera perineural, que proporciona una barrera de difusión en este modelo, esté comprometida. Se descubrió que ProTx-II no resultó eficaz en modelos de roedores de dolor agudo e inflamatorio; una explicación probable indicó la incapacidad de ProTx-II de cruzar la barrera hematoencefálica (Schmalhofer et al., Mol Pharmacol 74:1476-1484, 2008). Se ha propuesto que los bloqueadores de toxinas peptídicas de Nav1.7 tienen poca biodisponibilidad oral y son difíciles de administrar a las terminaciones nerviosas, 10 que significa que su uso como agentes terapéuticos sigue siendo limitado (Dib-Hajj et al., Nature Rev Neuroscience 14, 49-62, 2013).

Nav1.7 se expresa en el sistema nervioso periférico, por ejemplo, en los ganglios de la raíz dorsal nociceptiva (DRG), más notablemente en las neuronas DRG nociceptivas de diámetro pequeño, en particular en los terminales periféricas de la piel, con poca representación en el cerebro. La distribución de Nav1.7 (por ejemplo, terminación sensorial) y la fisiología la predisponen a un papel importante en la transmisión de estímulos dolorosos.

Una realización de la invención es variante de Protoxina-II para su uso en un método para tratar el dolor mediado por Nav1.7 mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la variante de Protoxina-1 de la invención a un sujeto con necesidad de ello durante un tiempo suficiente para tratar el dolor mediado por Nav1.7.

Las variantes de Protoxina-II de la invención Nav1.7 pueden utilizarse en cualquier terapia en la que se desee tratar el dolor mediado por Nav1.7 u otros trastornos de la disfunción de las neuronas sensoriales o simpáticas. "Tratar" o "tratamiento" del dolor se pretende que incluya parcial o completamente prevenir, detener, inhibir, reducir o retrasar la percepción del dolor.

En algunas realizaciones, el dolor mediado por Nav1.7 es dolor crónico, dolor agudo, dolor neuropático, dolor nociceptivo, dolor visceral, dolor de espalda, dolor posoperatorio, dolor térmico, dolor del miembro fantasma, o dolor asociado con afecciones inflamatorias, eritemalgia primaria (PE), trastorno de dolor extremo paraoxístico (PEPD), osteoartritis, artritis reumatoide, discectomía lumbar, pancreatitis, fibromialgia, neuropatía diabética dolorosa (PDN), neuropatía posherpética (PHN), neuralgia del trigémino (TN), lesiones de la médula espinal o esclerosis múltiple, o dolor asociado con enfermedad y degeneración.

El dolor neuropático incluye, por ejemplo, neuropatía diabética dolorosa (PDN), neuropatía postherpética (PHN) o neuralgia del trigémino (TN). Otras causas de dolor neuropático incluyen lesiones de la médula espinal, esclerosis múltiple, dolor del miembro fantasma, dolor posterior a un ataque cerebral y dolor asociado al VIH. Las afecciones como dolor de espalda crónico, osteoartritis y cáncer también pueden dar como resultado la generación de dolor relacionado con neuropático y por tanto son potencialmente adecuadas para el tratamiento con las variantes de Protoxina-II de la invención.

En otra realización, el dolor mediado por Nav1.7 está asociado con eritemalgia primaria (PE), trastorno de dolor extremo paraoxístico (PEPD), osteoartritis, artritis reumatoide, discectomía lumbar, pancreatitis o fibromialgia.

Las variantes de Protoxina-II de la invención pueden conjugarse con un segundo polipéptido para formar una proteína de fusión. Tales proteínas de fusión son, por ejemplo, las fusiones de Fc bien conocidas o fusiones con albúmina de suero humano para extender la vida media de los inhibidores peptídicos. La conjugación puede ser una conjugación directa a través de un conector, como un conector rico en glicina-serina. Tales conectores son bien conocidos en la técnica. Las variantes de Protoxina-II de la invención que incorporan fracciones adicionales pueden compararse por su capacidad de bloquear Nav1.7 y su eficacia en el tratamiento o reducción del dolor usando métodos bien conocidos y los descritos en la presente.

Otros trastornos de disfunción de las neuronas sensoriales o simpáticas que pueden tratarse con las variantes de Protoxina-II de la invención incluyen asma, tos, ardor de estómago, picor, dermatitis, inestabilidad de la vejiga y enfermedad de Reynaud.

COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS

Las variantes de Protoxina-II de la invención pueden formularse en un vehículo o portador farmacéuticamente aceptable. Una realización de la invención es una composición farmacéutica que comprende la variante de Protoxina-II aislada de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Un vehículo o portador adecuado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica o líquido cefalorraquídeo artificial, posiblemente suplementado con otros materiales comunes en las composiciones para administración parenteral. La solución salina tamponada neutra o la solución salina mezclada con albúmina de suero son vehículos ejemplares adicionales. Estas soluciones son estériles y generalmente están libres de material particulado y pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas (por ejemplo, filtración). Las composiciones pueden contener excipientes farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas, como agentes de ajuste y tamponadores del pH, agentes estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes, etc. Los vehículos adecuados y su formulación y envasado se describen, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (21a ed., Troy, D. ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD (2005) Capítulos 40 and 41).

Las variantes de Protoxina-II de la invención pueden administrarse mediante administración periférica. "Administración periférica" o "administrado periféricamente" significa introducir un agente en un sujeto fuera del sistema nervioso central. La administración periférica abarca cualquier vía de administración distinta de la administración directa a la columna espinal o al cerebro.

La administración periférica puede ser local o sistémica. La administración local puede usarse para concentrar el agente terapéutico en el sitio de acción, como la administración local en articulaciones, médula espinal, heridas quirúrgicas, sitios de lesión/trauma, fibras nerviosas periféricas, varios órganos (GI, urogenital, etc.) o tejidos inflamados. La administración sistémica da como resultado la administración de una composición farmacéutica a esencialmente todo el sistema nervioso periférico del sujeto y también puede dar como resultado la administración al sistema nervioso central dependiendo de las propiedades de la composición.

Las vías de administración periférica abarcan, sin limitación, administración tópica, inyección intravenosa o de otro tipo, y minibombas implantadas u otros dispositivos o formulaciones de liberación prolongada.

Las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen formulaciones que implican las variantes de Protoxina-II de la invención en formulaciones de liberación sostenida o controlada. Estas formulaciones pueden lograrse mediante el uso de, por ejemplo, microesferas inyectables, partículas bio-erosionables, microemulsiones, nanopartículas, nanocápsulas, macroemulsiones, compuestos poliméricos (como poliésteres, poliaminoácidos, hidrogeles, poli(ácido láctico), ácido poliglicólico o copolímeros de etileno vinilacetato), perlas o liposomas, ácido hialurónico o dispositivos de administración de fármacos implantables.

Las variantes de Protoxina-II de la invención pueden prepararse para su uso por vías parenteral (subcutánea, intramuscular o intravenosa), intracerebral (intraparenquimatosa), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial, intraportal o intralesional; mediante sistemas de liberación sostenida o mediante dispositivos de implantación, o cualquier otra administración, particularmente en forma de soluciones o suspensiones líquidas; para administración bucal o sublingual como en forma de comprimidos o cápsulas; o por vía intranasal como en forma de polvos, gotas nasales o aerosoles o ciertos agentes; por vía transdérmica en forma de gel, pomada, loción, crema o polvo par espolvorear, suspensión o sistema de administración de parche con potenciadores químicos para modificar la estructura de la piel o para aumentar la concentración del fármaco en el parche transdérmico, o con agentes que permiten la aplicación de formulaciones que contienen proteínas y péptidos sobre la piel (Publicación de Patente Internacional N° WO98/53847), o aplicaciones de campos eléctricos para crear vías de transporte transitorias como la electroporación, o para aumentar la movilidad de fármacos cargados a través de la piel, como la iontoforesis, o la aplicación de ultrasonidos, como la sonoforesis (Patentes de Estados Unidos N° 4.309.989 y 4.767.402). La composición también puede administrarse localmente mediante la implantación de una membrana, esponja u otro material apropiado sobre el que se haya absorbido o encapsulado la molécula deseada.

En ciertas realizaciones, cuando se usa un dispositivo de implantación, el dispositivo puede implantarse en cualquier tejido u órgano adecuado, y la administración de la molécula deseada puede ser mediante difusión, bolo de liberación programada o administración continua.

La concentración de las variantes de Protoxina-II de la invención u otros inhibidores peptídicos de Nav1.7 en dicha formulación farmacéutica puede variar ampliamente, por ejemplo de aproximadamente el 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7 %, 0,8%, 0,9%, 1,0%, 1,1%, 1,2%, 1,3%, 1,4%, 1,5%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9%, 2%, o entre el 2% y el 5%, hasta tanto como el 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% o 70% en peso y se seleccionará principalmente en base a los volúmenes de fluido, viscosidades y otros factores, de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado. Las variantes de Protoxina-II de la invención pueden liofilizarse para su almacenamiento y reconstituirse en un vehículo adecuado antes de su uso. Se ha demostrado que esta técnica es eficaz con preparaciones de proteínas convencionales. Las técnicas de liofilización y reconstitución son bien conocidas en la técnica.

Un ejemplo de composiciones farmacéuticas de la presente invención puede comprender tampón Tris de aproximadamente pH 7,0-8,5, o tampón de acetato de aproximadamente pH 4,0-5,5, y puede incluir además sorbitol, sacarosa, Tween-20 y/o un sustituto adecuado de los mismos.

Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente la dosis apropiada terapéuticamente eficaz. Una dosis eficaz se refiere a una cantidad o dosificación suficiente para producir un resultado deseado, es decir, para prevenir, detener, inhibir, reducir o retrasar parcial o completamente la percepción del dolor asociado con cualquier condición médica dolorosa. La cantidad eficaz puede variar dependiendo del vehículo específico y las variantes de Protoxina-II de la invención seleccionadas, y también depende de una variedad de factores y afecciones relacionadas con el sujeto a tratar y la gravedad del dolor. Por ejemplo, factores como la edad, el peso y la salud del sujeto al que le van a administrar las composiciones farmacéuticas de la invención, así como las curvas de respuesta a la dosis y los datos de toxicidad obtenidos en el trabajo preclínico con animales podrían estar entre los considerados. Una dosis determinada puede, si es necesario, repetirse a intervalos de tiempo apropiados seleccionados según sea apropiado por un médico u otra persona experta en la técnica relevante (por ejemplo, enfermera, veterinario o técnico veterinario) durante el período de tratamiento. La determinación de una cantidad eficaz o una cantidad terapéuticamente eficaz para un agente dado está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica.

Por tanto, podría prepararse una composición farmacéutica de la invención para inyección intramuscular que contenga 1 ml de agua tamponada estéril, y entre aproximadamente 1 ng y aproximadamente 100 mg, aproximadamente 50 ng y aproximadamente 30 mg o aproximadamente 5 mg y aproximadamente 25 mg de una variante de Protoxina-II de la invención. De manera similar, una composición farmacéutica de la invención para infusión intravenosa podría prepararse para que contenga aproximadamente 250 ml de solución de Ringer estéril y de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 30 mg o de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 25 mg de las variantes de Protoxina-II de la invención.. Los métodos reales para preparar composiciones administrables por vía parenteral son bien conocidos y se describen con más detalle en, por ejemplo, “Remington's Pharmaceutical Science”, 15a ed., Mack Publishing Company, Easton, PA.

La presente invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos específicos no limitativos.

Ejemplo 1: Diseño y generación de variantes de la Protoxina II

La sustitución de la biblioteca de exploración de aminoácidos limitada de posición única de Protoxina-II se diseñó para evaluar hasta qué grado pueden mejorarse la selectividad, el rendimiento de péptidos y la homogeneidad.

Las variantes de Protoxina-II se diseñaron como proteínas de fusión HSA escindibles con proteasa HRV3C en el siguiente formato desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal: 6xHis-HSA-conector-péptido escindible HRV3C-variante de Protoxina-II ("6xHis" descrito como SEQ ID NO: 108); el conector siendo (GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS; SEQ ID NO: 80, HSA teniendo la secuencia de la SEQ ID NO: 106, péptido escindible HRV3C teniendo la secuencia de la SEQ ID NO: 82). Cada variante de Protoxina-II, después de la escisión de HSA tenía un GP N-terminal residual del sitio de escisión.

Las variantes se caracterizaron en ensayos de despolarización de membrana usando FLIPR® Tetra como se describe en el Ejemplo 3 Ensayo de despolarización de membrana FLIPR® Tetra, y en experimentos de fijación en parche de membrana de células completas usando el ensayo QPatch como se describe en el Ejemplo 3.

Se diseñaron bibliotecas combinatorias para probar los efectos aditivos de los aciertos de posición única seleccionados en un intento de generar antagonistas de Nav1.7 con un perfil de potencia y de selectividad mejorados en comparación con el péptido nativo.

Construcción de los vectores de expresión

Los genes variantes de Protoxina-II diseñados se generaron usando tecnología de ensamblaje de genes sintética como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 6.521.427. Las secuencias de aminoácidos de las variantes de péptidos diseñadas se retrotradujeron a secuencias de ADN usando codones humanos de alta frecuencia. La secuencia de ADN de cada gen variante, junto con una parte del ADN del vector, incluyendo los sitios de clonación del ADN, se sintetizó como múltiples oligonucleótidos, algunos de los cuales contenían codones degenerados, y se ensamblaron en fragmentos de ADN de longitud completa. Los fragmentos de ADN ensamblados se amplificaron mediante PCR y los productos de PCR se clonaron posteriormente como un conjunto. Los productos de PCR combinados se digirieron con las enzimas de restricción apropiadas y se clonaron en el vector de expresión diseñado de tal manera que se fusionara cada gen de variante de toxina con el péptido señal y el compañero de fusión (6xHis-HSA-coenctor-péptido escindible HRV3C ("6xHis" divulgada como SEQ ID NO: 108) contenida en el vector. Se usaron técnicas de biología molecular estándar para identificar un clon positivo para cada variante diseñada. El ADN plasmídico de estos clones positivos se purificó y se confirmó la secuencia antes de expresar las proteínas de fusión de la variante del péptido Protoxina-II usando métodos estándar

Expresión de proteínas

Las células HEK 293-F se mantuvieron en medio 293 Freestyle™ (Invitrogen N° de Cat 12338) y se dividieron cuando la concentración de células estaba entre 1,5 y 2,0xl06 células por ml. Las células se hicieron crecer en suspensión, agitando a 125 RPM en un conjunto de incubador humidificado a 37° C y 8% de CO². Las células HEK 293F se transfectaron transitoriamente usando un complejo de ADN/lípido después de que se diluyeron a 1,0x106 células por ml. Para generar el complejo, se diluyeron 1,25 gg de ADN por ml de transfección en 1,0 ml de medio OptiPro (Invitrogen N° de Cat 12309) y se diluyeron 1,25 ml de reactivo de transfección Freestyle™ Max (Invitrogen N° de Cat 16447) en 1,0 ml de medio OptiPro. El ADN y el reactivo de transfección Max se mezclaron y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de añadirlos a las células. Las células transfectadas se colocaron en una conjunto de incubador humidificado a 37° C y 8% de CO²durante 4 días con agitación a 125 RPM. El sobrenadante se separó de las células mediante centrifugación a 5000 x g durante 10 minutos y se filtró a través de un filtro de 0,2 gm (Corning; N° de Cat 431153), luego se concentró 10 y 50 veces usando un Amicon Ultra Concentrator 10K (N° de Cat UFC901096), y centrifugando durante aproximadamente 10 minutos a 3.750xg.

Ejemplo 2: Purificación de variantes de Protoxina-II

Las variantes de Protoxina-II se expresaron como proteínas de fusión de HSA como se indica en el Ejemplo 1 y los péptidos de variantes de Protoxina-II se escindieron con proteasa HRV3C antes de la purificación. Se probaron dos metodologías para la purificación eficaz de las variantes de Protoxina-II.

Purificación de proteínas

Purificación de variantes de Protoxina-II por RP-HPLC

Las proteínas secretadas se purificaron a partir de los sobrenadantes de expresión mediante IMAC usando columnas HisTrap HP de 1 ml (GE Healthcare N° de Cat 17-5247-01). El método de cromatografía se ejecutó usando un AKTA Xpress y la proteína se eluyó de la columna usando un gradiente escalonado de imidazol. Las fracciones de los picos se combinaron y se digirieron durante la noche con proteasa HRV 3C (1 gg de proteasa/150 gg de fusión).

Los grupos de péptido-fusión escindidos se purificaron adicionalmente usando un sistema de HPLC Dionex con una columna Phenomenex Luna de 5 gm C18(2) de fase inversa (N° de Cat 00B-4252-P0-AX). Las muestras se eluyeron de la columna con un gradiente lineal de acetonitrilo al 0-68% (TFA al 0,05%). Las fracciones de elución se agruparon, se liofilizaron durante la noche y se reconstituyeron en solución salina tamponada con HEPES, pH 7,4 (H^eP^eS 10 mM, NaCl 137 mM, KCl 5,4 mM, glucosa 5 mM, CaCl²2 mM, MgCl²1 mM).

La Tabla 4 muestra los rendimientos de variantes de Protoxina-II purificadas por RP-HPLC. El rendimiento medio en mg/l fue de 0,01615.

Tabla 4

Purificación de variantes de la Protoxina II mediante extracción en fase sólida (SPE)

Las proteínas secretadas se purificaron a partir de los sobrenadantes de expresión mediante IMAC usando columnas HisTrap HP de 1 ml (GE Healthcare N° de Cat 17-5247-01). El método de cromatografía se ejecutó usando un AKTA Xpress y la proteína se eluyó de la columna usando un gradiente escalonado de imidazol. Las fracciones de los picos se agruparon y digirieron durante la noche con proteasa HRV3C (1 gg de proteasa/150 gg de fusión). La muestra escindida se cargó en una unidad de filtro centrífugo de corte de 50 kDa de peso molecular (Millipore UFC805096) y el péptido escindido se recogió en la fracción de filtrado.

Los grupos de péptidos se cargaron en un bloque de extracción en fase sólida de 96 pocillos (Agilent Bond Elut Plexa A3969030) para su purificación, desalación y concentración adicionales. Los bloques se usaron junto con un colector de vacío (Whatman). Las muestras de péptidos se cargaron y lavaron en TFA al 0,05% en agua y se eluyeron con un gradiente escalonado de acetonitrilo con TFA al 0,05% en agua. Las fracciones de elución se liofilizan a continuación durante la noche y se reconstituyeron en solución salina tamponada HEPES, pH 7,4 (HEPES 10 mM, NaCl 137 mM, KCl 5,4 mM, glucosa 5 mM, CaCl²2 mM, MgCl²1 mM).

Los péptidos se reconstituyeron en solución salina tamponada con HEPES suplementada, pH 7,4 (HEPES 10 mM, NaCl 137 mM, KCl 5,4 mM, glucosa 5 mM, CaCl²2 mM, MgCl²1 mM) y se midió la absorbancia a 280 nm. Luego, se calcularon los valores de concentración usando el coeficiente de extinción de cada muestra. Se cargaron 2 gg de cada péptido en un gel de 15 pocillos Invitrogen NuPAGE® Novex® Bis-Tris Gel y se ejecutaron en tampón MES no reducido.

Las muestras se analizaron en HPLC Agilent 1100 utilizando acetonitrilo al 4-80% en gradiente lineal de TFA al 0,05% con una columna analítica Phenomenex Luna C18(2) (N° de Cat 00A-4041-B0). Se normalizaron las concentraciones de todos los péptidos y se inyectaron 10 gl de cada uno para un total de 1,3 gg por muestra. Se monitorizó la absorbancia a 220 nm y se analizaron los cromatogramas usando el software Chromeleon.

La Tabla 5 muestra los rendimientos (mg) de variantes de Protoxina-II purificadas por SPE. El rendimiento medio en mg/l fue de 0,05353.

Los beneficios del proceso de purificación de SPE son la facilidad y el rendimiento de la purificación, ya que las muestras se procesan en paralelo en un bloque de 96 pocillos en lugar de en serie en RP-HPLC, y la mejora del rendimiento. Hubo, de media, un rendimiento más de 3 veces mayor (mg/l) para las variantes purificadas por SPE frente a RP-HPLC.

Tabla 5

continuación

Ejemplo 3: Caracterización de variantes de Protoxina-II

Se caracterizaron variantes de Protoxina-II seleccionadas en ensayos de despolarización de membrana y fijación en parche de membrana de células completas para evaluar su potencia y selectividad hacia Nav1.7.

Ensayo de despolarización de membrana de membrana FLIPR® Tetra

Se midió la capacidad de los péptidos generados para inhibir la despolarización de la membrana inducida por el agonista de Nav1.7 veratridina (3-Veratroilveracevina; Biomol, N° de Catálogo NA125) con un ensayo FRET (transferencia de energía de resonancia de fluorescencia) en FLIPR® Tetra usando DISBAC2(3) (Invitrogen, K1018) como aceptor de electrones y PTS18 (8-octadeciloxipireno-1,3,6-trisulfonato trisódico) (Sigma) como donante excitando al donante a 390-420 nm y midiendo FRET a 515-575 nm.

Se cultivaron células HEK293 que expresaban de manera estable Nav1.7 humano en medio DMEM/F-12 (1:1), suplementado con suero bovino fetal al 10%, penicilina/estreptomicina al 1%, 400 gg/ml de genetina y 100 gM de NEAA (todos los reactivos de Invitrogen). Se colocaron en placa 50 gl de células recolectadas a 25.000 células/pocillo en placas de fondo negro transparente de 384 pocillos revestidas con poli-lisina. Las placas se incubaron a temperatura ambiente (RT) durante 15 min seguido de una incubación durante la noche a 37° C. Todas las incubaciones se realizaron en la oscuridad a menos que se indique lo contrario. Al día siguiente, los pocillos se lavaron 4 veces con tampón de ensayo (NaCl 137 mM, KCl 4 mM, MgCl²2 mM, CaCl²2 mM, Glucosa 5 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4) y se resuspendieron en 25 gl de tampón de ensayo. Se preparó 2x stock (6 gM) del colorante PTS18 suspendiendo el colorante en pluronic F127 al 10% en DMSO a 1:1 (proporción v/v). Se añadieron 25 gl del stock 2x PTS18 en los pocillos y las células se tiñeron durante 30 min a RT, después de lo cual se lavó el colorante con el tampón de ensayo. Los péptidos se suspendieron a 3 veces su concentración final en el tampón de ensayo que contenía DISBAC²(3) 10 gM y VABSC-1 400 gM para suprimir la fluorescencia de fondo (Sigma, N° de Cat 201987). Se añadieron 25 gl/pocillo de los péptidos suspendidos en cada pocillo y se incubaron durante 60 minutos a RT. La despolarización se indujo mediante una concentración final de 25 gM de veratridina (añadiendo 25 gl/pocillo de 75 gM (3 x) solución madre), y se midió la reducción en la intensidad media de la fluorescencia del colorante FRET 30-100 segundos después de añadir el agonista. Se produjo una dilución de 1,3 veces de cada péptido medido después de añadir veratridina por convención, se informa la concentración al comienzo del ensayo FLIPR® Tetra.

Se construyeron curvas de concentración-respuesta de Protoxina-II sintética (Peptide International) en cada serie experimental y se usaron como controles. Los recuentos de fluorescencia para cada pocillo se convirtieron en % de respuesta normalizando la señal a la diferencia entre los valores de control negativo (respuesta al agonista veratridina solo) y control positivo (respuesta a veratridina en presencia de tetracaína 10 gM). Para las mediciones, la "corrección de uniformidad espacial" (todas las trazas de fluorescencia se normalizan a la intensidad de partida inicial media) y el "valor de sesgo de resta" (resta de la intensidad de partida inicial de cada traza) se activaron en FLIPR® Tetra. Cada punto de datos representó la respuesta en un pozo individual. Todos los puntos de datos individuales se usaron en un procedimiento de ajuste de mínimos cuadrados no lineal para encontrar el mejor ajuste a una función de Hill usando Origin (Microcal). Se extrajeron los valores de IC⁵⁰de la curva ajustada resultante. Las respuestas medias de los controles positivo (P) y negativo (N) se usaron para calcular el % de respuesta en un pocillo de la siguiente manera: % de respuesta = 100*(N-R)/(N-P).

Se aceptaron placas de ensayo si la potencia de los antagonistas de control para ese día estaba dentro de ± 0,5 unidades logarítmicas de su media histórica.

Ensayo QPatch

Se cultivaron células HEK293 que expresaban de manera estable Nav1.5 humana (SEQ ID NO: 105), Nav1.7 (SEQ ID NO: 79) o Nav1.6 (SEQ ID NO: 407) en medio DMEM/F-12 (1:1), suplementado con suero bovino fetal al 10%, penicilina/estreptomicina al 1%, geneticina 400 gg/ml y NEAA 100 gM (todos los reactivos de Invitrogen). Las células se mantuvieron a 37° C y en CO2 al 5% y se ensayaron tras alcanzar una confluencia de ~50-90%. Se cultivaron células CHO que expresan establemente Nav1.6 humano de una manera inducible por tetraciclina (SEQ ID NO: 407) en HAM F12, suplementado con suero bovino fetal al 10%, penicilina/estreptomicina al 1%, 10 gg/ml de blasticidina y 400 gg/ml de zeocina. Las células se mantuvieron a 37° C y en CO2 al 5%, y se ensayaron tras alcanzar una confluencia del ~50-90%. La expresión de Nav1.6 se indujo con 1 gg/ml de tetraciclina, 24-48 h antes de un experimento.

Antes de realizar la prueba en QPatch HT (Sophion), las células se disociaron primero usando tripsina al 0,05% (5 min a 37° C), se resuspendieron en medio CHO-S-SFM (Life Technologies) y se trituraron suavemente para descomponer los grumos de células. La densidad celular se ajustó a 1-2x106/ml con el mismo medio y las células se transfirieron a un "hotel" celular en QPatch HT y se usaron en experimentos durante varias horas. Para la formación de sellos de giga-ohmios y el registro de fijación en parcha de membrana de células completas, la solución extracelular contenía 137 mM de NaCl, KCl 5,4 mM, MgCl²1 mM, CaCl²2 mM, Glucosa 5 mM y HEPES 10 mM, pH = 7,4 y osmolaridad = 315 mOsm. La solución intracelular contenía CsF 135 mM, CsCl 10 mM, EGTA 5 mM, NaCl 5 mM y HEPES 10 mM, pH = 7,3 y osmolaridad = 290 mOsm. El protocolo de voltaje usado en el ensayo fue el siguiente. A partir de un potencial de retención de -75 mV (Nav1.7), -60 mV (Nav1.6) o -105 mV (Nav1.5), las células se hiperpolarizaron primero a -120 mV durante 2 segundos y luego se despolarizaron a 0 mV durante 5 ms antes de volver al potencial de retención. Este protocolo se repitió una vez cada 60 segundos durante las aplicaciones de líquido (ver más abajo). Por lo demás, las células se mantuvieron en el potencial de retención cuando no se ejecutó el protocolo de voltaje anterior. Tras establecer la configuración de registro de células completas, se elaboraron un total de cinco aplicaciones de la solución extracelular (todas conteniendo albúmina de suero bovino (BSA) al 0,1% con o sin compuesto de prueba, excepto en la última aplicación, que contenía TTX 1 pM o lidocaína 10 mM como control positivo) en las células que se estaban registrando. La primera aplicación de líquido contenía solo el tampón de control (5 pl). El protocolo de voltaje se ejecutó 10 veces (durante una duración total de 10 min) cinco segundos después de la aplicación. Las siguientes tres aplicaciones de líquido (5 pl cada una) contenían un compuesto de prueba (el mismo compuesto a la misma concentración para las tres aplicaciones) o tampón de control (solo para células de control). Cinco segundos después de cada una de estas aplicaciones, el protocolo de voltaje se volvió a ejecutar 10 veces (también una vez por minuto). La última aplicación contenía positivo (compuesto por tres sub aplicaciones de 10 pl, cada una separada por 2 segundos), cinco segundos después de los cuales se ejecutó dos veces el mismo protocolo de voltaje para obtener la corriente de valor de referencia. Las corrientes se muestrearon a 25 kHz y se filtraron a 5 kHz con un filtro Bessle de 8 polos. El nivel de compensación de resistencia en serie se fijó en el 80%. Para cada célula, la amplitud de corriente máxima a 0 mV para cada traza de corriente en las primeras cuatro aplicaciones de líquido se restó primero de la última traza en presencia de control positivo y luego se normalizó a la de la última traza en la primera (control tampón) aplicación como % de inhibición. Para controlar la descarga de la corriente, este valor (% de inhibición) para cada célula en presencia de un compuesto de prueba se normalizó adicionalmente al valor de % de inhibición medio para las células de control (típicamente 5-6) en el mismo experimento. La media de los dos últimos valores en la última aplicación compuesta (es decir, el % de valor de inhibición corregido para cada concentración de un compuesto de prueba) se tomó como el % de valor de inhibición para cada célula a la concentración de compuesto particular probada. Se promediaron los valores de % de inhibición para todas las células probadas a cada concentración de compuesto y se usaron en los cálculos de respuesta a la concentración. Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente (~22°C). Los datos se expresan como media ± SE. Se incluyó Protoxina-II de tipo salvaje en cada experimento como control positivo. Los datos se aceptaron solo si la potencia de la Protoxina-II estaba dentro de ± 0,5 unidades logarítmicas de su media histórica.

Los valores de IC⁵⁰para Nav1.7 para variantes de Protoxina-II seleccionadas obtenidas usando el FLIPR® Tetra se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6.

continuación

Se probaron variantes de Protoxina-II seleccionadas para determinar su selectividad frente a Nav1.5 humano usando QPatch. Los valores de IC⁵⁰tanto para Nav1.7 como Nav1.5 para péptidos seleccionados obtenidos usando QPatch se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7.

Ejemplo 4. Generación y caracterización de variantes de Protoxina II combinatorias

Se diseñaron bibliotecas combinatorias para probar los efectos aditivos de los aciertos de posición única seleccionados en un intento de generar antagonistas de Nav1.7 con un perfil de potencia y de selectividad más mejorados en comparación con el péptido nativo usando varios enfoques.

Se realizó un escaneo de aminoácidos limitado en todas las posiciones de Protoxina-II distintas de la cisteína usando A, D, Q, R, K y S para la diversificación. En estos experimentos, la Protoxina-II se expresó y probó como proteína de fusión Fc monovalente como se describe en el Ejemplo 1. A partir de esta exploración, se identificaron las sustituciones Y1Q, W7Q, S11A que mejoraron la potencia y/o selectividad de las variantes resultantes.

También se realizó una exploración completa de aminoácidos (excluyendo cys y trp) en las posiciones M6 y M19. La sustitución de M19F se identificó a partir de esta exploración que mejoró la potencia y/o la selectividad de las variantes resultantes.

Las quimeras de posición única de Protoxina-II/Huwentoxina-IV se diseñaron bidireccionalmente. El propósito de esta biblioteca fue obtener variantes de Protoxina-II que retuvieran el perfil de potencia y selectividad de la Protoxina-II de tipo salvaje y lograrían propiedades de replegamiento beneficiosas asociadas con la Huwentoxina-IV. Las sustituciones R22T y E12N se identificaron a partir de esta exploración.

El péptido NV1G1153 se diseñó adicionalmente diversificando la posición Y1 mediante una exploración de aminoácidos limitada usando R, K, T, A, D, E, Q y S, y mediante ingeniería de grupos de carga, donde todos los conjuntos de residuos cargados en la estructura tridimensional del péptido (D10/E12, K4/E17, D10/E12/R13) se mutaron.

Se introdujeron extensiones N- y C-terminales para seleccionar péptidos, incluyendo NV1G1153 con el propósito de mejorar la distribución de péptidos al sitio de acción y de mejorar la vida media de los péptidos sin aumentar significativamente el peso molecular del péptido resultante. Las extensiones N- y C-terminales que se utilizaron se muestran en la Tabla 8 y 9, respectivamente, y se describen en Oi et. al., Neuroscience Letters 434, 266-272, 2008; Whitney et. al., Nature Biotechnology 2011 29:4, 352-356; Sockolosky et. al., (2012) 109:40, 16095 16100. También se usaron péptidos de penetración celular Tat de VIH y poliarginina. Se usaron varios conectores para acoplar la variante de Protoxina-II a las extensiones N- y/o C-terminales. Los conectores usados se muestran en la Tabla 10.

Se probaron las variantes de Protoxina-II de cada campaña para su potencia y selectividad para Nav1.7 usando los métodos descritos en el Ejemplo 3. Las secuencias de aminoácidos de las variantes que inhibieron Nav1.7 con un valor de IC⁵⁰de 200 nM o menos se muestran en la Tabla 3. La Tabla 11 muestra la sustituciones de aminoácidos en variantes seleccionadas en comparación con la Protoxina-II de tipo salvaje, y los valores de IC⁵⁰para la inhibición de Nav1.7 en el ensayo FLIPR Tetra.

Tabla 8.

Tabla 9.

Tabla 10.

Tabla 11.

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La Protoxina-II de tipo salvaje inhibe Nav1.7 con un valor de IC⁵⁰de aproximadamente 4 nM en ensayo FLIPR como se describe en el Ejemplo 3. Las variantes que retienen la potencia de Nav1.7 significativa se caracterizaron adicionalmente. La Figura 1 muestra el género secuencia de variantes de Protoxina-II generadas que inhiben Nav1.7 con un valor de IC⁵⁰de 30 nM o menos.

Se probaron variantes de Protoxina-II seleccionadas para determinar su inhibición de Nav1.7 y su selectividad frente a Nav1.6 humano usando QPatch. Los valores de IC⁵⁰tanto para Nav1.7 como Nav1.6 para péptidos seleccionados obtenidos usando QPatch se muestran en la Figura 2. Estos péptidos inhibieron Nav1.7 con una IC⁵⁰de 30 nM o menos, y fueron por lo menos 30 veces más selectivos sobre Nav1.7 cuando se compara con Nav1.6.

Las secuencias de aminoácidos de los péptidos mostrados en la Figura 2 se muestran en la Figura 3. Todos estos péptidos tenían sustituciones W7Q y M19F en comparación con la Protoxina-II de tipo salvaje.

Las variantes de Protoxina-II se expresaron y purificaron como se describe en el Ejemplo 1, o se sintetizaron mediante métodos de síntesis en fase sólida estándar. Los rendimientos de los péptidos recombinantes o sintéticos se compararon con los rendimientos de la protoxina de tipo salvaje. La Tabla 12 muestra que los rendimientos de las variantes de Protoxina-II seleccionadas fueron significativamente más altas que los de la Protoxina-II, lo que indica mejores propiedades de plegamiento de las variantes. La escala de la síntesis en fase sólida fue de 0,5 mmol.

Tabla 12.

Ejemplo 5. Las variantes de la Protoxina-II son eficaces en modelos de dolor in vivo

Materiales y métodos

Animales Para este estudio se usaron ratones macho C57BI/6 (24-26 g), pedidos a Charles River y alojados individualmente.

Pruebas de comportamiento

Prueba de Von Frey: el umbral mecánico (táctil) fue evaluado mediante Filamentos de Von Frey siguiendo el método Up-Down (Dixon, 1980, Chaplan et al., 1994). Se usaron 7 estímulos graduados (filamentos de von Frey: 0,03, 0,07, 0,16, 0,4, 0,6, 1, 2 g; Stoelting, Wood Dale, IL). Los filamentos de Von Frey se presentaron perpendicularmente contra el área plantar central (entre toris) en una pata trasera. Se aplicó fuerza suficiente para doblar ligeramente el filamento y se mantuvo durante 3 segundos. Según el artículo de Chaplan, una respuesta positiva puede ser 1) una retirada brusca o 2) un retroceso inmediato tras retirar el filamento. Ver Chaplan et al para obtener más detalles. Los ratones se aclimataron a la malla de alambre en la cámara de prueba durante 30-60 minutos antes de la prueba.

Prueba de Hargreaves: Se usó una caja Hargreaves modificada para medir la latencia de retirada térmica de la pata (PWL) (Hargreaves et al., 1988, Pain, 32:77-88; Dirig et al., 1997, J Neurosci. Methods, 76:183-191). Esta caja consiste de una cámara con un suelo de vidrio elevado mantenido a temperatura constante (27° C). El estímulo nociceptivo térmico se origina en un haz de luz de bombilla de proyección debajo de la superficie del vidrio. El haz de luz se dirige al área entre toris (centro plantar). El botón de "inicio" encenderá la luz y pondrá en marcha el temporizador. Los movimientos (como una retirada repentina) de la pata estimulada activarán el interruptor para apagar la luz y detener el temporizador. Se muestra la latencia en segundos. Si no se produce ningún movimiento, la bombilla se apagará después de 20 segundos (corte) para evitar lesiones en los tejidos. Se permitió que los animales se habituaran a la superficie del vidrio durante 30-60 minutos antes de la medición de PWL. Se usó un amperaje constante durante todo el estudio, lo que dio como resultado latencias de retirada de la pata antes de la prueba de entre 8 y 12 segundos cuando se promediaron entre 3 y 6 lecturas tomadas con por lo menos 5 minutos de diferencia.

Cálculo de % de MPE: Porcentaje de efecto máximo posible (MPE%) = (T¹-Tü)/(Tc - Tü)x100%. T⁰: umbral el día 0 (post-CFA, pre-bomba); T¹: umbral el día 1 después de la implantación de la bomba; Tc: corte de la prueba (20 s para la prueba de Hargreaves y 2 g para la prueba de Von Frey)

Prueba de placa calefactora: Los animales se colocaron en una placa de metal de 10"x10" rodeada por 4 paredes de plexiglás (15 pulgadas de alto). La placa se mantuvo a una temperatura de 50 o 55°C. Se midió la latencia de respuesta (tiempo en el que el animal se estremece o se lame la pata trasera, salta o vocaliza por primera vez) y se retira el animal de la placa. Los animales que no mostraron respuesta se retiraron de la placa después de 40s (50° C) o 20s (55° C) para evitar cualquier posible daño tisular. Esta prueba se repitió de 2 a 5 veces cada 15-60 minutos en un día.

Modelos de dolor inflamatorio

Modelo de CFA: Los animales se anestesiaron con isoflurano (4% de inducción y 2% de mantenimiento) y se les inyectaron 20 gl de adyuvante de Freund completo al 100% (CFA; Sigma-Aldrich; Saint Louis, MO) en el área plantar central de una pata trasera usando una aguja de calibre 27 unida a una jeringuilla Hamilton de 50 gl. Modelo de carragenina: los animales se anestesiaron con isoflurano (4% de inducción y 2% de mantenimiento) y se les inyectaron 25 gl de 2% de A-carragenina (Sigma-Aldrich; Saint Louis, MO) disueltos en solución salina normal en el área central plantar de las patas traseras con una jeringuilla de insulina (BD; Franklin Lakes, Nueva Jersey).

Implantación de minibombas

Se llenaron y cebaron minibombas microosmóticas Alzet (Durect Corporation Modelo 1003D y 2001D) según la guía del fabricante. Los ratones se anestesiaron con isoflurano (5% de inducción; 2% de mantenimiento). Se les afeitó la espalda, se limpiaron con alcohol isopropílico y povidona yodada, y se les hizo una pequeña incisión entre las escápulas. Usando un par de fórceps o pinzas hemostáticas, se formó una pequeña bolsa separando los tejidos conectivos subcutáneos. La bomba se insertó en el bolsillo con el moderador de flujo apuntando en dirección opuesta a la incisión. Luego, se cerró la incisión en la piel usando grapas de 7 mm y se dejó que los animales se recuperasen en sus jaulas de origen.

Análisis de los datos

Los datos se representan como media ± s.e.m. Se usó Prism (Graphpad Software Inc., La Jolla, CA) para la representación gráfica y el análisis estadístico. Para la comparación de los valores umbral a lo largo del tiempo, se usó un ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Bonferroni con un nivel de significancia de p<0,05. La placa calefactora y los datos se analizaron mediante ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Bonferroni.

Resultados

Se estudió la eficacia de las variantes NV1D3034-OH (NV1D3034-COOH), NV1D3368-OH (NV1D3368-COOH) y NV1D2775-OH (NV1D2775-COOH) en el modelo de CFA, un modelo de dolor inflamatorio comúnmente usado. La inyección de CFA en la pata trasera indujo edema de la pata (no mostrado) e hipersensibilidad a estímulos térmicos (hiperalgesia térmica), como lo indica la latencia térmica reducida en la pata inyectada el día 0 (Figura 6A). La hiperalgesia térmica se revirtió por completo con NV1D3034-OH a 684 y 1824 gg/día, cuando se administró mediante una minibomba osmótica subcutánea (Figuras 4A y 4B).

NV1D3368-OH revirtió completamente la hiperalgesia térmica inducida por CFA a 684 y 1824 gg/día (Figura 5A y 5B). NV1D2775-OH demostró una fuerte eficacia en el modelo de CFA. Las latencias térmicas alcanzaron valores cercanos al corte después de la administración de NV1D2775 (Figura 6A y 6B, 1824 gg/día), lo que sugiere un fuerte efecto analgésico además del efecto antihiperalgesia. Además, NV1D2775-OH invirtió la alodinia táctil inducida por CFA (Figura 6C y 6D, 1824 gg/día). El efecto antihiperalgésico de NV1D2775-OH se observó tan pronto como 4 horas después de la implantación de la bomba (Figura 7A). El efecto alcanzó el máximo a las 8 h en tanto las pruebas térmicas como las táctiles (Figura 7A y 7B), que se mantuvo a las 24 h. La latencia térmica y el umbral táctil devolvieron el nivel de control 48 h después de la implantación de la bomba (aproximadamente 24 h después de lo previsto para que se vaciasen las bombas) (Figura 7A y 7B).

La hiperalgesia térmica inducida por CFA se revirtió fácilmente con dos péptidos adicionales, NV1D3368-amida (NV1D3368-NH2) y NV1D3034-N-metilamida (NV1D3034-NHMe). El térmico de los experimentos se resume en la Tabla 13.

Tabla 13.

NV1D2775-OH también mostró una fuerte eficacia dependiente de la dosis en la prueba de la placa calefactora (Figura 8). Las latencias a 50 y 55° C alcanzaron valores cercanos al punto de corte tras la administración de 1824 gg/día. A 228 gg/día, NV1D2775-OH produjo un aumento modesto pero significativo en la latencia térmica, en comparación con el control PBS.

La eficacia de NV1D2775-OH se evaluó en otro modelo de dolor inflamatorio, el modelo de carragenina. A los animales se les implantaron bombas de NV1D2775-OH o PBS. Las latencias de retirada térmica se midieron antes y el día 1 después de la bomba. Se inyectó A-carragenano en las patas traseras y se midieron de nuevo las latencias térmicas 2, 3 y 4 horas después del carragenano. NV1D2775-OH a 1824 gg/día produjo analgesia

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una variante de Protoxina-II aislada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 40, 44, 56, 59, 65, 78, 109, 110, 111, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 129, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 138, 139, 140, 141, 142, 145, 146, 147, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 156, 158, 159, 172, 173, 175, 177, 178, 183, 184, 185, 186, 189, 190, 193, 196, 197,

199, 205, 207, 210, 211, 216, 217, 224, 230, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 297, 298, 299, 301,302, 304, 305, 307, 308, 309, 310, 312, 314, 315, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, y 326,

en donde la variante inhibe la actividad de Nav1.7 humana con un valor de IC⁵⁰de 30x10-9 o menos, en donde el valor de IC⁵⁰se mide usando un ensayo de despolarización de membrana FLIPR Tetra, el ensayo comprendiendo transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) en presencia de 3-veratroilveracevina 25x10-6 M en células HEK293 que expresan de manera estable Nav1.7 humano y usando bis-1,3(ácido dietiltiobarbitúrico)trimetina oxonol como un aceptor de electrones y 8-octadeciloxipireno-1,3,6-trisulfonato trisódico como un donante excitando el donante a 390- 420 nm y midiendo FRET a 515-575 nm.

2. La variante de Protoxina-II aislada de la reivindicación 1, en donde la variante inhibe selectivamente NavI.7 humano.

3. La variante de Protoxina-II aislada de la reivindicación 2, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la secuencia de las SEQ ID NO: 56, 78, 114, 129, 133, y 146.

4. La variante de Protoxina-II aislada de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, o 3, que tiene un grupo de ácido carboxílico, amida, metilamida, o butilamida C-terminal libre.

5. Un conjugado que comprende la variante de Protoxina-II de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 conjugada con una fracción de extensión de la vida media; en donde el conjugado es una proteína de fusión que comprende la variante de Protoxina-II y una albúmina de suero humana (HSA), dominio de unión a albúmina (ABD), o un polipéptido de Fc, o el conjugado comprende polietilenglicol (PEG) acoplado químicamente a la variante de Protoxina-II.

6. Un polinucleótido aislado que codifica la variante de Protoxina-II de cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

7. Un vector que comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación 6.

8. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 7.

9. Un método para producir una variante de Protoxina-II aislada, que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 8 y recuperar la variante de Protoxina-II producida por la célula huésped.

10. Una composición farmacéutica que comprende la variante de Protoxina-II aislada de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o el conjugado de la reivindicación 5 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

11. La variante de Protoxina-II de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o la composición farmacéutica de la reivindicación 10 para su uso en el tratamiento de dolor mediado por NavI.7 en un sujeto con necesidad de ello; en donde opcionalmente

(a) el dolor es dolor crónico, dolor agudo, dolor neuropático, dolor nociceptivo, dolor visceral, dolor de espalda, dolor posoperatorio, dolor térmico, dolor del miembro fantasma, o dolor asociado con afecciones inflamatorias, eritemalgia primaria (PE), trastorno de dolor extremo paraoxístico (PEPD), osteoartritis, artritis reumatoide, discectomía lumbar, pancreatitis, fibromialgia, neuropatía diabética dolorosa (PDN), neuropatía posherpética (PHN), neuralgia del trigémino (TN), lesiones de la médula espinal o esclerosis múltiple; o

(b) la variante de Protoxina-II se administra periféricamente; o

(c) la variante de Protoxina-II se administra localmente a una articulación, médula espinal, herida quirúrgica, sitios de lesión o trauma, fibras nerviosas periféricas, órganos urogenitales, o tejidos inflamados; o

(d) el sujeto es un humano.